补骨脂衍生物透皮吸收剂的制备方法和临床应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种补骨脂衍生物透皮吸收剂的制备方法和临床应用，取补骨脂粉末用乙醇提取，提取物再经全乙酰化制取衍生物。补骨脂提取物全乙酰化衍生物加羧甲基纤维素(或聚乙烯醇)2-10g、甘油1g、蓖麻油1g、氮酮1-2g。称取海藻酸钠共10g，加入水100ml，羧甲基纤维素2-10g制备成透皮制剂。该制剂，制备方法简单，易溶于水，原料来源广，成本低廉，无副作用。
【专利说明】补骨脂衍生物透皮吸收剂的制备方法和临床应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学临床用药，具体说是涉及一种适用于骨折、骨不连、股骨头坏死、 骨质疏松的治疗与预防的药物。
【背景技术】
[0002] 骨折愈合是一个极其复杂的生物学过程，受诸多因素的影响，如何早期促进骨折 愈合一直是骨伤科领域研究的重点课题。近年来，对骨折迟缓愈合、不愈合治疗研究取得较 大进展。中药治疗骨折，历史悠久，经验独特，应用广泛。已从传统的内服外敷，发展为从单 味或复方中提取有效成份制成的针剂，以其简便、疗效确切而显示其优越性。但中药促进骨 折愈合的疗效机理是一项极为复杂的过程。随着研究的深入，中药对其的影响受到越来越 多学者的关注。
[0003] 补骨脂是豆科植物补骨脂的干燥果实，含有多种有效成分。体外试验表明，补骨脂 能抑制分离破骨细胞在骨片上形成的吸收陷窝的增加与扩张，说明其对分离破骨细胞有抑 制作用。研究发现，补骨脂素对大鼠成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性有明显促进作用。 补骨脂素的衍生物包括5-甲氧基补骨脂素（5-M0P)，8_甲氧基补骨脂素（8-M0P)和一 些取代物，现将其中几种典型结构列如下：Pabulenol ;Saxalin ;王因草；水合氧化前胡素； 独活醇；甲酸氧化前胡素一些羟基衍生物。 林举择等用MTT法测定补骨脂注射液对大鼠成骨细胞增殖的影响，结果显示原代成骨 细胞逐渐形成纤维细胞集落，有成纤维细胞型表现，传代成骨细胞逐渐被细胞分泌的基质 所包埋，形成钙化。补骨脂对新生大鼠成骨细胞的增殖有显著促进作用，表明利用胰酶消化 法可以分离培养出纯度高、数量较多且培养时间明显缩短的成骨细胞。补骨脂抗骨质疏松 的作用与其增加成骨细胞的数量和促进成骨细胞的增殖能力有关。[林举择，陈升恺，罗家 栋，补骨脂注射液对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响[J].中医正骨，2004,16?) :6.]
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种全乙酰化补骨脂衍生物透皮制剂的制备方法。是提供 一种制备方法简单，易溶于水，原料来源广泛的治疗和预防骨折的药物。
[0005] 本发明的优点是制备方法简单，原料来源广，成本低廉，无副作用。
[0006] 本发明的补骨脂衍生物透皮制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0007] 提取方法：取补骨脂粉末（过40目筛）100g，加10倍量70%乙醇，浸泡20hr，力口 热回流提取2h，提取2次，每次40min。合并2-3次滤液，减压回收溶剂，浓缩，干燥，干燥物 用甲醇溶解，活性碳脱杂质再除去甲醇溶剂，浓缩，干燥，得到补骨脂素提取物。
[0008] 补骨脂衍生物制备：将补骨脂素提取物30g，乙酸酐200ml和氨基磺酸2g，混合于 室温下反应30min，再将温度继续上升至60-90°C反应20min完成反应。至反应完全结束， 过滤除去未反应乙酸酐。产物中加入乙酸乙酯200ml冲洗，碳酸氢钠5% (10mLX2)冲洗。 然后干燥，过滤，减压浓缩得到产品。
[0009] 补骨脂全乙酰化衍生物透皮制剂的制备： 1. 方案1 :补骨脂全乙酰化衍生物透皮制剂的组方：补骨脂全乙酰化衍生物l〇g、羧甲 基纤维素2-10g、甘油lg、蓖麻油lg、氮酮l-2g。称取补骨脂衍生物10g，加入水100ml、羧 甲基纤维素2-10g，搅拌至澄明胶液，搅拌下依次加入氮酮l-2g、甘油lg、蓖麻油lg，混匀， 用碳酸氢钠调节PH值为7-7. 5左右，超声15min。使用时涂布于纱布上，覆盖在治疗部位。 2. 方案：2 :补骨脂全乙酰化衍生物透皮制剂的组方：补骨脂全乙酰化衍生物10g、聚乙 烯醇2-10g、甘油lg、蓖麻油lg、氮酮l-2g。称取补骨脂衍生物10g，加入水100ml、聚乙烯 醇2-10g，搅拌至澄明胶液。搅拌下依次加入氮酮l-2g、甘油lg、蓖麻油lg，混匀，用碳酸氢 钠调节PH值为7-7. 5左右，超声15min。使用时涂布于纱布上，覆盖在治疗部位。
[0010] 所述的药物组合物，在制备促进人或动物骨折愈合的治疗中的应用。
[0011] 为了进一步的验证本发明成品制剂的疗效，我们将上述具体制备方法1-3中制备 的药物进行了相应的动物试验，现将结果报告如下。
[0012] 试剂：骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)抗体购于北京博奥森生物技术有限公司
[0013] 动物分组模型制备：40只无特定病原体昆明小鼠（由郑州大学医学院实验动物中 心[Scxk(豫）2010-0002])提供。小鼠体重的范围为25?30g，3月龄，雌雄各半。 40只小鼠随机分成治疗组、模型组两组，每组20只。治疗组、模型组小鼠以20%氨基 甲酸乙酯5mg/kg腹腔注射麻醉，暴露大鼠股骨，用钢锯将股骨锯开，以达到骨髓渗出为度， 将创口缝合。然后治疗组小鼠在伤口附近肢体外敷透皮制剂，qd，连续给药7-14d并连续3d 肌内注射青霉素以抗感染。模型组小鼠不作处理。
[0014] 标本采集与组织学处理 40只小鼠分别在第1、2周末处死，取股骨做组织学制备。股骨用4% PFA加0. IM磷酸 缓冲液调整PH值为7. 2,室温固定3d。然后用20% EDTA加0. IM磷酸缓冲液调整PH值为 7. 2,浸泡S-IOd脱钙，再经系列乙醇脱水，石蜡包埋，沿股骨干长轴方向行厚度切成5 μ m厚 片，部分行HE染色。随机取5张股骨片，分别在X400奥林巴斯FV1000放大激光扫描共聚 焦显微镜下观察。
[0015] 免疫组化染色 小鼠处死后以骨痂为中心，包括上、下骨端各Icm取出标本,置入5%乙二胺四乙酸 (EDTA)液中脱钙10-15d，酒精逐级脱水，透明，浸蜡，石蜡包埋，5μπι厚连续切片，ABC法免 疫组化染色（ABC试剂盒由Vector公司提供）。正常组骨组BMP-McAb染色为阴性，骨折后 骨痂组织染色为阳性。
[0016] 统计学处理采用SPSS10. 0软件进行统计分析。各组数据以[±s表示，两组间比较 采用独立样本t检验，P < 0. 05表示差异有统计学意义。
[0017] 结果与结论 2. 1BMP-2蛋白的免疫阳性产物表达于骨基质内和骨母细胞胞质内，呈棕黄色。采用半 定量法判断BMP-2蛋白的表达情况：选10个高倍视野，显色的阳性反应细胞数< 25 %为+， 25?50%为++，> 75%为+++，无明显阳性反应细胞为_。计数资料的统计学分析采用卡 方检验。检验标准α =〇.〇5。 2. 2术后7d两组ΒΜΡ-2蛋白的表达情况比较 表1海藻酸钠衍生物水溶液对骨折小鼠骨中BMP-2含量的影响（2W，η = 20)
【权利要求】
1. 补骨脂素衍生物透皮制剂的制备方法，其特征在于补骨脂素经乙醇提取，减压回收 溶剂，浓缩，干燥；干燥物用甲醇溶解，活性碳脱杂质再除去甲醇溶剂，浓缩，干燥。将补骨 脂素提取物，乙酸酐和催化剂氨基磺酸混合进行全乙酰化反应得到补骨脂素全乙酰化衍生 物。
2. 补骨脂素全乙酰化衍生物透皮制剂的组方：补骨脂全乙酰化衍生物10g、羧甲基纤 维素（或聚乙烯醇）2-10g、甘油lg、蓖麻油lg、氮酮l-2g。
3. 权利2全乙酰化补骨脂衍生物透皮制剂在制备促进人或动物骨折愈合的治疗中的 应用。
【文档编号】A61K36/487GK104288219SQ201410573329
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】王宝英, 王永学, 司艳莉, 张利彬, 范秉琳 申请人:新乡医学院