专利名称：一种缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方法和应用，属于生物工 程技术领域。
背景技术：
随着生物技术的日益发展，越来越多的具有生理活性的多肽或蛋白质分子 被发现，多肽和蛋白类药物在现代疾病预防和治疗中作用日益突出。至今，美国 已经开发生物多肽药物300多个。但是，由于多肽分子难以透过生物膜，加之体内 外稳定性差、体内生物利用度低，一般只能注射给药。口服剂型易被患者接受， 是多肽药物非注射剂型的主要发展方向。相对于注射给药，口服是一种方便并且 病人依从性比较高的给药方式,对于需要长期给药的病人尤其方便。蛋白多肽类 药物目前已有个别品种实现了口服给药,如口服干扰素、胸腺肽、脑蛋白水解物 等。但是，由于药物本身的结构以及人体的吸收问题,蛋白多肽类药物口服生物利 用度很低。通常情况下，蛋白多肽类药物分子量大，难以通过消化系统的生物膜 屏障；胃酸、消化道酶等对蛋白多肽类药物有破坏、降解或聚合作用，严重影响 其稳定性。因此,提高口服生物利用度是蛋白多肽类药物口服给药的关键。近年 来,蛋白多肽类药物的口服给药技术研究不断取得新进展，为进一步发挥其功效 提供了新的技术支撑。
霍乱弧菌封闭带毒素Zonula Occludens Toxin,简称Z0T，是美国科学家 Fasano等1991年采用Ussing Chambers分析法测定CT阴性和CT阳性霍乱弧菌培养 物上清液时发现的、由399个氨基酸组成的一种毒素。它通过影响细胞间紧密连 接(tight junction,或称封闭带)，增加小肠粘膜的通透性。Z0T能可逆地调 节紧密连接的结构，因而它能影响生物大分子物质的吸收。但是封闭带毒素为大 分子，易形成包涵体，难以通过基因工程技术获得可溶性蛋白，为研究其生物学 功能增加了难度。缺失的霍乱弧菌封闭带毒素(deletion Zonula OccludensToxin，cZ0T)，是Marinarosaria等通过缺失ZOT基因不同区域，分析发现的封闭 带毒素活性中心，是封闭带毒素的265 399位氨基酸片断，具有封闭带毒素的完 整生物学功能，能够改变上皮细胞的通透性，促进蛋白、激素等大分子药物由黏 膜吸收，增强可溶性蛋白的生物学活性，而且这一作用可逆、安全，不损伤组织， 从而可能成为一种新颖、安全的多肽口服佐剂。由于其独特的生物学性质，使用 cZOT有可能开辟一种新颖的生物大分子药物口服给药新途径，给制药工业及疫苗 工业展示了光明的前景.
但是，cZ0T有135个氨基酸，分子量大，目前技术条件下无法通过化学合成 的方法获得；即使能够化学合成，其合成成本高，纯化困难。因此，需要一种高 效廉价的基因工程制备cZOT的方法。同时，由于该基因稀有密码子含量较高(占 30%),而常规的大肠杆菌BL21(DE3)不提供稀有密码子的翻译，所以cZOT在 BL21(DE3)中表达含量较低。因此，我们利用Rosetta gami (DE3)对稀有密码子 的偏爱性，选择大肠杆菌Rosetta gami (DE3)进行诱导表达，以提高cZOT的表
发明内容
本发明的目的是提供一种cZOT的高效表达方法，以期利用该方法大规模低 成本地发酵生产cZOT。
本发明要解决的一个技术问题是提出一种高效表达cZ0T的基因工程菌。该 基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌Rosetta gami (DE3)，所述重组质粒是 含cZ0T基因的质粒pET-32a(+)。具体分以下几个歩骤
1. 构建含cZOT基因的大肠杆菌(￡coh')基因工程菌 将cZOT基因按照SD序列-纯化标签His *Tag-硫氧还蛋白(Trx)-蛋白酶
(肠激酶EK)酶切位点-cZOT基因-终止密码子(TAA)的碱基序列设计上游引物 和下游引物，PCR得到该片断；用两种限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切该片 断，得到cZ0T基因；用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回 收大片段，连接上述两种基因片段，得到重组质粒pET-32a(+)-cZ0T;
2. 构建高效表达cZ0T的基因工程菌
将重组质粒pET-32a(+)-cZ0T转化到大肠杆菌Rosetta gami (DE3)感受态 细胞中，在含有氨苄青霉素(100ug/ml)、卡那霉素(15yg/ml)、四环素(12.5u g/ml)、氯霉素(34 u g/ml)中任意1-4种抗生素的LB固体培养基上培养16-20h， 挑取阳性转化子，经测序验证，获得高效表达cZOT的基因工程菌； 3.制备获得TrxA-cZOT融合蛋白 将筛选出的高产菌株在LB液体培养基中培养至0D600nm=0. 6 0. 8时，加入 终浓度为0. 6mM 1. OmM的IPTG诱导表达4 8小时，生产和积累可溶性表达的 TrxA-cZOT融合蛋白；离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破碎仪破菌后， 离心收集上清，进行亲和层析，收集TrxA-cZOT融合蛋白组分； 4.制备获得cZOT
用肠激酶(EK)酶解TrxA-cZOT融合蛋白，23。C 25。C下裂解16 18h，冰 浴5min，终止反应，再次进行亲和层析，收集穿透峰，冷冻干燥，得到cZOT。
本发明与已有技术相比较具有以下显著优点(1)通过基因工程技术的方 法生产cZOT，提高了cZOT的表达量，降低了生产成本；(2)只要进行一次亲和 层析，便可从发酵液中得到较纯的TrxA-cZOT融合蛋白，纯化步骤简单；(3)只 要进行一次酶解便能得到cZOT,得率高。
图1是重组质粒PET-32a(+)-cZOT的构建示意图。
图2是cZOT的分离纯化和酶切结果图，其中1为标准蛋白质分子质量；2为 携带TrxA- cZOT的融合蛋白；3为TrxA-cZOT融合蛋白经EK酶解；4为纯 化后的cZOT。
图3是cZOT促进胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)降血糖实验。
图4是cZ0T促进胰岛素(insulin)降血糖实验。
图5是cZOT促进血小板生成素(TPO)生成血小板实验。
具体实施例方式
下面结合附图，通过实施例，进一步说明本发明。说明书和实施例中凡未注 明具体条件的实验方法，按常规条件进行。
实施例1 构建大肠杆菌(Eco7/)表达载体pET-32a(+)-Trx-cZOT
第一步，cZ0T DNA序列的扩增上坊,弓l物 cgggtaccga cgacgacgac aaggagcctc agtc 下游引物 ggaattctca aaatatacta tttagtcctt ttttatc 通过热变性法从霍乱弧菌口服疫苗中提取基因组DNA，以该基因组DNA为模
板，加入Pyrobest DNA聚合酶和上下游引物，进行PCR扩增，反应产物用DNA Gel
Extraction Kit回收，获得cZOT DNA片段； 第二步，含有cZOT基因的工程菌构建
用Kpn I和EcoR I双酶切cZOT ，纯化回收大片段；用同样的两种酶双酶切
质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段；连接上述回收的两个片段，得到重组质粒
pET-32a(+) - cZ0T，将重组质粒pET-32a(+)-cZOT转化到大肠杆菌Rosetta gami
(DE3),制得含cZOT DNA序列的基因工程菌，测序证实该基因工程菌含完整的重
组cZOT DNA基因片段；
下面是重组质粒pET-32a(+)-cZOT的测序结果 Query 67
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实施例2 cZ0T的基因工程制备方法，即用所述的基因工程菌生产cZOT。 下述的亲和层析介质为NTA-0树脂，购自Novagen公司，下述的肠激酶(EK)， 购自上海新生源生物医药有限公司。
第一步液体培养
将实施例1中构建好的基因工程菌接种于20ml含氨节青霉素(100u g/ml)、 卡那霉素(15yg/ml)、四环素(12. 5ng/ml)、氯霉素(34wg/ml)中任意l-4 种抗生素的LB液体培养基中，37°C ， 210rpm，培养至0D600nm=l. (Tl. 2。按照5% 体积将上述菌液接种于400ml LB培养基中，培养至OD600nm=0. 6 1. 0。加终浓 度为0. 6mM~l. 0 raM的IPTG诱导表达4 h 8h。将摇瓶冰浴5min, 7000rpm， 4°C， 离心5min收集菌体。加20mlIDA-0 Buffer重悬菌体，同时加入终浓度为lmM的 PMSF。超声波破碎菌体，离心收集上清，SDS-PAGE证实cZOT在大肠杆菌中为可 溶性表达。
第二步纯化TrxA-cZOT
上清用亲和层析柱SNBC 3S NTA Resin分离纯化得融合蛋白TrxA-cZOT 。 用5倍NTA体积的IDA-0 Buffer平衡NTA Resin。将样品加到NTA Resin中， 分别用2倍NTA体积的IDA-0， IDA-20， IDA-40， IDA-60, IDA-80， IDA-100，IDA-200， IDA-500，5倍NTA体积的IDA-1000 Buffer洗脱，分别收集穿透部 分和各洗脱部分的洗脱液，用SDS-PAGE分析蛋白质洗脱情况。经SDS-PAGE分析 含有融合蛋白的TrxA-cZOT组分的洗脱液，用截流分子量为5KD的超滤管脱盐浓 缩，得到的TrxA-cZOT融合蛋白具有较高的纯度。 第三步制备cZOT
融合蛋白TrxA-cZOT用EK蛋白酶酶切。按照每微升EK可以切开150 u g融 合蛋白的剂量，23TT25。C酶切16 h 18 h，，得到了 TrxA和cZOT两条条带。 酶切产物用亲和层析柱SNBC 3S NTA Resin分离。收集穿透峰和IDA-0的洗 脱峰。经SDS- PAGE分析含有cZOT的洗脱液，用5KD的超滤管脱盐浓缩，，得到 的cZOT具有较高的纯度。
实施例3 cZOT在胰高血糖素样肽-1 (GLP-1) 口服给药中的应用
实验材料与方法
雌性健康昆明小鼠(清洁级，上海复旦大学医学院动物中心提供)；
50%葡萄糖溶液，0. 9。/。NaCl溶液，GLP-1， TrxA-cZOT， cZOT; 血糖测试仪(上海新立医疗器械有限公司)；
雌性健康昆明小鼠禁食过夜，分为4组(n=8)。 1，生理盐水对照组；2， GLP-l 口服对照组；3， TrxA-cZOT十GLP-1给药组；4， cZOT+ GLP-1给药组。
TrxA-cZOT+ GLP-1给药组灌胃给予200 w 1 50%葡萄糖溶液、800nmol/kg TrxA-cZOT和500咖ol/kgGLP-l，记此时为零时刻。分别于30、 60、 90、 120分 钟进行小鼠尾静脉取血lOul,用血糖测试仪测定血糖浓度。cZOT+ GLP-l给药 组灌胃给予相同剂量的葡萄糖、cZOT和GLP-1;生理盐水对照组只灌胃葡萄糖和 生理盐水；GLP-1对照组只灌胃葡萄糖和GLP-1，按照相同时间间隔测定血糖。
与对照组相比，在给药后30 120分钟，给药组都能够降低小鼠血糖，说明 按本发明方法制备出的TrxA-cZOT、cZOT具有促进GLP-1 口服吸收的生物学活性。
实施例4 cZOT在胰岛素(Insulin)降血糖实验中的应用
采用雌性健康昆明鼠，注射200mg/kg四氧嘧啶建立糖尿病模型，7天后禁 食12h，血糖Ml. lmmol/1者，确认为成模鼠。按照实施例3将模型鼠分为4组 1,生理盐水对照组；2，胰岛素口服对照组；3， TrxA-cZOT+胰岛素(Ins)给药 组；4， cZOT+胰岛素(Ins)给药组。TrxA-cZ0T+Ins给药组灌胃给予600nmol/kg TrxA-cZ0T和600nmol/kg Ins， 分别于30、 60、 90、 120分钟进行小鼠尾静脉取血10iU，用血糖测试仪测定血 糖浓度。cZOT+Ins给药组灌胃给予相同剂量的cZOT和Ins;生理盐水对照组只 灌胃生理盐水；Ins对照组只灌胃Ins，按照相同时间间隔测定血糖。
与对照组相比，在给药后90分钟内，给药组都能够降低小鼠血糖，说明按 本发明方法制备出的TrxA-cZOT、 cZOT具有促进Ins 口服吸收的生物学活性。
实施例5 cZOT在血小板生成素(TPO)促进血小板生成实验中的应用
采用雄性健康昆明鼠，尾静脉取血5y 1，置于195 ix 1血小板计数液中稀释， 37。C孵育30min，相差显微镜下计数血小板个数，以此为基础值分为2组1， TPO 口服对照组；2， cZOT+TPO给药组。给药组第1 5天每天灌胃700nmol/kg cZOT 和5mg/kgTP0—次；TPO对照组灌胃5呢/kg TPO，其他同给药组。分别于第3、 4、 5、 7、 9天进行血小板计数。
连续给药3天起，与对照组相比，给药组能够促进小鼠血小板的生成，说明 按本发明方法制备出的cZOT具有促进TPO 口服吸收的生物学活性。序列表副本
SEQUENCE LISTING
<110>华东师范大学
<120> —种缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方式及应用
<130> Zonula occludens toxin structure-function analysis.
Identification of the fragment biologically active on tight junctions and of the zonulin receptor binding domain.
<140> 2008100351981 <141> 2008-03-26
<腸 1
<170> Patentln version 3.2
〈210〉 1
<211> 408
〈212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 1
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权利要求
1. 一种缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方法，其特征在于包括以下几个步骤第一步构建含cZOT基因的大肠杆菌(E.coli)基因工程菌采用下列上游引物和下游引物克隆cZOT基因上游引物 cgggtaccga cgacgacgac aaggagcctc agtc下游引物 ggaattctca aaatatacta tttagtcctt ttttatcPCR得到该片断；用限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切该片断，得到cZOT基因；用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段，连接上述两种基因片段，得到重组质粒pET-32a(+)-cZOT；第二步构建高效表达cZOT的基因工程菌将重组质粒pET-32a(+)-cZOT转化到大肠杆菌Rosetta gami(DE3)感受态细胞中，在含有抗生素的LB固体培养基上培养16-20h，挑取阳性转化子，获得高效表达cZOT的基因工程菌；第三步制备获得TrxA-cZOT融合蛋白将筛选出的高产菌株在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.6～0.8时，加入终浓度为0.6mM～1.0mM的IPTG诱导表达4～8小时，生产和积累可溶性表达的TrxA-cZOT融合蛋白；离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破碎仪破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集TrxA-cZOT融合蛋白组分；第四步制备获得cZOT用肠激酶(EK)酶解TrxA-cZOT融合蛋白，23℃～25℃下裂解16～18h，冰浴5min，终止反应，再次进行亲和层析，收集穿透峰，冷冻干燥，得到cZOT。
2. 如权利要求1所述的缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方法，其特征在 于抗生素的LB固体培养基为氨苄青霉素(100ug/ml)、卡那霉素(15iig/ml)、四环素(12.5ug/ml)、氯霉素(34yg/ml)中任意1种或者一种以上。
3、 根据权利要求1制备的cZOT蛋白在制备胰高血糖素样肽-l(GLP-l)口服 给药中的应用。
4、 根据权利要求1制备的cZOT蛋白在制备cZOT蛋白在胰岛素(insulin,Ins) 口服给药中的应用。
5、 根据权利要求l制备的cZOT蛋白在制备cZOT蛋白在血小板生成素(TPO) 口服给药中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方法和应用，属于生物工程技术领域。首先，构建含cZOT基因的大肠杆菌(E.coli)基因工程菌，接着构建高效表达cZOT的基因工程菌，制备获得TrxA-cZOT融合蛋白，纯化得cZOT。本发明与已有技术相比较提高了cZOT的表达量，降低了生产成本；只要进行一次亲和层析，便可从发酵液中得到较纯的TrxA-cZOT融合蛋白，纯化步骤简单，得率高。
文档编号C12N15/31GK101440369SQ200810035198
公开日2009年5月27日 申请日期2008年3月26日 优先权日2008年3月26日
发明者吴叶林, 吴自荣, 张绪英, 静 李, 娟 顾, 马骁骏, 静 黄 申请人:华东师范大学