一种睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途，本发明所提供的方法包括：利用7天或2个月小鼠，分离睾丸，去除被膜和血管，暴露生精小管后用胶原酶IV消化，过滤消化后的细胞悬液；通过CD51的细胞特异标记，利用流式细胞仪进行分选，获得单个细胞，收集表达CD51的细胞，从而分离出所述CD51阳性睾丸间质干细胞。本发明提供了根据上述方法分离的睾丸间质来源干细胞，以及进一步在培养基中培养获得的自我更新和增殖、具有多向分化潜能的细胞，并且提供了将这些细胞用于制备治疗睾酮水平低下导致的相关疾病的组合物的用途。
【专利说明】-种睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞与组织工程【技术领域】，尤其涉及一种睾丸间质干细胞的分离、 培养方法及其用途。
【背景技术】
[0002] 随着全球老龄化进展加速，各种衰老相关性疾病日益引起人们的重视。其中由于 原发性或继发性睾丸间质细胞功能障碍引起的迟发性性腺功能减退（LOH)、老年雄激素缺 乏症等疾病在50岁以上男性的发病率高达20%以上，它不仅影响生活质量，也易导致心血 管疾病、精神疾病等重大疾病的发生。睾酮补充治疗是目前主要治疗手段。据估计，1997年 美国的睾酮产品市场规模约为〇. 49亿美元，而在2002年就超过3亿美元。统计数字表明， 45岁以上的男性有20%受到低睾酮水平的困扰，而接受治疗的仅2%，表明存在巨大的市 场潜力。但是外源性睾酮制剂无法模拟机体睾酮的生理情况，长期给予会导致睾丸局部睾 酮浓度下降，最终引起精液质量下降并进而影响男性生育功能，因此，睾酮制剂治疗LOH治 疗始终有很多争议。
[0003] 睾丸间质细胞移植是治疗迟发性性腺功能减退症等疾病的最佳手段。邓春华研 究团队成功体外培养出睾丸间质细胞后，对血清睾酮和游离睾酮水平均明显下降的老年SD 大鼠进行了睾丸间质细胞移植，在没有应用免疫抑制剂的情况下，移植后老年SD大鼠的血 清睾酮和游离睾酮均显著升高至成年SD大鼠的水平，提示同种异体睾丸间质细胞移植是 一种新的、有效的、更符合生理的补充睾酮的方法。但睾丸间质细胞的来源有限，扩增能力 有限，大大限制了其进一步的应用。
[0004] 睾丸间质干细胞是具有自我更新、可分化为睾丸间质细胞的一类细胞。在大 鼠出生后7天，梭形的睾丸间质干细胞主要分布在大鼠睾丸间质细胞部分以及血管周 围。Davidoff等认为睾丸的血管即血管平滑肌细胞及周细胞是睾丸间质细胞的前体细 胞(Davidoff MS,Middendorff R, Enikolopov G, Riethmacher D,Holstein AF, Muller D. Progenitor cells of the testosterone-producing Leydig cells revealed. The Journal of cell biology 2004;167:935-944·)。目前对辜丸间质干细胞的研 究甚少，没有明确的特意标志物。而对于睾丸间质干细胞的纯化方法也仅仅局限于 Metrizamide或Percoll密度梯度离心法，结合TOGFR- α阳性且LHR阴性细胞的免疫选择 (Immunoselection)法，纯化出大鼠睾丸中的睾丸间质干细胞。葛仁山等人取60只7天龄 大鼠睾丸进行睾丸间质干细胞分离，最终获得每一个睾丸中8,500睾丸间质干细胞，将分 离得到的睾丸间质干细胞移植入睾丸间质细胞损伤大鼠模型中（用全称，二甲磺酸乙烷， EDS)，发现睾丸间质干细胞可以在体内定植，并分化成有功能的睾丸间质细胞（Ge RS，Dong Q, Sottas CM, Papadopoulos V,Zirkin BR, Hardy MP. In search of rat stem Leydig cel Is: identification, isolation, and lineage-specific development. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:2719-2724)。虽然，移植睾丸间质干细胞治疗LOH为临床提供了良好的 应用前景，但是现行方法存在获得细胞量少，细胞种类不明确，缺乏细胞鉴定标准等众多弊 端，明显制约了临床应用，需要进一步的深入研究。
[0005] ⑶51又称为整合素蛋白α V，是整合素蛋白超家族中的一员，其实质为异质二聚 体整合膜蛋白由α链和β链两部分构成。进一步可细分为ανβ?，ανβ3，ανβ5， ανβ6和ανβ8共5个亚型。在调控胚胎器官形成，血管生成，血管通透性，癌症演进， 上皮组织的炎症及纤维化中发挥重要作用要作用。有研究报道，⑶51广泛分布于牙周韧 带，人脐带血及华通氏胶中MSC样细胞的表面。同时，也发现CD51存在于大部分人骨髓 MSC 细胞的表面，认为是 MSC 的标志物（Pinho S, Lacombe J, Hanoun M et al. F1DGFRalpha and CD5lmark human nestin+sphere-forming mesenchymal stem cells capable of hematopoietic progenitor cell expansion. The Journal of experimental medicine 2013 ;210:1351-1367)。目前尚未见研究报道以⑶51为标记物分离和鉴定睾丸间质干细胞 的相关研究。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于简化睾丸间质干细胞的分离及培养方法，提供睾丸间质干细胞 的鉴定方法，以及其应用。
[0007] 本发明采用如下技术方案：
[0008] 本发明的睾丸间质干细胞的分离方法是选择7天或2个月龄小鼠，分离小鼠睾丸， 用胶原酶IV，过滤消化后的细胞悬液，滤过筛网，获得单个细胞，所述细胞用CD51抗体进行 标记；
[0009] 将上述已经标记的单个细胞通过流式细胞仪进行分选，收集⑶51荧光强度是阴 性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述CD51阳性的睾丸间质干细 胞。
[0010] 本发明的分离方法的具体步骤如下： toon] (1)利用生后7天或两月龄雄性小鼠，采用颈椎脱臼法处死，在无菌条件下打开阴 囊部，取出双侧睾丸并在解剖显微镜下去除被膜和血管，用含1 %双抗的IXPBS反复冲洗， 随后用吸管及枪头轻轻吹打，使间质组织与曲精细管分散开，并用小剪刀剪碎组织部分，随 后放入lmg/ml的IV型胶原酶溶液，于37°C、5% CO2条件下孵育15min，加入含0. 5% BSA 的I XPBS终止胶原酶的消化，1500rmp离心5min ;弃去上清液，用孔径为40 μ m的尼龙网过 滤悬液，去除未消化的曲细精管，收集单细胞，以1500rmp离心5min，得到睾丸细胞悬液；
[0012] (2)进行CD51抗体标记，CD51抗体与睾丸细胞悬液混合，两者体积比为1:100,4°C 微旋孵育30分钟，对照细胞样本与IgG进行孵育，弃清液，PBS缓冲液洗涤2次，经流式分 选收集表达CD51的抗体荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而 分离出所述CD51阳性睾丸间质干细胞。
[0013] 本发明的分离方法得到的睾丸间质干细胞的培养方法如下：将分离得到的睾丸 间质干细胞在培养基中进行培养，产生自我更新和增殖的细胞；经实验表明，单纯在DMEM/ F12基础培养基，或加10%血清的培养基中培养分离的CD51阳性睾丸间质干细胞不增殖， 容易分化。因此，本发明在DMEM/F12基础培养基的基础上进行改良，优选的培养基为无 血清培养基，其成分包括：DMEM-F12培养基中加入InM地塞米松、lng/ml LIF，5mg/liter insulin, 5mg/liter transferrin, 5ug/liter sodium selenite 的 ITS、5%鸡胚提取物、 0·lmMβ-巯基乙醇、l%非必需氨基酸、l%N2、2%B27(Gibco)、20ng/mlbFGF、20ng/ml EGF、20ng/ml roGFBB、20ng/ml OSM。实验表明，将该培养用于本发明所述的睾丸间质干细 胞的培养，细胞增殖效果非常好。3天进行一次传代。
[0014] 本发明对分离得到的CD51阳性细胞进行睾丸间质干细胞系及干细胞相关蛋白表 达的检测，从分子水平分析CD51阳性干细胞的分子生物学特点，进一步提供该细胞的克隆 形成能力、自我更新、多向分化能力，从而对该种干细胞进行鉴定。结果表明，CD51阳性睾 丸间质干细胞呈克隆球样生长。培养的⑶51阳性睾丸间质干细胞表达Nestin，PDGFR-α， LIFR，ΡΗ3, SSEA-1，SSEA-4, GATA-4,但是不表达3 β -HSD，LHR等。该细胞具有克隆形成能 力。分化实验结果表明，CD51阳性睾丸间质干细胞可分化为脂肪细胞、成骨细胞。在睾丸 间质细胞诱导分化条件下，可分化为睾丸间质细胞，并分泌睾酮。
[0015] 考虑到本发明所述的分离的CD51阳性睾丸间质干细胞在体内的作用，将所述细 胞移植到去除睾丸间质细胞的大鼠动物模型（应用大鼠睾丸间质细胞的特异性凋亡诱导 剂二甲磺酸乙烷（EDS)，成功建立了 Leydig细胞凋亡模型），评价该细胞在睾丸微环境中的 作用。结果发现，该细胞移植后可以促进睾酮的分泌，因此本发明的方法得到的睾丸间质干 细胞可以用于制备治疗睾酮水平低下相关疾病的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是7天、2个月小鼠⑶51+细胞流式分选图。
[0017] 图2是细胞体外培养培养图。
[0018] 图3是培养的CD51阳性睾丸间质干细胞从单个细胞增长到克隆球的白光观察图。
[0019] 图4是培养的CD51阳性睾丸间质干细胞向成骨、成脂分化图；
[0020] (A)成骨钙结节茜素红染色（B)成脂油红0染色。
[0021] 图5是⑶51-睾丸间质细胞分化图。
[0022] 图6是CD51阳性睾丸间质干细胞在体外培养条件下分泌睾酮的示意图。
[0023] 图7是⑶51阳性睾丸间质干细胞移植到EDS模型大鼠10天后，血清睾酮水平示 意图。
【具体实施方式】
[0024] 下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
[0025] 实施例一：小鼠成体睾丸间质⑶51阳性细胞的分离
[0026] 本实施例选择从小鼠成体睾丸中分离获得睾丸间质干细胞。
[0027] 分离方法具体如下：
[0028] a.取出生后7天生殖系统发育健全的雄性C57BL/6雄性小鼠，采用颈椎脱臼法 处死，在无菌条件下打开阴囊部，取出双侧睾丸并在解剖显微镜下去除被膜和血管，用含 1%双抗的IXPBS反复冲洗。随后用吸管及枪头轻轻吹打，尽量使间质组织与曲精细管 分散开，并用小剪刀剪碎组织部分。随后放入lmg/ml含少量DNase酶的IV型胶原酶溶 液，于37°C、5% C02条件下孵育15min，加入大量含0. 5% BSA的IXPBS终止胶原酶的 消化，1500rmp离心5min ;弃去上清液，用孔径为40 μ m的尼龙网过滤悬液，收集的滤液以 1500rmp 离心 5min。
[0029] b.进行⑶51抗体标记。⑶51抗体（I: 100)与睾丸细胞悬液混合，4°C微旋孵育30 分钟，对照细胞样本与IgG进行孵育，弃清液，PBS缓冲液洗涤2次。使用流式细胞仪（BD influx cell sorter)先对IgG阴性对照组细胞悬液进行流式上样，选出阴性突光信号区域 作为阴性对照。随后对CD51阳性细胞悬液进行流式上样，分选纯化出CD51荧光强度是阴 性对照细胞的10倍或以上时收集细胞，用培养基对分选出的细胞进行收集。
[0030] 图1是出生7天、2个月小鼠睾丸中⑶51阳性睾丸间质干细胞流式分选图。如图 1所示，⑶51阳性细胞的阳性率最高的为7天的小鼠62. 36%，2个月小鼠为1.24%，并可 以看出随着年龄增长阳性率呈下降趋势，根据这一结果，为了获取更多的阳性细胞，我们就 可以选择7天龄小鼠为主要实验对象。
[0031] 实施例二：CD51阳性睾丸间质干细胞自我更新和增殖能力的鉴定
[0032] 本实施例是在实施例一的基础上，对所获得的CD51阳性睾丸间质干细胞自我更 新和增殖能力进行鉴定。
[0033] a.⑶51阳性睾丸间质干细胞自我更新能力的鉴定：
[0034] 1)将从小鼠成体睾丸中分选获得的单个CD51阳性细胞分别置于6孔板的各个单 孔中进行培养。培养液成分包括DMEM-F12培养基中加入InM地塞米松、lng/ml LIF，5mg/ liter insulin, 5mg/litertransferrin, 5ug/liter sodium selenite 的 ITS、5%鸡胚提取 物、0· ΙπιΜβ-巯基乙醇、1%非必需氨基酸、1% N2、2% B27(Gibco)、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、20ng/ml roGFBB、20ng/ml 0SM。观察细胞克隆的形成情况，当细胞克隆大小达到50um 以上、密度达到70%，用37°C的0.05%胰蛋白酶-EDTA对细胞消化30秒，进行传代。
[0035] 图2显示分选得到的原代细胞在培养基中贴壁，呈梭型生长。原代细胞传代后形 成克隆球生长。
[0036] 2)应用免疫荧光染色的方法进行包括H)GFR-a上正1?、他8^11、0)51、胚胎干细胞 标志物，例如SSEA-1、SSEA-4,睾丸间质细胞标志物LHR和3 β -HSD，GATA4以及细胞增殖 相关标志物？把的染色，细胞切片用4%多聚甲醛固2〇1^11，？85缓冲液中浸洗51^11\3次， 0. 2% Triton-X-IOO穿透30分钟，正常山羊血清室温孵育20分钟，加一抗，湿化盒中4°C过 夜，加二抗，室温孵育1小时，荧光显微镜观察结果。
[0037] CD51阳性睾丸间质干细胞球与上述干细胞增殖重新编程有关的标志物的免疫 荧光共染色结果表明，CD51阳性睾丸间质干细胞球表达Nestin、H)GFR-a、LIFR、SSEA1、 SSEA4、GATA4、PH3,但不表达 LHR、3 β -HSD。
[0038] b.⑶51阳性睾丸间质干细胞增殖能力的鉴定：
[0039] 为了演示CD51阳性睾丸间质干细胞的自我更新能力，我们从P7代CD51阳性睾丸 间质干细胞消化得到单细胞，进行单细胞球体形成试验。图3表明单细胞培养10天后可形 成克隆。结果表明，CD51阳性睾丸间质干细胞具有较强的自我更新能力。
[0040] C.⑶51阳性睾丸间质干细胞分化能力的鉴定：
[0041] 为了演示CD51阳性睾丸间质干细胞的分化能力，利用常规成骨，成脂培养液中进 行分化。图4所示，21天后，可向成骨细胞，脂肪细胞分化。在特定睾丸间质细胞分化培养 液（DMEM-F12培养基中加入2%FCS，10ng/ml PDGF-BB，lnMT3，lng/ml LH，70ng/ml IGF-I， IOng TOGF-BB以及ITS)中分化7天。结果显示如图5和图6,⑶51阳性睾丸间质干细胞 可向成熟睾丸间质细胞分化。通过免疫染色结果分析，分化的细胞表达GATA-4, P450C17， StAR，3 β -HSD，SF-1，LHR。睾酮ELISA检测结果发现，随着分化时间的增加，睾酮分泌增高。
[0042] 实施例三：观察CD51阳性睾丸间质干细胞在体内组织修复中作用
[0043] 大鼠EDS模型的建立：
[0044] 干细胞对体内受损组织的再生能力是一个重要的属性。因此，我们调查⑶51阳性 睾丸间质干细胞是否能在睾丸间质细胞缺失的大鼠模型中促进睾丸间质恢复。先前的研究 表明the cytotoxin ethane dimethanesulfonate(EDS)经过4天的处理可能耗尽睾丸间 质细胞。我们选择三组成年大鼠，分别为正常组、模型组、细胞组。模型组和细胞组的大鼠 接种EDS，4day后IxlO 6的⑶51阳性睾丸间质干细胞被注入细胞组老鼠中。移植后第10天 时测量血清中睾酮浓度。结果如图7所示，CD51阳性睾丸间质干细胞在睾丸内明显促进睾 酮的分泌。
[0045] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以 理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换 和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
【权利要求】
1. 一种睾丸间质干细胞的分离方法，其特征在于：所述的分离方法是选择7天或2个 月龄小鼠，分离小鼠睾丸，用胶原酶IV，过滤消化后的细胞悬液，滤过筛网，获得单个细胞， 所述细胞用⑶51抗体进行标记； 将上述已经标记的单个细胞通过流式细胞仪进行分选，收集CD51荧光强度是阴性对 照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述CD51阳性的睾丸间质干细胞。
2. 如权利要求1所述的睾丸间质干细胞的分离方法，其特征在于：所述的分离方法的 具体步骤如下： (1) 利用生后7天或两月龄雄性小鼠，采用颈椎脱白法处死，在无菌条件下打开阴囊 部，取出双侧睾丸并在解剖显微镜下去除被膜和血管，用含1 %双抗的IXPBS反复冲洗，随 后用吸管及枪头轻轻吹打，使间质组织与曲精细管分散开，并用小剪刀剪碎组织部分，随后 放入lmg/ml的IV型胶原酶溶液，于37°C、5% CO2条件下孵育15min，加入含0. 5% BSA的 I XPBS终止胶原酶的消化，1500rmp离心5min ;弃去上清液，用孔径为40 μ m的尼龙网过滤 悬液，去除未消化的曲细精管，收集单细胞，以1500rmp离心5min，得到睾丸细胞悬液； (2) 进行⑶51抗体标记，⑶51抗体与睾丸细胞悬液混合，两者体积比为1:100,4°C微 旋孵育30分钟，对照细胞样本与IgG进行孵育，弃清液，PBS缓冲液洗涤2次，经流式分选 收集表达CD51的抗体荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分 离出所述CD51阳性睾丸间质干细胞。
3. -种培养如权利要求1或2所述的方法得到的睾丸间质干细胞的方法，其特征在 于：将分离得到的睾丸间质干细胞在培养基中进行培养，产生自我更新和增殖的细胞；所 述培养基为无血清培养基，其成分包括：DMEM-F12培养基中加入InM地塞米松、lng/ml LIF, 5mg/liter insulin, 5mg/litertransferrin, 5ug/liter sodium selenite 的 ITS、 5%鸡胚提取物、0. ΙπιΜβ-巯基乙醇、1%非必需氨基酸、1% N2、2% B27(Gibco)、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、20ng/ml PDGFBB、20ng/ml OSM。
4. 一种如权利要求1-3任一项所述的方法得到的睾丸间质干细胞用于制备治疗睾酮 水平低下导致的相关疾病的药物的用途。
【文档编号】A61P5/26GK104212763SQ201410469363
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】项鹏, 姜美花, 蔡炳, 臧志军, 汪建成 申请人:中山大学