miR-1914*和miR-1915的用途
【专利摘要】本发明涉及miR-1914*和/或miR-1915作为大肠癌化疗药物的耐药性标示物的应用，以及其在制备具有抑制大肠癌转移、侵袭、凋亡、增值功能的药物中的应用。本发明中的miR-1914*和miR-1915是存在于血浆中，可以检测，并且它们在大肠癌耐药患者血浆中成下调趋势，其具有相对的组织特异性，既与大肠癌一线化疗耐药有关，同时还影响患者预后。miR-1914*和miR-1915单独使用或联合使用在大肠癌一线化疗耐药中起较为重要的作用，尤其是联合使用效果更好。
【专利说明】miR-1914* 和 miR-1915 的用途
【技术领域】
[0001] 本发明设计涉及一种microRNA的用途，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 大肠癌（colorectal cancer, CRC)为结肠癌和直肠癌的总称，大肠癌是指大肠粘 膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变，预后不良，死亡率较高。全世 界范围内大肠癌的发病率男性处于恶性肿瘤的第三位。据国际癌症研究组织（IARc)提供 的数据显示，亚洲地区，东亚死亡率为120. 1/100, 000。我国随着生活水平提高，饮食习惯改 变，总体发病率也呈现上升趋势。上海地区近年来大肠癌发生率每年上升4. 2%，由原来占恶 性肿瘤的第7位上升至第3位。研究表明，肿瘤的发展程度是影响生存期的重要因素，随着 肿瘤分期的不断进展，患者的5年生存率大幅的下降。然而，在我国仅有10%的患者初诊时 处于Tl期，大部分患者就诊时已经处于进展期，故其5年生存率徘徊在20%-50%之间。目 前在我国临床大肠癌患者T3、T4晚期期患者较多，预后更差，因此尤其需要引起我国临床 肿瘤医生的注意。
[0003] 大肠癌治疗主要为以手术+化疗为主的综合性治疗。而手术患者中约50%的患者 在术后5年内出现复发或转移。术前新辅助化疗可降低大肠癌分期、改善术式选择、提高近 期疗效；术后化疗可抑制大肠癌复发、治疗肿瘤转移。结直肠癌辅助化疗始于20世纪50年 代，经历探索、争论近30年，直至1988年Buyse等发表了第一个结直肠癌辅助化疗有效的 荟萃（meta)分析报告，大家对结直肠癌辅助化疗的有效性才达成共识。10多年来，众多学 者致力于结直肠癌辅助化疗的新药开发和新方案设计，其中较为常用的一线化疗为XELOX ，F0LF0X方案。可望降低分期，创造手术机会，提高术后生存率。化疗疗效取决于肿瘤对化 疗药物的敏感程度，这由肿瘤自身的生物学特性决定。究其原因可能是由于肿瘤的多药耐 药。随着近年来对结直肠癌多药耐药研究，给我们展示了结直肠癌治疗的新突破点，对于结 直肠癌多药耐药逆转剂的开发应用，将使结直肠癌的治疗出现质的飞跃。
[0004] 肿瘤的发生发展与细胞的分子网络异常有密切的关系，细胞从癌变到肿瘤的快速 生长、侵袭和转移是一个多因素作用、多基因参与，经过多阶段变化累积起来的、极其复杂 的病变过程。通过研究基因的改变以寻找肿瘤的发病原因和诊断及其预后方法是研究肿瘤 的重要途径，而最近几年，作为非编码的microRNA对癌症的研究已成为焦点。
[0005] microRNAs在1993年首次被发现，长度18 - 25nt，具有较好的稳定性和易于检 测的特点。microRNA在发育，细胞增殖、分化和凋亡等多种细胞径中都起了重要的调节作 用。据推测microRNA可能调控至少30%的基因的表达况。microRNA在进化上高度保守，它 们广泛存在于植物、线虫以及人类的细胞中它们能有效地抑制相关蛋白质的合成，导致靶 mRNA的降解，或者以其他形式调节机制来抑制靶基因的表达，产生基因沉默。microRNA主 要通过和靶基因 mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC)降解mRNA或阻碍其翻译。microRNA 组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性。最近的研究发现，microRNA表达 与多癌症相关，大约50%得到注解的microRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性点 (fragile site)，这说明microRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用，这些microRNAs 所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能。目前在许多肿瘤中已经发现了比较特异性的 microRNAs。正因为这些microRNA和临床结果、癌症预后密切相关，它们有望成为肿瘤诊 断、靶向治疗及预后预测的新的生物标记物。
[0006] 目前microRNA在肿瘤发生和发展过程中的生物学作用的研究已取得长足进步， 但是还有许多问题有待于进一步解决，许多研究目前尚处于初步阶段。当前microRNAs已 成为肿瘤研究中的又一个热点吸引了众多学者的关注。既往对microRNAs的研究主要集 中于它们在细胞内的活动。2008年，Mitchell等通过分离健康人血浆中的18?24个 核苷酸的RNA，并发现microRNAs能以一种非常稳定的形式存在于人体血楽中，以保护其 免受内源性RNase的降解。当前种种研究表明microRNA，瘤细胞基因表达模式与正常组织 有明显的不同，可以通过检测肿瘤病人循环RNA中的肿瘤特异的mRNA来进行肿瘤的诊 断。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种大肠癌化疗药物的耐药性标示物。
[0008] 本发明为解决第一个技术问题提出的一种技术方案是:miR-1914*和/或 miR-1915作为大肠癌化疗药物的耐药性标示物的应用。
[0009] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种具有抑制大肠癌转移、侵袭、凋亡、增 值功能的药物。
[0010] 本发明为解决第二个技术问题提出的一种技术方案是:miR-1914*和/或 miR-1915、含有miR-1914*的编码基因和/或miR-1915的编码基因的重组载体、含有 miR-1914*的编码基因和/或miR-1915的编码基因的重组病毒或含有miR-1914*的编码基 因和/或miR-1915的编码基因的重组病毒载体在制备具有抑制大肠癌转移、侵袭、凋亡、增 值功能的药物中的应用。
[0011] 本发明要解决的第三个技术问题是提供一种新的大肠癌耐药蛋白。
[0012] 本发明为解决第二个技术问题提出的一种技术方案是：NFIX作为大肠癌耐药蛋 白的应用。
[0013] 本发明具有积极的效果： (1)本发明使用基因芯片技术筛选出miR-1914*和miR-1915两个microRNA。经过多 组大量的验证，表明miR-1914*和miR-1915是存在于血浆中，可以检测，并且它们在大肠癌 耐药患者血浆中成下调趋势，从而可以作为大肠癌化疗药物的耐药性标示物，可以制成试 剂盒，用于区分耐药大肠癌与化疗敏感大肠癌。
[0014] (2)本发明证实了 miR-1914*和miR-1915能够影响耐药大肠癌细胞的耐药性， 使其对化疗药物敏感。且miR-1914*和miR-1915共同作用于耐药大肠癌细胞要强于单个 microRNA对耐药大肠癌细胞的影响。
[0015] (3)本发明证实了 miR-1914*和miR-1915在体内也能影响耐药大肠癌的耐药性， 且对大肠癌细胞的转移，侵袭，凋亡，增值产生影响。从而miR-1914*和/或miR-1915,或者 含有miR-1914*的编码基因和/或miR-1915的编码基因的重组载体、重组病毒、重组病毒 载体可以制备具有抑制大肠癌转移、侵袭、凋亡、增值功能的药物。
[0016] (4)本发明证实了 miR-1914*和miR-1915具有相对的组织特异性，既与大肠癌一 线化疗耐药有关，同时还影响患者预后。miR-1914*和miR-1915单独使用或联合使用在大 肠癌一线化疗耐药中起较为重要的作用，尤其是联合使用效果更好。
[0017] (5)本发明证实了 miR-1914*和miR-1915的共同靶基因为NFIX，miR-1914*和 miR-1915主要通过NFIX影响耐药大肠癌中的耐药蛋白，NFIX是新的大肠癌耐药蛋白。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1是实施例1中的某个样本取RNA水溶液行1%的琼脂糖凝胶电泳图； 图2是实施例1中血浆miR-1914*在四期大肠癌一线化疗有效组、四期大肠癌一线化 疗耐药组中表达的散点图； 图3是实施例1中血浆miR-1915在四期大肠癌一线化疗有效组、四期大肠癌一线化疗 耐药组中表达的散点图； 图4是实施例2中对质粒表达载体（pcDNA-copGFP vector)进行酶切线性化处理的原 理示意图； 图5是实施例2中对质粒表达载体（pGL3_promoter vector, E1761, Promega)进行 酶切线性化处理的原理示意图； 图6是实施例2中转染miR-1914*和miR-1915后对耐药细胞凋亡的各组比较图表； 图7是实施例2中NFIX、Pgp、BCL-2、MDRl、Beta actin在五组细胞组中的表达水平电 泳图； 图8是实施例2中NFIX、Pgp、BCL-2、MDRl、Beta actin在九组细胞组中的表达水平电 泳图； 图9是实施例3中各组瘤体的照片； 图10是实施例3中各组裸鼠成瘤，注射药物后肿瘤比较抑制率分析图表； 图11是实施例3中裸鼠瘤体内的NFIX、CyclinDl、VEGFC，P53、Survivin蛋白的改变 影响电泳图。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可 以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意 表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆 实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的 所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似 或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。统计结果中的表示P < 〇. 05, "**"表示 p < 0. 01。一个RNA前体的双臂分别加工产生miRNA，则根据克隆实验，在表达水平较低的 miRNA命名时在末尾加"
[0020] 实施例1 (人结直肠癌化疗耐药与敏感血浆microRNA的差异表达） 一、实验准备。
[0021] I、研究对象。
[0022] 选取复旦大学附属肿瘤医院大肠外科进行原发病灶切除术IV期大肠癌患者，患者 术前未进行放化疗，术后进行了规范标准的一线XELOX方案化疗。结直肠癌组织参照全国 结直肠癌协作组结直肠癌诊治规范以及AJCC/nCC的--!分期标准行诊断、分级和分 期。研究对象共100例，共分为2组：四期大肠癌耐药组（n=57)、四期大肠癌有效组（n=43)， 具体情况如表1所示。
[0023] 表1大肠癌患者临床资料
【权利要求】
1. miR-1914*作为大肠癌化疗药物的耐药性标示物的应用。 2. miR-1915作为大肠癌化疗药物的耐药性标示物的应用。 3. miR-1914*和miR-1915联合使用作为大肠癌化疗药物的耐药性标示物的应用。 4. miR-1914*、含有miR-1914*的编码基因的重组载体、含有miR-1914*的编码基因 的重组病毒或含有miR-1914*的编码基因的重组病毒载体在制备具有抑制大肠癌转移、侵 袭、凋亡、增值功能的药物中的应用。 5. miR-1915、含有miR-1915的编码基因的重组载体、含有miR-1915的编码基因的重 组病毒或含有miR-1915的编码基因的重组病毒载体在制备具有抑制大肠癌转移、侵袭、凋 亡、增值功能的药物中的应用。 6. miR-1914*和miR-1915、含有miR-1914*的编码基因和miR-1915的编码基因的重 组载体、含有miR-1914*的编码基因和miR-1915的编码基因的重组病毒或含有miR-1914* 的编码基因和miR-1915的编码基因的重组病毒载体在制备具有抑制大肠癌转移、侵袭、凋 亡、增值功能的药物中的应用。 7. NFIX作为大肠癌耐药蛋白的应用。
【文档编号】A61K48/00GK104388541SQ201410562511
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】胡劲松, 蔡三军 申请人:复旦大学附属肿瘤医院