专利名称：一种采用纳米传感器的微生物自动培养系统的制作方法
技术领域：
本发明属于纳米技术与生物医学技术领域，具体涉及一种采用纳米传感器的微生物自 动培养系统。
技术背景病原微生物侵入血液循环，并在血液中生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物，从而引 起急性或亚急性全身感染，可导致败血性休克和多脏器衰竭，如得不到及时、正确的诊断 和治疗，将危及患者的生命。血培养检查对于菌血症、败血症和细菌性心内膜炎等血液和 循环系统感染的诊断具有十分重要的意义。早期的血培养系统主要为手工方法，虽然成本较低，但需要操作人员有一定的经验， 耗费较多的人力和时间，且使用的培养基往往由各实验室自配，难以做到标准化和实施质 量控制。自动血培养系统可提高了细菌和真菌的阳性检出率，灵敏度高，重复性好，节省 人力，縮短检验周期，自动血培养系统的基础是检测细菌和真菌生长时所释放的二氧化碳 (co2)来作为无菌性体液(包括血液、脑脊液、胸水、腹水和关节液等)有无微生物存在的指标。检测系统与恒温孵育器合二为一，连续、自动地监测培养瓶中C02的产生情况，所测得的信号传送至电脑进行分析。 一旦出现阳性结果，电脑自动发出警报，指示阳性瓶 的位置，并自动打印出现阳性的时间等。但目前仪器、设备和消耗品基本上全部依赖国外， 成本较高，使检验收费也相应增加。检测方法通常使用如下几种放射标记法、C02感受变色法、均质荧光法和压敏法等。放射标记法是在细菌生长时利用碳14标记物(14C)为底物生成"C02，并对其含量进 行监测，换算成数值(生长指数)，该指数超过规定界限时报告阳性生长。该方法可在12h 检出30%的阳性，24h内检出60% 70%， 48h内检出80% 卯％。比传统培养技术快捷、 灵敏。特别是在结核菌的培养和药敏所需时间仅为10天，比传统方法G0 40天)大大 縮短。缺点是放射性废弃物的处理困难。C02感受颜色变化法主要基于培养瓶底部特殊的Novel C02感受器，当培养瓶内有微 生物生长，其释放的C02可经水饱和后，产生H+，使pH发生改变，感受器的颜色也随之 从深绿色变为黄色，LEDs (发光二极管)发射光进行检测。该技术可使85%的阳性标本 在48h内被检出。均质荧光法的原理是，培养基内含有荧光物质分子，微生物在生长代谢的过程中产生质子(使培养基变酸)、电子(使培养基还原)和各种带电荷的原子团(如在液体培养基 内C02变成C03—)。荧光分子接受这些物质后，结构发生变化而成为无荧光的化合物。用 一独特的光学系统检测每个培养瓶发出的荧光，用于判断其中有无微生物的存在。平均的 阳性标本检出时间为9小时，90%的阳性标本可在12小时内被检测，36小时内可检测出 99。/。以上的阳性标本。压敏检测系统则是检测培养瓶中C02和02的压力变化来判断有无微生物生长。该检测 系统因灵敏度相对较低而未得到广泛应用。以上几种探测方式的血培养仪在实际临床工作中都出现假阴性的情况，即在仪器不报 警的情况下人工进行盲传，可发现有细菌生长的情况，其原因可能是由于细菌生长缓慢， 释放的C02量不足以被仪器所检测到，即检测灵敏度太低。近年来，微米、纳米量级的各种传感器，特别是生物传感器和生物图像传感器的研究开发成为热门课题。纳米材料大多具有表面效应，表面原子具有较高活性，很容易与其它原子结合从而改变物理、化学性质；纳米结构材料具有的巨大的比表面积，这些非常有利于提高传感器件的灵敏度和响应速度。早期的应用大多集中在气敏探测方面。随着研究工作的进一步深入，纳米材料作为湿敏、pH值灵敏的应用也得到快速发展。这些传感器的共同特点(也即优点)是体积小，分辨率高，响应时间短，所需样品量少。它们在探测02、N02、 CO、 H2、甲醛和酒精以及甲酸等方面具有独特的优势，已在闩常生活、生物医学、工业生产、环境保护、反恐防灾、军事国防等诸多方面广泛应用。 发明内容本发明的目的在于提出一种检测响应速度快、灵敏度高、功耗小的微生物自动培养系统。本发明设计的微生物自动培养系统，采用纳米传感器作为后级检测设备。所述纳米传 感器由纳米薄膜或一维结构纳米线(棒)阵列，或金属氧化物纳米线(棒)阵列组成，其 材料为Sb、氧化锌、Sn02、 Ti02、 0120或111203等，或它们的掺杂物，以探测pH值的变 化引起的电信号来监测细菌培养过程中产生的C02，其具体结构如下本发明的自动培养系统，由微生物培养瓶、纳米传感器和控制显示记录装置组成，其 结构如图l所示。其中，微生物培养瓶密封，培养瓶中分为两个部分， 一部分为细菌培养 液5，另一部分为处于培养瓶底部的纯水或空气3，两部分由一层分隔膜4隔离开。这层 分隔膜确保只有C02能通过。培养瓶的底部有探测电极作为纳米传感器，该电极的一端与 外面的控制、显示、记录装置连接， 一端与培养瓶底层的纯水或空气3连通。探测电极采 用对电极结构， 一极为金或石墨等化学稳定的参比电极，另一极为纳米薄膜或纳米线(棒)阵列，或金属氧化物纳米线(棒)阵列。探测电极可以制备在同一绝缘基片上，也可以是 相互分列的棒状电极。本发明的结构示意图如图1所示。接种标本后的培养瓶在自动恒温、震荡培养过程中， 当有微生物生成时，培养液中将会放出C02气体，C02气体透过隔离膜融入底部的纯水或空气中，使其PH值发生改变，置于纯水或空气一侧的纳米传感器通过检测表面附有纳米 材料的对电极在不同H离子环境下电位差来自动地连续监测瓶中C02的产生情况，所测得 的信号传送至电脑分析，绘制显示出培养瓶中微生物的生长曲线。 一旦超过设定的阈值， 即判断为阳性结果，电脑自动发出警报，指示阳性瓶的位置，并自动记录或打印出现阳性 的时间。上述系统的特点主要有a. 纳米对电极用于探测C02引起的纯水中pH的变化；b. 由于所采用的纳米材料的比表面很大，因此探测电极理论上具有更高的检测灵敏 度和更短的响应时间，可作微量、痕量探测。c. 纳米电极对直接与探测与控制系统相连，pH的经时变化引起的电信号变化被自 动记录。
图1为培养瓶设计示意图及某一个瓶与系统连接概念图。 图2为氧化锌纳米线(棒)阵列电极制备示意图。 图3为氧化锌纳米线(棒)阵列SEM照片。 图4为氧化锌纳米线阵列电极对的pH灵敏特性，图5为标定的Sb纳米电极对的C02灵敏特性。图中标号l.控制、显示、记录系统2.纳米传感器对电极3.纯水或空气 4.分离 膜5.细菌培养液6.体液注入操作口， 7.金电极8.温度计9.水浴锅10.基片具体实施方式
下面以氧化锌纳米线制成的纳米探测电极为实施例进一步描述本发明。 1.电极对制备在不锈钢薄片上用溶液法生长氧化锌纳米线(棒)，面积3cm2 。反应溶液为lOmnwI/L 的硝酸锌和5 mmol/L的六亚甲基四胺[Hexamethylenetetramine (99%)]。 反应步骤与条件(反应装置如图2所示)1) 在烧杯中配置上述溶液，用玻璃棒搅拌至完全溶解；2) 水浴锅温控设置为卯'C,当水浴锅温度为70'C时将烧杯放入；3) 大约十分钟后当烧杯温度计显示温度为85'C时，开始在两电极之间加1.5 V电压；4) 维持上述条件反应1 h;5) 将样品取出，迅速用去离子水冲洗表面，去除沉淀和杂质；6) 将样品放入65'C烘箱，风干30分钟，以去除残余水。图3为制得的氧化锌纳米线(棒)阵列的SEM照片。以此样品作为传感器的探测电 极，对电极釆用金薄膜。 测试采用标准pH缓冲溶液(PH-4， 6.86, 9.2)对进行标定灵敏特性，结果如图4。所制备的 探测电极的pH值的灵敏度约为14mV/PH。模拟微生物培养系统的探测环境，我们在纯水中持续通入二氧化碳气体，探测电极对 纯水中PH值改变的时间响应如图5所示，响应时间为400秒。以上测试初步证明所以氧 化锌纳米线(棒)作为探测电极的纳米传感器可以用于微生物自动培养系统中的二氧化碳 检出探测。
权利要求
1、一种采用纳米传感器的微生物自动培养系统，其特征在于采用纳米传感器作为后级检测设备，所述纳米传感器由纳米薄膜或一维结构的纳米线阵列组成，其材料为Sb、氧化锌、SnO2、TiO2、Cu2O或In2O3，或这些材料的掺杂物。
2. 、根据权利要求1中所述的微生物自动培养系统，其特征在于由微生物培养瓶、纳 米传感器和控制显示记录装置组成；其中，微生物培养瓶密封，培养瓶中分为两个部分， 一部分为细菌培养液(5)，另一部分为处于培养瓶底部的纯水或空气(3)，两部分由一层 分隔膜(4)隔离开，这层分隔膜确保只有C02能通过；培养瓶的底部为探测电极(2)作 为纳米传感器，该电极的一端与外面的控制、显示、记录装置(l)连接，另一端与培养 瓶底层的纯水或空气(3)连通；所述探测电极(2)采用对电极结构， 一极为金或石墨制 作的参比电极，另一极为纳米薄膜或一维结构的纳米线阵列。
全文摘要
本发明属于纳米技术与生物医学技术领域，具体涉及一种采用纳米传感器的微生物自动培养系统。该系统主要包括特殊设计的培养瓶、纳米传感器探测器及控制显示记录装置。培养瓶中有一层分离膜将培养液与纯水或空气隔开，只有CO<sub>2</sub>能通过分隔薄膜。接种标本后的培养瓶在自动恒温、震荡培养的同时，通过检测由置于纯水或空气一侧的由纳米薄膜或纳米线(棒)阵列，金属氧化物纳米线(棒)阵列和对电极组成的电极之间的电位差来监控瓶中CO<sub>2</sub>的产生情况，所测得的信号传送至电脑分析，一旦超过设定的阈值，即判断为阳性结果，电脑自动发出警报。该系统可替代目前使用的自动培养系统，而且灵敏度高，操作简便，并可提高阳性检出率。
文档编号C12M1/36GK101307291SQ200810035590
公开日2008年11月19日 申请日期2008年4月3日 优先权日2008年4月3日
发明者倪语星, 孙大林, 徐华华, 郑凯波, 陈国荣 申请人:复旦大学