一种治疗肉鸡腹水征合症的rna干扰药物的制备方法和用途及其药效验证方法
【专利摘要】本发明公开了一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法和用途及其药效验证方法，首先构建慢病毒表达载体-HIF-1α-shRNAi，然后将HIF-1α-shRNAi重组质包装成药剂，再注射粒肉鸡体内，沉默HIF-1α基因，抑制下游基因血管内皮生长因子(VEGF)、体内内皮素-1(ET-1)、胰岛素样生长因子II(IGF-II)等表达，控制肺血管重构(PVR)现象，减少心肺功能损伤与腹水形成，最终实现临床肉鸡腹水征合症治疗。本发明具有特异性、高效性及多能性等治疗方面的优点。
【专利说明】一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法和用途及其药效验证方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因治疗【技术领域】，具体是一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的研制方法。
【背景技术】
[0002]肉鸡腹水综合征(ascites syndrome,AS)又称肉鸡肺动脉高压综合征(pulmonaryhypertens1n syndrome, PHS),是在各种因素作用下造成肉鸡相对缺氧或肉鸡生长过快，肺的容积与体重的增加不成正比，在此情况下，由于氧无法满足机体的正常需要，致使其呈现血液黏稠、血容量增加、肝肿大、肺瘀血水肿及肺动脉高压等病理现象，这种在临床上以腹腔积液和右心室肥大、扩张等为主要特征，被视为一种营养代谢病，也是公认的严重危害肉鸡养殖业的疾病之一。该病以肉鸡多发，冬季和早春易发，且分布范围广。北美、玻利维亚、秘鲁、墨西哥、南非、英国、美国、澳大利亚、德国、加拿大、意大利、日本等国家。近年来全球对AS调查发现，其发病率达10%?40%，呈上升趋势，平均发病率为4.2%，年死亡率超过25%，每年约有70亿只肉鸡受到腹水综合征的侵害，经济损失高达100亿美元。显然该病业已成为严重危害肉鸡养殖业发展的全球性问题。
[0003]自从肉鸡AS报道以来，不断有国内外学者对其病因进行了大量的研究，他们认为大多数肉鸡AS的诱发原因主要源于生长过快、组织缺氧、饲养密度过高、海拔过高、温度过低、高钠日粮及低硒日粮、低磷、低VC、VE等因素。其原因是这些诱因均可引起机体相对性缺氧，而对氧的消耗量已超过其心肺功能供氧的极限临界点，以致于机体处于缺氧状态，最终导致肺动脉高压而形成腹水。
[0004]近年来，有关HIF-1 α与肉鸡AS的研究也有些许报道，曾秋凤等采用RT-PCR技术检测正常肉鸡和AS患鸡肺脏HIF-1 a mRNA,结果表明，AS患鸡肺脏HIF-1 a mRNA表达丰度极显著高于正常肉鸡(P < 0.01)，揭示了 HIF-1 α与腹水综合征高度相关性。Zhang等证明了肉鸡食用高盐的饮水可以增加HIF-1a mRNA表达，引起肉鸡腹水发生。Toshiyuki等对鸡胚心室肌细胞中HIF-1 α基因进行了 cDNA克隆，得到了 HIF-1 α基因全长cDNA序列等。但是利用阻断HIF-1 α基因在肉鸡AS治疗上还未见相关研究，因此，抑制HIF-1 α的活性为治疗肉鸡AS提供了新靶点。目前，RNA干扰HIF-1 α基因的国内外研究主要在哺乳动物和人的研究较多，在肿瘤疾病中治疗，如Wang等通过HIF-1 a -shRNAi转染到人乳腺癌细胞中，发现HIF-1a与VEGF基因表达量分别下降了 91.63%、66.8%，从而抑制乳腺癌细胞的生长。Zhou等应用RNA干扰HIF-1 α将有效地抑制口腔鳞状细胞癌的发展，特别是抑制和预防癌症细胞的血管生成和生存，因此，它可以作为一种强有力的和特定的治疗口腔癌。Chen等利用RNA干扰HIF-1 α在小鼠肿瘤研究中，发现HIF-1 α和血管内皮生长因子的表达明显减少，抑制肿瘤血管生成和减毒转移，显著抑制肿瘤的生长。Min等在人肺腺癌多药耐药细胞的RNA干扰HIF-1 α实验中发现多药耐药基因及蛋白显著减少。此外，RNA干扰还在肝、呼吸系统及眼科等疾病中也得到广泛应用。以上RNA干扰HIF-1 α基因的研究成果为本发明探索RNA干扰HIF-1 α基因对肉鸡腹水的形成机理提供了非常重要的思路。
[0005]综上所述，肺动脉高压是对适应缺氧反应时机体的一种表现，同时在许多疾病中也是一种重要的病理生理症状。目前的研究发现，HIF-Ια是调控肺动脉高压的中心环节。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的研制方法，本发明利用RNA干扰技术来阻断HIF-1 α基因在肉鸡PAEC/肉鸡AS中有效作用。主要通过检测HIF-1 a ,ET-UVEGF基因表达及生理生化指标情况，进一步研究参与低氧环境中PAEC增殖与凋亡的作用机制等，并更深入地从分子水平上阐明RNA干扰HIF-1 α在肉鸡AS发生作用机制，将可能为临床肉鸡AS的预防和治疗提供一种新的途径和方法。
[0007]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0008]一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法，首先构建慢病毒表达载体-HIF-1 a -shRNAi，然后将HIF_1 a -shRNAi重组质粒包装成药剂，即为治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物。
[0009]作为本发明进一步的方案:HIF-1 a -shRNAi的慢病毒表达载体的构建:采用DNA重组技术将HIF-1 a -RNAi双链定向亚克隆入PU6启动子即可。
[0010]作为本发明进一步的方案:所述HIF-1 a -shRNAi的慢病毒表达载体的构建:采用pGCSIL-GFP载体，转染细胞为293T细胞。
[0011]所述的制备方法制备的治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的应用，将治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物注射到粒肉鸡体内，沉默HIF-1 α基因，抑制下游基因血管内皮生长因子(VEGF)、体内内皮素-1 (ET-1)、胰岛素样生长因子II(IGF-1I)的表达。
[0012]作为本发明进一步的方案:所述的应用的药效验证方法，包括:(1)RNA干扰HIF-1 α基因对肉鸡PAEC生长实验和(2) RNA干扰HIF-1 α基因在肉鸡体内对腹水形成实验;
[0013]步骤(I) RNA干扰HIF-1 α基因对肉鸡PAEC生长实验，具体包括:(1.1)鉴定RNA干扰靶点是否成功连接到慢病毒载体；(1.2) HIF-1 a -shRNAi细胞转染；(1.3)模拟缺氧实验；(1.4)细胞的爬片与DAPI染色；(1.5) HIF-la, VEGF、ET-1基因表达量的检测；
[0014]步骤(2)RNA干扰HIF-1a基因在肉鸡体内对腹水形成实验，具体包括:(2.1)人工诱导肉鸡腹水征合症试验；(2.2)动物分组；(2.3)动物接种；(2.4)检测。
[0015]作为本发明进一步的方案:步骤(1.2) HIF-1 a -shRNAi细胞转染是借助Lipofectamine2000转染细胞，筛选出最佳的干扰祀点。
[0016]作为本发明进一步的方案:步骤(2.1)人工诱导肉鸡腹水征合症试验是采用三利用环境低温、饲料添碘甲状腺原氨酸(T3)诱发肉鸡腹水征合症。
[0017]作为本发明进一步的方案:步骤⑴RNA干扰HIF-1 α基因对肉鸡PAEC生长实验:通过RNA干扰技术、细胞转染进行分组实验，利用RT-PCR、荧光定量PCR、Western Blot流式细胞仪检测方法对HIF-1 a、VEGF、ET-1基因表达进行检测以验证RNA干扰HIF-1 α基因在肉鸡PAEC中的效果。
[0018]作为本发明进一步的方案:步骤⑵RNA干扰HIF-1a基因在肉鸡体内对腹水形成实验:择用正常肉鸡和人工诱导的腹水征合症肉鸡为实验对象，采用RNA干扰技术进行肉鸡体内实验，以测定肉鸡中右心室重与全心室重的比值(RV/TV)、红细胞总数(PCV)、红细胞压积(HCT)、血红蛋白含量(Hb)、血清中丙二醛(MDA)、胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脱氢酶(LDH)指标，从而分析RNA干扰HIF-Ια对肉鸡腹水发病过程中生理生化指标的变化；与此同时，再通过RT-PCR、实时荧光定量PCR、Western Blot、免疫组化方法检测各组织中的HIF-1 a、VEGF、ET-1基因mRNA的表达情况；最终结合以上实验结果，验证肉鸡体内RAN干扰HIF-1 α对肉鸡腹水形成的影响
[0019]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0020]本发明采用RNA干扰技术，将对肉鸡体内的缺氧诱导因子-1 a (HIF_1 α )进行沉默，达到治愈肉鸡腹水综合征效果；通过RNA干扰技术、细胞转染等进行分组实验，利用RT-PCR、荧光定量PCR、Western Blot流式细胞仪等检测方法对HIF-1 α、VEGF, ET-1基因表达进行检测以验证RNA干扰HIF-1 α基因在肉鸡中的治疗效果；证实了该RNA干扰药物可应用于肉鸡腹水征合症治疗，且具有特导、高效性、多能性及治疗效果好等方面的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的研制方法的技术路线图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合【具体实施方式】对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
[0023]请参阅图1，一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法，首先构建慢病毒表达载体-HIF-1 a -shRNAi，然后将HIF_1 a -shRNAi重组质粒包装成药剂，即为治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物。
[0024]其中，构建慢病毒表达载体-HIF-1 a -shRNAi的步骤为:根据Genbank中报道的HIF-1 α基因寡核苷酸序列设计并合成引物，通过寡核苷酸序列正、反义链经过变性、复性后形成双链HIF-1 a -RNAi。采用DNA重组技术，将HIF_1 a -RNAi双链定向亚克隆入PU6启动子，得到慢病毒表达载体pGCSIL-GFP的-HIF-1 a -shRNAi。
[0025]所述治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物在治疗肉鸡腹水征合症中的应用，将治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物注射到粒肉鸡体内，沉默HIF-1 α基因，抑制下游基因血管内皮生长因子(VEGF)、体内内皮素-1 (ET-1)、胰岛素样生长因子II(IGF-1I)等表达，控制肺血管重构(PVR)现象，减少心肺功能损伤与腹水形成，最终实现临床肉鸡腹水征合症治疗。
[0026]所述治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的药效验证方法，包括以下步骤
[0027](I)RNA干扰HIF-1a基因对肉鸡PAEC生长实验
[0028](1.1)鉴定RNA干扰靶点是否成功连接到慢病毒载体:将HIF-1 a -shRNAi重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，选择阳性菌落进行PCR扩增和基因测序鉴定RNA干扰靶点是否成功连接到慢病毒载体。采用同样的方法，构建无效干扰序列-HIF-1 a -shRNA重组质粒。
[0029](1.2) HIF-1 a -shRNAi 细胞转染
[0030](1.2.1)肉鸡PAEC的分离及培养:取2周龄的肉鸡肺动脉，用0.25%的胰酶灌注，消化肉鸡肺动脉内皮细胞，经多次冲洗，收集消化的细胞悬液进行培养，在37°C、5% C02条件下培养3代后的细胞用于实验。
[0031](1.2.2)病毒的包装、浓缩及病毒滴度测定:质粒中抽提试剂盒提取
[0032]HIF-1 a -shRNAi/HIF-1 a -shRNA中质粒DNA，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度,保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8?2.0之间。用Lipofectamine 2000转染293T细胞，收获重组慢病毒并以0.45 μ m滤器过滤上清液后超速离心法浓缩。同时，利用ELISA测定病毒滴度，使病毒滴度达到lX108cfu/mL以上可用于转染。
[0033](1.2.3)转染:于第3代PAEC生长至约70%?80%融合时准备转染，采用脂质体(Lipofectamin 2000)法转染细胞，转染后24h在荧光显微镜下观察转染效率，筛选出转染效果达75%的细胞，备用于模拟缺氧实验。
[0034](1.3)模拟缺氧实验
[0035]设常氧为对照组，用CoCl2制造细胞缺氧环境为实验组，各组设为3小组:空白组(未转染重组质粒)、阴性组(转染HIF-1a-shRNA重组质粒)、干扰组(转染HIF-1 a -shRNAi重组质粒)。各小组6次重复，实验3次。分别在常氧和缺氧环境下培养，间隔3h收集培养上清液，共收集8次，检测收集各组培养上清液及细胞用于HIF-1 a、VEGF、ET-1mRNA基因的表达量。
[0036](1.4)细胞的爬片与DAPI染色
[0037]转染成功的细胞进行细胞爬片、固定、DAPI染色、封片与观察等方法，并在荧光显微镜下计数并了解转染效率。
[0038](1.5) HIF-la, VEGF, ET-1 基因表达量的检测
[0039](L 5.1) RT-PCR检测:收集细胞提取细胞总RNA，进行HIF-1 α、VEGF、ET-1基因RT-PCR扩增，将其反应物进行凝胶电泳检测。
[0040](1.5.2)荧光定量PCR检测:提取的细胞中总RNA通过荧光PCR溶解曲线判断扩增特异性、扩增曲线计算目的基因相对表达量，比较各组之间差异。
[0041](1.5.3)Western Blot检测:收集细胞提取总蛋白后,进行Western Blot检测细胞内HIF-1a及VEGF基因的蛋白水平。并以稳定表达的基因β-actin为内参照。
[0042](1.5.4) ELASA检测:取细胞培养上清液作为检测定样本，取等体积样本及检测试剂加入酶标板孔中，TMBE溶液显色，酶标仪650nm波长下读取数值，测出ET-1表达量。
[0043](1.5.5)流式细胞仪检测:将各组细胞培养72小时后，用0.25%胰酶消化，收集细胞，进行流式细胞仪检测各组细胞周期和凋亡情况。
[0044](1.6)统计学处理
[0045]实验数据应用SPSS 18.0软件处理，计量资料以均数土标准差(M±SD)表示，方差分析进行组间比较，P < 0.05表示差异显著性。
[0046](2) RNA干扰HIF-1 α基因在肉鸡体内对腹水形成实验
[0047](2.1)人工诱导肉鸡AS试验
[0048]取2周龄肉鸡利用环境低温、饲料添加三碘甲状腺原氨酸(Τ3)诱发肉鸡AS ;从2周龄开始试验，随后进行的临床病理学变化规律观察，统计腹水发病率，选出腹水发病肉鸡用于干扰实验。
[0049](2.2)动物分组
[0050]选择2周龄的正常肉鸡/人工诱导AS的肉鸡将随机分别分为空白组、阴性组、干扰组。每小组10只，各小组重复6次，实验3批。
[0051](2.3)动物接种
[0052]采用肉鸡翼下静脉注射法，干扰组将注射HIF-1 a -shRNAi重组质粒悬液，空白组和阴性组分别注射等量的生理盐水和无效干扰HIF-1 a -shRNA重组质粒悬液。在常氧/缺氧环境下饲喂数天后，采血样进行生化指标检测，同时从各组中抽取鸡样进行处死，取组织进行检测。
[0053](2.4)检测
[0054](2.4.1)生化指标检测:用称量法测定各组鸡的右心室与全心室的比值(RV/TV)，血液分析仪法测定PCV、HCT、Hb，用生化试剂盒测定血清中MDA、GSH-Px、LDH生化指标，监测肉鸡腹水发病过程中生理生化指标的变化情况。
[0055](2.4.2) RT-PCR检测:分批处死各实验组肉鸡，取组织样本(肺、肺动脉、心脏、肝器官)提取组织中总RNA，进行HIF-1 α、VEGF, ET-1基因RT-PCR扩增，将其反应物进行凝胶电泳检测比较各组之间差异。
[0056](2.4.3)荧光定量PCR检测:提取的组织中总RNA通过荧光定量PCR溶解曲线判断扩增特异性、扩增曲线计算目的基因相对表达量，比较各组之间差异。
[0057](2.4.4) Western Blot检测:取各实验组肉鸡内脏器官(肺、肺动脉、心脏、肝)提取组织中总蛋白并做B1frad法定量，进行Western Blot检测细胞内HIF-1 a、VEGF、ET_1基因的蛋白水平。并以稳定表达的基因β-actin为内参照。
[0058](2.4.5)免疫组织化学染色:取各实验组肉鸡的内脏器官(肺、肺动脉、心脏、肝)，用常规石蜡切片制片，3，3' - 二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水、透明、封片，各组均设阴性对照。采用MS细胞图像分析系统进行分析。
[0059]上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。
【权利要求】
1.一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法，其特征在于，首先构建慢病毒表达载体-HIF-1 a -shRNAi，然后将HIF_1 a -shRNAi重组质粒包装成药剂，即为治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物。
2.根据权利要求1所述的治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法，其特征在于，HIF-1 a -shRNAi的慢病毒表达载体的构建:采用DNA重组技术将HIF-1 a -RNAi双链定向亚克隆入PU6启动子即可。
3.根据权利要求1或2所述的治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法，其特征在于，所述HIF-1 a -shRNAi的慢病毒表达载体的构建:采用pGCSIL_GFP载体，转染细胞为293T细胞。
4.一种如权利要求1或2所述的制备方法制备的治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的应用，其特征在于，将治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物注射到粒肉鸡体内，沉默HIF-1a基因，抑制下游基因血管内皮生长因子(VEGF)、体内内皮素-1 (ET-1)、胰岛素样生长因子II(IGF-1I)的表达。
5.一种如权利要求4所述的应用的药效验证方法，其特征在于，包括:(I) RNA干扰HIF-1a基因对肉鸡PAEC生长实验和(2) RNA干扰HIF_1 a基因在肉鸡体内对腹水形成实验; 步骤(I) RNA干扰HIF-1 a基因对肉鸡PAEC生长实验，具体包括:(1.1)鉴定RNA干扰靶点是否成功连接到慢病毒载体；(1.2) HIF-1 a -shRNAi细胞转染；(1.3)模拟缺氧实验；(1.4)细胞的爬片与DAPI染色；(1.5)HIF-la、VEGF、ET-l基因表达量的检测； 步骤(2)RNA干扰HIF-1a基因在肉鸡体内对腹水形成实验，具体包括:(2.1)人工诱导肉鸡腹水征合症试验；(2.2)动物分组；(2.3)动物接种；(2.4)检测。
6.根据权利要求5所述的药效验证方法，其特征在于，步骤(1.2) HIF-1 a -shRNAi细胞转染是借助Lipofectamine 2000转染细胞,筛选出最佳的干扰祀点。
7.根据权利要求5所述的药效验证方法，其特征在于，步骤(2.1)人工诱导肉鸡腹水征合症试验是采用三利用环境低温、饲料添碘甲状腺原氨酸(T3)诱发肉鸡腹水征合症。
8.根据权利要求5-7之一所述的药效验证方法，其特征在于，步骤(I)RNA干扰HIF-1 α基因对肉鸡PAEC生长实验:通过RNA干扰技术、细胞转染进行分组实验，利用RT-PCR、荧光定量PCR、Western Blot流式细胞仪检测方法对HIF-1 a、VEGF, ET-1基因表达进行检测以验证RNA干扰HIF-1 α基因在肉鸡PAEC中的效果。
9.根据权利要求5-7之一所述的药效验证方法，其特征在于，步骤(2)RNA干扰HIF-1 α基因在肉鸡体内对腹水形成实验:择用正常肉鸡和人工诱导的腹水征合症肉鸡为实验对象，采用RNA干扰技术进行肉鸡体内实验，以测定肉鸡中右心室重与全心室重的比值(RV/TV)、红细胞总数(PCV)、红细胞压积(HCT)、血红蛋白含量(Hb)、血清中丙二醛(MDA)、胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脱氢酶(LDH)指标，从而分析RNA干扰HIF-1 α对肉鸡腹水发病过程中生理生化指标的变化；与此同时，再通过RT-PCR、实时荧光定量PCR、Western Blot、免疫组化方法检测各组织中的HIF-1 a , VEGF, ET-1基因mRNA的表达情况；最终结合以上实验结果，验证肉鸡体内RAN干扰HIF-1a对肉鸡腹水形成的影响。
【文档编号】A61K48/00GK104383557SQ201410573326
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】刘平, 胡国良, 郭小权, 曹华斌, 张彩英, 刘佩, 侯小露, 黄云飞 申请人:江西农业大学