白介素-18抗病毒口腔喷剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种白介素-18抗病毒口腔喷剂,喷剂的成分包括重组人类白介素-18(rhIL-18)，所述rhIL-18是以第36位的ASP位点为界去除了N-端前导序列之后的rhIL-18成熟肽，其质量浓度为1-1000μg/ml，优选的，质量浓度为5-50μg/ml。本发明提供了一种具有广谱抗病毒作用的口腔喷剂：白介素-18抗病毒口腔喷剂，可用于治疗和预防病毒感染引起的上呼吸道感染疾病。
【专利说明】白介素_18抗病毒口腔喷剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种口腔喷剂，具体涉及白介素-18抗病毒口腔喷剂。
【背景技术】
[0002] 病毒性传染病如SARS、埃博拉病毒出血症、艾滋病（AIDS)对人类极具威胁。病毒 可侵犯人体不同组织器官，感染细胞引起疾病。病毒是病原微生物中最小的一种，能在宿主 细胞内繁殖。病毒的核心是核糖核酸（RNA)或脱氧核糖核酸（DNA)，外壳是蛋白质，不具有 细胞结构。病毒感染并寄生于宿主细胞，依赖宿主细胞代谢系统进行自我复制繁殖。宿主 细胞在病毒基因提供的遗传信息调控下合成病毒核酸和蛋白质，然后在胞浆内装配成病毒 体，病毒体再释出而感染其他细胞，如此反复，直至所有细胞都被病毒感染。病毒不能独立 自营生活，必须依靠宿主的酶系统才能使其本身繁殖（复制），病毒核酸有时整合于细胞， 不易消除，因此抗病毒药研宄发展缓慢。
[0003] 上呼吸道感染有70%?80%由病毒引起，包括流感病毒和副流感病毒、鼻病毒、 冠状病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒等；另有20%?30%的上感由 细菌引起，细菌感染常继发于病毒感染之后。
[0004] 人类白介素-18有很强的刺激Thl细胞产生IFN-Y的活性，故命名为 IGIF(IFN-y inducing factor), 1996年被重新命名为IL-18。具有调节人免疫系统、刺激 T细胞增殖、诱导T细胞和NK细胞产生具有杀灭病毒特性的干扰素伽玛（IFN- Y )的功能。
[0005] 对病毒感染，目前还没有特效药，主要靠自身免疫来慢慢杀灭病毒。因此，免疫功 能低下的婴幼儿、老年人、重病患者容易受病毒传染。目前市场上还缺乏对上呼吸道感染的 特效抗病毒药物，尤其是广谱的抗病毒药物。
【发明内容】
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种具有广谱抗病毒作用的口腔喷剂：白介 素-18抗病毒口腔喷剂，可用于治疗和预防病毒感染引起的上呼吸道感染疾病。
[0007] 本发明采用的技术方案是：一种白介素-18抗病毒口腔喷剂，喷剂的成分包括重 组人类白介素-18 (rhIL-18)，所述rhIL-18是以第36位的ASP位点为界去除了 N-端前导 序列之后的rhIL-18成熟肽，其质量浓度为1-1000 y g/ml，优选的，质量浓度为5-50 y g/ ml 〇
[0008] 优选的，所述喷剂的成分还包括抗内毒素特异抗体，其抗体效价为100-10000滴 度，优选的，抗体效价为1000-3000滴度。
[0009] 优选的，所述喷剂的成分还包括抗流感病毒特异抗体。
[0010] 优选的，所述抗流感病毒特异抗体是用裂解灭活的一种或多种流感病毒的抗原 免疫动物所获得的经纯化后的特异抗体；所述的抗流感病毒抗体含量按抗体效价计为 100-50000滴度，优选的，抗体效价计为1000-5000滴度。
[0011] 优选的，所述流感病毒为HONl、HlNl、H2N2、H3N2。
[0012] 优选的，所述喷剂的成分还包括人类免疫球蛋白0. 01-10mg/ml或重组人类白蛋 白（rHSA)0.1-10mg/ml。
[0013] 优选的，所述喷剂的成分还包括葡萄糖酸氯已定或醋酸氯已定，其质量百分比浓 度为 0. 001% -0. 5%。
[0014] 优选的，所述喷剂的成分还包括pH为6-8. 5的缓冲液：浓度5-200mM，EDTA钠盐： 浓度l-20mM，甘油：质量百分比浓度1% -20%，或pH为6-8. 5的缓冲液：浓度5-200mM，甘 油：质量百分比浓度1% -20%，甘露醇：质量百分比浓度1% -10%。
[0015] -种制备上述白介素-18抗病毒口腔喷剂的方法，其特征在于：包括如下步骤：
[0016] 1)配制pH为6-8. 5的缓冲液；
[0017] 2)用步骤1)所制备的缓冲液配制含下述任一种或多种成分的溶液：EDTA钠盐、甘 油、甘露醇；
[0018] 3)用步骤2)所制备的溶液溶解或稀释rhIL-18成熟肽及其它要添加的蛋白至终 体积的10-20%，所述蛋白为重组人类白蛋白或人类免疫球蛋白；
[0019] 4)当配方中含有一种或多种抗体时，用步骤1)所制备的缓冲液稀释抗体溶液至 终体积的10-20% ;
[0020] 5)当配方中含有氯已定时，先用纯净水稀释所要添加量的氯已定至产品终体积的 50%或以上；
[0021] 6)成品液制备：
[0022] 将步骤3)所制备的溶液，用步骤1)所制备的缓冲液定容至终体积，即得；
[0023] 或者混合步骤3)和步骤4)所制备的溶液，并用步骤1)所制备的缓冲液定容至终 体积，即得；
[0024] 或者混合步骤3)、步骤4)和步骤5)所制备的溶液，并用步骤1)所制备的缓冲液 定容至终体积，即得；
[0025] 7)无菌过滤后分装于口腔喷雾瓶。
[0026] 优选的，所述步骤2)制备得到的溶液中含50% (v/v)甘油和6% (w/v)EDTA，或者 是30% (v/v)甘油和30% (w/v)甘露醇缓冲液。
[0027] 本发明具有的优点和积极效果是：本发明开发了一种具有广谱抗病毒作用的口 腔喷剂：白介素-18抗病毒口腔喷剂；该口腔喷剂含有重组人类白介素-18,具有调节人 免疫系统、刺激T细胞增殖、诱导T细胞和NK细胞产生具有杀灭病毒特性的干扰素伽玛 (IFN-Y)的功能，可用于治疗和预防病毒（包括流感病毒）感染引起的上呼吸道感染疾病。 当与流感病毒抗体和氯已定配伍时，降低感染率达到71 %，优于单独使用白介素-18,氯已 定和抗体的效果之和，具有协同作用。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
[0029] 实施例1
[0030] 一种白介素-18抗病毒口腔喷剂的制备方法，包括如下步骤：
[0031] 1)50%甘油-PE缓冲液制备：首先制备pH7. 4的PBS缓冲液：分别称取磷酸二氢钾 (KH2PO4)O. 27g，磷酸氢二钠（Na2HPO4) I. 42g，氯化钠（NaCl) 8g，氯化钾（KCl)O. 2g，加去离子 水约SOOmL充分搅拌溶解，然后加入IM盐酸调pH至7. 4,最后用去离子水定容到1L，既得； 分别取制得的PBS缓冲液50ml，甘油50ml，混匀后加入6g的EDTA-2Na，制得50 %甘油-PE 缓冲液；
[0032] 2)取rhIL-18成熟肽50mg、重组人类白蛋白（rHSA) lOOOmg，用IOOml步骤1)制得 的50 %甘油-PE缓冲液稀释后备用；
[0033] 3)将步骤2)制得的溶液IOOml用纯净水定容至IOOOml后再加入Iml薄荷香精， 混匀，用0. 2 y的滤膜过滤除菌后分装于喷雾瓶便制得白介素-18抗病毒口腔喷剂。
[0034] 实施例2
[0035] 一种白介素-18抗病毒复合口腔喷剂的制备方法，包括如下步骤：
[0036] 1)分别取甘油和实施例1中制得的pH7. 4的PBS缓冲液各50ml，混匀后加入6g 的已0了4-2似，制得体积比50%甘油^^缓冲液备用；
[0037] 2)取rhIL-18成熟肽50mg、重组人类白蛋白（rHSA) lOOOmg，用IOOml步骤1)制得 的50 %甘油-PE缓冲液稀释后备用；
[0038] 3)取抗内毒素特异抗体，用PBS缓冲液稀释并调效价至5000滴度，制备IOOrnl备 用；
[0039] 4)取抗流感病毒H1N1、H2N2、H3N2多克隆组合抗体，用PBS缓冲液稀释并调效价 至5000滴度，制备100ml备用；
[0040] 5)将步骤2)制得的溶液100ml、步骤3)制得的溶液IOOrnl和步骤4)制得的溶液 IOOrnl混合后用PBS缓冲液定容至1000ml，再加入Iml薄荷香精混匀，用0. 2 y的滤膜过滤 除菌后分装于喷雾瓶便制得白介素-18抗病毒复合口腔喷剂。
[0041] 实施例3
[0042] 一种抗病毒抗细菌双效复合口腔喷剂制备方法，包括如下步骤：
[0043] 1)分别取甘露醇30g，甘油30ml，加实施例1中制得的pH7. 4的PBS缓冲液至 100ml，混匀制得体积比30%甘油-甘露醇缓冲液；
[0044] 2)取rhIL-18成熟肽50mg、人类免疫球蛋白100mg，用IOOrnl步骤1)制得的30% 甘油-甘露醇缓冲液稀释后备用；
[0045] 3)取抗内毒素特异抗体，用PBS缓冲液稀释并调效价至5000滴度，制备IOOrnl备 用，
[0046] 4)取抗流感病毒H1N1、H2N2、H3N2多克隆组合抗体，用PBS缓冲液稀释并调效价 至5000滴度，制备100ml备用，
[0047] 5)取市购20%葡萄糖酸氯已定2. 5ml，加到700ml纯净水中混匀备用；
[0048] 6)将步骤2)制得的溶液100ml、步骤3)制得的溶液100ml、步骤4)制得的溶液 IOOrnl预先混合后，再与步骤5)制得的溶液700ml混合，最后加入Iml薄荷香精，混匀，用 〇. 2 y的滤膜过滤除菌后分装于喷雾瓶便制得抗病毒抗细菌双效复合口腔喷剂。
[0049] 对比例1
[0050] 一种抗流感病毒抗体口腔喷剂的制备方法，包括如下步骤：
[0051] 1)分别取甘露醇30g，甘油30ml，加实施例1中制得的pH7. 4的PBS缓冲液至 100ml，混匀制得体积比30%甘油-甘露醇缓冲液；
[0052] 2)取重组人类白蛋白（rHSA) lOOOrng，用IOOrnl步骤1)制得的30%甘油-甘露醇 缓冲液稀释后备用；
[0053] 3)取抗流感病毒H1N1、H2N2、H3N2多克隆组合抗体，用PBS缓冲液稀释并调效价 至5000滴度，制备IOOml备用；
[0054] 4)将步骤2)制得的溶液IOOml和步骤3)制得的溶液IOOml混合后，用PBS缓冲 液定容至IOOOml，再加入Iml薄荷香精混匀，用0. 2y的滤膜过滤除菌后分装于喷雾瓶便制 得抗流感病毒口腔喷剂。
[0055] 对比例2
[0056] -种抗细菌口腔喷剂的制备方法，包括如下步骤：
[0057] 1)分别取甘露醇30g，甘油30ml，加实施例1中制得的pH7. 4的PBS缓冲液至 100ml，混匀制得体积比30%甘油-甘露醇缓冲液；
[0058] 2)取人类免疫球蛋白100mg，用IOOml步骤1)制得的30%甘油-甘露醇缓冲液稀 释后备用；
[0059] 3)取市购20%葡萄糖酸氯已定2. 5ml，加到700ml纯净水中混匀备用；
[0060] 4)将步骤2)制得的溶液IOOml与步骤3)制得的溶液700ml混匀后，加入Iml薄 荷香精，混匀，用〇. 2 y的滤膜过滤除菌后分装于喷雾瓶便制得抗病毒抗细菌双效复合口 腔喷剂。
[0061] 实施例4
[0062] 比较不同配方口腔喷剂在预防感冒（包括病毒性和细菌性感冒）中的效果：
[0063] 在感冒高发期，从幼儿园挑选4-5岁志愿者（经家长同意）120名（不分性别），随 机分成6组（如表1所示），每组20名儿童。给组1-5的孩子分别用实施例1-5所制备的 口腔喷剂，给组6 (对照组）的孩子用生理盐水口腔喷剂，每天喷口腔4次，每次3-4喷；连 续进行20天，每天观察每组儿童有否感冒症状：发烧、咽喉肿痛、咳嗽、流鼻涕等症状并记 录。试验结果如表1所示：对照组中有14人感染，感染率70%;组1中有11人感染上感冒， 感染率55% ;组2中有5人感染，感染率25% ;组3中有4人感染，感染率20% ;组4中有 9人感染，感染率45% ;组5中有13人感染，感染率65%。显然，组1-4的口腔喷剂均有一 定的预防感冒的作用；尤其是，实施例3的复合口腔喷剂有显著预防感冒效果。而且，与对 照组相比，实施例3的功效（降低感染率71 % )大于实施例1 (降低感染率21 % ) +对比例 1 (降低感染率36% ) +对比例2 (降低感染率7% )的总和，这说明有效成分rhIL-18、流感 抗体及氯已定的混合使用有协同作用，比单独使用效果更好。
[0064] 表1.比较不同配方口腔喷剂的预防感冒功效：
【权利要求】
1. 一种白介素-18抗病毒口腔喷剂，其特征在于：所述喷剂的成分包括重组人类白介 素-18 (rhIL-18)，所述rhIL-18是以第36位的ASP位点为界去除了 N-端前导序列之后的 rhIL-18成熟肽，其质量浓度为1-1000 y g/ml，优选的，质量浓度为5-50 y g/ml。
2. 根据权利要求1所述的白介素-18抗病毒口腔喷剂，其特征在于：还包括抗内毒素 特异抗体，其抗体效价为100-10000滴度，优选的，抗体效价为1000-3000滴度。
3. 根据权利要求1或2所述的白介素-18抗病毒口腔喷剂，其特征在于：还包括抗流 感病毒特异抗体。
4. 根据权利要求3所述的白介素-18抗病毒口腔喷剂，其特征在于：所述抗流感病毒 特异抗体是用裂解灭活的一种或多种流感病毒的抗原免疫动物所获得的经纯化后的特异 抗体；所述的抗流感病毒抗体含量按抗体效价计为100-50000滴度，优选的，抗体效价计为 1000-5000 滴度。
5. 根据权利要求4所述的白介素-18抗病毒口腔喷剂，其特征在于：所述流感病毒为 H0N1、H1N1、H2N2、H3N2。
6. 根据权利要求1-5任一项所述的白介素-18抗病毒口腔喷剂，其特征在于：还包括 人类免疫球蛋白〇? 〇l_l〇mg/ml或重组人类白蛋白（rHSA)O. l-10mg/ml。
7. 根据权利要求6所述的白介素-18抗病毒口腔喷剂，其特征在于：还包括葡萄糖酸 氯已定或醋酸氯已定，其质量百分比浓度为0. 001 % -0. 5%。
8. -种权利要求1-7任一项所述的白介素-18抗病毒口腔喷剂的制备方法，其特征在 于：包括如下步骤： 1) 配制pH为6-8. 5的缓冲液； 2) 用步骤1)所制备的缓冲液配制含下述任一种或多种成分的溶液：EDTA钠盐、甘油、 甘露醇； 3) 用步骤2)所制备的溶液溶解或稀释rhIL-18成熟肽及其它要添加的蛋白至终体积 的10-20%，所述蛋白为重组人类白蛋白或人类免疫球蛋白； 4) 当配方中含有一种或多种抗体时，用步骤1)所制备的缓冲液稀释抗体溶液至终体 积的 10-20% ; 5) 当配方中含有氯已定时，先用纯净水稀释所要添加量的氯已定至产品终体积的 50%或以上； 6) 成品液制备： 将步骤3)所制备的溶液，用步骤1)所制备的缓冲液定容至终体积，即得； 或者混合步骤3)和步骤4)所制备的溶液，并用步骤1)所制备的缓冲液定容至终体 积，即得； 或者混合步骤3)、步骤4)和步骤5)所制备的溶液，并用步骤1)所制备的缓冲液定容 至终体积，即得； 7) 无菌过滤后分装于口腔喷雾瓶。
9. 根据权利要求8所述的白介素-18抗病毒口腔喷剂的制备方法，其特征在于：所述 步骤2)制备得到的溶液中含50% (v/v)甘油和6% (w/v)EDTA，或者是30% (v/v)甘油和 30% (w/v)甘露醇缓冲液。
【文档编号】A61P11/00GK104474534SQ201410811340
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】邹潮 申请人:哈德逊（天津）生物技术有限责任公司