一种昆仑雪菊原花青素的提取方法及在延缓衰老中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种昆仑雪菊原花青素的提取方法及在延缓衰老中的应用，选用生长在海拔2600米以上的昆仑雪菊花为原料，采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素，采用微射流压力处理2次；提取压力120MPa，提取温度50℃，乙醇浓度70%，提取时间30min；制备的原花青素的总抗氧化活性也比抗坏血酸高，结合果蝇生存实验和体内生化指标测定结果说明原花青素具有延缓果蝇衰老功效；通过小鼠肝损伤实验表明，从昆仑雪菊中提取原花青素可降低血清ALT和AST活性，对CCl4致小鼠肝损伤有一定的保护作用，应用从昆仑雪菊中提取原花青素具有良好的延缓衰老功效，具有广泛的实用价值。
【专利说明】 一种昆仑雪菊原花青素的提取方法及在延缓衰老中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及原花青素的提取制备的【技术领域】。具体的说，本发明涉及一种从昆仑雪菊原花青素的提取方法及其应用的制备【技术领域】。
【背景技术】
[0002]新疆昆仑雪菊,学名为两色金鸡菊{Coreopsis tine tori a)是菊科金鸡菊属一年生草本植物的干燥头状花序.在新疆主要分布于和田地区海拔高3000米左右的昆仑山区，有较丰富的野生资源。长期以来，昆仑雪菊被当地居民当花茶饮用，新疆维吾尔医院也作为一种维药材应用.具有清热解毒、活血化瘀、和胃健脾之功，用花泡茶饮，可治疗燥热烦渴、高血压、心慌、胃肠不适、食欲不振、痢疾及疮疖肿毒，是具有广阔前景和研究价值的新品种。作为药食两用资源，昆仑雪菊在近几年已经成为市场的卖点，已成为人们的高档馈赠礼品。关于昆仑雪菊黄酮研究较多，而对昆仑雪菊原花青素的研究鲜见报道。
[0003]原花青素iProcyemidinsWC)是一种黄烧_3_醇或黄烧_3，4_ 二醇聚合而成的一大类多酚化合物的总称，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。原花青素还具有保护心血管、预防高血压、抗肿瘤、抗辐射、抗突变、美容等，并具有改善人体微循环的功能。原花青素作为植物中一类普遍的次级代谢产物同花色素、生物黄酮等物质一样广泛分布于各种植物的种子、叶子、果实、花和皮、壳等处，目前国内外多从葡萄籽中提取原花青素，其次是从松树皮中提取。而以昆仑雪菊花作为提取原花青素原料，研究其提取方法和含量的文章还未见报道。
[0004]动态超高压微射流(DHPM)是一种特殊形式的高压均质技术，它利用高压使液体物料高速流过狭窄的缝隙时受到强大的剪切力、撞击力以及空穴爆炸力等综合作用，使细胞破碎、促进细胞内容物溢出，从而提高有效成分的提取率的过程。目前已有学者研究了 DHPM在提取和大分子改性方面的应用，如对马铃薯叶中总黄酮提取及活性影响、木瓜蛋白酶活性的影响、脂肪酸脂质体的制备、对胰蛋白酶的活性、稳定性和构象的影响等，但尚无关于将DHPM技术运用于雪菊原花青素提取的相关研究报道。
【发明内容】
[0005]针对现有技术中未见有关将DHPM技术运用于雪菊原花青素提取的研究和报道，本发明需要解决的技术问题就在于克服现有技术的缺陷，旨在提供一种昆仑雪菊原花青素的提取方法及在延缓衰老中的应用，制备的原花青素的总抗氧化活性也比抗坏血酸高，结合果蝇生存实验和体内生化指标测定结果说明原花青素具有延缓果蝇衰老功效，具有广泛的应用价值。
[0006]本发明提供的技术方案:
本发明以生长在海拔2600米以上的昆仑雪菊花为原料，采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素，优化提取工艺，并对提取物进行抗氧化、延缓果蝇衰老作用及对CC14诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用的研究，确定了从昆仑雪菊中提取原花青素在延缓衰老中的应用具有良好的效果；制备的原花青素的总抗氧化活性也比抗坏血酸高，是一种天然的抗氧化剂，结合果蝇生存实验和体内生化指标测定结果说明原花青素具有延缓果蝇衰老功效；通过小鼠肝损伤实验表明，从从昆仑雪菊中提取原花青素可降低血清ALT和AST活性，对CC14致小鼠肝损伤有一定的保护作用，应用从从昆仑雪菊中提取原花青素具有良好的延缓衰老功效，具有广泛的应用价值。
[0007]本发明具体提供一种昆仑雪菊原花青素的提取方法，％按照重量百分比计，具体提取方法步骤如下:
(I)生长在海拔2600米以上的昆仑雪菊花为原料，将烘干后的雪菊粉在粉碎机中粉碎后过40目筛。
[0008](2)用石油醚对雪菊粉脱脂8小时并在50°C烘干2h。
[0009](3)乙醇浸润:料液比按重量比1:40配置的70%乙醇提取液放置于4°C冰箱中静置过夜。
[0010](4)预均质:使用均质压力为30MPa,均质2次。
[0011](5)动态超高压微射流处理:采用一定微射流压力处理2次；提取压力120MPa，提取温度50°C，乙醇浓度70%，提取时间30min。
[0012](6)乙醇回流:以60%乙醇浓度，提取时间2.5 h，提取温度60 °C，回流提取2次，离心并合并滤液,经过旋转蒸发工艺，蒸发温度30°C,转速40rpm。
[0013](7)大孔树脂纯化:AB-8大孔树脂纯化最优条件为原花青素上样浓度为1.06mg/mL、上样pH=6、上样流速为2BV/h，用4倍柱床体积70%的乙醇以流速为2BV/h洗脱；经过旋转蒸发工艺，蒸发温度30°C,转速40rpm ;纯化后昆仑雪菊原花青素的纯度为66.76%。
[0014](8)采用真空冷冻干燥，冷凝温度一 50°C，真空度<20Pa条件下制备获得昆仑雪菊原花青素浓缩粉。
[0015]进一步，本发明通过体外抗氧化实验表明，对于清除羟基自由基，抗坏血酸与原花青素的IC5tl值分别为0.052mg/mL与0.045mg/mL ;对于清除DPPH.自由基，抗坏血酸与原花青素的IC50值分别为0.003mg/mL与0.025mg/mL，表明原花青素的清除羟基自由基与DPPH.自由基活性比抗坏血酸强；昆仑雪菊原花青素与抗坏血酸的总抗氧化能力IC5tl值分别为0.002mg/mL与0.003mg/mL,由此可表明昆仑雪菊原花青素具有良好的抗氧化活性。
[0016]本发明通过果蝇生存实验结果表明，采用本发明采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素添加量达到0.0067%时雌性与雄性的平均寿命均显著高于相应对照组；果蝇体内实验测定表明，原花青素添加量为0.0201%剂量组的SOD活性较对照组显著提高，而MDA含量却显著降低，表明采用本发明提供的动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素具有延缓果蝇衰老的功效。
[0017]本发明通过小鼠肝损伤实验结果表明，采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素可以减轻实验性肝损伤所致炎性反应，降低肝体指数，降低血清中ALT、AST活性(P〈0.05)。由此可得结论，本发明采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素对CC14造成的实验性肝损伤有保护作用，其机制可能与雪菊原花青素抗氧化作用有关。
[0018]本发明提供给了原花青素含量的具体计算方式:
显色剂制备:A液为0.5%香草醛溶液(称取0.500g香草醛溶于甲醇液中，最后定容到10mL) ;B液为4%的盐酸液(取4mL浓盐酸溶于甲醇中，定容至10mL );显色剂:A:B=1:1，现用现配。
[0019]原花青素对照品的制备:精密称取原花青素对照品10.0 mg，放置于1mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得到浓度是1.0mg/mL的原花青素对照品溶液。
[0020]原花青素标准曲线:准确吸取原花青素对照品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、
2.5mL别然后用甲醇定容至10mL。各取ImL分别加入5mL显色剂,摇勻,避光。在30±1°C恒温水浴中保持30min，保温比色。取出比色管，在Amax=500nm波长下，测定其吸光度，绘制标准曲线。根据原花青素浓度与吸光值的数量关系，绘制出标准曲线。得标准回归曲线方程为:A=0.4066C-0.0018, r=0.9996，说明原花青素浓度在0.050?1.250mg/mL之间呈良好的线性关系。
[0021 ]原花青素含量=2.4594A+0.0044
本发明提供给了原花青素提取得率计算方式:
实验数据采用Minitlabl5分析软件进行数据分析，以原花青素提取得率为考察指标原花青素提取得率计算公式:得率/%=[CXVXn/W] X 100%
其中:C为根据标准曲线计算出的浓度mg/mL ^为提取液的体积mL ;11为样品溶液的稀释倍数；W为样品的质量mg。
[0022]本发明采用统计方法利用Minitabl5、SPSS17.0、Excel等软件对实验数据进行分析。
[0023]通过实施本发明具体的
【发明内容】
可以达到以下有益效果:
(I)本发明采用动态超高压微射流辅助提取昆仑雪菊原花青素，并利用正交实验优化提取工艺，同时对昆仑雪菊原花青素的抗氧化性及延缓衰老作用进行了研究，探讨了雪菊原花青素对小鼠CC14肝损伤的保护作用；实验结果表明，动态超高压微射流辅助提取昆仑雪菊原花青素的最佳条件是:微射流压力120MPa，提取温度50°C，乙醇浓度70%，提取时间30min，此条件下原花青素的提取率为22.29%，纯度为25.68 ±0.98%，经AB-8大孔树脂纯化后纯度为66.76±0.34%。体外抗氧化实验表明，对于清除羟基自由基，抗坏血酸与原花青素的IC5tl值分别为0.052mg/mL与0.045mg/mL ;对于清除DPPH.自由基，抗坏血酸与原花青素的IC5tl值分别为0.003mg/mL与0.025mg/mL，表明原花青素的清除羟基自由基与DPPH.自由基活性比抗坏血酸强；昆仑雪菊原花青素与抗坏血酸的总抗氧化能力IC5tl值分别为0.002mg/mL与0.003mg/mL,由此可表明昆仑雪菊原花青素具有良好的抗氧化活性。
[0024](2)本发明通过果蝇生存实验结果表明，采用本发明采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素添加量达到0.0067%时雌性与雄性的平均寿命均显著高于相应对照组；果蝇体内实验测定表明，原花青素添加量为0.0201%剂量组的SOD活性较对照组显著提高，而MDA含量却显著降低，表明采用本发明提供的动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素具有延缓果蝇衰老的功效。
[0025](3)本发明通过小鼠肝损伤实验结果表明，采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素可以减轻实验性肝损伤所致炎性反应，降低肝体指数，降低血清中ALT、AST活性(P〈0.05)。由此可得结论，本发明采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出雪菊原花青素对CC14造成的实验性肝损伤有保护作用，其机制可能与雪菊原花青素抗氧化作用有关。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明提供的活性研究试验路线图。
[0027]图2显示为乙醇浓度对提取得率及DPPH.清除率的影响图。
[0028]图3显示为提取温度对提取得率及DPPH.清除率的影响图。
[0029]图4显示为提取时间对提取得率及DPPH.清除率的影响图。
[0030]图5显示为微射流压力对提取得率及DPPH.清除率的影响图。
[0031]图6显示为原花青素清除羟基自由基活性图。
[0032]图7显示为原花青素清除DPPH.自由基活性图。
[0033]图8显示为原花青素总抗氧化活性图。
【具体实施方式】
[0034]下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例，本发明中基本涉及到的％无特别指明都是重量百分比计。
[0035]试验原料:昆仑雪菊采自新疆和田的昆仑山区，由新疆和田沙漠玫瑰有限责任公司采摘并提供，由新疆医科大学药学院的胡君萍博士鉴定为菊科金鸡菊品种。学名为两色金鸡菊C.tinctoria,本实验所用的为其干燥的花序；原花青素标准品(纯度95%),天津市尖峰天然产物研究;AB-8大孔吸附树脂，天津南开大学实验化工厂；天津建成生物试剂有限公司；2，2-二苯基-1-苦味酰苯肼(DPPH)，天津市化学试剂三厂；S0D试剂盒、MDA试剂盒自南京建成生物工程研究所。CCL4，分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；联苯双酯(1.5mg/粒)，浙江万邦药业股份有限公司；丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司；天冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司。
[0036]主要化学试剂:乙醇、甲醇、香草醛、浓盐酸、双氧水、碘化钾、三氯甲烷、邻二氮菲、磷酸纳、硫酸亚铁、石油醚、丙酸、琼脂粉、酵母粉，铁氰化钾，三氯乙酸，三氯化铁等化学试剂均为分析纯。
[0037]实验动物:黑檀体果蝇(Ebony，e)由新疆大学生命科学与技术学院微生物实验室提供同济大学生命科学与技术学院鉴定；昆明种小鼠，体重18_22g，雌雄各半120只，合格证号N0.65000200000072，由新疆实验动物研究中心提供，许可证号SCXK (新)2011-0001。本发明具体采用的活性研究试验路线图参见附图1。
[0038]试验仪器:SABA18全自动生化仪,意大利；IKA旋转蒸发仪,广州仪科实验室技术有限公司；V-1100D型可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；AL-104电子天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；MDF-382E型超低温冰箱，日本三洋电子生物仪器有限公司；TDL_5_A离心机，上海安亭科学仪器厂；THZ-82恒温振荡器，常州国华电器有限公司；FZ102-SM真空冷冻干燥设备，德国西门子公司；SHB-1II循环水式真空泵，郑州长城科工贸有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；HH-S型恒温水浴锅，巩义市英峪予华有限公司；H-1微型混合器，上海康禾光电仪器有限公司；高速冷冻离心机，德国SIGMA电仪器有限公司；体视显微镜，宁波舜宇仪器有限公司；隔水式恒温培养箱GHP-9050，上海-恒科技有限公司；985-370型匀浆器，美国B1spec公司等。
[0039]本发明中选用的所有原辅材料，所选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0040]实施例一:新疆昆仑雪菊原花青素的提取
本发明具体提供一种昆仑雪菊原花青素的提取方法，％按照重量百分比计，具体提取方法步骤如下:
(I)生长在海拔2600米以上的昆仑雪菊花为原料，将烘干后的雪菊粉在粉碎机中粉碎后过40目筛。
[0041](2)用石油醚对雪菊粉脱脂8小时并在50°C烘干2h。
[0042](3)乙醇浸润:料液比按重量比1:40配置的70%乙醇提取液放置于4°C冰箱中静置过夜。
[0043](4)预均质:使用均质压力为30MPa,均质2次。
[0044](5)动态超高压微射流处理:采用一定微射流压力处理2次；提取压力120MPa，提取温度50°C，乙醇浓度70%，提取时间30min。
[0045](6)乙醇回流:以60%乙醇浓度，提取时间2.5 h，提取温度60 V，回流提取2次，离心并合并滤液,经过旋转蒸发工艺，蒸发温度30°C,转速40rpm。
[0046](7)大孔树脂纯化:AB-8大孔树脂纯化最优条件为原花青素上样浓度为1.06mg/mL、上样pH=6、上样流速为2BV/h，用4倍柱床体积70%的乙醇以流速为2BV/h洗脱；经过旋转蒸发工艺，蒸发温度30°C,转速40rpm ;纯化后昆仑雪菊原花青素的纯度为66.76%。
[0047](8)采用真空冷冻干燥，冷凝温度一 50°C，真空度<20Pa条件下制备获得昆仑雪菊原花青素浓缩粉。
[0048]实施例二:提取新疆昆仑雪菊原花青素最优工艺的确定
选择浓度为60%(V/V)的乙醇作为提取溶剂，反复浸提两次，以乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度温度4个因素做单因素实验，以昆仑雪菊原花青素提取得率和DPPH.清除率为评价提取工艺条件的指标。
[0049]1.1乙醇浓度对提取得率及DPPH.清除率的影响
准确称取1.0OOg雪菊花粉，石油醚脱脂至无色并烘干，料液比1:40，配置40%，50%，60%，70%, 80%, 90%乙醇浓度放置于4°C冰箱中静置过夜，经30MPa，均质2次后，在微射流压力100 MPa下处理2次，50°C水浴提取30分钟，提取2次，离心合并滤液后测吸光度值，计算得率；计算DPPH.清除率，结果如附图2所示:
由附图2所示，在乙醇浓度40-60%的范围内，提取得率及DPPH.清除率均呈现增长趋势，随着提取剂用量的增加，原花青素提取得率明显增大，这是因为对于一定量的粉末原料，溶剂用量的增加降低了浓度，增加了原料与溶剂接触面的浓度差，从而提高了原花青素与溶剂的扩散速度，原花青素提取得率升高。此时DPPH.的清除率为78.64%，随着乙醇浓度进一步增加，但是当乙醇浓度超过60%时，原料中的绝大部分原花青素已被溶解出来，提取得率缓慢降低，对DPPH.清除率也有所下降，因此选择60%的乙醇作为溶剂。
[0050]1.2提取温度对提取得率及DPPH.清除率的影响
称1.0OOg雪菊花粉，处理条件同2.1.1.1，在微射流压力100 MPa下处理2次，20°C，30°C AOV, 50°C，60°C水浴提取30分钟，提取2次，离心合并滤液后测吸光度值，计算得率；计算DPPH.清除率，结果如附图3示。
[0051]从附图3可以看出，提取温度在20~40°C之间时，随着提取温度的增加，原花青素提取得率相应增大，这是由于升高温度增加了溶剂分子和原花青素分子的动能，促进了原花青素的扩散作用，使原花青素溶出率增大。但当温度超过40°C时变得缓慢降低，这可能是因为温度升高，溶剂的挥发加快，减少了溶剂和原料之间的有效接触面，使出原花青素提取得率下降。且在40°C时，DPPH.的清除率高达88.00%，，因此选择40°C为最佳提取温度。
[0052]1.3提取时间对提取得率及DPPH.清除率的影响
称1.0OOg雪菊花粉，处理条件同2.1.1.1，在微射流压力10MPa下处理2次，40°C水浴提取10、20、30、40、50分钟，提取2次，离心合并滤液后测吸光度值，计算得率；计算DPPH.清除率，结果如附图4所示。
[0053]由附图4可见，随着提取时间的增加，雪菊原花青素提取得率出现先增加后减小的趋势，当提取时间30min时雪菊原花青素提取得率不再增加反而有所下降。分析原因可能是长时间作用下，有效成分发生降解或者是由于时间过长，造成杂质含量增加，有效成分含量随之下降，从而导致提取得率的降低。其DPPH.的清除率达到78.85%。因此选择30min为最佳提取时间。
[0054]1.4微射流压力对提取得率及DPPH.清除率的影响
称1.0OOg雪菊花粉，处理条件同上，在微射流压力分别40MPa，60MPa，80 MPa, 10MPa,120Mpa下处理2次，40°C水浴提取30分钟，提取2次，离心合并滤液后测吸光度值，计算得率；计算DPPH.清除率，结果见附图5。
[0055]由附图5所示，随着微射流压力的增大，提取得率及DPPH ?清除率均呈现显著增长趋势，说明增加微射流压力有利于溶剂渗透到植物细胞内部，加速相互渗透，以增加原花青素在乙醇中的溶解度。在微射流压力上升到10MPa时，DPPH.清除率达到57.32%。随着压力进一步的增大，提取得率及DPPH.清除率都趋于平缓，因此，考虑到仪器的承受负荷，选择10MPa为最佳。
[0056]结论:动态超高压微射流辅助提取昆仑雪菊原花青素最优工艺为:提取压力120MPa，提取温度50°C，乙醇浓度70%，提取时间30min，此条件下原花青素的提取率为22.29%，纯度为25.68±0.98%，经AB-8大孔树脂纯化后纯度为66.76±0.34%。
[0057]实施例三:新疆昆仑雪菊原花青素最优工艺的确定
以乙醇浓度、提取温度、提取时间、微射流压力为自变量设计四因素三水平L9 (34)正交优化实验昆仑雪菊原花青素提取工艺。
[0058]表1:正交试验结果表
【权利要求】
1.一种昆仑雪菊原花青素的提取方法，其特征在于，％按照重量百分比计，具体提取方法步骤如下: (1)生长在海拔2600米以上的昆仑雪菊花为原料，将烘干后的雪菊粉在粉碎机中粉碎后过40目筛； (2)用石油醚对雪菊粉脱脂8小时并在50°C烘干2h； (3)乙醇浸润:料液比按重量比1:40配置的70%乙醇提取液放置于4°C冰箱中静置过夜； (4)预均质:使用均质压力为30MPa,均质2次； (5)动态超高压微射流处理:采用一定微射流压力处理2次；提取压力120MPa，提取温度50°C，乙醇浓度70%，提取时间30min ； (6)乙醇回流:以60%乙醇浓度，提取时间2.5 h，提取温度60 V，回流提取2次，离心并合并滤液，经过旋转蒸发工艺，蒸发温度30 °C,转速40rpm ； (7)大孔树脂纯化:AB-8大孔树脂纯化最优条件为原花青素上样浓度为1.06mg/mL、上样pH=6、上样流速为2BV/h，用4倍柱床体积70%的乙醇以流速为2BV/h洗脱；经过旋转蒸发工艺，蒸发温度30°C，转速40rpm ;纯化后昆仑雪菊原花青素的纯度为66.76% ； (8)采用真空冷冻干燥，冷凝温度一50°C，真空度<20Pa条件下制备获得昆仑雪菊原花青素浓缩粉。
2.一种昆仑雪菊原花青素在延缓衰老中的应用。
【文档编号】A61K31/352GK104173401SQ201410365439
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】敬思群, 柴文杰 申请人:新疆大学, 敬思群