神经生长因子在制备治疗脊髓损伤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种神经生长因子(NGF)在制备治疗脊髓损伤的应用。NGF在制备治疗脊髓损伤药物中的应用，药物的形式可以是粉针剂、水剂、脂质体。NGF可以抑制内质网应激，减少内质网引起的脊髓神经元凋亡，从而对脊髓损伤产生治疗作用。
【专利说明】神经生长因子在制备治疗脊髓损伤药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种NGF的应用，尤其涉及NGF在制备治疗脊髓损伤药物中的应用，包 括各种因素导致的脊髓原发性损伤和继发性损伤的治疗。
【背景技术】
[0002] 脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI)是一种严重的神经系统创伤，通常可导致严 重的神经功能障碍和残疾，不仅影响患者个人生理及心理，而且对家庭及社会造成沉重的 负担。世界上脊髓损伤瘫痪病人有上千万，我国亦逾百万，据统计美国每年新增1万多伤病 员，我国仅北京地区脊髓损伤发生率约800人/年。已成为高发伤病之一。
[0003] 脊髓损伤可以分为原发性损伤和继发性损伤。脊髓损伤发生后，其损伤临近部位 的组织受损破坏，发生出血、坏死，为原发性损伤；随后损伤区及临近部分发生缺血、再灌注 损伤，脂质过氧化产生氧自由基损害，细胞内钙离子超载，炎症介质产生，兴奋性神经递质 损害，细胞凋亡等一系列病理生理过程，称为继发性损伤。继发性损伤是一种细胞和分子水 平主动调节的过程，具有可逆性。继发性损伤可加重原发性损伤，造成脊髓功能障碍，致使 机体全瘫或部分瘫痪。如果能阻断此连锁反应中的某一环节，则可能明显减轻继发性损伤， 促进脊髓功能的恢复。而对原发性脊髓损伤的主要依靠外科手术，到目前为止尚无有效治 疗发现，故对继发性损伤进行药物控制治疗，有可能成为减轻脊髓损伤的有效途径。
[0004] 研宄表明，脊髓损伤继发性与神经细胞凋亡有关，细胞凋亡又称细胞程序性死亡， 是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。其受控于 一系列基因顺序表达而发现的主动的耗能的自杀性死亡，是维持机体细胞种类和数量动态 平衡的重要机制，与多种疾病的发生发展密切相关。目前已知的三条主要信号转导途径来 控制细胞凋亡：1、线粒体通路；2、死亡受体通路；3、内质网通路。内质网通路机制是近年来 发现的一条新的凋亡途径，且很多动物实验已被初步证明内质网通路参与了脊髓损伤的继 发性病理机制。内质网是真核细胞中重要的细胞器，参与蛋白质合成、折叠和寡聚化，还参 与脂类代谢、类固醇代谢的合成以及Ca 2+调节等。内质网非常敏感，葡萄糖营养素的缺乏、 蛋白质糖基化的抑制、二硫键形成的障碍、蛋白质运转异常、Ca 2+耗竭等刺激均可导致内质 网功能失调，即内质网应激。内质网应激时内质网内蛋白质不能正确折叠而被大量滞留， 导致未折叠蛋白反应，激发内质网和高尔基体、细胞核之间的信号转导，抑制蛋白质合成并 启动内质网相关基因转录，一定程度的内质网应激可增强内质网的应激能力，促进内质网 功能恢复。但是内质网应激持续存在或过强时将诱导内质网相关性蛋白细胞凋亡，造成组 织损伤。脊髓损伤时，发生的缺血缺氧、酸中毒、ATP耗竭、妈超载以及大量自由基生成等均 可诱导内质网应激，从而使其在脊髓损伤发生发展中具有重要意义。
[0005] 未折叠蛋白应答是一种对抗内质网应激的自身保护机制，有利于细胞内环境的稳 定。其由一个内质网分子伴侣GRP78和3个内质网应激感受蛋白所介导，分别是IRE-1、 ATF6、PERK。无内质网应激时IRE-1、ATF6、I3ERK分别与分子伴侣GRP78结合，处于无活性 状态。一旦内质网应激，GRP78从3种跨U旲蛋白上解尚，转而去结合未折萱蛋白。解尚后的 感受蛋白被活化并启动为折叠蛋白应答，降低未折叠或错误折叠蛋白在内质网内的积累， 通过IRE-1、ATF6、PERK三条信号途径，恢复内质网的正常功能，是一个促生存相应。长时间 或过量的应激，会损伤内质网，这三条通路同时也能诱导内质网应激介导的细胞凋亡信号 通路，去除无功能细胞，其并非直接诱导凋亡，而是通过激活下游凋亡信号分子：Ca SpaSel2 和GADD153/CH0P是内质网应激特异性的转录因子，在死亡受体和线粒体通路中不被活化。
[0006] 目前对于脊髓损伤治疗，在临床尚无特殊用药，治疗不是很理想。损伤早期多用糖 皮质激素（地塞米松、甲基强的松龙等）来减轻炎症反应。甲基强的松龙是目前应用最为 广泛且公认最有效的治疗脊髓损伤的药物。大剂量应用甲基强的松龙可通过多种机制阻止 脊髓损伤继发性损伤的发生，但是其在临床应用中会导致病人出现过敏、休克，导致或加重 溃疡、糖尿病等相关并发症，为治疗脊髓损伤增加了一定的风险，也引起了临床医生的担忧 和警惕。故研发一种副作用少且有疗效的脊髓损伤治疗药物已经成为目前研宄的热点和难 点。
[0007] 近来研宄表明，脊髓损伤后给予外源性生长因子可以促进神经功能的恢复。神经 营养因子还可与其他中和轴突生长抑制因子，共同起到促进轴突生长和补充的作用。
[0008] 自1953年意大利科学家Levi-montalcini发现NGF，至今已有60年历史。神经 生长因子（NGF)是神经营养因子中最早被发现且是目前研宄最为透彻的。现在研宄最多的 NGF是从小鼠颁下腺中分离的分子量为140 000的糖蛋白。它包含α、β、γ三个亚单位， 活性区是β亚单位，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体，与 人体NGF的结构具有高度的同源性，生物效应也无明显的种间特异性。NGF是具有神经元 营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经 元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。作为神经营养因子 最重要的当然是它的神经营养作用，在胚胎发育的一定时期内，NGF为效应神经元生存所必 须。体外实验证实，如果培养液中不加 NGF，神经细胞即不能长出轴突，也不能存活。NGF及 其受体也广泛分布于中枢神经系统，由海马和脑皮质产生的NGF可通过胆碱能神经逆行运 输至前脑基底核，维持胆碱能神经元的存活和功能。在胚胎发育早期，中枢NGF的含量决定 胆碱能神经的密度。在无胆碱能神经支配的小脑区和下丘脑，NGF含量也较高，表明除胆碱 能神经外，NGF对其他类神经元也有营养作用。同时NGF还具有神经保护作用当NGF的效 应神经元受到损伤时，例如切断轴突、药物损害，甚至缺血、缺氧等，神经元将发生一系列的 病理改变，包括死亡，实验研宄证实NGF通过：（1)抑制毒性氨基酸的释放；（2)抑制钙离子 超载；（3)抑制超氧自由基的释放；（4)抑制细胞凋亡等机制而明显减轻或防止这些继发性 病理损害的发生来保护神经元细胞。NGF的第三个作用是促神经生长作用，实验证明，在切 断轴突后给予NGF将减少某些神经元的变性与死亡，无疑这将有助于提高轴突再生的可能 性。同时它还影响轴突再生开始的时间和参与再生的神经元数目以及再生神经的质量和速 度。这些信息提示我们NGF在脊髓损伤的神经保护和修复能有非常明显的作用。除此之外， NGF在神经系统以外，也发挥一定效应。NGF可以影响免疫细胞的活性，进而调节免疫系统 功能。NGF还可以抑制某些肿瘤的有丝分裂，促其向良性分化。它甚至还能促进创口组织的 修复反应，促进创口愈合。如果能在脊髓损伤中亦有这些作用，可大大降低脊髓损伤后其他 并发症的发生几率，且能加快病人的术后恢复。
【发明内容】
[0009] 本发明的主要目的在于提供一种NGF的应用，NGF应用于制备治疗和预防各种原 因造成的原发性脊髓损伤或继发性脊髓损伤。
[0010] 本发明的另一个目的在于提供一种NGF的应用，NGF对各种原因造成的原发性脊 髓损伤或继发性脊髓损伤有明显的治疗和预防作用。
[0011] 为实现以上目的，一种NGF的应用，我们分别通过动物实验和体外细胞实验来证 明NGF确实通过抑制内质网应激来减少脊髓神经元细胞的凋亡从而对各种原因造成的原 发性脊髓损伤或继发性脊髓损伤有明显的治疗和预防作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1各组脊髓损伤后运动功能评分。
[0013] 图2各组脊髓损伤HE染色。
[0014] 图3各组脊髓损伤免疫组化图。
[0015] 图4各组脊髓损伤神经保护相关蛋白的表达。
【具体实施方式】
[0016] 以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优 选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定 的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背 离本发明的精神和范围的其他技术方案。
[0017] 实施例INGF对实验性挤压致脊髓损伤大鼠的治疗作用
[0018] 动物模型和分组：SD大鼠30只，体重220-250g，雌性。用以下方法制作脊髓损伤 大鼠模型：10%水合氯醛3.5ml/kg腹腔麻醉。俯卧固定大鼠四肢，作背部后正中切口。切 开皮肤以及皮下组织，显露并咬除T9锥板和棘突。用15g动脉夹压迫脊髓2min，麻醉清醒 后双下肢呈现弛缓性瘫痪。术后7日给予注射用头孢唑林50mg/kg腹腔注射每日2次，并 每日给予大鼠人工排泄大小便2次。将动物随机分为3组（每组10只大鼠），假手术组： 只接受T9椎板切除手术，下肢行动正常；对照组：脊髓损伤后，不注射NGF溶液，只给予相 同剂量的生理盐水；NGF治疗组：在脊髓损伤30Min后注射用0. 9% NaCl稀释的NGF20 μ g/ kg，之后保持20 μ g/kg/day的量，直到脊髓损伤有明显恢复。
[0019] 检测指标和结果：
[0020] BBB评分：根据BBB评分标准，分别于术后1，3, 7,14天进行评定，并遵循双盲法观 察原则，通过计分来评价动物双后肢功能状况。通过BBB评分，结果发现皮下注射NGF治疗 组后肢恢复情况比对照组明显好转。各组损伤大鼠 BBB评分结果见表1及图1。HE染色： 分别于术后7天和14天处死大鼠取材，石蜡包埋，切片（5 μ m)，通过苏木精-伊红染色，于 镜下观察发现给予NGF后，大鼠脊髓组神经细胞凋亡明显少于对照组，见附图2。免疫组化 学染色：分别于术后7天和14天处死大鼠取材，石蜡包埋，切片（5 μ m)，经DAB显色，发现给 予NGF后，大鼠脊髓损伤处神经元和神经胶质细胞GRP78, CHOP和Caspase-12蛋白表达明 显少于对照组，见附图3。Western blot:于术后7天处死大鼠取材，用化学发光试剂盒曝 光、显影、定影，发现与对照组相比，NGF治疗组GRP78, CHOP和Caspase-12表达明显减少， 见附图4 ;而神经保护因子GAP-43表达明显增加，见附图4。
[0021] 表1各组脊髓损伤大鼠不同时间点BBB评分比较（X土s)
[0022]
【权利要求】
1. 一种NGF的应用，其特征在于，NGF在制备治疗脊髓损伤药物中的应用，包括各种因 素导致的脊髓原发性损伤和继发性损伤的治疗。
【文档编号】A61K38/18GK104436166SQ201410589321
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】张宏宇, 肖健, 邬芬赞, 张超, 李校堃 申请人:温州医科大学