一种多西紫杉醇的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种多西紫杉醇的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途，多西紫杉醇的核酸适配体序列包括序列1或序列2所示的DNA片段。该核酸适配体可以是各种同源性较高的类似序列或由本发明序列得到的衍生物。本发明的核酸适配体及其衍生物可用作药物载体、或者用于药物设计与开发、药物分离与纯化、制备药物及其他制品、制备多西紫杉醇检测探针或靶点探针等，具有能够与多西紫杉醇高特异性和高亲和力结合、无免疫原性、能够化学合成、生物相容性好、分子量小、稳定、易于保存等优点。
【专利说明】一种多西紫杉醇的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途，具体涉及一种可结合多西紫杉醇的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途。
【背景技术】
[0002]多西紫杉醇(Docetaxel)属于紫杉烷类抗肿瘤药，主要干扰细胞有丝分裂及分裂期间所需的微管网络，起到抗肿瘤效果，其不良反应主要表现为过敏反应，血小板减少，心动过速，低血压，神经毒性反应，胃肠道反应以及皮肤毒性反应等。多西紫杉醇水溶性小，市售药物泰索帝采用吐温-80增溶，乙醇助溶，会引发过敏反应、溶血反应等副作用，在临床应用中存在潜在风险，因此，如何降低泰索帝副作用、提闻临床疗效已成为亟待解决的问题。另外，由于多西紫杉醇的结构特性，使其摩尔吸光系数较低，难以运用简单的低成本光谱方法进行高灵敏的微量定量分析。
[0003]核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体的系统进化技术(SELEX)筛选得到的，能特异结合祀物质的单链寡聚核苷酸(ssDNA或ssRNA)。核酸适配体与抗体功能类似，但是与抗体相比具有更多的优势，如具有更高的亲和力与特异性，无免疫原性，能够化学合成，成本低，可进行标记，稳定性好，易于保存等优点。核酸适配体的靶分子更为广泛，包括金属离子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白质等，并能从单一靶标扩展至完整的病毒颗粒及细胞等复合物靶标。
[0004]但是，目前尚未发现与多西紫杉醇具有高亲和力且低成本的核酸适配体。如果获得一种多西紫杉醇核酸适配体，将有望提供一种新的研究多西紫杉醇的手段以及拓展多西紫杉醇的应用范围。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够与多西紫杉醇高特异性和高亲和力结合、无免疫原性、能够化学合成、生物相容性好、分子量小、稳定、易于保存的多西紫杉醇的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种多西紫杉醇的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下序列I或序列2所示的DNA片段:
[0007]序列1:
[0008]5’ -TTCCAAACGTCCACCGCCAAAA-3’ ；
[0009]序列2 (即序列I的反向序列):
[0010]5，-AAAACCGCCACCTGCAAACCTT-3，。
[0011]上述的核酸适 配体中，所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
[0012]上述的核酸适配体中，所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质(如FITC等)、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、酶或叶酸标记(甚至连接上放射性和治疗性物质等)。
[0013]以上不论是经部分取代还是经过修饰后的核苷酸序列，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可用于与多西紫杉醇特异性的结合。
[0014]作为一个总的技术构思，本发明提供一种多西紫杉醇的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种:
[0015](I)与上述所列核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60%以上(例如可将上述核酸适配体序列删除或增加部分互补的核苷酸);
[0016](2)与上述所列核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；
[0017](3)上述所列核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。
[0018] 作为一个总的技术构思，本发明还提供一种多西紫杉醇的核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物是上述所列核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是上述所列核酸适配体改造成的相应锁核酸或肽核酸。
[0019]以上不论是衍生出的核酸适配体还是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构性质和功能，即都可用于与多西紫杉醇特异性结合。
[0020]作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的核酸适配体或者上述的核酸适配体衍生物在用于药物载体中的用途。
[0021]作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的核酸适配体或者上述的核酸适配体衍生物在药物设计与开发中的用途。
[0022]作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的核酸适配体或者上述的核酸适配体衍生物在药物分离与纯化中的用途。
[0023]作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的核酸适配体或者上述的核酸适配体衍生物在制备药物及其他制品中的用途。
[0024]作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的核酸适配体或者上述的核酸适配体衍生物在制备多西紫杉醇检测探针中的用途。
[0025]作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的核酸适配体或者上述的核酸适配体衍生物在制备多西紫杉醇靶点探针中的用途。
[0026]与现有技术相比，本发明的优点在于:
[0027](I)本发明的核酸适配体可以高亲和力、高特异性地结合多西紫杉醇，具有稳定性好、无毒性、易于修饰、且序列长度较短等优点，有利于大规模工业化生产及应用。本发明的核酸适配体还具有亲水特性，与难溶于水的药物多西紫杉醇结合后，可提高多西紫杉醇在水中的溶解度，有望在不使用其他助溶剂(如乙醇等)、增溶剂(如吐温等)的情况下，达到临床应用治疗的目的。
[0028](2)本发明的核酸适配体具有易修饰特性，可以通过修饰信号物质，将多西紫杉醇的紫外吸收信号转化为其他信号(如荧光等)，从而实现多西紫杉醇的高灵敏检测。
[0029](3)本发明利用核酸适配体与多西紫杉醇的结合特性，有望提高多西紫杉醇的稳定性、安全性和溶解度，延长药效，减少多西紫杉醇与其他血液内源性物质的结合。选择本发明的核酸适配体为药物载体结合多西紫杉醇，能够保护药物免受环境影响，可获得适宜的释药速度，起到作用和缓而持久的药效，并且能够避免因吐温及酒精引起的药物不良反应。同时，对本发明的核酸适配体进行标记与修饰有利于多西紫杉醇的体内示踪及新药物的开发等。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为本发明实施例中优化探针的亲和力考察结果。
[0031]图2为本发明实施例中核酸适配体与多西紫杉醇结合的质谱图。
[0032]图3为本发明实施例中核酸适配体与多西紫杉醇结合的圆二色谱图。
【具体实施方式】
[0033]以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
[0034]实施例:
[0035]一种本发明的多西紫杉醇的核酸适配体，该核酸适配体的核苷酸序列包括以下序列所示的DNA片段，即能够特异性结合多西紫杉醇的特征序列:
[0036]5， -TTCCAAACGTCCACCGCCAAAA-3’
[0037](也可以为5 ’ -AAAACCGCCACCTGCAAACCTT-3 ’ )。
[0038]上述的核酸适配体的核苷酸序列选自天然存在或人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。
[0039]一种多西紫杉醇的核酸适配体序列，该核酸适配体的序列包含有与上述特征序列的核苷酸的全部都相同的序列。
[0040]上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置可被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
[0041]上述核酸适配体的核苷酸序列上可结合生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白或酶标记，或叶酸等肿瘤靶向分子标记。
[0042]上述核酸适配体可衍生出其他的核酸适配体，衍生出的核酸适配体的核苷酸序列可以为以下三种序列中的任意一种:
[0043](1)与本实施例所列核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60%以上(例如可将上述核酸适配体序列删除或增加部分互补的核苷酸);
[0044](2)与本实施例所列核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；
[0045](3)上述本实施例所列核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。
[0046]上述本实施例所列核酸适配体的核苷酸序列的骨架还可衍生出硫代磷酸酯骨架，上述核酸适配体还可改造成相应锁核酸或肽核酸。
[0047]上述本实施例的多西紫杉醇的核酸适配体具有以下用途:(I)在用于药物载体中的用途；(2)在药物设计与开发中的用途；(3)在药物分离与纯化中的用途；(4)在制备药物及其他制品中的用途；(5)在制备多西紫杉醇检测探针中的用途；(6)在制备多西紫杉醇用作靶点探针中的用途。
[0048]本实施例的上述多西紫杉醇为紫杉烷类抗肿瘤药，其化学名称为5β，20_环氧-1，2α，4，7 0，10 0，13 0-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯_2_苯甲酸酯-13-[ (2' R，3' S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯，CAS号为114977-28-5。[0049]上述本实施例的多西紫杉醇的核酸适配体主要利用微流控芯片进行筛选，具体筛选过程包括以下步骤:
[0050](a)优化核酸文库:其中DNA文库的结构分为五部分:中间是一段26个碱基的固定序列，用于和固定探针(BDNA)互补杂交；固定序列的两侧是两条DNA手臂，均包括18个喊基的随机序列和19个喊基的PCR扩增所必须的序列。固定探针是一端标有生物素的与文库固定序列互补的DNA链，用于文库的固定。
[0051]随机文库RS36:
[0052]5，-CCGCTTCGCCGTCTCCTAC-NNNNNNNNNNNNNNNNNN-AAAAGTGGGTAGGGCGGGTTGGAAAA-NNNNNNNNNNNNNNNNNN-CGCTCGTCACCCTTCTCCT-3’(注:N 代表 A、T、G、C 中任一碱基)；
[0053]5，引物:5，-FAM-CCGCTTCGCCGTCTCCTAC-3，；
[0054]3’ 引物:5，-Biotin-AGGAGAAGGGTGACGAGCG-3，；
[0055]固定探针:5’-Biotin-TACCGCAAAAAAAAACCAACCCGCCCTACCCAC-3’ ；
[0056](b)初筛:将微流控表面依次修饰生物素化的牛血清白蛋白、亲和素、文库。文库预处理方法:将1nmol文库(约1014条DNA链)、1.5nmol BDNA溶于20 μ L的杂交缓冲液(0.5mmol/L 磷酸缓冲液，10.5mmol/L NaCl, 15mmol/L MgCl2, pH6.8)中，95°C变性 lOmin，缓慢冷却至室温，静置3h以上，使文库与BDNA杂交，加入130 μ L的结合缓冲液(IOOmmoI/LNaCl,5mmol/L KCl,2mmol/L MgCl2, lmmo/L CaC12, 20mmol/L Tris-HCl, pH7.6)，备用。文库固定方法:首先在室温下将150 μ L、lmg/mL的生物素化的BSA通过注射泵以I μ L/min的流速通过芯片，然后用0.01mol/L的PBS溶液以5 μ L/min的流速冲洗IOmin ;再以同样的流速通入60 μ LUmg/mL的亲和素，同样用0.01mol/L的PBS溶液以5 μ L/min的流速冲洗IOOmin0将预处理过的150 μ L的DNA文库(即杂交后的DNA文库)以0.5 μ L/min的流速通过修饰过的芯片，用结合缓冲液以5μ L/min的流速冲洗IOmin,则完成了文库在芯片中的固定。然后将目标物多西紫杉醇溶液通入，收集芯片中流出的溶液，得到初筛核酸文库，其中含有DNA与多西紫杉醇的复合物。
[0057](C)纯化:将步骤(b)得到的初筛核酸文库进行PCR扩增，扩增产物(即生物素化的双链DNA)通过链霉亲和素微珠填充的亲和柱进行分离，再通过碱变性解链、脱盐后形成次一级核酸文库。其中，PCR反应扩增条件为:94°C预变性IOmin ;94°C变性45sec，62°C退火30sec，72°C延伸30sec，扩增N(最优轮数)个循环；72°C延伸7min。采用梯度PCR，以初始核酸文库作为模版优化退火温度，最终得到退火温度为62°C。而每轮筛选产物的最优扩增轮数都是经过轮数优化获得的。在轮数优化后，将剩余的文库在相同的条件下扩增。PCR结果均通过3%琼脂糖凝胶电泳进行验证，染料为SYBR Glod0将PCR后文库进行单链制备，用于下一轮的筛选，单链制备方法:取50 μ L链霉亲和素微珠加入到1.5mL EP管中，用0.01mol/L PBS冲洗3次后加入PCR扩增获得的双链产物，25°C震荡孵育30min后离心去上清；继续用0.01mol/L PBS冲洗3次后加入500 μ L200mmol/L的NaOH，25°C震荡孵育IOmin进行单链化处理；离心收集上清中游离的单链DNA ;收集产物通过高效液相色谱进行脱盐处理，干燥浓缩后溶于少量水中，得到次一级核酸文库，用紫外分光光度计进行定量，于-20°C冰箱中保存。
[0058](d)循环:以上述得到的次一级核酸文库替代起始核酸文库并重复上述的步骤
(b)~步骤(C)，每次循环时应当重新在微流控芯片中修饰生物素化的牛血清白蛋白及亲和素，直至得到包含有与多西紫杉醇高亲和力和高特异性结合的核酸适体的核酸文库；
[0059](e)筛选效率评价:采用荧光法测定筛选效率，即筛选过程中DNA的富集情况。检测信号是DNA文库的5’端修饰的荧光染料FAM的荧光值。本实施例将预处理过的DNA文库的荧光值设为H)，将修饰文库时流出的溶液(含有未固定上的文库)的荧光值设为Fl，竞争结合时从芯片中收集到的溶液的荧光值设为F2，则筛选效率计算如下式:筛选效率=F2/(F0-Fl-F2)X100%o根据这个公式监测每一轮的筛选效率，筛选效率越高，说明竞争到溶液中的DNA越多，通过筛选效率的测定可以监测筛选富集情况。当筛选达到平台期时，对文库进行克隆测序。
[0060]多西紫杉醇为小分子药物，初步推断真正与其结合的碱基应不超过三十个。对测序结果进行同源性比对，根据文库设计方案，固定序列与PCR引物序列存在于所有序列中且长度较长，因此对序列两个手臂进行拆分，删去引物部分序列，改变固定序列，采用表面等离子体共振法对核酸适配体与多西紫杉醇的结合效果进行考察。通过表面等离子体共振考察结合能力的方法，从而推测其核心结合序列，并对优化的最优序列进行结合能力的考察。
[0061]考察1:
[0062]优化探针 1:5’ -TTCCAAACGTCCACCGCCAAAAGTGGGTAGGGCGGGTTGGAAAA-3’
[0063]固定探针1:5，-Biotin-TACCGCAAAAAAAAACCAACCCGCCCTACCCAC-3，
[0064]优化探针2:5，-TTCCAAACGTCCACCGCCAAAACCAACCCGCCCTACCCACAAAA-3’
[0065]固定探针2:5’ -Biotin-TACCGCAAAAAAAAAGTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’
[0066]利用表面等离子体共振仪(SPR)对优化探针I及优化探针2与多西紫杉醇的亲和力进行考察，将InM优化探针与1.5nM的固定探针溶于20 μ L的杂交缓冲液中(0.5mmol/L 磷酸缓冲液，10.5mmol/L NaCl, 15mmol/L MgCl2, pH6.8)，95°C变性 lOmin，缓慢冷却至室温，静置3h以上，使文库与BDNA杂交，加入130 μ L的结合缓冲液，4°C保存备用(优化探针I与固定探针I杂交，优化探针2与固定探针2杂交)。具体实验过程如下:
[0067](I)金膜的清洗:首先将金膜浸泡在丙酮中摇晃3min，用超纯水冲洗干净，再用乙醇清洗3min，用超纯水冲洗干净，最后用高纯氮气吹干。
[0068](2)敏感元件的组装:将棱镜用酒精擦拭干净，在棱镜的中央滴一滴松柏油，将金膜安装在棱镜上，再将棱镜、流通池安装到表面等离子体共振仪(SPR)中。
[0069](3)金膜的修饰:首先在流通池中注入结合缓冲溶液(100mmol/L NaCl,5mmol/LKCl,2mmol/L MgCl2，lmmo/L CaC12, 20mmol/L Tris-HCl, pH7.6)，记录其 SPR 光谱，然后加Λ lmg/mL的Biotin-BSA，室温孵育2.5h，用结合缓冲溶液反复冲洗，记录SPR角度；随后加入lmg/mL的亲和素,室温孵育Ih后用结合缓冲溶液反复冲洗,记录SPR角度；最后加入杂交的DNA链，修饰Ih后用结合缓冲溶液反复冲洗，记录SPR角度。
[0070](4)亲和力的测定:将不同浓度的目标物多西紫杉醇(25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、250nmol/L、500nmol/L)分别加入流通池中，与修饰在金膜上的DNA孵育IOmin后，用结合缓冲液冲洗2min，记录SPR角度。如图1所示，以目标物的浓度为横坐标，以不同浓度目标物与DNA结合后引起的SPR角度变化为纵坐标作图，计算优化探针的解离常数(Kd值)，优化探针I的Kd为69±4nM，优化探针2的Kd为41±7nM。优化探针I与优化探针2的固定序列不同，可见固定序列不是与多西紫杉醇结合的核心序列，本发明所提供的序列TTCCAAACGTCCACCGCCAAAA为与多西紫杉醇结合的核心序列，并对此序列做
进一步的的考察。
[0071]考察2:采用电喷雾电离质谱法，对多西紫杉醇与本实施例所提供的序列(5’ -TTCCAAACGTCCACCGCCAAAA-3’ )的混合溶液进行检测。根据原子量表(IUPAC2007standard atomic weights),本发明提供的核酸适配体与多西紫杉醇的复合物分子量为7426.17。通过电喷雾电离质谱法获得的核酸适配体与多西紫杉醇的复合物分子量为7425.7。根据第三方检测报告，电喷雾电离质谱法误差为0.03%。因此，测量误差在方法允许误差范围内，证明本专利提供的核酸适配体与多西紫杉醇能够以高亲和力结合，结果见图2。
[0072]考察3:采用圆二色谱法对核酸适配体(5’ -TTCCAAACGTCCACCGCCAAAA-3’)结构以及核酸适配体与多西紫杉醇结合后的构型变化进行表征。固定核酸适配体的浓度为10 μ Μ，分别加入终浓度为0μΜ、?μΜ、2μΜ、3μΜ、4μΜ的多西紫杉醇溶液。缓冲溶液为IOOmmol/L NaCl,5mmol/L KCl,2mmol/L MgCl2，lmmo/L CaC12,20mmol/L Tris-HCl，0.02%ρΗ7.6。结果见图3，由圆二色谱法实验结果可见，核酸适配体的圆二色谱图在249nm处的负峰随着多西紫杉醇的浓度增高，角度信号增强，并且波峰发生约3nm的蓝移。说明多西紫杉醇使核酸适配体的构型发生变化，以嵌入的方式与本实施例所提供的核酸适配体结合。
[0073]以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下 的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种多西紫杉醇的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下序列I或序列2所示的DNA片段: 序列1:
5’ -TTCCAAACGTCCACCGCCAAAA-3’ ； 序列2:
5’ -AAAACCGCCACCTGCAAACCTT-3’。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
3.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、酶或叶酸标记。
4.一种多西紫杉醇的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种: (O与权利要求1或2或3中所述核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60%以上； (2)与权利要求1或2或3中所述核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列； (3)权利要求1或2或3中所述核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。
5.一种多西紫杉醇的核酸适配体衍生物，其特征在于，所述核酸适配体衍生物是权利要求I或2或3中所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是权利要求1或2或3中所述核酸适配体改造成的相应锁核酸或肽核酸。
6.—种如权利要求1~4中任一项所述的核酸适配体或者如权利要求5所述的核酸适配体衍生物在用于药物载体中的用途。
7.—种如权利要求1~4中任一项所述的核酸适配体或者如权利要求5所述的核酸适配体衍生物在药物设计与开发中的用途。
8.—种如权利要求1~4中任一项所述的核酸适配体或者如权利要求5所述的核酸适配体衍生物在药物分离与纯化中的用途。
9.一种如权利要求1~4中任一项所述的核酸适配体或者如权利要求5所述的核酸适配体衍生物在制备药物及其他制品中的用途。
10.一种如权利要求1~4中任一项所述的核酸适配体或者如权利要求5所述的核酸适配体衍生物在制备多西紫杉醇检测探针、多西紫杉醇靶点探针中的用途。
【文档编号】A61K31/337GK103898119SQ201410110983
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】羊小海, 王柯敏, 陈南迪, 王青, 朱莹 申请人:湖南大学