细胞融合瘤苗及其制备方法和在胃癌防治中的应用的制作方法
【专利摘要】一种细胞融合瘤苗，由灭活胃癌细胞与树突状细胞融合，在树突状细胞表面负载胃癌细胞全抗原。树突状细胞取自外周血中提取的单核细胞，经增殖而得。灭活肿瘤细胞取自于MGC-803，MKN-45，NCI-N87和SGC-7901等细胞系。本发明细胞融合瘤苗，可对多种胃癌细胞产生免疫保护作用，实现生物体对胃癌细胞的主动性免疫功能的建立，以促使机体对胃癌细胞的免疫防护功能。同时，细胞融合瘤苗还具有胃癌的治疗作用和胃癌的术后防治作用。
【专利说明】细胞融合瘤苗及其制备方法和在胃癌防治中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞融合瘤疫苗，尤其涉及使用一种以胃癌细胞标准株制成的瘤苗，可对多种胃癌细胞产生保护作用，实现生物体对胃癌细胞的主动性免疫功能的建立，以促进机体对胃癌细胞的免疫防护功能。
【背景技术】
[0002]胃癌(gastric cancer)是最常见的胃肿瘤，根据世界卫生组织估计，胃癌是全世界排名第四个最普遍被诊断的癌症，而且在所有癌症中死亡率排名第二。胃癌也是中国最常见的恶性肿瘤之一，在中国其发病率居各类肿瘤的首位，每年约有17万人死于胃癌，接近全部恶性肿瘤死亡人数的1/4，且每年还有2万以上新的胃癌病人产生出来。胃癌被视为国际间重要的健康危机。目前，针对胃癌的预防性策略的研究，特别是对胃癌疫苗的研究，在国内和国际均处于起步阶段，尚无阶段性研究成果出现。
[0003]树突状细胞(dendritic cells,DC)自1973年由Steinman和Cohn报道以来，该细胞已被广泛和深入地研究。DC细胞是目前所发现的功能最强的专职抗原呈递细胞(antigenpresenting cel 1，APC)，该细胞能够激活静息状态的T细胞，从而实现识别和杀死肿瘤细胞的重要作用。
[0004]在对肿瘤疫苗的探索中，研究者们采用了多种策略来研制DC瘤苗，以激发抗肿瘤特异性免疫应答。主要包括负载肿瘤抗原的DC、肿瘤抗原致敏的DC和肿瘤抗原基因转染的DC等。在这些DC疫苗的临床应用中，Rosenberg等(Nat Med, 2004, 10(9):909-915)总结了 35篇肿瘤疫苗的临床应用结果，仅有7.1% (14/198)的受试人群有客观反应。其失败的原因主要有以下三方面:一方面是已确定的特异性肿瘤抗原较少，各种突变因素导致肿瘤细胞容易通过抗原变异逃避针对单一抗原表位的免疫作用；另一方面，由于提取的肿瘤蛋白在体内易被蛋白质水解酶降解，诱导的免疫效应不能持久，难以获得理想的治疗效应；最后，基因修饰法制备的肿瘤疫苗，不仅费时，而且基因导入效率和基因转移的靶向性等技术难题尚未完全解决，影响因素较多。由此可以见，传统的DC肿瘤疫苗在临床上的效果并不理想，这就要求我们去探寻一种新的、更有效的DC肿瘤疫苗。
[0005]在这种背景下，DC一肿瘤融合细胞疫苗(DCs-tumor fused vaccine)成为当前肿瘤免疫治疗研究的热点。因为融合瘤苗既能够表达肿瘤的所有抗原成分，又具有DC的抗原提呈能力，即融合苗细胞能呈递肿瘤细胞所有的抗原。在肿瘤细胞特异性抗原仍未得到明确的鉴定或由于突变等因素的影响不可能及时鉴定的前提下，用DC融合细胞递呈全肿瘤细胞抗原被认为是一种简单而有效的抗肿瘤方法。融合细胞可以通过聚乙二醇(PEG)化学方法或电融合仪获得。因为肿瘤细胞在融合前经高强度的、射线照射或丝裂霉素-COnitomycin C, MMC)处理，所以，DC—融合瘤疫苗是没有肿瘤增殖危险的。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的在于提供一种细胞融合瘤苗，可直接靶向胃癌术后或化疗后的微小病灶，并可主动渗入外周淋巴器官中残余的胃癌细胞，实现胃癌的主动预防和彻底治疗，使胃癌发病的安全隐患与风险大大降低，针对传统治疗的预后产生较大的改观。
[0007]本发明的另一个目的在于提供一种细胞融合瘤苗制备方法，通过化学方法在树突状细胞表面负载胃癌细胞全抗原制得。
[0008]本发明的再一个目的在于提供一种细胞融合瘤苗在用于制备治疗胃癌疾病药物中的应用。
[0009]本发明的又一个目的在于提供一种疫苗，其含有树突状细胞表面负载胃癌细胞全抗原的细胞融合瘤苗。
[0010]本发明提供的一种细胞融合瘤苗，其由灭活胃癌细胞与树突状细胞融合，在树突状细胞表面负载胃癌细胞全抗原。
[0011]本发明提供的一种细胞融合瘤苗制备方法，树突状细胞和灭活肿瘤细胞按5:1?10:1比例混合，细胞总量为1X107?2X107，采用聚乙二醇(分子量Mw为500Da?15, OOODa)以融合树突状细胞和灭活肿瘤细胞，制得树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗。
[0012]本发明提供的另一种细胞融合瘤苗制备方法，树突状细胞和灭活肿瘤细胞按5:1?10:1比例混合，细胞总量为1 X 107?2X 107，离心，弃上清，逐滴加入PEG应用液(PEG溶于X-vivo培养基，浓度为50w/w% )，边滴加边振荡混匀，37度静置60秒后，在之后的第N分钟逐滴加入N ml X-vivo培养基(N为大于1的正整数)，直至液体总量至50ml，收集融合细胞并置于X-vivo培养基中，加入GM-CSF和rhIL-4，培养4天获得树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗。
[0013]本发明提供的各种细胞融合瘤苗制备方法，可采用多种方法获取树突状细胞。比如:从健康供体或患者自身外周血中提取单核细胞，并在粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)的诱导下进行体外增殖。本发明在此所提及的获得树突状细胞的方法，应当被理解为出于充分公开的必要而进行的说明，不应作为对本发明技术方案的限制。
[0014]本发明提供的各种细胞融合瘤苗制备方法，可从标准的胃癌细胞系中制取灭活肿瘤细胞，将细胞系如:但不仅限于MGC-803(由中国科学院细胞库提供)，MKN-45(由中国科学院细胞库提供)，NC1-N87 (由中国科学院细胞库提供)和SGC-7901(由中国科学院细胞库提供)等，经体外培养至对数生长期，向培养基中加入终浓度为10μ g/ml的丝裂霉素C，37°C,5% C02条件下灭活4小时，吸弃含丝裂霉素C的培养基，PBS(pH7.4)充分洗涤4次以上，胰酶消化细胞并计数。本领域技术人员可以理解，还可有其它手段获得此类灭活肿瘤细胞。本发明在此所提及的方法，应当被理解为出于充分公开的必要而进行的说明，不应作为对本发明技术方案的限制。
[0015]本发明提供的各种细胞融合瘤苗制备方法，树突状细胞和灭活肿瘤细胞混合比例如:但不限于 5:1、6:1、7:1、8:1、9:1 和 10:1。
[0016]本发明提供的细胞融合瘤苗具有胃癌的免疫保护作用，将树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗经尾静脉注入非荷瘤小鼠体内进行主动免疫，再将大剂量胃癌细胞注入小鼠皮下，与未免疫组比较，可观察到树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗免疫接种组无明显成瘤现象，而对照组全部成瘤，差异具有显著性。
[0017]本发明提供的细胞融合瘤苗具有胃癌的治疗作用，使用近红外量子点标记树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗，并将标记后的疫苗经尾静脉注入胃癌荷瘤小鼠体内，可以体外观察到瘤苗细胞主动靶向至肿瘤组织部位，2周后荷瘤小鼠的肿瘤体积显著缩小，与仅注射PBS的对照组荷瘤小鼠比较，差异具有显著性。
[0018]本发明提供的细胞融合瘤苗具有胃癌的术后防治作用，将胃癌荷瘤小鼠皮下瘤体经外科手术切除后，静脉注射树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗，与未注射组比较，可观察到注射树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗组手术部位无新生瘤体生长现象，而未注射组在2周后新生瘤体即裸眼可见。两组相比，差异具有显著性。
[0019]因此，本发明提供的细胞融合瘤苗可用于制备治疗和预防胃癌的药物或组合物，如:疫苗。
[0020]本发明技术方案实现的有益效果:
[0021 ] 本发明提供的胃癌疫苗的生产方法解决了胃癌疫苗生产的核心问题，并最终提供了一种基于健康供体或患者自身树突状细胞的胃癌细胞疫苗。
[0022]本发明提供的胃癌疫苗实现了树突状细胞-胃癌细胞融合疫苗在应用中主动靶向和微小病灶治疗。
[0023]本发明提供的胃癌疫苗可制成药物或组合物，用于胃癌的预防和治疗。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为本发明制备的树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗的光镜照片，图中，“1”表示箭头所指向的为灭活胃癌细胞，“2”表示箭头所指向的为树突状细胞；
[0025]图2为本发明制备的树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗的电镜照片，图中，“1”表示箭头所指向的为灭活胃癌细胞，“2”表示箭头所指向的为树突状细胞；
[0026]图3为本发明树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗对胃癌荷瘤鼠的主动免疫保护应用结果图；
[0027]图4为本发明树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗对胃癌荷瘤鼠的主动靶向治疗应用结果图；
[0028]图5为本发明树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗对胃癌荷瘤鼠术后的治疗作用结果图。
【具体实施方式】
[0029]以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
[0030]本发明以下实施例仅以MGC-803细胞系作为胃癌疫苗肿瘤细胞来源为例，制备得到的树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗用于治疗胃癌相关性疾病，但本发明不仅仅限于MGC-803细胞，胃癌细胞系的其它相关细胞亦可作为疫苗制备的来源，制备过程和治疗效果与本实施例相似或本领域的普通技术人员可以通过有限次实验得到。
[0031]实施例1外周血树突状细胞的分离培养方法
[0032]以下操作均在无菌条件下进行:
[0033]取健康供体或患者自身静脉血25?50ml，肝素(15U/ml)充分抗凝；在抗凝血中加入等量无菌PBS(pH7.4)进行1:1稀释，颠倒混匀；在50ml离心管中，加入25ml Ficoll淋巴细胞分离液(Lymphoprep,Axis-Shield)，将稀释后的血液25ml小心从液面加入，并在淋巴细胞分离液表面形成血液细胞层，保持液体界面分层清晰；小心将含有淋巴细胞分离液及稀释血液的离心管置水平离心机中(Eppendorf Centrifuge5810,转子AT-4-62,离心半径16cm)，800G，室温下离心20min，缓升缓降；小心吸取云雾状单核细胞层(自上而下第1?4层分别为血浆和血小板层，单核细胞层，Ficoll层，红细胞层)，置含20ml培养基离心管中，260G，水平离心10分钟，弃上清；重复离心洗涤一次，弃上清；收集管底单核细胞，重悬于X-vivo培养基中，细胞密度1.5?2.0 X 106/ml，37度，5% C02条件下培养过夜，使DC细胞充分贴壁；次日吸弃悬浮细胞，并用X-vivo培养基小心清洗贴壁细胞一次，弃悬浮细胞，在培养瓶中再次加入等量X-vivo培养基，并加入细胞因子GM-CSF(终浓度:50ng/ml)和rhIL-4 (终浓度:10ng/ml);继续在上述条件下培养，每3天加入倍量培养基和相应浓度细胞因子，培养至第6天；在DC培养液中加入磷酸脂多糖(LPS，200ng/ml)以激活DC，继续培养至第8?9天，收获成熟DC。
[0034]实施例2胃癌细胞的体外培养及灭活
[0035]以胃癌细胞MGC-803细胞为例:
[0036]胃癌细胞培养至对数生长期，在培养基中加入丝裂霉素C至终浓度为10 μ g/ml,37度，5% C02条件下培养4小时，吸弃含丝裂霉素C的培养基，PBS(pH7.4)充分洗涤(4次以上)，以去除可能残余的丝裂霉素，胰酶消化细胞并计数。
[0037]实施例3 DC-胃癌细胞融合瘤苗的制备方法
[0038]以分子量为1500的聚乙二醇(PEG)为例:称取PEG2g，加入小瓶中，置灭菌器中灭菌；待温度回落至60度左右时，加入2ml X-vivo培养基，充分混匀，即为50% PEG应用液；将一、二两步中收集的DC细胞和MGC-803细胞在50ml离心管内按6:1比例混合，细胞总量为2X107，离心，弃上清，在管底保留约200 μ 1液体；在90秒内，将lml50% PEG应用液逐滴加入混合细胞，边滴加边振荡混匀，使两种细胞与PEG充分接触；将加有PEG的混合细胞置37度静置60秒后，在第1分钟内逐滴加入1ml X-vivo培养基，边加边振荡混匀，第2分钟内加入2ml培养基，第3分钟内加入3ml培养基，如此一直添加X-vivo培养基，直至液体总量至50ml，完成融合过程。离心，弃上清，收集融合细胞，置50ml X-vivo培养基中，加入GM-CSF和rhIL-4，置37°C，5% C02条件下培养4天。培养结束后，将细胞悬液取出至50ml离心管中，15G，离心3分钟弃上清，再加入20ml X-vivo培养基，同样离心3分钟，弃上清，收集到的细胞即为DC-胃癌细胞融合瘤苗(参见图1和图2)。
[0039]实施例4树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗对胃癌荷瘤小鼠的主动免疫保护应用
[0040]将收获的胃癌融合瘤疫苗经尾静脉注入体内进行主动免疫，每次注入融合细胞2.5X 106,间隔一周，共两次。完成两次免疫后，将IX 107个胃癌细胞注入小鼠皮下，胃癌细胞包括MGC-803、MKN-45、NC1-N87和SGC-7901等，同样数量的胃癌细胞同时接种未进行免疫接种小鼠。2周后，每天记录成瘤情况，并记录肿瘤大小，记录时长为肿瘤细胞接种后3个月。实验结果发现，本发明制备的胃癌融合瘤疫苗对小鼠进行两次免疫接种后，可以有效抑制包括MGC-803在内的所有胃癌细胞的生长，与未进行免疫接种组比较有显著性差异(参见图3)。
[0041]实施例5树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗对胃癌荷瘤小鼠靶向性治疗的应用
[0042]收获经二制备的胃癌融合瘤疫苗，用近红外量子点-单克隆抗体探针CD3(NIR-QDs-Mab3, EM:720nm，参见 Nanoscale Res.Lett., 2014, 9(1):244)标记后，经尾静脉注入荷瘤小鼠体内，对照组荷瘤小鼠仅注入NIR-QDs-Mab3。注后1、2、3、5、7、10、15、20,25和30日分别对实验组和对照组荷瘤小鼠进行近红外成像，观察融合瘤疫苗对肿瘤部位的靶向作用；同时，每日观察，记录两组小鼠肿瘤的大小。实验结果发现，本发明制备的胃癌融合瘤疫苗可以有效靶向肿瘤部位，实验组小鼠肿瘤明显变小或消失，对照组小鼠肿瘤体积日益增大，两组相比，差异具有显著性(参见图4)。
[0043]实施例6树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗对胃癌荷瘤小鼠术后的治疗应用
[0044]将荷瘤小鼠的肿瘤按外科手术常规切除，分为两组，其中实验组经尾静脉注入胃癌融合瘤疫苗，对照组注入PBS，逐日观察肿瘤复发情况，观察时间为3个月。结果发现，实验组小鼠肿瘤均无复发(无明显肿瘤生长)，而对照组复发率为82%，其中裸眼可见复发者为74%，解剖可见复发者为8%，两组比较，差异具有显著性(参见图5)。
【权利要求】
1.一种细胞融合瘤苗，其特征在于由灭活胃癌细胞与树突状细胞融合，在树突状细胞表面负载胃癌细胞全抗原。
2.根据权利要求1所述的细胞融合瘤苗，其特征在于所述的树突状细胞取自外周血中提取的单核细胞，经增殖而得。
3.根据权利要求1所述的细胞融合瘤苗，其特征在于所述的灭活肿瘤细胞取自于MGC-803, MKN-45, NC1-N87 和 SGC-7901 之一种或几种细胞系。
4.一种权利要求1-3之一所述的细胞融合瘤苗在制备治疗和预防胃癌药物中的应用。
5.一种权利要求1-3之一所述的细胞融合瘤苗在制备胃癌免疫保护药物中的应用。
6.—种权利要求1-3之一所述的细胞融合瘤苗在制备胃癌术后治疗药物中的应用。
7.一种胃癌疫苗，其特征在于包括权利要求1-3之一所述的细胞融合瘤苗。
8.一种细胞融合瘤苗制备方法，其特征在于包括如下步骤: 树突状细胞和灭活肿瘤细胞按5:1?10:1比例混合，细胞总量I X 17?2 X 17,采用聚乙二醇以融合树突状细胞和灭活肿瘤细胞，制得树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗； 所述聚乙二醇的分子量Mw为500Da?15，OOODa0
9.一种细胞融合瘤苗制备方法，其特征在于其特征在于包括如下步骤: 树突状细胞和灭活肿瘤细胞按5:1?10:1比例混合，细胞总量为I X 17?2 X 17,离心，弃上清，逐滴加入PEG应用液，边滴加边振荡混匀，37度静置60秒后，在之后的第N分钟逐滴加入N ml X-vivo培养基，直至液体总量至50ml，收集融合细胞并置于X-vivo培养基中，加入GM-CSF和rhIL-4，培养4天获得树突状细胞-胃癌细胞融合瘤苗； 所述PEG应用液为PEG溶于X-vivo培养基，浓度为50w/w%。 所述N为大于I的正整数。
10.根据权利要求8或9所述的细胞融合瘤苗制备方法，其特征在于所述的树突状细胞和所述的灭活肿瘤细胞按5:1、6:1、7:1、8:1、9:1和10:1之一种比例混合。
【文档编号】A61P35/00GK104258415SQ201410469370
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】崔大祥, 李超, 梁淑静, 张春雷, 郅晓, 陈 峰 申请人:上海交通大学