神经轴突导向因子在制备促进角膜损伤修复制品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种神经轴突导向因子在制备促进角膜损伤修复制品中的应用，即利用神经轴突导向因子来制备抑制角膜上皮损伤后炎症反应及促进角膜上皮修复的药物或制备，本发明发现Netrin1不仅能促进角膜缘干细胞增殖和迁移能力，还能抑制正常小鼠和糖尿病小鼠角膜上皮损伤后的炎症反应，促进正常小鼠和糖尿病小鼠的角膜上皮的损伤修复，可用于眼表角膜和结膜上皮干细胞的培养、糖尿病角膜病变的治疗、神经性角膜炎的治疗。
【专利说明】神经轴突导向因子在制备促进角膜损伤修复制品中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于眼科疾病治疗药品制备【技术领域】，具体涉及一种神经轴突导向因子在制备促进角膜损伤修复制品中的应用，即神经轴突导向因子在治疗糖尿病角膜病变、神经营养性角膜炎等影响角膜修复疾病中的应用。
【背景技术】
[0002]角膜的透明及功能的完整取决于角膜各层组织的结构和代谢的正常，而位于最外层的角膜上皮组织无疑对此起着相当重要的作用。角膜上皮是防御外界致病因子侵犯的物理屏障，其完整性维持依赖于上皮细胞的细胞间，细胞与基底膜之间的紧密连接和锚定连接以及上皮细胞的不断自我更新。
[0003]角膜上皮层受损可影响细胞间的连接，引起细胞膜的通透性和选择性发生变化，从而影响其屏障功能，导致角膜易受外界致病因子的侵害引起炎症导致角膜混浊，甚至引起失明。角膜损伤后的再上皮化是损伤修复的一个最基本的过程，上皮化可以迅速重建上皮屏障，这对于保持角膜的结构完整及正常功能非常重要。各种物理损伤、化学损伤、机械损伤、病原微生物、内分泌及免疫性因素均可导致角膜上皮损伤。如糖尿病性角膜病变，有研究表明:47%-64%的糖尿病患者可能会出现原发性角膜病变，其临床特征主要表现为角膜敏感度下降、上皮愈合延迟、神经营养性角膜溃疡等症状。糖尿病患者在进行白内障或视网膜手术后可能出现角膜上皮再生延迟，甚至出现反复剥脱现象。
[0004]角膜上皮损伤后的愈合过程非常复杂，有许多因素参与调节:①源于基底细胞及角膜缘干细胞的不断增殖、分化的上皮细胞的自我更新对上皮细胞损伤后的迅速再上皮化、重建上皮屏障，从而保持角膜的结构完整及正常功能非常重要；②在角膜上皮愈合过程中，由细胞表达的不同的细胞外基质分子及细胞表面受体，对由细胞骨架介导的细胞粘附和运动方面起关键性作用；③许多生长因子如EGF、KGF、HGF、TGF、PDGF等)通过自分泌或/和旁分泌途径参与调节角膜上皮细胞的增殖及迁移，维持角膜结构和功能的正常位于细胞表面的细胞粘附分子(如整合素)以受体-配体的形式发挥作用，在角膜创伤愈合中起重要作用；⑤另外，其他一些因素如神经性因素等也参与调节角膜上皮细胞的屏障功能及创伤愈合。
[0005]不论何种原因引起的角膜上皮缺损，能否迅速完整地修复，是恢复角膜上皮细胞的屏障功能、促进创伤愈合、保持良好视力的关键。因此全面了解角膜上皮细胞屏障功能及创伤愈合的调节因素，对临床上治疗角膜上皮细胞屏障功能障碍及促进创伤愈合来讲是非常重要的。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种神经轴突导向因子在制备促进角膜损伤修复制品中的应用，即利用神经轴突导向因子来制备抑制角膜上皮损伤后炎症反应及促进角膜上皮修复的药物或制备，从而弥补现有技术的不足。
[0007]发明人发现，在小鼠角膜上皮细胞系TKE2的培养基KSFM中添加一定剂量的神经轴突导向因子Netrinl (例如10_20ng/ml)能够有效地促进角膜缘干细胞增殖。在TKE2细胞高糖诱导模型中，培养基中添加一定剂量的Netrinl (例如10-100ng/ml)能够有效地促进角膜缘干细胞迁移。同时，在正常C57小鼠和STZ诱导的糖尿病小鼠中，建立角膜上皮刮除损伤模型后，结膜下注射一定剂量的Netrinl (例如50ng)，能够有效地促进角膜上皮损伤修复，抑制炎症反应；从而促成了本发明。
[0008]本发明首先提供Netrinl的一种新的用途，即在制备用于促进角膜上皮损伤修复制品或抑制角I吴炎症反应制品中的应用。
[0009]所述的制品为滴眼液，其中包含有药理有效浓度的神经轴突导向因子；
[0010]所述的制品还可以是注射液；
[0011]其中药理有效浓度，为10-100ng/ml,优选50ng/ml ；
[0012]所述的神经轴突导向因子，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1;
[0013]为了提高神经轴突导向因子在治疗角膜上皮损伤后炎症和促进角膜上皮损伤修复中的效果，发明人对神经轴突因子的氨基酸序列进行了改造，改造后的氨基酸序列为SEQID NO:2;
[0014]本发明发现Netrinl不仅能促进角膜缘干细胞增殖和迁移能力，还能抑制正常小鼠和糖尿病小鼠角膜上皮损伤后的炎症反应，促进正常小鼠和糖尿病小鼠的角膜上皮的损伤修复，可用于眼表角膜和结膜上皮干细胞的培养、糖尿病角膜病变的治疗、神经性角膜炎的治疗。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1:在TKE2的培养基中添加不同浓度的Netrinl对细胞克隆增殖能力的影响，培养液中添加10ng/ml的Netrinl即能有效促进TKE2细胞克隆的增殖。
[0016]图2:在TKE2高糖环境下损伤模型的培养基中添加不同浓度的Netrinl对细胞迁移能力的影响，培养液中添加50ng/ml或100ng/ml的Netrinl能有效促进TKE2细胞的迁移能力。
[0017]图3:Netrinl对正常小鼠角膜上皮损伤修复的影响，结膜下注射50ngNetrinl能有效促进角膜上皮的损伤修复。
[0018]图4 =Netrinl对STZ诱导的糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复的影响，结膜下注射50ng Netrinl能有效促进糖尿病小鼠角膜上皮的损伤修复。
[0019]图5 =Netrinl对正常小鼠和STZ诱导糖尿病小鼠角膜损伤炎症反应的影响，结膜下注射50ng Netrinl能有效减少小鼠损伤的角膜上皮中炎症细胞的浸润。
【具体实施方式】
[0020]神经轴突导向因子(Netrinl)属于Netrin家族成员，是最早发现的可溶性神经突起导向因子。Netrinl是对突变线虫缺陷UNC-6基因进行基因分析而被发现，并命名为轴突导向因子，现称神经轴突导向因子。Netrinl是一种高度保守的细胞分泌型可溶性蛋白，分子量约70~80kD，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。目前Netrinl只是用于急性肾损伤模型中能调控肾小管上皮炎症和细胞凋亡；细胞迁移、肿瘤细胞生存能力、胚胎细胞的发育中得到了应用。
[0021]下面结合实施例对本发明进行详细的描述:
[0022]实施例1:添加不同浓度Netrinl对TKE2细胞增殖和迁移能力的影响
[0023]1.应用 KSFM (Keratinocyte-SFM 加 BPE(50yg/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)培养液常规培养TKE2细胞，将4X 14个细胞接种至60mm培养皿中，分别向各皿中添加不同浓度的Netrinl (0、5、10和20ng/ml)，然后于5%C02和37°C的条件下培养，每3天更换新培养基，同时添加上述浓度的Netrinl因子，培养6天后利用细胞计数器进行细胞计数，细胞数量统计见图1。如图1所示，未添加Netrinl培养的TKE2细胞数量为2.7X 105，而添加10和20ng/ml Netrinl培养液培养的TKE2细胞数分别为4.4X 105、
4.7 X 105，较空白对照培养的TKE2细胞数量增加了 1.5_2倍(*P〈0.01)。由此，证明了添加10-20ng/ml的Netrinl能有效促进TKE2细胞的增殖。
[0024]2.应用 KSFM (Keratinocyte-SFM 加 BPE(50yg/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)培养液常规培养TKE2细胞，将I X 15个细胞接种至六孔板中，选择一孔作为对照，一孔加入lmol/L的甘露醇25 μ 1/ml,其余4个孔分别加入lmol/L的葡萄糖25μ 1/ml，然后于5%C02和37°C的条件下培养，2天后在六孔板内行细胞划痕试验，显微镜1x照相后向添加葡萄糖的孔内加入Netrinl (O, 10, 50, 100ng/ml), 24h后显微镜照相,观察划痕部位TKE2细胞向中央迁移的情况见图2。如图2所示，对照组TKE2细胞划痕24h后细胞迁移面积约占划痕缺损面积60%，而添加lmol/L葡萄糖组的细胞迁移面积约占20%，可见高糖环境能有效抑制TKE2细胞的迁移；而分别添加10ng/ml、50ng/ml和100ng/ml Netrinl培养的TKE2细胞迁移面积分别约为50%、70%和60%，由此可见Netrinl能有效逆转高浓度葡萄糖对细胞迁移的抑制作用，促进TKE2细胞迁移。
[0025]实施例2:外源性添加Netrinl对角膜上皮损伤修复的影响
[0026]1.Netrinl对正常小鼠角膜上皮损伤修复的影响。
[0027]将12只C57BL/6小鼠(6_8周龄)随机分为对照组和实验组，使用3mm环钻和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm区域内的上皮，同时对照组小鼠右眼结膜下注射7μ I PBS，实验组小鼠右眼结膜下注射50ng Netrinl (溶解于7 μ I PBS)，于建模后0、24、48和72h分别使用荧光素钠染色及裂隙灯下照相，观察各组小鼠的上皮损伤修复的情况，代表性裂隙灯观察照片见图3。如图3所示，结膜下注射PBS的正常小鼠24h、48h和72h的上皮缺损率分别为0.83,0.65和0.32 ;结膜下注射50ng Netrinl的正常小鼠24h、48h和72h的上皮缺损率分别为0.83,0.54和0.16。由此可见，Netrinl能有效促进小鼠角膜上皮的损伤修复。
[0028]2.Netrinl对STZ诱导的糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复的影响
[0029] 将12只STZ诱导的C57BL/6糖尿病小鼠随机分为对照组和实验组，使用3mm环钻和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm区域内的上皮，同时对照组小鼠右眼结膜下注射7 μ I PBS,实验组小鼠右眼结膜下注射50ngNetrinl (溶解于7 μ I PBS)，于建模后0、24、48和72h分别使用荧光素钠染色及裂隙灯下照相，观察各组小鼠的上皮损伤修复的情况，代表性裂隙灯观察照片见图4。如图4所示，结膜下注射PBS的糖尿病小鼠24h、48h和72h的上皮缺损率分别为0.83,0.70和0.46 ;结膜下注射50ng Netrinl的糖尿病小鼠24h、48h和72h的上皮缺损率分别为0.74,0.33和0.07。由此可见，Netrinl能有效促进糖尿病小鼠角膜上皮的损伤修复。
[0030]3.Netrinl对正常及STZ诱导的糖尿病小鼠角膜上皮损伤后炎症反应的影响
[0031]取正常与STZ诱导的C57BL/6糖尿病小鼠经上述处理后48h与72h的小鼠眼球，置于OCT中制作冰冻样本。用冰冻切片机制作8 μ m厚度冰冻切片，通过免疫荧光方法检测Netrinl对中性粒细胞标记(Ly6G)的影响。如图5所示,Netrinl能明显减少正常及STZ诱导的C57BL/6糖尿病小鼠角膜上皮损伤部位中性粒细胞的浸润，抑制角膜上皮损伤后的炎症反应。
[0032]实施例3 =Netrinl的性状改造
[0033]为了提高神经轴突导向因子在治疗角膜上皮损伤后炎症和促进角膜上皮损伤修复中的效果，对神经轴突导向因子Netrinl的氨基酸序列进行了改造，即对Netrinl第O~21位氨基酸进行剪切，保留自22~604位氨基酸。获得Netrinl的改造体HumanNetrinl (Val22Ala604)，其氨基酸序列为 SEQ IDN0:2。
[0034]具体改造步骤如下:
[0035]以人NetrinlcDNA为模板，通过PCR扩增Netrinl全长蛋白序列中第22-604位(Netrinl-截短)共583个氨基酸的编码序列，Netrinl-截短引物序列为AGACACGAATTCGTGCGCGGCGGGCCCGGGCTCA、AGACTCGAGGGCCTTCTTGCACTTGCC,在引物序列的两端分别为人工引入的EcoR I和Xho I酶切位点。用EcoRI和XhoI分别双酶切空载体pGEX_4T_l和PCR扩增产物，将Netrinl-截短以正确读框与pGEX_4T_l载体连接，获得GST与Netrinl-截短融合蛋白表达质粒PGEX-Netrinl-截短。获得的重组表达载体分别应用酶切和测序的方法进行鉴定，结果显示酶切片段的大小正确，并且测序结果显示与参考序列完全相符，根据测序结果和读码框位置可知，翻译后的氨基酸序列为SEQ ID NO:2;
[0036]将构建的GST融合蛋白表达质粒转化到大肠杆菌BL-21中，挑取单克隆菌株接种到3ml LB培养液中，37°C、250rpm振荡过夜；再按3%。接种量转接，37°C培养至菌液A值达到0.6~0.8后，加入IPTG至终浓度为500 mol/L，继续振荡培养2h ;然后4°C、3000rpm离心30min收集菌体，按40: I的比例加入细菌裂解液重悬菌体，超声破碎细菌，离心收集上清液；应用Glutath1ne Sepharose4B纯化柱(购自AmershamB1sciences公司)纯化GST-Netrinl-截短融合蛋白；将GST-Netrinl-截短融合蛋白用Thrombin凝血酶切掉之后，再过一次纯化柱，收集穿透液了，然后通过透析和冻干，得到Netrinl-截短蛋白，然后使用PBS缓冲液重新溶解为100ng/ul的储液，冻存于_80°C备用。并验证改造后的Netrinl(Netrinl-截短蛋白)在治疗角膜缘干细胞增殖和促进角膜上皮损伤修复中的效果。
[0037]一、Netrinl-截短蛋白对TKE2细胞的影响
[0038]1.应用 TKE2 细胞的培养液(Keratinocyte-SFM 加 BPE (50 μ g/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)常规培养TKE2细胞，将4X 14个细胞接种至60mm培养皿中，分别向两皿中添加Netrinl (10ng/ml)和Netrinl-截短(10ng/ml)，然后于5%C02和37°C的条件下培养，每3天更换新培养基，同时添加上述浓度的Netrinl和Netrinl-截短因子，培养6天后利用细胞计数器进行细胞计数，细胞数量统计显示，添加10和20ng/ml Netrinl培养液培养的TKE2细胞数分别为4.5X105、4.7X105，而添加10和20ng/mlNetrinl_截短培养液培养的TKE2细胞数分别为5.6X 105、6.8X 105，较空白对照培养的TKE2细胞数量增加了1-1.5倍(*P〈0.05)。由此可见，与添加Netrinl因子相比，添加Netrinl-截短因子能更有效地促进TKE2细胞的增殖。
[0039]2.应用 KSFM (Keratinocyte-SFM 加 BPE(50yg/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBCO, 10724-011)培养液常规培养TKE2细胞，将I X 15个细胞接种至六孔板中，每个孔都加入lmol/L的葡萄糖25μ 1/ml，然后于5%C02和37°C的条件下培养，2天后行细胞划痕试验，显微镜1x照相后向孔内分别加入Netrinl (10, 50, 100ng/ml)和Netrinl-截短因子(10，50，100ng/ml),24h后显微镜照相，观察划痕部位TKE2细胞向中央迁移的情况。添加Netrinl的TKE2细胞划痕24h后细胞迁移面积分别约占划痕缺损面积50%、70%和60%，而添加Netrinl-截短因子的TKE2细胞划痕24h后细胞迁移面积分别约占划痕缺损面积60%、85%和60%。由此可见Netrinl-截短因子促进TKE2细胞迁移的作用更明显。
[0040]二:外源性添加NETRIN1对角膜上皮损伤修复的影响
[0041]1.Netrinl对正常小鼠角膜上皮损伤修复的影响
[0042]将12只C57BL/6小鼠(6_8周龄)随机分为对照组和实验组，使用3mm环钻和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm区域内的上皮，同时对照组小鼠右眼结膜下注射50ngNetrinl (溶解于7ul PBS),实验组小鼠右眼结膜下注射50ng Netrinl-截短(溶解于7ulPBS)，于建模后0、24、48和72h分别使用荧光素钠染色及裂隙灯下照相，观察各组小鼠的上皮损伤修复的情况，结膜下注射50ng Netrinl的正常小鼠24h、48h和72h的上皮缺损率分别为0.83,0.53和0.17 ;结膜下注射50ng Netrinl-截短因子的正常小鼠24h、48h和72h的上皮缺损率分别为0.76,0.33和0.08。结果表明结膜下注射50ngNetrinl_截短因子能更有效的促进角膜上皮的损伤修复。
[0043]2.Netrinl对STZ诱导的糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复的影响
[0044]将12只STZ诱导的C57BL/6糖尿病小鼠随机分为对照组和实验组，使用3mm环钻和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm区域内的上皮，同时对照组小鼠右眼结膜下注射50ng Netrinl (溶解于7ul PBS),实验组小鼠右眼结膜下注射50ng Netrinl-截短(溶解于7ul PBS)，于建模后0、24、48和72h分别使用荧光素钠染色及裂隙灯下照相，观察各组小鼠的上皮损伤修复的情况，结膜下注射50ng Netrinl的糖尿病小鼠24h、48h和72h的上皮缺损率分别为0.75,0.32和0.07 ;结膜下注射50ng Netrinl-截短因子的糖尿病小鼠24h、48h和72h的上皮缺损率分别为0.68,0.26和0.04。结果表明结膜下注射50ng Netrinl-截短因子能更有效的促进糖尿病小鼠角膜上皮的损伤修复。
【权利要求】
1.一种神经轴突导向因子的用途，其特征在于，是在制备用于促进角膜上皮损伤修复制品或抑制角I吴炎症反应制品中的应用。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的神经轴突导向因子，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的神经轴突导向因子的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的制品为包含有药理有效浓度的神经轴突导向因子的滴眼液或注射液。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述的药理有效浓度为10-100ng/ml。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述的药理有效浓度为50ng/ml。
7.一种用于促进角膜上皮损伤修复的制品，其特征在于，所述的制品为包含有药理有效浓度的神经轴突导向 因子的药物。
【文档编号】A61K38/19GK104043109SQ201410086629
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年3月5日 优先权日:2014年3月5日
【发明者】周庆军, 张阳阳, 谢立信, 陈鹏, 高华 申请人:山东省眼科研究所