抗铁调素抗体及其用途的制作方法

本申请要求申请号为No.61/791,953，申请日为2013年3月15日的美国临时申请的优先权，该申请全部内容通过引用并入本文。

序列表

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发明背景

铁是活生物体生长和发育需要的必需微量元素。在哺乳动物中，铁含量是通过控制铁吸收、铁再循环以及从储存铁的细胞中释放铁的方式来调节。铁主要在十二指肠和上部空肠中通过肠上皮细胞吸收。铁通过骨髓中的网状内皮组织巨噬细胞、肝Kupffer细胞和脾从降解的红细胞再循环。铁的释放是通过铁转运蛋白(ferroportin)来控制，该蛋白是一种位于肠上皮细胞、巨噬细胞和肝细胞(这些都是能将铁释放至血浆中的主要细胞)表面上的主要铁输出蛋白。铁调素结合铁转运蛋白，并通过使其从细胞表面内化并降解来降低其功能活性(Nemeth等,Science,306:2090-3,2004)。

发明概述

本文提供能够结合铁调素(Hep)或铁调素肽的抗体及其抗原结合片段。一方面，本文提供抗体或其抗原结合片段，其特异性结合铁调素或铁调素肽的N末端并在体外和/或在体内中和铁调素的活性。

一方面，本文提供特异性结合铁调素或铁调素肽的抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，

其中所述重链可变区包含：

(i)具有SEQ ID NO:55-57任一的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO:58-60任一的氨基酸序列的CDR2，和

(iii)具有SEQ ID NO:61-63任一的氨基酸序列的CDR3，

且所述轻链可变区包含：

(i)具有SEQ ID NO:64-66任一的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO:67-69任一的氨基酸序列的CDR2，和

(iii)具有SEQ ID NO:70-72任一的氨基酸序列的CDR3。

一方面，本文提供特异性结合于铁调素或铁调素肽的抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，

其中所述重链可变区包含：

(i)具有SEQ ID NO:1-3任一编码的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO:4-6任一编码的氨基酸序列的CDR2，和

(iii)具有SEQ ID NO:7-9任一编码的氨基酸序列的CDR3，

且所述轻链可变区包含：

(i)具有SEQ ID NO:10-12任一编码的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO:13-15任一编码的氨基酸序列的CDR2，和

(iii)具有SEQ ID NO:16-18任一编码的氨基酸序列的CDR3。

一方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含IgG1或IgG4可变重链和可变轻链。

一方面，本文提供特异性结合铁调素或铁调素肽的抗体或其抗原结合片段，其通过将具有SEQ ID NO:19-27任一的氨基酸序列的肽注射啮齿动物(即，小鼠、大鼠或兔)而制得。在另一实施方式中，所述肽与载体(例如，钥孔血蓝素(KLH))偶联，或与佐剂(完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(IFA))共同施用。在另一实施方式中，肽与半抗原(例如，二硝基酚[DNP])以及载体偶联。

在一些情况中，抗体或其抗原结合片段结合的铁调素肽可以具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列。

本文提供抗体或其抗原结合片段，其特异性结合包含Hep-5、Hep-9、Hep-20、Hep 22和Hep25任一的氨基酸序列的表位。

在一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合包含Hep-20(SEQ ID NO:22)、Hep 22(SEQ ID NO:23)和Hep25(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的表位。

在一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合包含Hep-5(SEQ ID NO:25)或Hep-9(SEQ ID NO:24)的表位。在另一种实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合包含铁调素的氨基酸残基1-9的表位。在另一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合包含铁调素氨基酸残基1-9的表位的2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸残基。

在另一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体，其包含SEQ ID NO:55编码的重链CDR1、SEQ ID NO:58编码的重链CDR2、SEQ ID NO:61编码的重链CDR3、SEQ ID NO:64编码的轻链CDR1、SEQ ID NO:67编码的轻链CDR2和SEQ ID NO:70编码的轻链CDR3。

在另一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体，其包含SEQ ID NO:56编码的重链CDR1、SEQ ID NO:59编码的重链CDR2、SEQ ID NO:62编码的重链CDR3、SEQ ID NO:65编码的轻链CDR1、SEQ ID NO:68编码的轻链CDR2和SEQ ID NO:71编码的轻链CDR3。

在另一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体，其包含SEQ ID NO:57编码的重链CDR1、SEQ ID NO:60编码的重链CDR2、SEQ ID NO:63编码的重链CDR3、SEQ ID NO:66编码的轻链CDR1、SEQ ID NO:69编码的轻链CDR2和SEQ ID NO:72编码的轻链CDR3。

抗体可以是，例如，单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一种实施方式中，人源化可变重链包含如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。在另一种实施方式中，人源化可变轻链包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。

一方面，本文提供抗体或其抗原结合片段，其包含如下序列表中所示的重链可变区框架区和轻链可变区框架区，其中在SEQ ID NO:1-18任一中鉴别的CDR被插入采用Kabat编号的框架区中。

抗原结合片段可以是，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv片段、单链结合多肽、Fd片段、可变重链、可变轻链或dAb片段。抗原结合片段可以是，例如AVIMER、双特异性抗体或重链二聚体。重链二聚体可以是，例如，骆驼或鲨鱼重链构建体。

本文描述的抗体或其抗原结合片段可具有约1至约10pM、约10至约20pM、约1至约29pM、约30至约40pM、约10至约100pM、或约20至约500pM的解离常数(Kd)。

本文描述的抗体或其抗原结合片段可具有小于约500pM、小于约400pM、小于约300pM、小于约200pM、小于约100pM、小于约75pM、小于约50pM、小于约30pM、小于约25pM、小于约20pM、小于约18pM、小于约15pM、小于约10pM、小于约7.5pM、小于约5pM、小于约2.5pM或小于约1pM的解离常数(Kd)。

本文描述的抗体或其抗原结合片段可具有约10^-9至约10^-14、约10^-10至约10^-14、约10^-11至约10^-14、约10^-12至约10^-14、约10^-13至约10^-14、约10^-10至约10^-11、约10^-11至约10^-12、约10^-12至约10^-13或10^-13至约10^-14的对铁调素或铁调素肽的亲和性。

本文提供了组合物，其包含本文所述的抗体或抗原结合片段，以及可接受的载体或赋形剂。

本文还提供了分离的核酸分子，其包含编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。本文还提供了包含可操作地与调控序列连接的核酸分子的表达载体。本文还提供了包含本文提供的载体或核酸分子的宿主细胞。本文还提供了使用宿主细胞产生抗体的方法，包括在合适的条件下培养该宿主细胞以使核酸表达来产生抗体。

本文还提供了使用本文所述的抗体或其抗原结合片段的治疗方法。一方面，本文提供了在需要的受试者中治疗铁内稳态障碍的方法，包括向所述受试者施用本文所述的组合物。另一方面，本文提供了在需要的受试者中调节铁调素活性的方法，包括向所述受试者施用本文所述的组合物。再另一方面，本文提供了在需要的受试者中治疗铁内稳态障碍的方法，包括向所述受试者施用本文所述的组合物。再另一方面，本文提供了在需要的受试者中治疗血色素沉着病的方法，包括向所述受试者施用本文所述的组合物。再另一方面，本文提供了治疗具有病理或不当升高(相对于身体和血浆的铁储存不当升高)的铁调素水平的受试者的方法，包括向所述受试者施用本文所述的组合物。再另一方面，本文提供了在需要的受试者中治疗贫血的方法，包括向所述受试者施用本文所述的组合物。再另一方面，本文提供了在需要的受试者中治疗或减轻炎症的方法，包括向所述受试者施用本文所述的组合物。在一个实施方式中，要治疗或者减轻的炎症是慢性炎症。在再另一方面，本文提供了在需要的受试者中治疗炎性疾病的方法，包括向所述受试者施用本文所述的组合物。再另一方面，本文提供了在需要的受试者中治疗感染的方法，包括向所述受试者施用本文所述的组合物。感染可以是，例如，细菌、真菌或病毒感染。再另一方面，本文提供了治疗铁难治性缺铁性贫血(IRIDA)的方法。再另一方面，本文提供了治疗炎症性贫血(AI)和慢性病性贫血(ACD)的方法。再另一方面，本文提供了治疗慢性肾病(CKD)的方法。再另一方面，本文提供了治疗与升高的铁调素相关的癌症和化疗诱导的贫血(CCIA)的方法。再另一方面，本文提供了治疗与升高的铁调素相关的神经炎性疾病的方法。

在某些情况下，上述的任一方法进一步包括向所述受试者施用一种或多种红细胞生成刺激剂。红细胞生成刺激剂包括，但不限于，红细胞生成素、红细胞生成素变体、红细胞生成刺激试剂(ESA；例如依泊亭α[如等]、依泊亭β[如NeoRecormon等]、达依泊汀(Darbepoetin)α[如等]、甲氧基聚乙二醇依泊亭β[如等]等)、缺氧诱导因子(HIF)脯氨酰羟化酶抑制剂、骨髓衍生红系细胞因子(例如erythroferrone)、微型铁调素(mini-hepcidin)肽(参见，如Ganz等的U.S公开No.20120040894，其通过引用将其并入本文)、铁调素的反义抑制剂(参见，如Lin和Babitt.的U.S.公开No.20100136015，其通过引用将其并入本文)、铁调素的siRNA抑制剂(同上)、铁调素的miRNA抑制剂(同上)、抗BMP-2抗体(同上)、抗-BMP-4抗体(同上)、抗BMP-6抗体(同上)、小分子抑制剂(同上)、抗IL-6抗体(参见，如Cornfeld等的U.S.公开No.20110059080，其通过引用将其并入本文)、抗TNF-α抗体、甲氨蝶呤、抗炎剂(如，类固醇[如，皮质类固醇等]；非甾体抗炎药[NSAID；如阿司匹林、布洛芬、萘普生、环加氧酶(COX)抑制剂等]、激素(如，睾酮)或免疫选择性抗炎衍生物[ImSAID；例如三肽FEG(Phe-Glu-Gly)及其D-异构体feG])、铁调素调节蛋白(hemojuvelin)、结合红细胞生成素的抗体，及其组合。在一种实施方式中，特异性结合铁调素的抗体或其抗原结合片段和红细胞生成刺激剂同时施用或顺序施用。

本文组合物的施用可为任意合适的方式，包括但不限于，注射。在一种实施方式中，注射可以是，例如静脉内注射、皮下注射、肌内注射或脊柱注射到脑脊液(CSF)中。

本文还提供容器装置，包含本文描述的组合物。该容器装置可为可以容纳液体或冻干组合物的任何适宜的容器，包括但不限于，小瓶(vial)、注射器、瓶子(bottle)、静脉输液(IV)袋(intravenous bag)或安瓿。注射器可能能够容纳适合于注射入受试者的任意体积的液体，包括但不限于0.5cc、1cc、2cc、5cc、10cc或更多。

本文提供了试剂盒，其包含本文描述的一种或多种组合物。一方面，本文提供用于治疗与升高的铁调素水平相关的病症或铁内稳态障碍的试剂盒，其包含本文所述的抗体或其抗原结合片段以及红细胞生成刺激剂。可以知晓，在一些情况中，铁调素可处于正常范围内但是相对于铁储存不当地升高。

另一方面，本文提供用于治疗与升高的铁调素水平相关的病症或铁内稳态障碍的试剂盒，其包含本文所述抗体或其抗原结合片段和附着或包装于容器的标签，所述标签描述了抗体或其抗原结合片段与红细胞生成刺激剂联合使用。

另一方面，本文提供用于治疗与升高的铁调素水平相关的病症的试剂盒，其包含红细胞生成刺激剂和附着或包装于容器的标签，所述标签描述了红细胞生成刺激剂与本文所述抗体或其抗原结合片段联合使用。

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说明书中提到的所有的出版物、专利、专利申请通过引用并入本文，等同于各单独出版物、专利或专利申请专门地和单独地被述及通过引用并入本文。

附图简介

本发明的新颖特征特别地在权利要求中说明。对本发明的特征和优点的更好地理解参考下文中描述使用本发明基本原则的解释性实施方式的具体说明以及如下附图实现：

图1：用于免疫BALB/c小鼠以形成杂交瘤并发现MAbs H32、583和1B1的铁调素肽抗原序列的例子；

图2：使用用K18-生物素铁调素-25涂布并用抗小鼠IgG(H+L)偶联HRP检测的中性抗生物素蛋白(neutravidin)涂布平板对分离的杂交瘤进行第一轮筛选的例子。显示的是在HRP显色并添加终止溶液后450nm下的光密度(OD)值。注意到第9列D-F行中的阳性信号(>2.0OD)。阳性对照和阴性对照孔分别是G12和H12。

图3：使用从杂交瘤上清液捕获小鼠IgG的兔抗小鼠Fc涂布的平板，从确定为阳性的第一轮筛选(图2)进行分离的杂交瘤的第二轮筛选的例子。随后，使用链霉抗生物素蛋白偶联HRP筛选结合的小鼠IgG与K18-生物素铁调素-25的结合。显示的是在HRP显色并添加终止溶液后450nm下的光密度(OD)值。注意到第9列D行中的阳性信号(>2.0OD)。阳性对照和阴性对照孔分别是G12和H12。

图4：对于抗铁调素结合呈阳性的杂交瘤功能性活性的筛选。孔使用抗-小鼠Fc抗体涂布并封闭。在重复孔中，每个指示的杂交瘤上清液被添加至包含1ng NT-生物素铁调素-25示踪剂的结合缓冲液中，有或没有100ng合成铁调素-25。在向孔中加入终止缓冲液后，使用SA-HRP以450nm处OD值检测NT-生物素铁调素-25的结合。抗体5A3(与4B1和5A4一样)在不具有铁调素-25的情况下在缓冲液中显示出极佳的结合，并且在结合缓冲液中被铁调素-25完全阻断，表明了杂交瘤5A3包含可以在溶液中结合NT-生物素铁调素-25和合成铁调素-25二者的抗体。最终从杂交瘤5A3获得的克隆随后被重命名为MAb 583；因此，Mab 583的数据显示于5A3孔中。虽然在本筛选中克隆4B1和5A4也明显为阳性，但在进一步扩增、功能性和同种型筛选后二者在测试时都不能产生功能性抗铁调素抗体。

图5：MAb 583、1B1、和H32的特征，包括抗原、免疫BALB/c小鼠的血清滴度、注射部位、注射频率、用于制备杂交瘤的组织以及通过每轮筛选产生这些分离的功能性抗铁调素单克隆抗体的成功率。

图6：8个MAb开发活动(campaign)的功能性抗-铁调素-25MAb的总成功率。筛选了总共11,845个杂交瘤，从而发现了MAb H32、583和1B1。

图7：蛋白A柱上Mab 583纯化的还原性SDS-PAGE分析。稀释的杂交瘤上清液的粗制品、柱洗涤期间收集的流穿(flow-through)级分以及高度纯化的MAb 583(纯化批次003)和1B1(纯化批次003)通过考马斯(Coomassie)染色分析。道的说明如图右侧所示。

图8：在溶液中铁调素-25中和Mab 583的ELISA分析。这一基于溶液的筛选测试了0.0和0.1-8.0ng的合成铁调素-25(x轴)阻断(中和)溶液中20ng MAb 583的结合的能力。在结合缓冲液中合成铁调素(0.1-8.0ng)在2小时内加入20ng MAb 583中。铁调素-25处理的Mab 583溶液加入到具有共价结合至马来酸酐活化微平板的铁调素-25(200ng/孔)的重复孔中。使用偶联HRP的兔抗小鼠IgG(H+L)以TMB作为底物来检测Mab 583与铁调素-25的结合。在加入终止缓冲液后，使用分光光度计通过测量450nm处的OD(光密度)将Mab 583与结合的铁调素-25的结合量化。

图9：考马斯染色的非还原性三甲基甘氨酸(tricine)SDS-PAGE凝胶(左图)及用MAb 583探测的铁调素-25、铁调素-22、铁调素-20和抗菌肽(protegrin)(1.5μg/道)的Western印迹(右图)。图下方的图例提供了道的说明。

图10：MAb 583和MAb 1B1对铁调素-25、铁调素-20、K18-生物素铁调素-25、K24-生物素铁调素-25和NT-生物素铁调素-25的结合活性的考马斯染色的还原性SDS-PAGE及Western印迹。图下方的图例提供了道的说明。

图11：24μg/ml的MAb 583对结合至链霉抗生物素蛋白涂布的Biacore芯片的K18-生物素铁调素-25、NT-生物素铁调素-25和K24-生物素铁调素-25的结合亲和性的Biacore分析。数据分别显示了Mab 583对NT-生物素铁调素-25的高亲合力和皮摩尔级的解离常数，及对于K18-生物素铁调素-25和K24-生物素铁调素-25的大约降低一个级数(one log)的亲和常数。

图12：5μg/ml的MAb 583对结合至链霉抗生物素蛋白涂布的Biacore芯片的K18-生物素铁调素-25和NT-生物素铁调素-25的结合亲和性的Biacore分析。1200秒(20分钟)内Biacore迹线的斜率几乎没有变化，表明了Mab 583对K18生物素铁调素-25和NT-生物素铁调素-25的低结合解离常数。

图13：图12所示的Biacore实验的结合亲和性的结果。数据显示与在24μg/ml下测定时相比，MAb 583对K18-生物素铁调素-25与对NT-生物素铁调素-25相比具有更高的亲和性和皮摩尔常数(KA)以及更低的解离常数(KD)。

图14：显示24μg/ml的MAb 1B1对K18-生物素铁调素-25、NT-生物素铁调素-25和K24-生物素铁调素-25的结合亲和性的Biacore数据。这些数据显示了MAb 1B1对K24-生物素铁调素-25有强的亲和性，对K18-生物素铁调素-25有较弱的亲和性，而对NT-生物素铁调素-25没有亲和性。该实验进行了500秒，且在结合K24-生物素铁调素-25和K18-生物素500秒后通过Biacore仪器没有观察到或计算出1B1的解离。

图15：显示24μg/ml的MAb 1B1对于K24-生物素铁调素-25的结合亲和性的Biacore数据。这些数据显示了1B1对于K24-生物素铁调素-25的强亲和性及500秒内MAb 1B1没有从K24-生物素铁调素-25的解离，表明了1B1对于铁调素-25可能具有低的皮摩尔至飞摩尔级的解离常数。

图16：铁调素-25、铁调素-22、铁调素-20对以100ng/ml每孔涂布的MAb 583抗体的结合的ELISA标准曲线分析。通过ELISA测量NT-生物素铁调素-25示踪剂(1ng/孔)相对于铁调素-25、铁调素-22和铁调素-20的相对结合。使用GraphPad Prism软件进行四参数逻辑回归分析以获得所示的曲线。曲线的右移证明了与MAb 583对铁调素-25的亲和性相比，MAb 583对于铁调素-22和铁调素-20的相继降低的亲和性。

图17：与NT-生物素铁调素-25相比较，鼠铁调素-1(小鼠铁调素-25)、抗菌肽和铁调素-(10-25)肽与MAb 583的结合的ELISA分析。这些数据显示，MAb 583不结合最高2000ng/ml浓度的鼠铁调素-1、抗菌肽或包含对铁调素-25的10-25区域正确的半胱氨酸键的氧化和重折叠铁调素-(10-25)肽。

图18：铁调素(10-25)肽结合MAb 1B1的ELISA分析。结果表明与铁调素-25相比，MAb 1B1对于包含10-25区域的正确半胱氨酸键的氧化和重折叠铁调素-(10-25)肽没有结合亲和性。K18-生物素铁调素-25用于检测。注意到铁调素-(10-25)肽不结合浓度高达2000ng/ml的MAb 1B1。

图19：铁调素(10-25)结合MAb 1B1的ELISA分析。结果表明与铁调素-25相比时，MAb 1B1对包含10-25区域的正确半胱氨酸键的氧化和重折叠的铁调素-(10-25)肽没有结合亲和性。用NT-生物素铁调素-25进行检测。注意到铁调素-(10-25)肽在最高浓度2000ng/ml的铁调素-(10-25)肽下不结合MAb 1B1。

图20：用MAb 583处理的Fpn-GFP细胞的流式细胞分析。细胞用百日青蜕皮酮(ponasterone)诱导过夜以诱导鼠Fpn-GFP的表达。第二天，通过洗涤除去百日青蜕皮酮，并添加铁调素-25和MAb 583抗体24小时。以100ng/ml(37nM)的浓度使用铁调素-25。以铁调素浓度的10倍、2倍或1/3(370nM、74nM和10nM)添加MAb 583。对照MAb是通过ELISA体外筛选时失败的抗铁调素单克隆抗体，并以最高浓度(370nM)使用。注意到10nM的MAb 583完全中和37nM的铁调素-25，及其导致FPN-GFP降解的生物活性。

图21：在37nM铁调素-25存在的情况下，在用浓度为10-370nM的MAb 583处理的HEK细胞中FPN-GFP荧光的百分变化(％)。

图22：用MAb 583处理的Fpn-GFP细胞的流式细胞分析。用百日青蜕皮酮诱导细胞过夜以诱导鼠Fpn-GFP的表达。第二天，通过洗涤除去百日青蜕皮酮，并添加铁调素-25和MAb 583抗体24小时。以100ng/ml(37nM)的浓度使用铁调素-25。在这些基于细胞的MAb 583生物活性的分析中MAb 583以铁调素-25摩尔浓度的1/3、1/6、1/12和1/24添加。对照MAb是通过ELISA体外筛选时失败的抗铁调素单克隆抗体，并以最高浓度(370nM)使用。注意到2.5nM MAb 583显著中和(～23％降低)37nM铁调素-25及其导致体外摩尔比1/12的FPN-GFP降解的生物活性。

图23：如图22所述的37nM铁调素-25存在的情况下，在用浓度为0.62-10nM的MAb 583处理的HEK细胞中FPN-GFP荧光的百分变化(％)。

图24：用MAb 583处理的Fpn-GFP细胞的铁蛋白分析。用百日青蜕皮酮诱导HEK细胞过夜，以诱导鼠Fpn–GFP表达和并铁转运至培养基中。第二天，通过洗涤除去百日青蜕皮酮，并添加铁调素-25和MAb 583抗体24小时。以100ng/ml(37nM)的浓度使用铁调素-25。以铁调素浓度的10倍、2倍或1/3(370nM、74nM和10nM)添加MAb 583。对照MAb是通过ELISA体外筛选时失败的抗铁调素单克隆抗体，并以最高浓度(370nM)使用。注意到10nM MAb 583显著中和37nM铁调素-25及其导致FPN-GFP降解和保留细胞内铁蛋白结合铁的生物活性。使用RIPA缓冲液提取蛋白质，并使用铁蛋白ELISA(Ramco)来确定细胞内铁蛋白浓度。

图25：用MAb 583处理的Fpn-GFP细胞的铁蛋白分析。用百日青蜕皮酮诱导HEK细胞过夜以诱导鼠Fpn-GFP表达和铁转运至培养基中。第二天，通过洗涤除去百日青蜕皮酮，且添加铁调素-25和MAb 583抗体24小时。以100ng/ml(37nM)的浓度使用铁调素-25，且在这些基于细胞的Mab 583生物活性分析中以铁调素-25摩尔浓度的1/3、1/6、1/12和1/24使用MAb 583抗体。对照MAb(伪MAb)是通过ELISA体外筛选时失败的抗铁调素单克隆抗体，并以最高浓度(370nM)使用。注意到2.5-5nM的583显著中和37nM的铁调素-25及其导致FPN-GFP降解和细胞内铁蛋白结合铁的保留的生物活性。使用RIPA缓冲液提取蛋白质，并使用铁蛋白ELISA(Ramco)来确定细胞内铁蛋白浓度。

图26：如图25所述的在37nM铁调素-25存在的情况下，在用浓度为0.62-10nM的MAb 583处理的HEK细胞中细胞内铁蛋白浓度的百分变化(％)。

图27：雄性C57Bl/6小鼠中体内注射MAb 583和人铁调素-25对血清铁浓度的影响。五组小鼠(n＝8/组)腹膜内注射PBS(组1，H–PBS和组5，PBS)、1mg MAb 583(组2，H-Mab)、0.5mg MAb 583(组3，H-2Mab)或0.5mg对照Mab(组4，H-伪Mab)。第二天，组3的所有小鼠接受另外的0.5mg MAb 583，并且在24小时后组1-4接受单次注射50μg的人铁调素-25和组5接受PBS。2小时后处死所有小鼠，并测量血清铁。统计分析(细节参见图28)表明在PBS和PBS加铁调素-25间存在显著差异(H-PBS，P＝0.001)，且在PBS加铁调素-25(H–PBS)以及接受两剂0.5mg MAb 583和铁调素-25的小鼠之间存在显著差异(H-2Mab，P＝0.004)。

图28：如图27所示的MAb 583的体内研究中五组雄性C57BL/6小鼠的血清铁浓度的描述性统计值(平均数、标准偏差、SEM)和一元ANOVA的结果。总体显著性水平P＝0.05的相对于对照组的多重比较(Holm-Sidak法)给出了0.001至0.253的比较依赖性(comparison-dependent)的未调整P值。

图29：MAb 583嵌合体与鼠MAb 583对于结合铁调素-25涂布的ELISA板的比较。100ng铁调素-25共价结合马来酸酐活化的96孔微板的孔。向微平板添加增加量的MAb 583嵌合体(BAP070-01；3650ng/ml；空心正方形)和鼠MAb 583(阳性对照Mab；空心三角形)，并允许结合1小时。通过兔抗人IgG1(H+L)HRP检测MAb 583嵌合体的结合。用HRP偶联的抗小鼠IgG1(H+L)检测结合的鼠MAb 583抗体。向孔中添加TMB后5分钟时用1N HCl终止反应并立即读数。在加入终止溶液后用分光光度计上450nm的OD来定量结合。X轴：ng/ml表示的抗体浓度；Y轴：450nm OD值。

图30：结合铁调素25涂布的ELISA板的MAb 583嵌合体。100ng铁调素-25共价结合马来酸酐活化的96孔微板的孔。向微平板添加增加量的MAb 583嵌合体(BAP070-01；3650ng/ml；实心圆)和来自空载体转染细胞的上清液(BAP070；实心正方形)，并允许结合2小时。以TMB作为底物通过兔抗人IgG1(H+L)HRP检测MAb 583嵌合体的结合。在加入终止溶液后用分光光度计上以450nm定量结合。

图31：使用BAP070-01MAb 583嵌合体获得的铁调素-25标准曲线。微平板的孔用150ng/ml的G蛋白涂布并封闭。向孔中以150ng/孔添加Mab 583嵌合体(BAP070–01)，并允许结合1小时。向包含NT-生物素铁调素-25(1ng/孔)的分析缓冲液中添加已知浓度的合成铁调素-25，混合，加入至8个重复孔中，并允许竞争2小时。冲洗孔，并用以TMB为底物的SA-HRP检测NT-生物素铁调素-25示踪剂的结合。在加入终止溶液后在分光光度计上以450nm定量结合。使用Graphpad Prism软件(San Diego,CA)采用四参数逻辑回归法来产生标准曲线。

图32：在中性抗生物素蛋白涂布的微平板上MAb 583嵌合体对NT-生物素铁调素-25的结合。微平板上的孔用150ng/ml中性抗生物素蛋白涂布并封闭。向孔中以1ng/孔添加NT-生物素铁调素-25示踪剂，并允许结合1小时。以150ng/孔将Mab 583嵌合体(BAP070-01)与已知浓度合成铁调素-25一起添加到孔中，并允许与NT-生物素铁调素-25竞争结合一小时。以TMB作为底物，用兔抗人IgG1(H+L)HRP检测MAb 583嵌合体的结合。在加入终止溶液后用分光光度计以450nm定量结合。图上的点表示两次重复(实心菱形和正方形)以及平均数(实心三角形)。

发明详述

根据本申请，可使用本领域技术范围内常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术已在文献中被详细解释。参见，例如，Sambrook等,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III[Ausubel,R.M.,ed.(1994)]；"Cell Biology:A Laboratory Handbook"Volumes I-III[J.E.Celis,ed.(1994))]；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III[Coligan,J.E.,ed.(1994)]；"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait ed.1984)；"Nucleic Acid Hybridization"[B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985)]；"Transcription And Translation"[B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.(1984)]；"Animal Cell Culture"[R.I.Freshney,ed.(1986)]；"Immobilized Cells And Enzymes"[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,"A Practical Guide To Molecular Cloning"(1984)，每篇文献以其全部内容通过引用具体并入本文。

抗体术语

如本文使用的，术语“抗体”是指天然的或部分的或完全合成生成的免疫球蛋白(Ig)。该术语也包括具有结合结构域的任何多肽或蛋白质，所述结合结构域是抗原结合结构域或者是与抗原结合结构域同源。该术语还包括“抗原结合片段”和例如下文描述的类似结合片段的其他可互换使用的术语。该术语也考虑到互补决定区(CDR)移植的抗体及其他人源化抗体(包括CDR修饰和框架区修饰)。

天然的抗体和天然的免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。各轻链一般通过一个共价二硫键连接至重链，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间变动。每个重链和轻链也具有规律地间隔开的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变域(“VH”)，接着多个恒定域(“CH”)跟随的。每个轻链在一端有可变域(“VL”)，且在另一端有恒定域(“CL”)；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，且轻链可变域与重链的可变域对齐。据信特定的氨基酸残基形成了轻链和重链可变域之间的界面。

如本文使用的，术语“合成多核苷酸”、“合成基因”或“合成多肽”是指相应的多核苷酸序列或其部分序列、氨基酸序列或其部分序列源自与等同的天然发生序列相比经过设计或从头合成或修饰的序列。合成多核苷酸(抗体或抗原结合片段)或合成基因可以用本领域已知的方法制备，包括但不限于，化学合成核酸或氨基酸序列。合成基因通常在氨基酸或多核苷酸水平(或两者)不同于天然存在的基因，并且通常处于合成表达控制序列的环境中。例如，合成基因序列可以包括通过例如取代、删除或添加一个或多个氨基酸或核苷酸而改变的氨基酸或多核苷酸序列，从而提供了不同于源序列的抗体氨基酸序列或多核苷酸编码序列。与天然基因相比，合成基因多核苷酸序列可能不是必然编码具有不同氨基酸的蛋白质；例如，他们还可以包含结合有不同密码子但编码相同氨基酸的合成多核苷酸序列(即，核苷酸变化代表了氨基酸水平的沉默突变)。

关于抗体，术语“可变域”是指用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的抗体可变域。但是，这种可变性不是在抗体的整个可变域中均匀分布的。相反地，其集中在轻链和重链可变域两者的称为高变区(又名CDR)的三个区段中。可变域的更高度保守的部分被称为“框架区”或“FR”。未修饰的重链和轻链的可变域各自包含四个FR(FR1、FR2、FR3和FR4)，主要采取与形成环形连接且在一些情况中形成β-折叠片结构的部分的3个CDR散布的β-折叠片构型。每条链的CDR通过FR紧密地保持在一起，并与另一链的CDR保持在一起，导致形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)，第647-669页)。

本文使用的术语“高变区”和“CDR”是指抗体中负责结合抗原的氨基酸残基。CDR包含来自以互补方式结合抗原的三个序列区域的氨基酸残基，且被称为VH和VL链各自的CDR1、CDR2和CDR3。根据Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)，在轻链可变域中CDR通常对应于大约24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)位的残基，以及在重链可变域中CDR通常对应于大约31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)位的残基。可以理解的是，不同抗体的CDR可包含插入，因此氨基酸编号可能不同。Kabat编号系统利用附属特定残基的字母的编码方案来说明这些插入(例如，轻链的CDRL1中的27A、27B、27C、27D、27E和27F)以反映在不同抗体间编号中的插入。或者，根据Chothia和Lesk(J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)，在轻链可变域中CDR通常对应于大约26-32(CDRL1)、50-52(CDRL2)和91-96(CDRL3)位的残基，和在重链可变域中CDR通常对应于大约26-32(CDRH1)、53-55(CDRH2)和96-101(CDRH3)位的残基。

如本文使用的，“框架区”或“FR”是指形成抗原结合口袋或沟槽的一部分的框架氨基酸残基。在某些实施方式中，框架残基形成了环，该环是抗原结合口袋或沟槽的一部分，且环中的氨基酸残基可以接触或不接触抗原。框架区通常包含CDR之间的区域。根据Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)，在轻链可变域中FR通常对应于大约0-23(FRL1)、35-49(FRL2)、57-88(FRL3)和98-109位的残基，以及在重链可变域中FR通常对应于大约0-30(FRH1)、36-49(FRH2)、66-94(FRH3)和103-133位的残基。如上文对轻链的Kabat编码所述的，重链也以类似方式来说明插入(例如，重链CDRH1的35A、35B)。或者，根据Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)，在轻链可变域中FR通常对应于约0-25(FRL1)、33-49(FRL2)、53-90(FRL3)和97-109(FRL4)位的残基，和在重链可变域中FR通常对应于约0-25(FRH1)、33-52(FRH2)、56-95(FRH3)和102-113(FRH4)位的残基。

FR的环氨基酸可通过检验抗体重链和/或抗体轻链的三维结构来评估和确定。可分析三维结构的溶剂可达氨基酸位置，因为所述位置很可能在抗体可变域中形成环和/或提供抗原接触。某些溶剂可达位置可耐受氨基酸序列多样性，而其他位置(例如，结构位置)一般较少多样化。抗体可变域的三维结构可以来自晶体结构或蛋白质建模。

抗体的恒定域(Fc)不直接涉及抗体与抗原的结合，而是相反显示出各种效应子功能，例如抗体通过与Fc受体(FcR)的相互作用参与抗体依赖性细胞毒性。在向受试者施用后，Fc域还可以增加循环中的抗体的生物利用度。

根据重链的恒定域的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分为不同的类别。存在五种主要的免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的某些还可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域(Fc)分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型都是公知的。

基于恒定域氨基酸序列，来自任一脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以归为被称为κ和λ的两种明显不同类型中的一种。

本文中可互换使用的术语“抗体的抗原结合部分”、“抗原结合片段”、“抗原结合域”、“抗体片段”或“抗体功能性片段”是指保留抗体特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。这些术语中包含的抗体片段的非限制例子包括但不限于：(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含两个由铰链区的二硫桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)包含抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段；(v)dAb结构域(Ward等,(1989)Nature 341:544 546)，其包含VH结构域；以及(vi)分离的CDR。该定义中还包括“半”抗体，其包含单一重链和单一轻链。本文也包括单链抗体的其他形式，如双特异性抗体。

“F(ab')2”与“Fab'”部分可以通过用蛋白酶如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶处理Ig而制得，并且其包括在靠近两个重链各自的绞链区之间存在的二硫键处消化免疫球蛋白而产生的抗体片段。例如，木瓜蛋白酶在两个重链各自的绞链区之间存在的二硫键上游切割IgG，以产生两个同源抗体片段，其中由VL和CL(轻链恒定区)组成的轻链和由VH与CHγ1(重链恒定区的γ1区)组成的重链片段在其C末端区通过二硫键连接。这两个同源抗体片段中的每一个被称为Fab'。胃蛋白酶也在两个重链各自的绞链区之间存在的二硫键的下游切割IgG，以产生比两个上述Fab'在铰链区连接的片段稍大一些的抗体片段。该抗体片段被称为F(ab')2。

Fab片段也包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段与Fab片段区别在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括一个或多个来自抗体绞链区的半胱氨酸。Fab'-SH在本文中是其中恒定域的半胱氨酸残基带有游离巯基的Fab'的名称。F(ab')2抗体片段最初作为其间存在铰链半胱氨酸的Fab'片段对产生的。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。

“Fv”是指包含完整的抗原识别和抗原结合位点的抗体片段。该区域由紧密、非共价或共价结合的一个重链和一个轻链可变域的二聚体组成(二硫键连接的Fv已在本领域中描述，参见Reiter等(1996)Nature Biotechnology 14:1239-1245)。在此构型中，各个可变域的三个CDR相互作用以限定在VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。共同地，VH和VL链各自的一个或多个CDR的组合赋予抗体抗原结合特异性。举例来说，可以理解，例如，当转入受体抗体或其抗原结合片段的VH和VL链时，CDRH3和CDRL3可能足以赋予抗体抗原结合特异性，且这一CDR的组合可以通过本文描述的任意方法来测试结合、亲和性等。甚至单个可变域(或仅包含抗原特异性的3个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，虽然可能以与第二可变域组合时相比较低的亲和性。另外，虽然Fv片段的两个结构域(VL和VH)是由单独的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接以使二者能够形成单一蛋白质链，其中VL和VH区域配对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；Bird等(1988)Science 242:423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Osbourn等(1998)Nat.Biotechnol.16:778)。这些scFv也旨在被术语抗体的“抗原结合部分”涵盖。特异性scFv的任何VH和VL序列都可以连接Fc区cDNA或基因组序列，以产生编码完整Ig(例如，IgG)分子或其他同种型的表达载体。VH和VL还可以用于通过蛋白质化学或者重组DNA技术产生Ig的Fab、Fv或其他片段。

“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单多肽链中。在某些实施方式中，Fv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使sFv能够形成抗原结合所需的结构。对于sFvs的综述，参见例如，Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg和Moore eds.Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。

术语“AVIMER^TM”是指一类人类起源的治疗蛋白，其与抗体和抗体片段无关，并由几个模块化且可重复利用的称为A-结构域(也称为A类模块、补体型重复或LDL受体A类结构域)的结合结构域组成。它们通过体外外显子重组和噬菌体展示技术从人细胞外受体结构域开发(Silverman等,2005,Nat.Biotechnol.23:1493-1494；Silverman等,2006,Nat.Biotechnol.24:220)。所得蛋白质可以包含多个独立的结合结构域，其与单一表位结合蛋白相比能够显示出改善的亲和性(某些情况下，亚纳摩尔)和特异性。参考，例如U.S.专利申请公开No.2005/0221384,2005/0164301,2005/0053973和2005/0089932,2005/0048512,和2004/0175756,其每篇文献全文引入作为参考。

已知的217种人A -结构域中的每一种均包含～35个氨基酸(～4kDa)；且这些结构域被平均5个氨基酸长度的接头隔开。天然的A-结构域迅速且高效地折叠成主要由钙结合以及二硫键形成介导的均一、稳定的结构。这一常见结构需要只有12个氨基酸的保守骨架基序。最终的结果是包含多个结构域的单一蛋白质链，其中每个结构域表现出独立的功能。蛋白质的各个结构域独立地结合，并且各结构域的能量贡献是累加的。这些蛋白质从亲合力多聚体(avidity multimers)称为“AVIMERs^TM”。

术语“双特异性抗体”是指有两个抗原结合位点的小的抗体片段，所述片段包含在同一多肽链上(VH-VL)中连接到轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)。通过使用因太短而不允许同一条链上的两个结构域配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。双特异性抗体更详细描述于，例如，EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444 6448(1993)中。

抗原结合多肽还包括重链二聚体，例如，来自骆驼和鲨鱼的抗体。骆驼和鲨鱼抗体包含V样和C样结构域的两条链(没有一个具有轻链)的同型二聚体对。因为骆驼中重链二聚体IgG的VH区不必与轻链产生疏水相互作用，重链中通常接触轻链的区域被改变为骆驼中的亲水氨基酸残基。重链二聚体IgG的VH结构域被称为VHH结构域。鲨鱼Ig-NAR包含一个可变结构域(被称为V-NAR结构域)和5个C样恒定结构域(C-NAR结构域)的同型二聚体。在骆驼中，抗体集的多样性由VH或VHH区域中的CDR1、2和3决定。骆驼VHH区中的CDR3由其相对长的长度来表征，平均16个氨基酸(Muyldermans等,1994,Protein Engineering 7(9):1129)。这与很多其他物种的抗体的CDR3区相反。例如，小鼠VH的CDR3具有平均9个氨基酸。保持了骆驼可变区体内多样化的骆驼源抗体可变区的文库可以通过例如美国专利申请序列No.20050037421中公开的方法制得。

非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式包括嵌合抗体，其包含源自非人Ig的最小序列。对于其最大部分，人源化抗体是人IgG(受体抗体)，其中该受体的一个或多个CDR被来自非人物种抗体(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔子或非人灵长动物等的具有所需特异性、亲和性和结合功能的CDR替换。一些情况下，人Ig的一个或多个FR氨基酸残基被相应的非人氨基酸残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中不存在的残基。如果需要的话，可以进行这些修饰以优化抗体性能。人源化抗体可以包含基本上全部的至少一个和某些情况下2个可变结构域，其中全部或基本上全部高变区对应于非人免疫球蛋白的那些高变区，并且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗体任选地还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常为人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。详细细节参见Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Reichmann等,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。

人源化抗体还包括其中重链和轻链CDR的部分或全部源自非人单克隆抗体、基本上可变区的所有剩余部分源自人可变区(重链及轻链)且恒定区源自人恒定区的抗体。在一种实施方式中，重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3区源自非人抗体。另一种实施方式中，重链和轻链的至少一个CDR(例如，CDR3)源自非人抗体。CDR1、CDR2和CDR3的各种不同组合可以源自非人抗体，且设想在本发明中。在一个非限制性实例中，重链和轻链各自的一个或多个CDR1、CDR2和CDR3区源自本文所提供的序列。

本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同源抗体的群体获得的抗体，即，构成所述群体的单个抗体除了可能少量存在的可能天然形成突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。另外，与可包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰词“单克隆”将抗体性质表示为从基本同源的抗体群体获得，并且不解释为要求以任何特定方法制备抗体。例如，单克隆抗体可以通过首次由Kohler等,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法制得，或可以通过重组DNA法制得(参见，例如，US专利No.4,816,567)。在某些实施方式中，可以采用如Clackson等,Nature 352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。

如下文详述的，通过饱和硫酸铵沉淀法、优球蛋白沉淀法、己酸法、辛酸法、离子交换色谱法(DEAE或DE52)或利用抗Ig柱或蛋白A、G或L柱的亲和色谱法等，可以从上文提到的培养物上清液或腹水分离和纯化抗体。

本文描述的组合物和方法中使用的示例性抗体是完整的免疫球蛋白分子，例如比如，人源化抗体或包含抗原结合位点(即，互补位)的人源化Ig分子的那些部分或者单一重链和单一轻链，包括本领域已知为Fab、Fab′、F(ab)′、F(ab′)2、Fd、scFv、可变重链结构域、可变轻链结构域、可变NAR结构域、双特异性scFv、双特异性Fab2、三特异性Fab3和单链结合多肽的那些部分以及被称为抗原结合片段的其他部分。当构建免疫球蛋白分子或其片段时，可变区或其部分可能融合、连接或以其他方式结合一个或多个恒定区或其部分，以产生本文所述的任意抗体或其片段。这可以通过本领域熟知的多种方法来完成，包括但不限于，分子克隆技术或编码该分子的核酸的直接合成。构建这些分子的示例性的非限制性方法也可以在本文所述的实施例中找到。

制备双特异性或其他多特异性抗体的方法也是本领域熟知的，且包括化学交联、使用亮氨酸拉链(Kostelny等，J.Immunol.148:1547-1553,1992)；双特异性抗体技术(Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48,1993)；scFv二聚体[Gruber等,J.Immunol.152:5368,1994]，线性抗体(Zapata等,Protein Eng.8:1057-62,1995)；以及螯合重组抗体(Neri等,J Mol Biol.246:367-73,1995)。

“线性抗体”包含一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其形成了一对抗原结合区域。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的(Zapata等Protein Eng.8:1057-62(1995))。

另外，本文公开的抗铁调素抗体也可被构建为折叠成多价形式，其可改善结合亲和性、特异性和/或增加血液中的半衰期。抗铁调素抗体的多价形式可以使用本领域已知的技术来制备。

双特异性或多特异性抗体包括交联的或“异偶联(heteroconjugate)”抗体。例如，异偶联物中的一个抗体可以与抗生物素蛋白偶联，另一个与生物素偶联。异偶联抗体可使用任意便利的交联方法来制备。合适的交联剂是本领域熟知的，并与许多交联技术一起在美国专利No.4,676,980中被公开。另一种方法设计为通过在scFv的C末端增加链霉抗生物素蛋白编码序列来制备四聚体。链霉抗生物素蛋白由四个亚基组成，所以当scFv-链霉抗生物素蛋白被折叠时，四个亚基结合来形成四聚体(Kipriyanov等,Hum Antibodies Hybridomas 6(3):93-101(1995)，其公开内容以其全部通过引用并入本文)。

按照另一种制备双特异性抗体的方法，在一对抗体分子间的界面可以进行改造以最大化从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比。一个界面包含抗体恒定区的CH3结构域的至少一部分。该方法中，来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧链被替换为更大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)。通过将大氨基酸侧链替换为较小的那些(例如，丙氨酸或苏氨酸)，在第二抗体分子的界面上形成了具有与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔(cavities)”。这提供了用于相比于其他不期望终产品(如同二聚体)提高异二聚体的得率的一种机制。参见1996年9月6日公开的WO 96/27011。

从抗体片段产生双特异性或多特异性抗体的技术在本领域中是常规已知的。例如，双特异性或三特异性抗体可以通过化学连接来制备。Brennan等(Science 229:81(1985))描述了一种方法，其中完整的抗体被蛋白水解切割以产生F(ab')2片段。这些片段在二硫醇复合剂亚砷酸钠存在下还原以稳定相邻二硫醇且防止形成分子间二硫键。随后，产生的Fab'片段被转化为硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后，Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺还原被转化为Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可以用作酶的选择性固定的试剂。Better等(Science 240:1041-1043(1988))公开了从细菌分泌功能性抗体片段(参见，例如,Better等,Skerra等，Science 240:1038-1041(1988))。例如，Fab'-SH片段可以直接从大肠杆菌(E.coli)回收，并化学偶联以形成双特异性抗体(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992)；Shalaby等,J.Exp.Med.175:217-225(1992))。

从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性或多特异性抗体片段的各种技术在本领域中都是熟知的。例如，双特异性抗体已使用亮氨酸拉链来制备，例如，GCN4(通常参见Kostelny等,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同型二聚体在绞链区被还原以形成单体，且随后再氧化以形成抗体异二聚体。该方法也可以用来生产抗体同型二聚体。

如本文使用的，“微型抗体(minibody)”是指通过肽接头(无铰链)或通过IgG铰链与CH3融合的scFvs，已描述于Olafsen等,Protein Eng Des Sel.2004年4月；17(4):315-23中。

如本文使用的，“maxibody”是指共价连接免疫球蛋白Fc区的二价scFv，参见，例如，Fredericks等,Protein Engineering,Design&Selection,17:95-106(2004)和Powers等,Journal of Immunological Methods,251:123-135(2001)。

如本文使用的，“胞内抗体(intrabody)”是指表现出细胞内表达并且可操控细胞内蛋白质功能的单链抗体(Biocca等,EMBO J.9:101-108,1990；Colby等,Proc Natl Acad Sci USA.101:17616-21,2004)。包含保持抗体构建体在细胞内区域中的细胞信号序列的胞内抗体可以如Mhashilkar等(EMBO J 14:1542-51,1995)和Wheeler等(FASEB J.17:1733-5.2003)描述的来制备。transbody是可穿透细胞的抗体，其中蛋白质转导结构域(PTD)与单链可变片段(scFv)抗体融合(参见，Heng等,(Med Hypotheses.64:1105-8,2005))。

本发明还额外考虑了作为SMIP或对靶蛋白具有特异性的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白的抗体。这些构建体是包含与执行抗体效应子功能必须的免疫球蛋白结构域融合的抗原结合结构域的单链多肽。参见，例如WO 03/041600、U.S.专利公开号20030133939和US专利公开号20030118592，将其通过引用并入本文。

抗体及其抗原结合片段的人源化可以通过本领域已知的以及本文描述的多种方法来完成。同样地，人源化抗体的产生也可以通过本领域已知的以及本文描述的多种方法来完成。

在一个示例性的实施方式中，本申请预期包含重链可变区和/或轻链可变区的单链结合多肽，其结合本文所述的表位并且任选地具有免疫球蛋白Fc区。这种分子是单链可变片段(scFv)，任选地通过免疫球蛋白Fc区的存在而具有效应子功能或延长的半衰期。制备单链结合多肽的方法是本领域已知的(例如，U.S.专利申请No.2005/0238646)。

术语“种系基因片段”或“种系序列”是指来自于生殖细胞系(单倍体配子以及单倍体配子从其形成的那些二倍体细胞)的基因。种系DNA包含编码单个Ig重链或轻链的多个基因片段。这些基因片段携带在生殖细胞中，但直到被排列变成功能性基因才能被转录和翻译为重链和轻链。在骨髓中B细胞分化期间，这些基因片段通过能产生超过10⁸种特异性的动态遗传系统随机重组。这些基因片段中的大多数都已在种系数据库中被公开和收集。

抗体或其抗原结合片段的结合亲和性和/或亲合力可通过修饰构架区来改善。修饰构架区的方法是本领域已知的，并在本文中考虑。待改变的一个或多个相关框架氨基酸位置的选择取决于多种标准。选择改变的相关框架氨基酸的一个标准可以是供体和受体分子间氨基酸框架残基的相对差异。使用这种方法来选择待改变的相关框架区位置具有避免在确定残基时的任何主观偏好或由残基带来的CDR结合亲和性贡献的中任何偏好。

如本发明所使用的，“免疫反应性”是指对氨基酸残基的序列(“结合位点”或“表位”)具有特异性的抗体或其抗原结合片段，而如果对其他的肽/蛋白质是交叉反应性的，在以将其配制用于人使用的水平下是无毒的。术语“结合”是指两分子之间的直接结合，其是由于例如在生理条件下共价的、静电的、疏水的、及离子的和/或氢键的相互作用，并且包括例如盐桥和水桥以及任意其他的常规结合手段的相互作用。术语“优先结合”是指结合剂结合于结合位点的亲和性高于其结合不相关氨基酸序列的亲合性。优选地这种亲和性为比结合剂对于不相关氨基酸序列的亲和性高至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍。术语“免疫反应性”和“优先结合”在本文中可以互换使用。

如本文使用的，术语“亲和性”是指两种试剂可逆结合的平衡常数，且以Kd来表示。在一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段显示了所需的特性，例如对铁调素的结合亲和性以KD(平衡解离常数)计在以下范围内：1×10^-6M或更低、或低至10^-16M或更低(例如，约10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12、10^-13、10^-14、10^-15、10^-16M或更低)。平衡解离常数可以使用BIAcore和/或KinExA在溶液平衡分析中来确定。本文使用的术语“亲合力”是指在稀释后两个或更多个试剂的复合体对解离的抗性。表观亲和性可以通过如酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟知的任意其它方法来确定。亲合力可以通过例如Scatchard分析或本领域技术人员熟知的任意其它技术来确定。

“表位”是指能够与抗体的可变区结合口袋形成结合相互作用的抗原或其他的大分子的部分。这类结合相互作用可以表现为与一个或多个CDR区的一个或多个氨基酸残基的分子间接触。抗原结合可以包括，例如，CDR3或CDR3对，或在某些情况下VH和VL链的最多全部六个CDR的相互作用。表位可以是线性肽序列(即，连续的)或可以由非连续氨基酸序列组成(即，“构象的”或“非连续的”)。抗体可以识别一种或多种氨基酸序列；因此表位可以限定多于一种的不同氨基酸序列。抗体识别的表位可以通过本领域技术人员熟知的肽作图和序列分析技术来确定。结合相互作用表现为与CDR的一个或多个氨基酸残基的分子间接触。

术语“特异性”是指其中抗体不会显示与除包含被抗体识别的表位的抗原以外的其他分子的任何显著结合的情况。该术语在下列情况下也是适用的：例如，抗原结合结构域对许多抗原带有的特定表位是特异性的，而在这样的情况下，带有抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段能够结合携带该表位的各种抗原。术语“优先结合”或“特异性结合”是指抗体或其片段以与其结合不相关氨基酸序列时相比更大的亲和性结合到表位，并且如果对包含表位的其他多肽是交叉反应性的，在将其配制用于人使用的水平下是无毒的。在一方面，这种亲和性比抗体或其片段对于不相关氨基酸序列的亲和性高至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍。本文中术语“免疫反应性”、“结合”、“优先结合”和“特异性结合”是可以互换使用的。术语“结合”是指两个分子间由于例如在生理条件下共价、静电、疏水及离子和/或氢键相互作用导致的直接结合，并且包括例如盐桥和水桥以及任意其他的常规结合手段的相互作用。

抗体可以通过本领域已知的方法来进行结合亲和性的筛选，所述方法包括但不限于凝胶迁移分析、蛋白质印迹、放射标记的竞争分析、色谱共分级分离法(co-fractionation by chromatography)、共沉淀法、交联、ELISA等等，其在例如Current Protocols in Molecular Biology(1999)John Wiley&Sons,NY中进行了描述，将其全部内容通过引用并入本文。

结合靶抗原上的期望表位的抗体可以通过常规的交叉阻断分析来进行筛选，例如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow和David Lane(1988)中描述的方法。还可以使用常规竞争结合分析，其中未知抗体通过其抑制靶标与本发明的靶标特异性抗体的结合的能力来表征。可以使用完整的抗原、其片段如胞外结构域或线性表位。表位作图法在Champe等,J.Biol.Chem.270:1388-1394(1995)中被描述。

抑制或中和人铁调素活性的抗体可以通过以下鉴别：将铁调素与抗体接触，比较存在和不存在测试抗体时的铁调素活性，并且确定抗体的存在是否降低了铁调素的活性。特定抗体或抗体组合的生物活性可以使用合适的动物模型(包括本发明描述的任意一种)在体内进行评价。

在一种实施方式中，本文提供了高通量筛选(HTS)分析来鉴别与靶标铁调素相互作用或抑制靶标铁调素生物活性的抗体。HTS分析允许以有效的方式筛选大量化合物。

短语“保守氨基酸置换”是指基于某些共同性质的氨基酸分组。定义单个氨基酸之间的共同性质的功能性方式是分析同源有机体的相应蛋白质之间氨基酸变化的归一化频率(Schulz,G.E.和R.H.Schirmer,Principles of Protein Structure,Springer-Verlag)。根据这类分析，可以定义其中组内的氨基酸优先彼此交换并且因此其对整体蛋白质结构的影响彼此最为相似的氨基酸组(Schulz,G.E.和R.H.Schirmer,Principles of Protein Structure,Springer-Verlag)。以此方式定义的氨基酸组的例子包括：

(i)带电荷组，由Glu和Asp、Lys、Arg和His组成，

(ii)带正电荷组，由Lys、Arg和His组成，

(iii)带负电荷组，由Glu和Asp组成，

(iv)芳香族组，由Phe、Tyr和Trp组成，

(v)氮环组，由His和Trp组成，

(vi)大的脂族非极性组，由Val、Leu和Ile组成，

(vii)轻微极性组，由Met和Cys组成，

(viii)小残基组，由Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln和Pro组成，

(ix)脂族组，由Val、Leu、Ile、Met和Cys组成，以及

(x)小羟基组，由Ser和Thr组成。

除了上述的组，每个氨基酸残基可以形成其自己的组，并且由单个氨基酸形成的组可简单地通过上文所述本领域常用的氨基酸的一字母和/或三字母缩写指代。

“保守残基”是在大量相似蛋白质中相对不变的氨基酸。通常保守残基仅通过用相似氨基酸取代而变化，如以上“保守氨基酸置换”所述的。

除非以其他方式特别说明，本文的氨基酸序列中使用的字母“x”或“xaa”旨在表明在该位置可以放置二十种标准氨基酸中的任意一种。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性和同一性各自可以通过出于比较目的比对的各序列上的位置而确定。当比较的序列中等同位置被相同碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置处是同一的；当等同位点被相同或相似的氨基酸残基(例如，空间的和/或电子性质相似)占据时，那么分子在该位置可被称为同源(相似)的。以同源性/相似性百分比或同一性表示是指比较的序列共有的位置处同一或相似氨基酸数目的函数。“不相关”或“非同源”序列与本发明序列共有低于40％、优选低于25％的同一性。比较两个序列时，残基(氨基酸或核酸)的不存在或额外残基的存在也降低同一性和同源性/相似性。

术语“同源性”描述了基于数学的序列相似性的比较，其用于鉴定具有相似的功能或基序的基因或蛋白质。本发明的核酸(核苷酸、寡聚核苷酸)和氨基酸(蛋白质)序列可以用作“查询(query)序列”以针对公共数据库进行检索，从而例如鉴别其他家族成员、相关序列或同源物。这类检索可以使用NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)来进行(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10)。BLAST核苷酸检索可以使用NBLAST程序来进行，分数＝100，字长＝12，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST氨基酸检索可以使用XBLAST程序来进行，分数＝50，字长＝3，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得出于比较目的空位比对，可以使用Altschul等,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402所述的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和BLAST)的缺省参数(参见,www.ncbi.nlm.nih.gov)。

如本文使用的，“同一性”是指在两个或以上序列比对以最大化序列匹配(即，考虑空位和插入)时对应位置上相同核苷酸或氨基酸残基的百分比。同一性可以通过已知方法容易地算出，包括但不限于描述于Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991；和Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)中描述的那些方法。设计了确定同一性的方法以给出测试序列间的最大匹配。此外，确定同一性的方法编码成公开可用的计算机程序。确定两个序列间的同一性的计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包(Devereux,J.等,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F等,J.Molec.Biol.215:403-410(1990)和Altschul等Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1997))。BLAST X程序在NCBI以及其他来源上均可公开获得(BLAST手册,Altschul,S.等,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894；Altschul,S.等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。也可使用熟知的Smith Waterman算法以确定同一性。

“分离的”(可与“基本上纯的”或“纯化的”互换使用)当用于多肽时是指多肽或其部分，根据其来源或处理方式：该多肽或其部分(i)作为表达载体的一部分的表达产物存在于宿主细胞中；或(ii)连接其在天然状态下连接的部分以外的蛋白质或其他化学部分上；或(iii)在天然状态下不存在，例如，通过附接或增加至少一个疏水性部分至蛋白质来化学操作的蛋白质从而使该蛋白质成为自然界不存在的形成。“分离的”进一步是指一种蛋白质，其是：(i)化学合成的；或(ii)在宿主细胞中表达并从相关的或污染的蛋白质纯化。该术语通常是指已经从与其一起天然存在的其他蛋白质和核酸分离的多肽。优选地，该多肽也从用于纯化该多肽的物质如抗体或凝胶基质(聚丙烯酰胺)分离。

“诱导宿主免疫反应”指的是受试者经历疾病征兆或症状的缓解或减轻，并且特别地包括，但不限于，延长存活期。

人源化免疫球蛋白(包括人源化抗体)已经通过遗传工程方法来构建。先前描述的大多数人源化免疫球蛋白包含与特定人免疫球蛋白链(即，受体或接受体)的框架相同的框架，以及来自非人(即，供体)免疫球蛋白链的三个CDR区。如本文所述的，人源化还可以包括其中人源化免疫球蛋白链框架中有限数量的氨基酸被鉴别并选定为与供体中而不是受体中那些位置处的氨基酸相同的标准，以提高包含人源化免疫球蛋白链的抗体的亲和性。

当期望增加的人源化抗体亲和性时，转化的抗体的CDR内的残基可另外被其他的氨基酸置换。通常，CDR中不超过4个氨基酸残基被改变，并且最典型的是CDR中不超过2个残基被改变，除了重链CDR2(其中多达10个残基可被改变)。亲和性的改变可以用常规方法来检测，例如本文描述的方法(例如,Biacore)。

“超人源化(superhumanizing)”抗体的方法在US专利No.6,881,557中进行了更详细描述，将其全部内容通过引用并入本文。

人源化抗体和抗原结合片段可以使用本领域熟知的常规技术来构建并产生。另外，重组制备的抗体常常可以大量产生，特别是利用高水平表达载体时。

抗体可以使用本领域熟知的常规技术来测序。一方面，一个或多个CDR的氨基酸序列插入到例如人抗体(或其抗原结合片段)框架的合成序列中，以产生能限制使用非人抗体治疗人类受试者的不良反应的人抗体。一个或多个CDR的氨基酸序列也可以插入到结合蛋白例如AVIMER^TM的合成序列中，以产生对人类受试者施用的构建体。这些技术可以根据要治疗的动物物种来进行修饰。例如，对于兽医用途，可以合成抗体、抗原结合片段或结合蛋白用于非人类(例如，灵长动物、母牛、马等等)的施用。

另一方面，使用本领域公认的技术(如本文提供的和并入的那些)，编码一个或多个CDR区的氨基酸序列的核苷酸可例如，通过重组技术被插入编码抗体、抗原结合片段或结合蛋白的现有多核苷酸的限制性内切酶位点中。

为了进行表达，表达系统是使用利用谷氨酰胺合成酶基因作为选择标记的GS系统(Lonza)的表达系统。简单来说，使用利用谷氨酰胺合成酶基因作为选择标记的GS系统(Lonza)通过电穿孔(250V)在CHO细胞中进行转染。野生型CHO细胞在包含10％透析的胎牛血清(FCS)与2mM谷氨酰胺的DMEM(Sigma)中生长。用300μg线性DNA通过电穿孔转染6x10⁷CHO细胞。电穿孔之后，细胞再悬浮于具有谷氨酰胺的DMEM中，然后接种到36x96平板中(50μl/孔)，并在37℃、5％CO2中孵育。第二天，以150μl/孔的量添加选择培养基(无谷氨酰胺的DMEM)。大约3周后，使用不相关的抗体作为阴性对照，通过ELISA(参见下文)筛选集落。产生>20μg/ml的所有集落被扩增至24平板中，且随后到重复的T25烧瓶中。

为了高水平生产，最广泛使用的哺乳动物表达系统是利用通过二氢叶酸还原酶缺陷(“dhfr–”)中国仓鼠卵巢细胞提供的基因扩增程序的系统。该系统是本领域技术人员熟知的。该系统基于编码催化二氢叶酸转化为四氢叶酸的DHFR酶的二氢叶酸还原酶“dhfr”基因。为了实现高生产率，dhfr-CHO细胞用包含功能性DHFR基因及编码期望蛋白质的表达载体转染。这种情况下，期望蛋白质是重组抗体重链和/或轻链。

通过增加竞争的DHFR抑制剂甲氨蝶呤(MTX)的量，重组细胞通过扩增dhfr基因发展出抗性。在标准情况下，所使用的扩增单元比dhfr基因尺寸大很多，并且因此抗体重链是共扩增的(co-amplified)。

当需要大规模生产蛋白质例如抗体链时，要考虑所使用细胞的表达水平和稳定性。在长期培养中，重组CHO细胞群体(尽管来自单一亲本克隆)在扩增过程中相对于其特异性抗体产生丧失其同质性。

本申请提供编码本文所述抗体或抗原结合片段的分离的多核苷酸(核酸)、包含所述多核苷酸的载体以及用于转录和翻译所述多核苷酸成多肽的宿主细胞和表达系统。

本申请也提供了包含上述的至少一种多核苷酸的质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体。

本申请也提供包含如上所述的一种或多种构建体的重组宿主细胞。编码本文所述的任意抗体或其抗原结合片段的核酸本身形成了本申请的一个方面，产生本文所述抗体或其抗原结合片段的方法也形成了本申请的一个方面，该方法包括从其编码核酸的表达。表达通常可以通过在合适的条件下培养包含所述核酸的重组宿主细胞来实现。在通过表达产生之后，抗体或抗原结合片段可以使用任何合适的技术来进行分离和/或纯化，然后视情况使用。

本文描述的特异性抗体、抗原结合片段和编码核酸分子及载体可从例如其天然环境中以基本纯或同质形式被提供、分离和/或纯化。对于核酸，不含或基本上不含编码具有所需功能多肽的序列以外起源的核酸或基因。核酸可以包含DNA或RNA，并可被全部或部分合成。纯化的方法是本领域熟知的。

在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是本领域熟知的。合适的宿主细胞包括，但不限于，细菌细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞和杆状病毒系统。本领域可获得的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠骨髓瘤细胞和许多其他的细胞。常见的细菌宿主是大肠杆菌。

本领域中已经建立了原核细胞如大肠杆菌中抗体和抗体片段的表达。对于综述，参见例如Plückthun,A.Bio/Technology 9:545-551(1991)。作为生产本文所述抗体及抗原结合片段表达的一种选择，在培养的真核细胞中的表达也是本领域技术人员可获得的，最近的综述可参见，例如Raff,M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4:573-576；Trill J.J.等(1995)Curr.Opinion Biotech 6:553-560，将上述每一个的全部内容通过引用并入本文。

可以选择或构建合适的载体，包含合适的调控序列，包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸序列、增强子序列、标记基因和其他合适的序列。在适宜情况下，载体可以是质粒、病毒，例如噬菌体或噬菌粒。进一步的细节参见，例如Molecular Cloning:a Laboratory Manual:2nd edition,Sambrook等,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press。操作核酸的许多已知的技术和方案，例如制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞中及基因表达和蛋白质分析等，在Short Protocols in Molecular Biology,Second Edition,Ausubel等eds.,John Wiley&Sons,1992中进行了详细描述。Sambrook等和Ausubel等公开的方法通过引用将其全部内容并入本文，并且它们在本领域也是熟知的。

因此，本发明另一个方面提供了包含本文公开的核酸的宿主细胞。还有另一方面提供了包括将这种核酸引入宿主细胞中的方法。可以使用任何可获得的技术进行所述引入。对于真核细胞，合适的技术可以包括，例如，磷酸钙转染、DEAE Dextran、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其他病毒(例如牛痘病毒或对于昆虫细胞，杆状病毒)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括，例如，氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。

所述引入之后可以接着引起或允许从核酸表达，例如通过在用于基因表达的条件下培养宿主细胞。

在一种实施方式中，核酸整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)中。按照标准技术，整合可以通过包括促进与基因组重组的序列来促进。Ig增强可根据需要引起以最大化表达。

本发明也提供了一种方法，其包括在表达系统中使用上文中所述的构建体来表达上述的抗体或其抗原结合片段。

本发明还涉及分离的核酸，例如重组DNA分子或克隆的基因、或其简并变体、突变体、类似物或其片段，其编码本文所述的抗体或抗原结合序列。

一方面，本申请提供了编码本文所述抗体或其抗体结合片段的核酸。

在另一种实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段的重组DNA分子或克隆基因的完整DNA序列可被可操作地连接可引入适宜宿主中的表达控制序列。因此本申请扩展至使用包含编码抗体的VH和/或VL或其部分的DNA序列的克隆基因或重组DNA分子转化的单细胞宿主。

本申请另一特征是本文公开的DNA序列的表达。在本领域中众所周知的，通过可操作地将DNA序列连接至合适的表达载体中的表达控制序列并用所述表达载体转化合适的单细胞宿主，可以表达DNA序列。

DNA序列与表达控制序列的这种可操作连接当然包括(如果其还不是DNA序列的部分)在序列上游的正确阅读DNA框中提供起始密码子ATG。

多核苷酸和载体可以以分离的和/或纯化的形式提供(例如，不含或基本上不含除了编码具有所需功能多肽的多核苷酸以外起源的其他多核苷酸)。如本文使用的，“基本上纯的”或“基本不含”是指包含少于，例如约20％或更少外来材料、约10％或更少外来材料、约5％或更少外来材料、约4％或更少外来材料、约3％或更少外来材料、约2％或更少外来材料、或约1％或更少外来材料的溶液或悬浮液。

有多种宿主/表达载体组合可以用于表达本发明的DNA序列。有用的表达载体例如可以由染色体的、非染色体的和合成的DNA序列的区段组成。合适的载体包括，但不限于，SV40和已知细菌质粒的衍生物，例如，大肠杆菌质粒col El、Pcr1、Pbr322、Pmb9和它们的衍生物，质粒例如RP4；噬菌体DNA，例如噬菌体λ的众多衍生物，例如NM989，及其他噬菌体DNA，例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒如2u质粒或其衍生物；真核细胞中有用的载体，例如昆虫或哺乳动物细胞中有用的载体；来源于质粒和噬菌体DNA组合的载体，例如已被修饰以利用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒；等等。

本文还提供了重组宿主细胞，其包含一种或多种多核苷酸构建体。编码本文提供的抗体或抗原结合片段的多核苷酸形成了本发明的方面，产生抗体或抗原结合片段的方法也形成了本发明的方面，该方法包括从多核苷酸的表达。可以通过例如在合适的条件下培养包含所述多核苷酸的重组宿主细胞实现表达。抗体或抗原结合片段随后可以通过使用任何合适的技术分离和/或纯化，并视情况使用。

多种表达控制序列的任一种——控制可操作地与其连接的DNA序列表达的序列——可以用于这些载体中以表达DNA序列。所述有用的表达控制序列包括，例如，SV40的早期或晚期启动子、CMV、牛痘病毒、多瘤病毒(polyoma)或腺病毒、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、LTR系统、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区、fd壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其他的糖解酶的启动子、酸性磷酸酶(例如Pho5)的启动子、酵母α-交配因子的启动子、及已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其他序列，及其各种组合。

在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是已知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域可获得的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠骨髓瘤细胞和许多其他的细胞。常见的细菌宿主可以是例如，大肠杆菌。

本领域已经建立了在原核细胞中例如大肠杆菌中表达抗体或抗原结合片段的系统。对于综述，参见例如Plückthun,A.Bio/Technology 9:545-551(1991)。在培养的真核细胞中的表达对本领域技术人员来说也是可获得的(Raff,M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4:573-576；Trill J.J.等(1995)Curr.Opinion Biotech 6:553-560)。

多种单细胞宿主细胞也可用于表达DNA序列。这些宿主包括众所周知的真核的和原核的宿主，例如大肠杆菌、假单胞菌、芽胞杆菌、链霉菌、真菌如酵母的菌株，和动物细胞，例如CHO、YB/20、NS0、SP2/0、Rl.l、B-W和L-M细胞、非洲绿猴肾细胞(例如，COS 1、COS 7、BSC1、BSC40和BMT10)，昆虫细胞(例如，Sf9)以及组织培养中的人细胞和植物细胞。

可以理解，不是所有的载体、表达控制序列和宿主具有相同的表达DNA序列的性能。也不是所有的宿主与相同表达系统同样良好地发挥作用。但是，本领域技术人员无需过多实验就可以选择合适的载体、表达控制序列以及宿主以实现期望的表达，这并不超出本申请的范围。例如，选择载体时，必须要考虑宿主，因为所述载体必然要在该宿主中起作用。载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力和载体编码的其他蛋白质例如抗生素标记等的表达也考虑在内。本领域技术人员可以选择合适的载体、表达控制序列和宿主以实现期望的表达而不超出本申请的范围。例如，在选择载体时，必须要考虑宿主，因为所述载体在该宿主中起作用。载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力和载体编码的任何其他蛋白质如抗生素标记等的表达也可以考虑在内。

本发明还提供本文其他部分所述的质粒、载体、转录和表达盒形式的构建体，其包含至少一种上述的多核苷酸。可以选择或构建合适的载体，其包含合适的调控序列，包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸序列、增强子序列、选择标记和其他合适的序列。适当情况下，载体可以是质粒、病毒如噬菌体、噬菌粒等。进一步的细节参见，例如Molecular Cloning:a Laboratory Manual:2nd edition,Sambrook等,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press。操纵核酸的许多已知的技术和方案，例如，制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞中和基因表达以及蛋白质分析，在Short Protocols in Molecular Biology,Second Edition,Ausubel等eds.,John Wiley&Sons,1992中进行了详细描述。Sambrook等和Ausubel等公开的方法通过引用并入本文。

选择表达控制序列时，一般考虑多种因素。所述因素包括，例如，系统的相对强度、其可控性及与表达的特定DNA序列或基因的相容性，特别是关于潜在的二级结构。合适的单细胞宿考虑，例如，其与所选载体的相容性、其分泌特性、其正确折叠蛋白质的能力和其发酵需求、以及要表达的DNA序列编码的产品物宿主的毒性和纯化表达产物的难度来选择。

另一方面提供了包含本文所述一种或多种多核苷酸的宿主细胞。另一方面提供了使用任何可获得的技术将这样的一种或多种核苷酸引入宿主细胞中的方法。对于真核细胞，合适的技术可以包括，例如,磷酸钙转染、DEAE Dextran、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其他病毒(例如牛痘病毒或对于昆虫细胞，杆状病毒)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括，例如，氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。

引入后可以接着引起或允许从一种或多种多核苷酸的表达，例如，通过在用于从一种或多种多核苷酸表达一种或多种多肽的条件下培养宿主细胞。可以使用可诱导系统，并且表达通过添加激活剂诱导。

在一种实施方式中，多核苷酸可以整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)中。按照标准技术，整合可通过包括促进与基因组重组的序列促进。在另一实施方式中，核酸被保持在宿主细胞中的游离体载体上。

提供了包括在表达系统中使用上述的构建体来表达特定多肽的方法。

考虑到这些和其他因素，本领域技术人员可以构建多种载体/表达控制序列/宿主组合，其通过发酵或者在大规模动物培养中来表达DNA序列。

编码抗体、抗原结合片段或结合蛋白的多核苷酸在克隆之外或与克隆相反可重组/合成地制备。多核苷酸可以用适合于抗体、抗原结合片段或结合蛋白的密码子设计。一般来说，如果所述序列被用于表达，则选择对于期望的宿主优选的密码子。完整的多核苷酸可以从通过标准方法制备的重叠寡核苷酸组装，并组装成成完整的编码序列。参见，例如,Edge,Nature,292:756(1981)；Nambair等,Science,223:1299(1984)；Jay等,J.Biol.Chem.,259:6311(1984)，其中的每一篇都被通过引用将其全部内容并入本文。

位点特异性地将非天然氨基酸并入蛋白质中的通用方法在Noren等Science,244:182-188(1989年4月)中进行了描述。该方法可以用来产生具有非天然氨基酸的类似物。

如上所述的，编码抗体或其抗原结合片段的DNA序列通过合成而不是克隆来制备。DNA序列可用对于抗体或抗原结合片段氨基酸序列合适的密码子设计。一般来说，如果所述序列被用于表达，则选择对于期望的宿主优选的密码子。完整的序列从通过标准方法制备的重叠寡核苷酸来组装，并组装成完整的编码序列。

抗体或其抗原结合片段可使用本领域已知技术(例如，通过添加聚乙二醇(PEG))来修饰用于各种不同目的。PEG修饰(PEG化)可以导致以下一种或多种：改善的循环时间、改善的溶解性、改善的对蛋白水解的抗性、降低的抗原性和免疫原性、改善的生物利用度、降低的毒性、改善的稳定性和更易于配制(综述参见,Francis等,International Journal of Hematology 68:1-18,1998)。

不包含Fc部分的抗原结合片段的情况中，可以将Fc部分添加(例如，重组地)到该片段，例如，以在施用于受试者时提高血液循环中抗原结合片段的半衰期。合适Fc区的选择和整合所述片段的方法在本领域中是已知的。可以使用本领域已知的常规方法将IgG的Fc区引入到感兴趣的多肽中从而提高其循环半衰期但不损失其生物学活性，例如，U.S.专利号6,096,871中公开的那些，通过引用将其全部内容并入本文。当对受试者施用时，抗体的Fc部分可被进一步修饰以提高血液循环中抗原结合片段的半衰期。可以使用本领域的常规方法来确定修饰，例如，U.S.专利No.7,217,798中描述的方法，通过引用将其全部内容并入本文。

其他的提高循环中基于抗体的融合蛋白质的半衰期的方法也是已知的，例如，U.S.专利号7,091,321和6,737,056中描述的方法，其每一篇都通过引用将其全部内容并入本文。另外，抗体和其抗原结合片段可被产生或表达以使得它们在其复杂的N-葡萄糖苷-连接的糖链上不包含岩藻糖。已知从复杂N-葡萄糖苷-连接的糖链上移除岩藻糖会提高抗体和抗原结合片段的效应子功能，包括但不限于，抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。类似地，可以结合表位的抗体或其抗原结合片段可在其C末端连接到源自任意抗体同种型(例如IgG、IgA、IgE、IgD和IgM)以及任意同种型亚类(特别是IgG1、IgG2b、IgG2a、IgG3和IgG4)的免疫球蛋白重链的全部或部分上。

另外，本文描述的抗体或抗原结合片段也可以被修饰，从而使其能够跨过血脑屏障。本文描述的抗体或抗原结合片段的这种修饰允许治疗脑疾病如多形性胶质母细胞瘤(GBM)。允许蛋白质如抗体或抗原结合片段跨越血脑屏障的示例性修饰被描述于US专利申请公开号2007/0082380中，通过引用将其全部内容并入本文。

免疫球蛋白的糖基化已被证实对其效应子功能、结构稳定性、抗体产生细胞的分泌率有显著的影响(Leatherbarrow等,Mol.Immunol.22:407(1985))。负责这些性质的糖类基团通常连接于抗体的恒定(C)区。例如，IgG在CH 2结构域的297位天冬酰胺的糖基化是IgG激活补体依赖性细胞溶解的经典途径的完全能力所需要的(Tao和Morrison,J.Immunol.143:2595(1989))。IgM在CH 3结构域的402位天冬酰胺的糖基化是抗体正确装配和细胞溶解活性所必须的(Muraoka和Shulman,J.Immunol.142:695(1989))。移除IgA抗体在CH1和CH3结构域的162和419位的糖基化位点导致胞内降解和至少90％的分泌抑制(Taylo和Wall,Mol.Cell.Biol.8:4197(1988))。另外，抗体和其抗原结合片段可被产生或表达，从而它们在其复杂N-葡萄糖苷-连接的糖链上不包含岩藻糖。已知从复杂N-葡萄糖苷-连接的糖链上移除岩藻糖会提高抗体和抗原结合片段的效应子功能，包括但不限于，抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。这些“去岩藻糖基化”抗体和抗原结合片段可利用本领域已知的分子克隆技术通过多种系统来生产，包括但不限于，已被遗传工程化而使得它们不再包含对于在复杂N-葡萄糖苷-连接的糖链上包含岩藻糖所必须的酶和生化途径转基因动物、转基因植物或细胞系(亦称为岩藻糖基转移酶敲除的动物、植物、或细胞)。可被工程化成岩藻糖基转移酶敲除的细胞的非限制性实例包括CHO细胞、SP2/0细胞、NS0细胞和YB2/0细胞。

也已经观察到免疫球蛋白在可变(V)区中的糖基化。Sox和Hood报道，大约20％的人抗体在V区中被糖基化(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 66:975(1970))。V结构域的糖基化被认为起因于V区序列中N-连接糖基化信号Asn-Xaa-Ser/Thr的偶发出现，并且本领域中还未认为其对于免疫球蛋白功能具有作用。

可变结构域框架残基的糖基化可以改变抗体与抗原的结合相互作用。本发明包括人源化免疫球蛋白链的框架CDR中有限数目的氨基酸根据其选择来进行突变(例如，残基的置换、删除或添加)以提高抗体亲和性的标准。

在抗体或含Fc多肽的Fc区中，半胱氨酸残基可被移除或引入，从而消除或增加该区域中链间二硫键的形成。使用该方法产生的同型二聚体特异性结合剂或抗体可显示出改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀灭和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等,J.Exp Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。

已经证实，CDR内的序列可导致抗体结合至II类MHC，并且触发不期望的辅助T细胞反应。保守置换可以允许抗体保留结合活性、还降低其触发不期望的T细胞反应的能力。在一种实施方式中，重链或轻链的N末端20个氨基酸中的一个或多个可被移除。

在一些实施方式中，可以产生具有改变的糖结构从而导致改变的效应子活性的抗体分子，包括不存在或具有减少的岩藻糖基化的抗体分子，其显示出改善的ADCC活性。本领域中已知多种方法以实现这一点。例如，ADCC效应子活性由抗体分子与FcγRIII受体的结合来介导，这已被证实依赖于CH2结构域Asn-297处的N-连接糖基化的糖结构。非岩藻糖化抗体以比天然的、盐藻糖基化抗体相比提高的亲和性结合该受体，并且更有效地触发FcγRIII介导的效应子功能。一些宿主细胞株，例如Lec13或大鼠杂交瘤YB2/0细胞系天然地产生具有较低岩藻糖基化水平的抗体。Shields等,J Biol Chem.Jul.26,2002；277(30):26733-40；Shinkawa等,J Biol Chem.Jan.31,2003；278(5):3466-73。二分(bisected)糖水平的提高(例如通过在过表达GnTIII酶的细胞中重组产生抗体)也被确定为提高ADCC活性。Umana等,Nat Biotechnol.February 1999；17(2):176-80。已经预期两个岩藻糖残基中仅一个不存在可能足以提高ADCC活性(Ferrara等,J Biol Chem.Dec.5,2005)。

本文还包含抗体的共价修饰。如果适用的话，这些可通过化学合成或抗体的酶促或化学切割来完成。其他类型的共价修饰可通过靶定氨基酸残基与有机衍生化试剂反应来引入，所述衍生化试剂能够与所选择的侧链或N-或C-末端残基发生反应。

半胱氨酰残基最通常与α-卤代乙酸酯(和对应胺)反应，如氯乙酸或氯乙酰胺，以获得羧甲基或羧酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰残基也通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯代-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑反应衍生化。

组氨酰残基可通过与焦碳酸二乙酯在pH 5.5-7.0下反应而被衍生化，因为该试剂对组氨酰侧链是相对特异性的。对溴苯乙酰基溴也可使用；反应可以在pH 6.0下的0.1M二甲胂酸钠中进行。

赖氨酰基(lysinyl)和氨基末端残基可与琥珀酸或其他羧酸酐进行反应。用这些试剂的衍生化具有反转赖氨酰残基电荷的作用。用于衍生含α-氨基的残基的其他合适试剂包括酰亚氨酯(imidoester)如甲基吡啶酰亚胺酯(picolinimidate)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯代硼氢化物(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、邻甲基异脲、2,4-戊二酮和与乙醛酸的转氨酶催化反应。

精氨酰残基可通过与一种或几种常规试剂的反应进行修饰，例如苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮。由于胍官能团的高pKa值，精氨酸残基的衍生化要求反应在碱性的条件下进行。而且，这些试剂可与赖氨酸的基以及精氨酸ε-氨基发生反应。

可进行酪氨酰残基的特定修饰，特别令人感兴趣的是通过与芳香重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入到酪氨酰残基中。最常见的，N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷可被用来分别形成邻乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。酪氨酰残基使用¹²⁵I或¹³¹I来进行碘化以制备标记的蛋白质用于放射免疫测定中。

羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳二亚胺(R―N＝C＝N―R')的反应进行选择性修饰，其中R和R'是不同的烷基，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰基和谷氨酰基残基通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。

谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基可分别脱酰氨成为对应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。这些残基是在中性或碱性条件下脱酰胺基。

其他的修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,pp.79-86(1983))、N末端胺的乙酰化和任一C末端羧基的酰胺化。

另一共价修饰类型涉及化学或酶促偶联糖苷至特定结合剂或抗体上。这些方法的优点是它们不要求在对N-或O-连接糖基化具有糖基化能力的宿主细胞中产生多肽或抗体。取决于使用的偶联方式，糖可被连接于(a)精氨酸和组氨酸、(b)游离羧基、(c)游离的巯基如半胱氨酸的那些、(d)游离羟基如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些、(e)芳香残基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法在WO 87/05330(公开日1987年9月11日),和Aplin与Wriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,pp.259-306(1981)中进行了描述。

移除多肽或抗体上存在的任何糖部分可通过化学或酶促来实现。化学去糖基化包括将抗体暴露于化合物三氟甲磺酸或等同化合物。该处理导致切割大部分或全部糖，除了连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)，而同时保留抗体完整。化学去糖基化在Hakimuddin等Arch.Biochem.Biophys.259:52(1987)和Edge等.Anal.Biochem.,118:131(1981)中进行了描述。酶促切割抗体上的糖部分可以通过利用多种内或外糖苷酶来完成，参见Thotakura等.Meth.Enzymol.138:350(1987)。

铁调素活性的另一共价修饰类型包括将抗体与多种非蛋白聚合物中的一种连接，例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、聚氧乙烯化山梨糖醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油、聚氧化烯或多糖聚合物如右旋糖酐。这些方法也是本领域已知的，参见例如US专利号：4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；4,179,337；4,766,106；4,179,337；4,495,285；4,609,546或EP 315456。

结合预定多肽抗原的亲和性通常可通过在V区框架(通常在邻近一或多个CDR的区域内和/或在一个或多个构架区内)引入一个或多个突变来调节。通常，这类突变涉及引入保守氨基酸置换，其破坏或产生糖基化位点序列但不实质上影响多肽的亲水(hydropathic)结构性质。一般地，避免引入脯氨酸残基的突变。抗体和其抗原结合片段的糖基化进一步在U.S.专利No.6,350,861中进行了描述，将其糖基化作用的相关内容通过引用并入本文。

抗铁调素抗体

本文提供了结合铁调素的人源化抗体及其抗原结合片段。

铁调素涉及调节铁内稳态。铁调素结合铁转运蛋白并通过导致其从细胞表面内化并降解来降低其功能活性。

高水平的人铁调素可导致降低的铁水平，反之依然。导致铁调素活性缺失的铁调素基因的突变与少年型血色素沉着病(一种严重的铁过载疾病)有关。在小鼠中的研究证实了铁调素在控制正常的铁内稳态中的作用。

铁调素也可以涉及炎症期间的铁螯合作用。已经观察到在炎性刺激如感染(其诱导脊椎动物的先天免疫系统的急性期应答)后铁调素基因表达强烈地上调。可能通过脂多糖(LPS)、松节油、弗氏完全佐剂、不完全佐剂、腺病毒感染和炎性细胞因子白细胞介素-6(IL-6)上调铁调素基因表达。在患有慢性炎性疾病(包括细菌、真菌和病毒感染)的患者中也发现了铁调素表达和炎症性贫血之间的强相关性。

人铁调素是25个氨基酸的肽，具有抗微生物和铁调节活性。它也被称为LEAP-1(肝表达的抗微生物肽)。编码小鼠中83个氨基酸的前原肽的铁调素cDNA和在大鼠和人中84个氨基酸的前原肽的铁调素cDNA在通过铁调节的肝特异性基因的研究中随后被鉴别。首先切割24残基的N末端信号肽来制备前铁调素，其随后进一步处理以产生在血和尿中都发现的成熟铁调素。在人尿中，主要形式包含25个氨基酸，尽管在特定疾病中也存在不可检出的或极低浓度的较短的22和20个氨基酸的肽。

已经产生了抗铁调素的单克隆抗体(MAbs)，其调节铁调素活性并因而调节铁内稳态。下文中，提及术语“抗体”被认为包含本文所述的任意“抗原结合片段”，且该术语在可应用时是可互换使用的。

这些抗体及其抗原结合片段可用于诊断和治疗各种病症和疾病以及铁调素的纯化和检测。

抗体或抗原结合片段与铁调素的结合可以部分(例如5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或其间任意数字)或完全调节铁调素。抗体或抗原结合片段的活性可以使用体外分析和/或体内本领域已知的分析来确定，例如本文中描述的那些方法或本领域另外已知。

一方面，上文描述的任一抗体的抗原结合片段为Fab、Fab’、Fd、F(ab’)2、Fv、scFv、单链结合多肽(例如，具有Fc部分的scFv)或其本文描述的任何其他功能性片段。

如有需要，本发明描述的抗体或其抗原结合片段可以进一步被修饰以改变抗体的特定性质而同时保留期望的功能性。例如，在一种实施方式中，化合物可被修饰以改变化合物的药代动力学性质，例如体内稳定性、溶解性、生物利用度或半衰期。

抗体或其抗原结合片段可被配制用于施用于受试者的任意合适的途径，包括但不限于注射。注射包括例如皮下注射、腹膜内注射或静脉内注射。施用可在一、二、三、四、五、六、七或更多个注射位点进行。在一种实施方式中，施用是在6个注射位点。

使用这类方法产生的结合铁调素的抗体、抗原结合片段和结合蛋白质可被测试其以下一种或多种：结合亲和性、亲合力以及调节能力。有用的抗体和抗原结合片段可被施用于受试者以预防、抑制、管理或治疗病症、疾病或障碍，下文将更详细说明。

可利用常规方法来鉴别结合铁调素的抗体或其抗原结合片段。抗体和抗原结合片段可以评价结合亲和性、结合速率、解离速率和亲合力中的一个或多个。一方面，抗体可以评价其调节铁调素或其中存在铁调素结合序列(表位)的多肽的活性的能力。可以使用本领域公认的分析方法进行结合亲和性、结合速率、解离速率和亲合力的测量，包括(表面等离子体共振)但不限于，酶联免疫吸附测定(ELISA)、Scatchard分析、BIACORE分析等等，以及本领域技常用和本领域技术人员熟知的其他分析方法。

抗体与铁调素的结合和/或抗体及其抗原结合片段的能力的测量可通过，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、竞争结合分析、ELISPOT分析或本领域已知的任何其他可用的分析方法确定。这些分析方法是本领域常用的并且是本领域技术人员熟知的。

在一种非限制性实施方式中，可以用ELISA分析来测量结合铁调素的特定抗体或抗原结合片段的结合能力。

分析方法，例如ELISA，也可以用来鉴别与其他抗体或其抗原结合片段相比对铁调素显示出更高特异性的抗体或其抗原结合片段。如ELISA的分析方法也可以用于鉴别结合一种或多种多肽或一种或多种铁调素种类的表位的抗体或其抗原结合片段。特异性分析可以通过运行平行ELISA来进行，其中测试抗体或其抗原结合片段同时在单独的分析室中筛选其结合包含铁调素表位的不同多肽种类上的一种或多种表位的能力，以鉴别结合铁调素的抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员熟知的另一种测量表观结合亲和性的技术是表面等离子体共振技术(在BIACORE 2000系统上进行分析)(Liljeblad等,Glyco.J.2000,17:323-329)。标准测量和常规结合分析被描述于Heeley,R.P.,Endocr.Res.2002,28:217-229。

通过使用多种体外和体内方法，包括但不限于本领域已知的和本文描述的方法，可以测试抗体及其抗原结合片段的多种功能。

本文提供了结合铁调素的抗体及其抗原结合片段。在一个方面，本文提供了特异性结合铁调素的抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，

其中所述重链可变区包含：

(i)具有SEQ ID NO:55-57任一的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO:58-60任一的氨基酸序列的CDR2，和

(iii)具有SEQ ID NO:61-63任一的氨基酸序列的CDR3，

和所述轻链可变区包含：

(i)具有SEQ ID NO:64-66任一的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO:67-69任一的氨基酸序列的CDR2，和

(iii)具有SEQ ID NO:70-72任一的氨基酸序列的CDR3。

一方面，本文提供特异性结合铁调素或铁调素肽的抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，

其中所述重链可变区包含：

(i)具有SEQ ID NO:1-3任一编码的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO:4-6任一编码的氨基酸序列的CDR2，和

(iii)具有SEQ ID NO:7-9任一编码的氨基酸序列的CDR3，

和所述轻链可变区包含：

(i)具有SEQ ID NO:10-12任一编码的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO:13-15任一编码的氨基酸序列的CDR2，和(iii)具有SEQ ID NO:16-18任一编码的氨基酸序列的CDR3。

一方面，本文提供抗体或其抗原结合片段，包含如后文序列表所示的重链可变区框架区；和轻链可变区框架区，其中在SEQ ID NO:1-18或55-72任一中识别的CDR被插入利用Kabat编码的框架区中。

一方面，本文提供特异性结合铁调素的抗体或其抗原结合片段，通过将具有SEQ ID NO:19-27任一的氨基酸序列的肽注射啮齿动物(即，小鼠，大鼠或兔)而制备。在另一实施方式中，所述肽与载体(例如，钥孔血蓝素(KLH))或佐剂(完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(IFA))偶联。在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合铁调素的氨基酸残基1-9。在另一实施方式中，本文提供特异性结合铁调素的氨基酸残基1-7的抗体或其抗原结合片段。

抗体或其抗原结合片段结合的铁调素肽可以具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列。

本文提供抗体或其抗原结合片段，其特异性结合包含Hep-5、Hep-9、Hep-20、Hep-22和Hep25中任一的氨基酸序列的表位，其中所述肽的序列如序列表所示。

在一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合包含Hep-20(SEQ ID NO:22)、Hep-22(SEQ ID NO:23)和Hep-25(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的表位。

在一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合包含Hep-5(SEQ ID NO:25)或Hep-9(SEQ ID NO:24)的表位。在另一实施方式中，本文提供特异性结合包含铁调素的氨基酸残基1-9的表位的抗体或其抗原结合片段。在另一实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合包含铁调素氨基酸残基1-9的表位的2、3、4、5、6、7、8、或9个氨基酸残基。

在另一实施方式中，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体，其包含SEQ ID NO:55编码的重链CDR1、SEQ ID NO:58编码的重链CDR2、SEQ ID NO:61编码的重链CDR3、SEQ ID NO:64编码的轻链CDR1、SEQ ID NO:67编码的轻链CDR2和SEQ ID NO:70编码的轻链CDR3。

在另一实施方式中，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体，其包含SEQ ID NO:56编码的重链CDR1、SEQ ID NO:59编码的重链CDR2、SEQ ID NO:62编码的重链CDR3、SEQ ID NO:65编码的轻链CDR1、SEQ ID NO:68编码的轻链CDR2和SEQ ID NO:71编码的轻链CDR3。

在另一实施方式中，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体，其包含SEQ ID NO:57编码的重链CDR1、SEQ ID NO:60编码的重链CDR2、SEQ ID NO:63编码的重链CDR3、SEQ ID NO:66编码的轻链CDR1、SEQ ID NO:69编码的轻链CDR2和SEQ ID NO:72编码的轻链CDR3。

抗体可以是，例如，单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一种实施方式中，人源化可变重链包含如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。在另一实施方式中，人源化可变轻链包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。

一方面，本文提供了抗体及其抗原结合片段，包含如后文序列表所示的重链可变区框架区和轻链可变区框架区，其中在SEQ ID NO:1-18或55-72任一中识别的CDR被插入利用Kabat编码的框架区中。

抗原结合片段可以是，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv片段、单链结合多肽、Fd片段、可变重链、可变轻链、dAb片段或本文所述任何其他类型的片段。抗原结合片段可以是，例如AVIMER、双特异性抗体或重链二聚体。重链二聚体可以是，例如，骆驼或鲨鱼的重链构建体。

本文描述的抗体或其抗原结合片段可以具有约1至约10pM、约10至约20pM、约1至约29pM、约30至约40pM、约10至约100pM或约20至约500pM的解离常数(Kd)。

本文描述的抗体或其抗原结合片段可以具有小于约500pM、小于约400pM、小于约300pM、小于约200pM、小于约100pM、小于约75pM、小于约50pM、小于约30pM、小于约25pM、小于约20pM、小于约18pM、小于约15pM、小于约10pM、小于约7.5pM、小于约5pM、小于约3pM或小于约1pM的解离常数(Kd)。

本文描述的抗体或其抗原结合片段可以具有约10^-9至约10^-14、约10^-10至约10^-14、约10^-11至约10^-14、约10^-12至约10^-14、约10^-13至约10^-14、约10^-10至约10^-11、约10^-11至约10^-12、约10^-12至约10^-13或10^-13至约10^-14的对铁调素或铁调素肽的亲和性。

本文提供组合物，其包含抗体或其抗原结合片段以及可接受的载体或赋形剂。下文更详细描述了组合物。

本文还提供分离的核酸分子，包含编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。本文还提供了包含可操作地连接调控序列的核酸分子的表达载体。本文还提供包含本文提供的载体或核酸分子的宿主细胞。本文还提供使用宿主细胞产生抗体的方法，包括在合适的条件下培养该宿主细胞，使核酸被表达以产生抗体。

组合物

本文所述每一种化合物当与可接受载体或赋形剂组合时都可用作组合物。这些组合物可用于体外或体内分析或者在体内或体外施用于受试者以用公开的化合物治疗受试者。

除活性成分外，药物组合物可以包括本领域技术人员熟知的药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其他材料。这些材料应该是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。载体或其他材料的准确性质将取决于施用途径。

包含通过本文所述方法确定的目标蛋白质(例如，抗体或抗原结合片段)的药物制剂可通过混合具有所需纯度水平的蛋白质和任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂以冻干制剂或水性溶液的形式制备用于储存(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂是在使用的剂量和浓度下对接受者无毒的那些，且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸类；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；苯酚，丁基或苄基醇；烷基对羟基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于约10残基的)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子例如钠；金属复合体(例如，Zn蛋白质复合体)；和/或非离子型表面活性剂如或聚乙二醇(PEG)。

可接受的载体是对于要施用的受试者在生理学上可接受的，并且保持与其一起或在其中施用的化合物的治疗性质。可接受的载体及其配制已被一般地描述于例如Remington'pharmaceutical Sciences(18th Edition,ed.A.Gennaro,Mack Publishing Co.,Easton,PA 1990)。一种示例性的载体为生理盐水。本文使用的短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或介质，例如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，参与从一个器官或身体部分的施用位置携带或转运主题化合物到另一器官或身体部分，或用于体外分析系统中。每种载体从与制剂中其他成分相容并且对给药的受试者无害的意义上说是可接受。可接受的载体也不应改变主题化合物的特定活性。

在一方面，本文提供了药学上可接受或生理上可接受的组合物，包括溶剂(水性或非水性)、溶液、乳液、分散介质、涂层、等渗和吸收促进或延迟剂，与药学施用相容。因此药物组合物或药物制剂是指适合于在受试者中的药物用途的组合物。药物组合物和制剂包括一定量的本发明所述的化合物及药学或生理上可接受载体。

组合物可被配制成适合于特定的施用途径(即，系统或局部的)。因此，组合物包含适合于以各种途径施用的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一种实施方式中，如果需要的话，组合物可以进一步包括可接受的添加剂以提高组合物中化合物的稳定性和/或控制组合物的释放速率。可接受的添加剂不改变主题化合物的特定活性。示例性的可接受的添加剂包括，但不限于，糖例如甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖、木糖醇、海藻糖、山梨糖、蔗糖、半乳糖、右旋糖酐、右旋糖、果糖、乳糖及其混合物。可接受的添加剂可与可接受的载体和/或赋形剂例如右旋糖组合。或者，示例性的可接受的添加剂包括，但不限于，表面活性剂例如聚山梨酸酯20或聚山梨醇酯80，以提高肽的稳定性和减少溶液的凝胶化。表面活性剂可以以溶液的0.01％至5％的量添加至组合物中。添加这种可接受的添加剂提高储存中组合物的稳定性与半衰期。

在一种实施方式中，组合物可包含与调节张力并起稳定化作用的张力调节剂(tonicity agent)(例如多元醇、山梨糖醇、蔗糖或氯化钠)组合的等渗缓冲剂例如磷酸盐、醋酸盐或TRIS缓冲剂。组合物中张力调节剂可以以约为5％的量存在。

在另一种实施方式中，组合物可包含0.01至0.02％重量/体积的表面活性剂，从而抑制聚集并提高稳定性。

在另一个实施方式中，组合物的pH范围可以为4.5-6.5至4.5-5.5。

关于抗体的药物组合物的其他示例性说明可在，例如US 2003/0113316和U.S.专利No.6,171,586中找到，将每一篇的全部内容通过引用并入本文。

如果治疗的特定适应症需要的话，本发明的组合物还可包含多于一种活性化合物，例如具有不会不利地相互影响的互补活性的那些。例如，还可以进一步提供免疫抑制剂的治疗方法。这些分子适当地以对预期目的有效的量组合地存在。

活性成分可在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒与纳米囊剂)或在粗乳液中被包埋在通过例如凝聚作用或界面聚合制备的微胶囊中，例如分别使用羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)中。

本发明还预期了抗体的悬浮液与晶体形式；制备悬浮液和晶体形式的方法是本领域技术人员熟知的。

用于体内施用的组合物必须是无菌的。在一些实施方式中，本发明的组合物可由常规、熟知的灭菌技术来灭菌。例如，灭菌可通过经无菌过滤膜进行过滤而很容易地实现。所得溶液可被包装使用，或在无菌条件下过滤并冻干，在施用之前将冻干制剂与无菌溶液结合。

例如当多肽在液体组合物中相对不稳定时，可使用冷冻干燥来稳定多肽以供长期储存。冻干周期通常由三步组成：冷冻、首次干燥以及二次干燥；Williams和Polli,Journal of Parenteral Science and Technology,Volume 38,Number 2,pages 48-59(1984)。在冷冻步骤，冷却溶液直至其充份冷冻。在该阶段，溶液中的大部分水形成了冰。冰在首次干燥阶段升华，其通过使用真空降低操作室压力至低于冰的蒸气压而进行。最终，在降低操作室压力和升高的搁架温度的二次干燥阶段中去除吸附或结合的水。该方法产生了被称为冻干饼的材料。随后，所述饼可在使用前被重组。尽管稀释的抗菌剂溶液有时用于形成胃肠外施用的药物，冻干材料的标准重组方法是添加一定量纯水(通常等于冻干期间去除的体积)；Chen,Drug Development and Industrial Pharmacy,Volume 18,Numbers 11and 12,pages 1311-1354(1992)。

某些赋形剂例如多元醇(包括甘露糖醇、山梨糖醇和甘油)；糖(包括葡萄糖和蔗糖)；和氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)可作为稳定剂用于冷冻干燥产品；参见，例如,Carpenter等,Developments in Biological Standardization,Volume 74,pages 225-239(1991)。多元醇和糖也可用于保护多肽免受冷冻和干燥导致的伤害，并提高以干燥状态储存期间的稳定性。糖在冷冻干燥处理和储存期间都是有效地。其他种类的分子，包括单糖和二糖以及多聚物例如PVP，也被报道为冻干制品的稳定剂。

对于注射来说，组合物和/或药剂可为适于用上文所述合适的溶液进行重组的粉末。它们的例子包括，但不限于，冷冻干燥的、旋转干燥的或喷雾干燥的粉末、无定形粉末、颗粒(granules)、沉淀物或微粒(particulates)。对于注射来说，组合物可任选包含稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂及其组合。

还可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括包含抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，该基质为成型物品的形式，例如，薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(参见，例如U.S专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物例如Lupron Depot^TM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚D-(-)-3-羟丁酸。尽管聚合物例如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸羟基乙酸使得在超过100天的时间内释放分子成为可能，但某些水凝胶在较短的时期内释放蛋白质。微囊化的抗体在体内保留较长的时间，但它们可能由于在37℃暴露于潮湿而改性或结块，从而导致损失生物活性并且可能会改变免疫原性。取决于所涉机制，可以设计合理策略而提高稳定性。例如，如果发现结块机制是通过硫醇-二硫化物互换形成的分子间S—S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制水分含量、使用合适的添加剂和开发特定的聚合基质组合物来提高稳定性。

本发明描述的组合物可设计为本文所述的短效、快速释放、长效或持续释放。在一种实施方式中，组合物可配制成控制释放或缓慢释放。

施用药物组合物可以通过例如，注射，包括但不限于皮下注射、玻璃体内(intravitreal)注射、真皮内(intradermal)注射、静脉内注射、动脉内注射、腹膜内注射、脑脊髓内(intracerebreospinal)注射或肌内注射等方式。各种注射类型的组合物制剂中使用的赋形剂和载体都可预期用于本发明。下面的描述仅仅是通过举例进行说明，而不意在限制组合物的范围。用于注射的组合物包括，但不限于，水性溶液(在水溶性的情况下)或分散液、以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、无菌水、Cremophor EL^TM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)，及其适当的混合物。保持流动性可以通过以下方式，例如，通过使用包衣层例如卵磷脂、通过在分散体的情况中保持所需的颗粒尺寸和通过利用表面活性剂。抗菌剂和抗真菌剂包括，例如，对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸和乙基汞硫代水杨酸钠。等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇和氯化钠，均可被包含于组合物内。所得溶液可被包装用于原样使用或被冻干；冻干制剂可随后在给药之前与无菌溶液组合。对于静脉内的注射或在患部的注射，活性组分制备成胃肠外可接受的水性溶液形式，其是无热原的且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域技术人员完全能够使用例如等渗载体如氯化钠注射液、林格氏(Ringer's)注射液、乳酸化林格氏(Lactated Ringer's)注射液制备合适的溶液。防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他的添加剂在需要的时候可被包括在组合物内。如果需要的话，无菌注射溶液可以通过混合在合适的溶剂中所需量的活性成分以及上面列举组分的一种或其组合而进行制备，随后过滤灭菌。通常，分散体通过将活性成分加入包含基础分散介质和上述列举中其他所需组分的无菌载体中而进行制备。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任意其他期望成分的粉末。

组合物可以经由玻璃体内、皮下或经由玻璃体植入物而常规施用。

组合物可以常规地静脉内施用，例如注射单位剂量。对于注射，活性成分可以是胃肠外可接受的水性溶液形式，其基本上是无热原的且有适当的pH、等渗性和稳定性。本领域技术人员可以使用例如等渗介质例如氯化钠注射液、林格氏(Ringer's)注射液、乳酸林格氏注射液等制备合适的溶液。防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他的添加剂在需要的时候可被包括在组合物内。另外，还可通过气溶胶化来施用组合物(Lahn等,Aerosolized Anti-T-cell-Receptor Antibodies Are Effective against Airway Inflammation and Hyperreactivity,Int.Arch.Allergy Immuno.,134:49-55(2004))。

在一个实施方式中，组合物是冻干的，例如，为了提高存储保质期。当考虑将组合物用于本发明提供的药剂或任意方法时，预期组合物基本上是无热原的从而在施用给人类受试者时组合物不会导致炎症反应或危险的过敏性反应。测试组合物的热原和制备基本无热原的组合物对本领域技术人员来说是熟知的，并且可以使用市售的试剂盒来完成。

可接受的载体可包含稳定、提高或延迟吸收或清除率的化合物。这些化合物包括，例如，糖如葡萄糖、蔗糖或右旋糖酐；低分子量蛋白质；减少肽的清除率或水解的组合物；或者赋形剂或其他的稳定剂和/或缓冲剂。延迟吸收的试剂包括，例如，单硬脂酸铝和明胶。洗涤剂也可用于稳定或提高或减少药物组合物的吸收，包括脂质体载体。为了防止被消化，化合物可与组合物复合以使其对酸水解和酶水解具有抗性，或者可以将化合物与合适的抗性载体例如脂质体进行复合。防止化合物被消化的方法在本领域中是熟知的(参见，例如Fix(1996)Pharm Res.13:1760 1764；Samanen(1996)J.Pharm.Pharmacol.48:119 135；和U.S.专利No.5,391,377,其描述用于治疗剂口服递送的脂质组合物)。

术语“药学上可接受的”是指在施用于人时在生理上可耐受并且通常不会造成变应性或类似不良反应(如胃部不适，眩晕等等)的分子实体和组合物。

当提及治疗组合物时，术语“单位剂量”是指适合作为单一剂量用于人类的物理离散单位，各个单位包含经计算与所需稀释剂(即，载体或介质)一起产生期望治疗效果的预先确定量的活性物质。

组合物可以通过与剂量制剂相容的方式并且以治疗有效量施用。要施用的剂量取决于要治疗的受试者、受试者免疫系统利用活性成分的能力以及所需结合能力的水平。要施用的活性成分的精确量取决于医生的判断，并且与各个体有关。最初施用和加强注射的合适给药方案也是可变化的，但通常为起始施用、接着通过随后注射或其他施用方式在一个或多个小时间隔施用的重复剂量。或者，本发明也预期足以维持血液中浓度的连续静脉内输注。

一种实施方式预期使用本发明所述组合物制备用于治疗本文所述症状、疾病或障碍的药物。可以基于需要治疗的受试者的身体状况配制药物，也可以基于病症、疾病或障碍的阶段以单个或多个制剂配制药物。可以将药物包装于具有恰当标签的合适包装内以便配送至医院和诊所，其中所述标签用于提示治疗患有本文所述疾病的受试者。药物可以以单个或多个单位包装。用于组合物剂量和用法的说明书可以包含在如下文所述的包装里。本发明还涉及上文所述抗铁调素抗体或其抗原结合片段和药学上可接受载体的药物。

本申请提供了结合铁调素的抗体和其抗原结合片段的组合物，并且包括本文其他部分描述的物质。本申请所述结合铁调素的抗体及其抗原结合片段可以用于治疗与铁内稳态相关的各种疾病和病症。

组合物(本发明所述抗体或抗原结合片段)可以单独施用或与第二组合物同时或先后(取决于治疗的病症)联合施用。在一种实施方式中，第二治疗性处理是红细胞生成刺激剂。当施用两个或多个组合物时，可以联合施用组合物(顺次或同时施用)。可以施用单个剂量或多个剂量的组合物。

配制用于人类受试者施用时，组合物可被配制为无热原的。测试组合物的热原和制备无热原药物组合物是本领域技术人员熟知的。

一种实施方式预期使用本发明的任意组合物来制备用于治疗本发明所述障碍的药剂。可以基于需要治疗的受试者的身体状况配制药物，也可以基于障碍的阶段以单个或多个制剂形式配制药物。可以将本发明的药物包装于具有恰当标签的合适包装内以便配送至医院和诊所，其中所述标签用于提示治疗患有本文所述障碍的受试者。药物可以以单个或多个单位包装。用于药物组合物剂量和用法的说明书可以包含在如下文所述的包装里。

诊断

本申请提供了诊断铁调素相关障碍的方法，包括：(a)将来自怀疑患有所述障碍的受试者的生物样品与本文所述抗体或其抗原结合片段在允许抗体或其抗原结合片段结合铁调素的条件下接触；和(b)检测和/或定量结合抗体或其抗原结合片段的铁调素，其中在(b)中定量的样品中铁调素的量高于阈值提示存在铁调素相关障碍，低于阈值提示不存在铁调素相关障碍。

本申请提供了区分炎性疾病和非炎性疾病的方法，包括：(a)将来自怀疑患有所述障碍的受试者的生物样品与本文所述抗体或其抗原结合片段在允许抗体或其抗原结合片段结合铁调素的条件下接触；和(b)检测和/或定量结合到抗体或其抗原结合片段的铁调素，其中在(b)中定量的样品中铁调素的量高于阈值提示存在炎性疾病，低于阈值提示不存在炎性疾病。

在一种实施方式中，抗体或抗原结合片段还包括可检测的部分。检测可以在体外(in vitro)、体内或离体(ex vivo)发生。铁调素与抗体或其抗原结合片段的检测和/或确定(定量、定性等)的体外分析方法包括但不限于，例如ELISA、RIA和western印迹。体外检测中，铁调素的诊断或监控可以通过从受试者获得样品(例如，血样)以及在例如标准ELISA分析中检验样品来进行。例如，96孔微滴定板可被涂布本文所述抗体或其抗原结合片段、冲洗、然后用PBS-Tween/BSA涂布以抑制非特异性结合。血样可被连续稀释并放入单个或重复孔中，并与铁调素连续稀释标准曲线相比较。孵育并冲洗孔后，添加生物素标记的抗铁调素抗体，随后添加链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶。冲洗孔并添加底物(辣根过氧化酶)以在板上显色。使用常规的读板器和软件来读板。

当在体内检测时，通过使用任何常规方法例如本文所述方法施用抗体或抗原结合片段来产生接触。在所述方法中，检测样品或受试者中的铁调素可用于诊断与活性有关或相关的疾病或障碍，例如本文所述的疾病和障碍的。

铁调素的体内检测、诊断或监控中，对受试者施用结合铁调素的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段连接可检测的部分。可检测的部分可以用本领域已知的方法来可视化，例如但不限于，核磁共振成像(MRI)、荧光、放射成像、内窥镜提供的光源、腹腔镜或血管内导管(即,通过检测光活性剂)、光扫描、正电子发射体层摄像术(PET)扫描、全身核磁共振(NMR)、放射闪烁造影术、单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)、靶向近红外区(NIR)扫描、X-射线、超声等等，例如下列文件描述的，如U.S专利No.6,096,289、U.S.专利No.7,115,716、U.S.专利No.7,112,412、U.S.专利申请No.20030003048和U.S.专利申请No.20060147379，将每一篇的全部内容通过引用并入本文。使用这些方法检测化合物的标记也是本领域熟知的，并在通过引用将其并入本文的上述专利和应用中进行了描述。可检测部分的可视化允许检测、诊断和/或监控铁调素相关症状或疾病。

利用对期望靶蛋白即铁调素的抗体特异性的其他诊断分析是本领域熟知的，也被本发明所预期。

对于体外检测方法，从受试者获得的样品包括但不限于，血、组织活检样品和来自受试者的流体。

因此,本发明提供了抗铁调素的人源化抗体和其抗原结合片段，其能够用于检测或诊断与疾病或障碍相关的铁调素水平，潜在地表明需求治疗处置。在特定的实施方式中，抗体包含本发明所述的人源化抗铁调素抗体。在其他实施方式中，抗体进一步包括第二试剂(agent)。该试剂可以是分子或部分，例如比如报告分子或可检测标记。用于这些检测方法的可检测标记/部分是本领域熟知的，下文将详细描述。报告分子是可以使用分析方法检测的任何部分。与多肽偶联的报告分子的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、着色颗粒或配体，例如生物素。可检测的标记包括由于其特定功能性质和/或化学性质可被检测到的化合物和/或元素，其使用允许它们附着的多肽被检测和/或进一步定量(如果需要的话)。本领域熟知许多合适的可检测的(成像)试剂，并且连接它们到多肽的方法也是本领域熟知的(参见，例如U.S专利No.5,021,236；4,938,948；和4,472,509，将每一篇通过引用并入本文)。

将多肽如抗体与可检测的部分连接的方法是本领域熟知的，包括，例如，重组DNA技术来形成融合蛋白质和偶联物(例如化学偶联)。通过化学偶联或重组工程制备融合蛋白的方法是本领域熟知的。共价和非共价连接各组分的方法也是本领域熟知的。参见，例如Williams(1995)Biochemistry 34:1787 1797；Dobeli(1998)Protein Expr.Purif.12:404-414；和Kroll(1993)DNA Cell.Biol.12:441-453。

在某些情况下，可能有必要在标记或部分以及本申请所述抗体、抗原结合片段或结合蛋白的一或多个部分之间引入非结构多肽接头区。接头帮助改善柔性和/或降低任意两片段之间的空间位阻。接头还可以帮助各片段进行合适的折叠。接头可以是天然来源的，例如被确定为在蛋白质的两个结构域之间的无规卷曲中存在的序列。一种接头序列是在RNA聚合酶亚基的C末端和N-末端结构域之间发现的接头。其他天然存在的接头的实例包括在1CI和LexA蛋白质上发现的接头。

在接头内，氨基酸序列可以基于例如经验确定或用模型来揭示的接头性质而变化。选择接头的考虑因素包括接头的柔性、接头的电荷和天然存在亚基的接头中一些氨基酸的存在。接头还被设计，以使得接头上的残基接触脱氧核糖核酸(DNA)，从而影响结合亲和性或特异性或与其他蛋白质相互作用。某些情况下，例如有必要跨越亚基之间的较长距离时或当结构域必须被保持为特定构型时，接头可以任选包含其他折叠的结构域。在一些实施方式中，接头设计要涉及结构域排列，其需要接头跨越相对较短距离，例如小于约10埃但是，在某些实施方式中，接头跨越最多约50埃的距离。

在接头内，氨基酸序列可以基于例如经验确定或用模型来揭示的接头性质而变化。选择接头的考虑因素包括接头的柔性、接头的电荷和天然存在亚基的接头中一些氨基酸的存在。接头还被设计，以使得接头上的残基接触DNA，从而影响结合亲和性或特异性或与其他蛋白质相互作用。某些情况下，例如有必要跨越亚基之间的较长距离时或当结构域必须被保持为特定构型时，接头可以任选包含其他折叠的结构域。

偶联多肽(游离的或细胞结合的)至珠粒的方法是本领域熟知的。选择偶联的多肽或呈递多肽的细胞的方法也是本领域熟知的。简单来说，顺磁性聚苯乙烯微粒是商业上可获得的(Spherotech,Inc.,Libertyville,IL；Invitrogen,Carlsbad,CA)，其中将肽偶联到已用官能团进行修饰或已涂布多种抗体或配体(如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或生物素)的微粒表面。

微粒的顺磁性允许利用磁体将它们从溶液中分离。在从磁体上移除后，微粒很容易再悬浮于溶液中。在管中，多肽可被偶联至涂布聚氨酯层的顺磁性聚苯乙烯微粒。微粒表面的羟基可以通过与对羟基苯甲磺酰氯的反应而被活化(Nilsson K和Mosbach K.“p-Toluenesulfonyl chloride as an activating agent of agarose for the preparation of immobilized affinity ligands and proteins.”Eur.J.Biochem.1980:112:397-402)。或者，包含表面羧酸的顺磁性聚苯乙烯微粒可用碳二亚胺活化，随后偶联至多肽，从而在多肽伯胺基团和微粒表面羧酸基团之间形成稳定的酰胺键(Nakajima N和Ikade Y,Mechanism of amide formation by carbodiimide for bioconjugation in aqueous media,Bioconjugate Chem.1995,6(1):123-130；Gilles MA,Hudson AQ和Borders CL Jr,Stability of water-soluble carbodiimides in aqueous solution,Anal Biochem.1990Feb 1；184(2):244-248；Sehgal D和Vijay IK,a method for the high efficiency of water-soluble carbodiimide-mediated amidation,Anal Biochem.1994Apr；218(1):87-91；Szajani B等,Effects of carbodiimide structure on the immobilization of enzymes,Appl Biochem Biotechnol.1991Aug；30(2):225-231)。另一个选择是偶联生物素化的多肽至表面已经共价连接单层链霉抗生物素蛋白的顺磁性聚苯乙烯微粒(Argarana CE,Kuntz ID,Birken S,Axel R,Cantor CR.Molecular cloning and nucleotide sequence of the streptavidin gene.Nucleic Acids Res.1986；14(4):1871-82；Pahler A,Hendrickson WA,Gawinowicz Kolks MA,Aragana CE,Cantor CR.Characterization and crystallization of core streptavidin.J Biol Chem 1987:262(29):13933-13937)。

多肽可被偶联至多种荧光染料、猝灭剂和半抗原如荧光素、R-藻红素和生物素。偶联可以发生在多肽合成期间或在多肽合成纯化之后。生物素是一种小的(244千道尔顿)维生素，其以高亲和性结合至抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白并且能够被偶联至多数肽上而不会改变其生物活性。使用固定的链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白亲合凝胶，生物素标记的多肽很容易从未标记的多肽中纯化，并且链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白偶联探针可用于在例如ELISA、斑点印迹(dot blot)或蛋白质印迹应用中检测生物素化的多肽。生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯是最常用的生物素化试剂。N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素在生理缓冲液中与伯胺有效地反应以形成稳定的酰胺键。多肽在N末端具有伯胺，在赖氨酸残基侧链上也可以有伯胺，伯胺可用作N-羟基琥珀酰亚胺活化生物素试剂标记的靶位点。一些不同的生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯也是可获得的，其具有不同的性质和间隔臂长度(Pierce,Rockford,IL)。磺基N-羟基琥珀酰亚胺酯试剂是水溶性的，能使反应在不存在有机溶剂的条件下进行。

生物素与多肽的摩尔比可以使用本领域已知技术用2-(4’-羟基偶氮苯-2-羧酸)分析来确定(Green,NM,(1975)“Avidin.In Advances in Protein Chemistry.”Academic Press,New York.29,85-133；Green,NM,(1971)“The use of bifunctional biotinyl compounds to determine the arrangement of subunits in avidin.”Biochem J.125,781-791；Green,NM.,(1965)“A spectrophotometric assay for avidin and biotin based on binding of dyes by avidin.”Biochem.J.94:23c-24c)。一些生物素分子可偶联至多肽，并且每个生物素分子可以结合一个分子的抗生物素蛋白。生物素抗生物素蛋白键的形成是非常迅速地，并且在有机溶剂、极端pH和改性试剂中都是很稳定的。为了定量生物素化，在2-(4’-羟基偶氮苯-2-羧酸)与抗生物素蛋白的混合物中添加包含生物素化多肽的溶液。由于生物素对抗生物素蛋白具有高亲和性，其替代了2-(4’-羟基偶氮苯-2-羧酸)，在500nm处的吸光度成比例地降低。通过测量2-(4’-羟基偶氮苯-2-羧酸)抗生物素蛋白溶液在添加包含生物素的肽之前和之后的吸光度，可以在单个小池(cuvette)中定量溶液中生物素的量。吸光度的变化按照对2-(4’-羟基偶氮苯-2-羧酸)抗生物素蛋白复合体的消光系数与样品中生物素的含量相关。

或者，抗体、抗原结合片段或结合蛋白可以与荧光部分偶联。多肽与荧光部分(例如，R-藻红素、异硫氰酸荧光素(FITC)等等)的偶联可以使用本领域已知的技术完成，所述技术描述于，例如，Glazer,AN和Stryer L.(1984).Trends Biochem.Sci.9:423-7；Kronick,MN和Grossman,PD(1983)Clin.Chem.29:1582-6；Lanier,LL和Loken,MR(1984)J.Immunol.,132:151-156；Parks,DR等(1984)Cytometry 5:159-68；Hardy,RR et al.(1983)Nature 306:270-2；Hardy RR等(1984)J.Exp.Med.159:1169-88；Kronick,MN(1986)J.Immuno.Meth.92:1-13；Der-Balian G,Kameda,N和Rowley,G.(1988)Anal.Biochem.173:59-63。

在一个非限制性实施方式中，抗体抗原结合片段可以连接(偶联)可检测的标记(例如放射性核素、铁相关化合物、染料、显像剂或荧光剂)用于免疫检测铁调素，其可用于对体外和/或体内抗体与铁调素的结合进行可视化。

非限制性放射性标记的实例包括，例如³²P、³³P、⁴³K、⁵²Fe、⁵⁷Co、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁷Cu、⁶⁸Ga、⁷¹Ge、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、⁷⁷As、⁷⁷Br、⁸¹Rb/⁸¹MKr、⁸⁷MSr、⁹⁰Y、⁹⁷Ru、⁹⁹Tc、¹⁰⁰Pd、¹⁰¹Rh、¹⁰³Pb、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹¹Ag、¹¹¹In、¹¹³In、¹¹⁹Sb、¹²¹Sn、¹²³I、¹²⁵I、¹²⁷Cs、¹²⁸Ba、¹²⁹Cs、¹³¹I、¹³¹Cs、¹⁴³Pr、¹⁵³Sm、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁹Eu、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁸⁹Re、¹⁹¹Os、¹⁹³Pt、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁷Hg、¹⁹⁹Au、²⁰³Pb、²¹¹At、²¹²Pb、²¹²Bi和²¹³Bi。可以使用抗体成像领域已知的常规化学将放射性标记附着到化合物上。放射性标记的化合物用于体外诊断技术和体内放射性显像技术以及放射性免疫疗法。

在一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以偶联至治疗部分和可检测部分。抗体或其抗原结合片段可以与亲和标记(例如，纯化标记)偶联或重组改造。亲和标记例如His6标签(SEQ ID NO:28)在本领域中是常规的。

本申请提供的抗体或其抗原结合片段可以偶联或链接到治疗部分和/或显像或可检测部分和/或亲和标记。偶联或连接多肽的方法是本领域熟知的。化合物与标记之间的连接(结合)包括本领域熟知的任意方法，包括但不限于，共价和非共价相互作用，化学偶联以及重组技术。

治疗方法

本申请提供了通过对受试者施用结合铁调素的抗体或其抗原结合片段的组合物在受试者(人或非人)中诱导应答的方法。抗体结合的结合位点可以是连续的或构象的/不连续的表位。在一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合至包含铁调素氨基酸残基1-9位的表位。在另一实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合包含铁调素氨基酸残基1-9的表位的2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸残基。在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合Hep-20、Hep-22与Hep-25。

铁调素可具有例如SEQ ID NO:19的氨基酸序列。铁调素肽可具有例如SEQ ID NO:20-25任一的氨基酸序列。在另一实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合本文所述肽SEQ ID NO(包括，例如SEQ ID NO:19-27)的任一的氨基酸序列。

本发明的有效应答是指当受试者经历部分或完全的疾病迹象或症状的缓解或减轻时实现的应答，并且特别包括，但不限于，延长存活期。基于预后因素(包括复发次数、疾病的阶段以及其他因素)，预期的无进展存活期可以月至年来计量。延长存活期包括但不限于至少1月(mo)、约至少2个月、约至少3个月、约至少4个月、约至少6个月、约至少1年、约至少2年、约至少3年等时间。总存活期也可以以月到年来计量。或者，有效的应答可以是受试者症状维持不变。治疗症状的进一步说明在下文中详述。

本申请所述抗体或抗原结合片段的组合物可以用作非治疗剂(例如，作为亲和纯化试剂)。通常，在一个这种实施方式中，使用本领域常规的方法例如Sephadex树脂或滤纸将感兴趣的蛋白质固定于固相上。固定的蛋白质与包含要纯化的感兴趣靶标(或其片段)的样品接触，随后用合适的溶剂冲洗载体，基本上去除了除结合在固定抗体上的靶蛋白以外样品中的其他全部材料。最后，用另一种合适的溶剂冲洗载体，例如甘氨酸缓冲液、pH 5.0，以释放靶蛋白。除了纯化，组合物可用于本申请所述疾病与障碍的检测、诊断和治疗。

本申请所用术语“接触”是指将化合物的组合物或溶液和包浴(bathing)来自机体的多肽、细胞、组织或器官的液体培养基添加在一起。或者，“接触”是指将化合物的溶液或组合物与源自机体的液体(例如血、血清或血浆)进行混合。体外应用中，组合物还可以包含另一组分，例如二甲基亚砜(DMSO)。二甲基亚砜有助于化合物的摄取或化合物的溶解度。通过利用递送装置比如基于移液器的装置或基于注射器的装置，包含测试化合物的溶液可被加入到包浴细胞、组织或器官的培养基中，或与另一种液体例如血等混合。对于体内应用，接触可以通过例如以任何合适方式向受试者施用组合物而发生；与药学上可接受赋形剂与载体一起的组合物在上文已经进行了详细描述。

根据本申请的一种实施方式，“受试者”(例如，哺乳动物，如人，或非人类动物，如灵长类、啮齿类、母牛、马、猪、羊等等)是哺乳动物，其显示出本申请所述疾病或障碍的一种或多种临床表现和/或症状。

本申请所述组合物可能以治疗有效量(其通过抑制例如本申请所述的与铁调素相关的疾病或障碍来有效产生一些期望的治疗效果)施用给受试者，且具有可应用于任何医学治疗中的合理受益/风险比率。为了向人类受试者施用本发明的组合物，可以使用本领域技术人员熟知的方法来配制化合物。治疗有效量是在器官或组织中实现至少部分期望的治疗或预防效果的量。带来预防和/或治疗处理疾病或障碍所必需的抗铁调素抗体或其抗原结合片段的剂量并不是固定的。施用的抗铁调素抗体或其抗原结合片段的剂量可根据疾病种类、疾病的扩展程度、患有疾病或障碍的哺乳动物的大小而不同。一种实施方式中，本文所述的两种或多种抗铁调素抗体联合向所述受试者施用。联合包括同时或顺次施用抗体。

本申请定义的“施用”是指以导致组合物进入受试者体内的方式向受试者提供组合物。所述施用可以通过任何途径施用，包括，但不限于，通过皮下、玻璃体内、真皮内、静脉内、动脉内、腹膜内、脑脊髓内，或肌内给药(例如，注射)来局部地、区域地或系统地施用。“同时施用”指的是在彼此相差较短时间期限内施用；所述时间期限可以是小于2周、小于7天、小于1天或甚至可以是同时施用。

可以改变组合物中活性成分的实际剂量水平，从而获得对于特定受试者、组合物和施用方式有效实现期望治疗应答的活性成分的量，且对受试者是无毒的。选择的剂量水平取决于很多因素，包括所使用特定化合物的活性、给药途径、给药时间、所使用特定化合物的排出速率、治疗的持续时间、与所使用特定化合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、治疗受试者的年龄、性别、体重、身体状况、一般健康水平和前病史、以及医学领域熟知的类似因素。

本申请所述抗体和抗原结合片段可以不同的给药量以及经不同的时限施用至受试者。非限制性剂量包括约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约125mg/kg、约150mg/kg、约175mg/kg、约200mg/kg或其间的任意整数。另外，抗体或抗原结合片段可以按照下述施用：一周两次、每周、每两周、每三周、每4周、每6周、每8周、每12周或其间任意周数的联合。也预期了给药周期，比如例如，每周一次或两次施用抗体或其抗原结合片段并持续4周，随后2周不治疗。其他的给药周期包括，例如，本申请所述的剂量和周数周期的各种组合也预期在本发明范围内。

组合物的治疗有效量可能发生改变，并且取决于疾病的严重程度和治疗受试者的体重和总体状况，但通常每次应用约1.0μg/kg至约100mg/kg体重、或约10μg/kg至约30mg/kg、或约0.1mg/kg至约10mg/kg、或约1mg/kg至约10mg/kg。根据需要、取决于对障碍或症状的应答、以及受试者的治疗耐受性，施用可以为每天施用、隔天施用、每周施用、每月两次施用、每月施用、或更大或更小的频次。可能需要较长时间内(例如4、5、6、7、8、9、10或12周或更长时间)的维持剂量，直到产生对障碍症状的期望的抑制，并且剂量可根据需要调整。治疗的进展可以通过常规技术和分析很容易地进行监控。

特定的剂量可根据受试者的疾病症状、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药间隔、给药途径、排出速率以及药物联用等来调整。所有上述包含有效量的剂量形式在常规实验范围内都是可行的，因此，包括在本发明的范围内。

在某些实施方式中，本发明的特异性结合试剂或抗体是在生理溶液中、以0.01mg/kg至100mg/kg的剂量范围、以每天至每周至每月(例如，每天、每隔一天、每三天、或每周2、3、4、5、或6次)的频次静脉注施用，优选剂量范围为以每周2次或3次频次的0.1至45mg/kg、0.1至15mg/kg或0.1至10mg/kg，或每月一次最多45mg/kg。

“接触”在本申请中被定义为将本申请提供的组合物与本申请所述的细胞、器官、组织或液体物理上接近。接触包括系统性或局部施用本申请提供的组合物，包括但不限于，体外、体内和/或体外的程序与方法。“组合(combining)”与“接触”在本文中可以互换使用，指的是相同的意思。

本申请所述抗体可以任何合适的方法全身地或局部地施用，包括胃肠外、皮下、腹膜内、脑脊髓内、肺内、和鼻内施用，并且如果期望局部治疗，损害内给药。胃肠外途径包括静脉内、动脉内、腹膜内、硬膜外的、鞘内施用。另外，特异性结合制剂或抗体适合用脉冲输注，特别是用递减剂量的特异性结合制剂或抗体。在一种实施方式中，组合物是通过注射来施用，部分取决于给药是短期的还是长期的。可以预期其他给药方式，包括局部、特别是经皮、经粘膜、直肠、口腔或局部给药例如通过置于接近期望位点的导管。

当受试者经历部分或完全的疾病迹象或症状的缓解或减轻时实现了应答，并且特别包括，但不限于，延长存活期。基于预后因素包括复发的数目、疾病的阶段以及其他因素，预期的无进展存活期可以月至年来计量。延长存活期包括但不限于至少1月(mo)、约至少2个月(mos)、约至少3个月、约至少4个月、约至少6个月、约至少1年、约至少2年、约至少3年或更多。总存活期也可以以月到年来计量。受试者的症状可以维持不变或可以减轻。

具有本领域常规技能的医生或兽医可以很容易确定和给出所需的组合物有效量(ED50)的处方。例如，医师或兽医可以以比为了实现期望治疗效果所需剂量低的水平、开始给药组合物中所使用化合物，然后逐渐增加剂量直到实现预期效果。或者，剂量可保持恒定。

组合物可以通过上文所述的任一常规途径施用给受试者。无论选择何种给药途径，本发明的化合物(其可以以合适的水合形式和/或组合物形式使用)被配置(如下文所述或使用本领域技术人员熟知的其他惯用方法)成可接受剂量形式。

抗体和/或其他药物可在分开的组合物中联合，用于同时或先后施用。在一种实施方式中，同时施用包括在同一时间施用的或者彼此在30分钟内施用的一种或多种组合物。施用可在相同或不同的位置进行。

所述成分的毒性和治疗效能可以通过在细胞培养或实验动物中的例如用于确定LD50(对50％群体的致命剂量)和ED50(对50％群体的治疗有效剂量)的标准药物程序来确定。毒性和治疗效果之间的剂量比率称为治疗指数，其可以用LD50/ED50比率来表示。当可能使用显示出毒性副作用的化合物时，应小心设计靶向所述化合物至受侵袭组织位点的递送系统，以最小化对健康细胞的潜在损害，从而，降低副作用。

细胞培养分析和动物实验中获得的数据可被用于制定供人体使用的剂量范围。所述化合物的剂量优选处于包括ED50的一系列循环浓度范围内，具有很小毒性或没有毒性。取决于使用的剂量形式和使用的给药途径，剂量可以在范围内变化。对于本发明方法使用的任何化合物，其治疗有效剂量都可以从细胞培养分析中初估。剂量可以在动物模型中形成，以实现包括在细胞培养中确定的IC50(即，实现半数最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度排布。血浆中的水平可以通过例如高效液相色谱法等来测定。这些信息可用于更精确地确定人体中的可用剂量。

如本申请所使用的，抗体或其抗原结合片段可以是铁调素活性拮抗剂，是指抑制铁调素的铁调节活性的物质。

一方面，铁调素活性拮抗剂可以是抑制铁调素功能的物质，例如，通过抑制铁调素和铁转运蛋白之间的结合，通过抑制铁调素控制的细胞铁保留或帮助铁转运蛋白依赖性铁转运。铁调素活性拮抗剂包括结合铁调素并抑制其活性的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段,可在某些情况下结合铁转运蛋白但不激活铁转运蛋白铁转运。

在另一实施方式中，本申请所述抗体或其抗原结合片段可在体外和/或体内抑制(或中和)铁调素铁调节活性。铁调素中和抗体用于治疗铁调素相关障碍或铁内稳态障碍。铁调素中和活性可通过例如多种标识来测量，例铁蛋白/铁水平、红血细胞计数、红细胞性质(血红蛋白含量和/或细胞容积)、早期红细胞性质(网织红细胞计数、血红蛋白含量或细胞容积)、铁转运蛋白内化或铁转运等。在一种非限制性实施方式中，本申请所述抗体或其抗原结合片段以约10^-8M或更低的EC50降低胞内的铁浓度，和/或增加循环铁浓度。

本申请所述抗体或其抗原结合片段可拮抗人铁调素的作用或抑制铁调素铁调节活性。在某些实施方式中，本申请所述抗体或其抗原结合片段以下述EC50发挥作用：约1×10^-8M或更低、或约1×10^-7M或更低。例如，经铁蛋白分析确定，抗体可以约1×10^-8M或更低的EC50降低细胞胞中的胞内铁水平，或可以约1×10^-8M或更低的EC50降低铁蛋白表达。在其他实施方式中，本申请所述抗体与对照抗体或安慰剂相比，可降低游离血清铁调素水平至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％。在其他实施方式中，本申请所述抗体可能增加红血细胞计数(数量)、红血细胞平均细胞容积或红血细胞血红蛋白含量、增加血红蛋白、增加红细胞压积、增加％Tsat、增加循环(或血清)铁水平、和/或增加或正常化网织红细胞计数、网织红细胞平均细胞容积、网织红细胞血红蛋白含量或网织红细胞数量。

本申请提供了利用本文描述的抗体或其抗原结合片段的诊断方法。本申请所述抗体或其抗原结合片段还可用于提纯目的。

本申请还提供了利用本文所述抗体或其抗原结合片段的治疗方法。所述抗体或其抗原结合片段可被用于治疗铁调素相关障碍。所述方法可应用治疗的治疗铁调素相关疾病、炎性疾病、和铁内稳态的疾病或障碍包括但不限于：非洲铁超载、α地中海贫血、阿尔茨海默病、贫血、癌性贫血、慢性病性贫血、炎症性贫血、动脉硬化或动脉粥样硬化(包括冠状动脉疾病、脑血管疾病或外周闭塞动脉疾病)、共济失调、铁相关共济失调、缺转铁蛋白血症、癌症、血浆铜蓝蛋白缺乏、化疗诱导的贫血、慢性肾病(chronic renal/kidney disease)(I、II、III、IV或V期)包括末期肾病或慢性肾衰竭(chronic renal/kidney failure)、急性肾损伤(AKI)、肝硬化、典型的血色素沉着病、胶原诱导的关节炎(CIA)、具有铁调素过量(铁调素升高)的状态、先天性红细胞生成不良性贫血、充血性心力衰竭、克罗恩氏病、乳糜泻(celiac disease)、炎性肠病(IBD)、糖尿病、铁生物分布障碍、铁内稳态障碍、铁代谢障碍、铁转运蛋白疾病、铁转运蛋白突变血色素沉着病、叶酸缺乏、弗里德赖希共济失调、索性脊髓病、细综合征(gracile syndrome)、幽门螺杆菌(H.pylori)感染或其他细菌感染、哈-施病、血色素沉着病、转铁蛋白受体2突变导致的血色素沉着病、血红蛋白病、肝炎、肝炎(乙型(Brock))、丙型肝炎、肝细胞癌、铁调素缺乏、遗传性血色素沉着病、HIV或其他病毒性疾病、亨廷顿舞蹈病、高铁蛋白血症、低色素小红细胞性贫血、血铁过少、胰岛素抵抗、缺铁性贫血、缺铁性障碍、铁超载障碍、具有铁调素过量的铁缺乏状态、少年型血色素沉着病(HFE2)、多发性硬化、转铁蛋白受体2突变、HFE、铁调素调节蛋白、铁转运蛋白、TMPRSS6(IRIDA)、或其他基因的铁代谢、新生期血色素沉着病、铁相关的神经变性疾病、骨质减少、骨质疏松、胰腺炎、泛酸激酶相关的神经变性、帕金森病、糙皮病、异食癖、卟啉症、迟发性皮肤卟啉症、假脑炎、肺含铁血黄素沉着病、红血细胞病、类风湿性关节炎、脓毒病、铁粒幼红细胞性贫血、系统性红斑狼疮、地中海贫血、中间型地中海贫血、输血铁过载、肿瘤、脉管炎、维生素B6缺乏、维生素B12缺乏、和/或威尔逊病。

本文使用的“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”是指对处于疾病或障碍的风险中的受试者、对具有针对疾病或障碍的素因(predisposition)的受试者的预防性治疗，以及对患有疾病或障碍的受试者的治疗。

在预防性方法中，施用治疗剂可在不期望的疾病或障碍的症状显现之前发生，从而预防疾病或症状、或者推迟其进展。因此，当与预防方法联用时，术语“治疗有效”是指，在治疗后，(平均起来)有更少数量的受试者发展出不期望的疾病或障碍、或是症状严重程度加剧。

当与涉及在受试者显现出疾病或障碍的症状之后施用治疗剂的治疗方法联用时，术语“治疗有效”是指，在治疗后，疾病或障碍的一种或多种迹象或症状改善或消除。

如本文使用的，“铁调素相关障碍”是指破坏铁内稳态的异常铁调素水平(例如，与贫血症或储存铁程度有关的铁调素过量或铁调素缺乏)引起的或与其相关的状态。破坏铁内稳态可以进而导致继发性疾病如贫血。急性或慢性炎性状态可以导致铁调素表达的上调，其可以导致降低的循环铁水平，其引起贫血或恶化已存在的贫血。铁示例性调素相关炎性疾病包括癌性贫血、慢性病性贫血、炎症性贫血、化疗诱导的贫血、慢性肾病(I、II、III、IV或V期)、末期肾病、慢性肾衰竭、充血性心力衰竭、癌症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩氏病、幽门螺杆菌感染或其他细菌感染、丙型肝炎、HIV及其他病毒性疾病、动脉硬化、动脉粥样硬化、肝硬化、胰腺炎、脓毒病、脉管炎、铁缺乏、低色素小红细胞性贫血和具有铁调素过量的状态。

如本文使用的，术语“铁内稳态疾病(或失调症)”是指受试者铁水平需要调节的状态。其包括铁调素相关障碍；不与铁调素水平升高相关但受益于抑制铁调素活性的状态，如不是由铁调素引起的铁内稳态的破坏：迷行性铁吸收、循环、代谢或排出引发破坏正常铁血水平或组织分布的疾病；不良铁调节是其他疾病或状态(例如炎症、癌症或化疗)的结果的疾病；异常铁血水平或组织分布引起的疾病或障碍；以及可通过调节铁水平或分布来治疗的疾病或障碍。铁内稳态疾病或障碍、铁调素相关障碍和可导致铁调素过量的炎性状态的非限制性实例包括非洲铁超载、铁难治性缺铁性贫血(IRIDA)、α地中海贫血、阿尔茨海默病、贫血、癌性贫血、慢性病性贫血、炎症性贫血、动脉硬化或动脉粥样硬化(包括冠状动脉疾病、脑血管疾病或外周闭塞动脉疾病)、共济失调、铁相关共济失调、缺转铁蛋白血症、癌症、血浆铜蓝蛋白缺乏、化疗诱导贫血、慢性肾病(I、II、III、IV或V期)包括末期肾病或慢性肾衰竭、急性肾损伤(AKI)、心肺旁路相关的AKI、药物或毒素相关的AKI、肝硬化、典型的血色素沉着病、胶原诱导的关节炎(CIA)、具有铁调素过量(铁调素升高)的状态、先天性红细胞生成不良性贫血、充血性心力衰竭、克罗恩氏病、乳糜泻、炎性肠病(IBD)、糖尿病、铁生物分布障碍、铁内稳态障碍、铁代谢障碍、铁转运蛋白疾病、铁转运蛋白突变血色素沉着病、叶酸缺乏、弗里德赖希共济失调、索性脊髓病、细综合征、幽门螺杆菌感染或其他细菌感染、哈-施病、遗传性血色素沉着病、获得性血色素沉着病、转铁蛋白受体2突变导致的血色素沉着病、血红蛋白病、肝炎、肝炎(乙型)、丙型肝炎、肝细胞癌、HIV或其他病毒性疾病、亨廷顿舞蹈病、高铁蛋白血症、低色素小红细胞性贫血、血铁过少、胰岛素抵抗、缺铁性贫血、缺铁性障碍、铁超载障碍、具有铁调素过量的铁缺乏状态、少年型血色素沉着病(HFE2)、多发性硬化、转铁蛋白受体2突变、HFE、铁调素调节蛋白、铁转运蛋白或其他基因的铁代谢、新生期血色素沉着病、铁相关的神经变性疾病、骨质减少、骨质疏松、胰腺炎、泛酸激酶相关的神经变性、帕金森病、糙皮病、异食癖、卟啉症、迟发性皮肤卟啉症、假脑炎、肺含铁血黄素沉着病、红血细胞病、类风湿性关节炎、脓毒病、铁粒幼红细胞性贫血、系统性红斑狼疮、地中海贫血、中间型地中海贫血、输血铁过载、肿瘤、脉管炎、维生素B6缺乏、维生素B12缺乏、和/或威尔逊病。

铁调节破坏涉及的非炎性状态包括但不局限于、维生素B6缺乏、维生素B12缺乏、叶酸缺乏、糙皮病、索性脊髓病、假脑炎、帕金森病(Fasano等,J.Neurochem.96:909(2006)and Kaur和,Ageing Res.Rev.,3:327(2004))、阿尔茨海默病、冠心病、骨质减少和骨质疏松(Guggenbuhl等,Osteoporos.Int.16:1809(2005))、血红蛋白病和红血球代谢障碍(Papanikolaou等,Blood 105:4103(2005))、和外周闭塞动脉疾病。

一方面，本申请提供了在有需要的受试者中治疗铁内稳态障碍的方法,包括向所述受试者施用本申请所述组合物。另一个方面，本申请提供了在有需要的受试者中调节铁调素活性的方法，包括对所述受试者施用本申请所述组合物。另一方面，本申请提供在有需要的受试者中治疗铁内稳态障碍的方法，包括向所述受试者施用本申请所述组合物。另一方面，本申请提供了在有需要的受试者中治疗血色素沉着病的方法，包括向所述受试者施用本申请所述组合物。另一方面，本申请提供治疗铁调素水平升高的受试者的方法，包括向所述受试者施用本申请所述组合物。另一方面，本申请提供在有需要的受试者中治疗贫血的方法，包括向所述受试者施用本申请所述组合物。另一方面，本申请提供了在有需要的受试者中治疗炎性疾病的方法，包括向所述受试者施用本申请所述组合物。另一方面，本申请提供了在有需要的受试者中治疗感染的方法，包括向所述受试者施用本申请所述组合物。感染可以是，例如，细菌感染、真菌感染、或病毒感染。

在某些情况下，这些方法中的任意方法进一步包含给所述受试者施用红细胞生成刺激剂，所述红细胞生成刺激剂选自红细胞生成素、红细胞生成素变体和结合红细胞生成素的抗体。在一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段特异性结合铁调素，且所述红细胞生成刺激剂同时施用或顺次施用。如本文使用的，术语“红细胞生成活性”意思是在体内分析确定的刺激红细胞生成的活性，例如exhypoxic红细胞增多小鼠分析中显示的。参见，例如，Cotes和Bangham,Nature 191:1065(1961)。

在一种实施方式中，本申请所述抗体或其抗原结合片段和红细胞生成刺激剂可用来改善患有贫血的受试者的治疗。另一种实施方式中，对红细胞生成刺激剂疗法例如红细胞生成素或其类似物(如促红细胞生成素或其类似物(重组人红细胞生成素α、重组人红细胞生成素β、达依泊汀α))具有低反应性包括无反应的患者，不管怎么说，会受益于与铁调素活性拮抗剂或铁调素表达抑制剂的共治疗。另一个实施方式中，本申请所述抗体或其抗原结合片段和红细胞生成刺激剂可用来改善对患有继发于输血依赖性铁过载的铁负荷障碍的、或患有铁分布失常病如弗里德赖希共济失调症的患者的治疗。

如本文使用的，“红细胞生成刺激剂”是指直接或间接引起红细胞生成素受体活化的化合物，例如，通过结合并引起受体二聚化、或通过刺激内源性红细胞生成素表达。红细胞生成刺激剂包括红细胞生成素和及其能够结合并激活红细胞生成素受体的变体、类似物、或衍生物；结合红细胞生成素受体并激活所述受体的抗体；或结合并激活红细胞生成素受体的肽；或结合并激活红细胞生成素受体的、小的有机化合物(任选的分子量小于约1000道尔顿)。红细胞生成刺激剂包括、但不局限于,重组人红细胞生成素α、重组人红细胞生成素β、重组人红细胞生成素δ、重组人红细胞生成素ω、重组人红细胞生成素ι、重组人红细胞生成素ζ及其类似物、聚乙二醇化(pegylated)红细胞生成素、氨甲酰化红细胞生成素、模拟肽(包括EMP1/hematide)、模拟抗体和HIF抑制剂(参见U.S.专利公开号2005/0020487，其全部公开内容通过引用并入本文)。示例性红细胞生成刺激剂包括红细胞生成素、达依泊汀、红细胞生成素激动剂变体、和结合并激活红细胞生成素受体的肽或抗体(包括在U.S.专利申请号No 2003/0215444和2006/0040858中公开的化合物，将其各自公开的全部内容通过引用并入本文)、以及红细胞生成素分子或其变体或其同种型，如下文的专利或专利申请中公开的，将其各自的全部内容通过引用并入本文：U.S.专利号No.4,703,008；5,441,868；5,547,933；5,618,698；5,621,080；5,756,349；5,767,078；5,773,569；5,955,422；5,830,851；5,856,298；5,986,047；6,030,086；6,310,078；6,391,633；6,583,272；6,586,398；6,900,292；6,750,369；7,030,226；7,084,245；7,217,689；PCT公开号WO 91/05867；WO 95/05465；WO 99/66054；WO 00/24893；WO 01/81405；WO 00/61637；WO 01/36489；WO 02/014356；WO 02/19963；WO 02/20034；WO 02/49673；WO 02/085940；WO 03/029291；WO 2003/055526；WO 2003/084477；WO 2003/094858；WO 2004/002417；WO 2004/002424；WO 2004/009627；WO 2004/024761；WO 2004/033651；WO 2004/035603；WO 2004/043382；WO 2004/101600；WO 2004/101606；WO 2004/101611；WO 2004/106373；WO 2004/018667；WO 2005/001025；WO 2005/001136；WO 2005/021579；WO 2005/025606；WO 2005/032460；WO 2005/051327；WO 2005/063808；WO 2005/063809；WO 2005/070451；WO 2005/081687；WO 2005/084711；WO 2005/103076；WO 2005/100403；WO 2005/092369；WO 2006/50959；WO 2006/02646；WO 2006/29094；US公开号US 2002/0155998；US 2003/0077753；US 2003/0082749；US 2003/0143202；US 2004/0009902；US 2004/0071694；US 2004/0091961；US 2004/0143857；US 2004/0157293；US 2004/0175379；US 2004/0175824；US 2004/0229318；US 2004/0248815；US 2004/0266690；US 2005/0019914；US 2005/0026834；US 2005/0096461；US 2005/0107297；US 2005/0107591；US 2005/0124045；US 2005/0124564；US 2005/0137329；US 2005/0142642；US 2005/0143292；US 2005/0153879；US 2005/0158822；US 2005/0158832；US 2005/0170457；US 2005/0181359；US 2005/0181482；US 2005/0192211；US 2005/0202538；US 2005/0227289；US 2005/0244409；US 2006/0088906；US 2006/0111279。

一种实施方式中，还预期了本申请所述的抗体或其抗原结合片段和在体内再分配铁储存的铁螯合剂。铁螯合剂是能够结合铁并从组织或循环中去除铁的物质。实例包括去铁胺和地拉罗斯(deferasirox)以及去铁酮(deferiprone)(1,2-二甲基-3-羟基吡啶-4-酮)。

施用本申请组合物可以使用任何合适的方法，包括但不限于，注射。在一种实施方式中，注射可以是例如静脉内注射、皮下注射或肌内注射。

包装、试剂盒和预填充容器

本申请还提供包含如上所述的一或多种化合物的试剂盒。试剂盒可以包含在合适容器装置中的结合铁调素的抗体或其抗原结合片段。

试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶(flask)、瓶子(bottle)、安瓿、静脉袋(IV)和/或其他的容器装置，向其中可以放置至少一种多肽，和/或优选的，等分部分。本申请还提供了包含本申请所述组合物的容器。

试剂盒可包括处于封闭限制中的包含至少一种融合蛋白、可检测部分、报道分子的装置、和/或任何其他药剂容器，用于商业销售。这些容器可能包括注射和/或吹塑的塑料容器，其中保持有期望的小瓶。试剂盒还包括印刷材料，用于试剂盒中材料的使用说明。

包装和试剂盒可另外包括药物制剂中的缓冲剂、防腐剂和/或稳定剂。试剂盒的各个组分可被装入单独的容器中，并且所有各种容器被装入单一包装中。本发明的试剂盒可被设计用于冷藏或室温贮藏。

另外、制品可含有用于延长试剂盒保质期的稳定剂，并且包括，例如，牛血清白蛋白(BSA)。当组合物是冻干的，试剂盒可包含其他溶液制品，用于重组冻干制剂。可接受的重组溶液是本领域熟知的，包括，例如，药学上可接受的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

包装和试剂盒可进一步包括用于分析的一种或多种组分，例如，用于ELISA分析的。在本申请中要检测的样品包括，例如，血、血浆、和组织切片，以及分泌物、尿、淋巴及其产物。包装和试剂盒可进一步包括用于收集样品的一种或多种组分(例如，注射器、杯子、药签等等)。

包装和试剂盒可进一步包括详细说明例如产品说明、施用方式和/或治疗适应症的标签。本申请提供的包装可包括本申请所述任一组合物。疾病(例如，IBD)、类风湿关节炎、骨关节炎、癌症及其转移形式。

术语“包装材料”是指容纳试剂盒组分的物理结构。包装材料可以保持组分无菌，可由用于此目的材料制成(例如，纸，波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿等)。标签或说明书可包括合适的文字指导说明。因此，试剂盒可另外包括用于在本发明的任一方法中使用所述试剂盒组分的标签或指导说明。试剂盒可以包括在包装内的化合物，或与用于在本申请所述方法中施用所述化合物的指导说明一起的分配器。

在另一实施方式中，试剂盒还可进一步包含用于红细胞生成刺激剂的容器。

指导说明可以包括用于实施本申请所述任一方法包括治疗方法的指导。指导说明可进一步包括满意临床终点或任何可能发生的有害症状的说明，或监管机构例如食品与药物管理局要求的附加信息，用于在人类受试者中应用。

指导说明可在“印制材料”上，例如，在试剂盒内或附着于试剂盒的纸或纸板上、或在附着于试剂盒或包装材料的标签上、或接在含有试剂盒组分的小瓶或管上。指导说明还可被包含在电脑可读取介质上，例如闪/云驱动，盘(软盘或硬盘)，光学CD如CD或DVD-ROM/RAM、磁带、电存储介质如RAM和ROM、IC端(tip)及其混合，如磁/光存储介质。

本申请提供了包含本申请所述组合物的容器装置。容器装置可以是能容纳液体或冻干组合物的任何合适容器，包括但不限于小瓶、注射器、瓶子、静脉袋(IV)、或安瓿。注射器能容纳适于注射入受试者的任何体积的液体，包括但不限于0.5cc、1cc、2cc、5cc、10cc或更多。

本申请提供了包含本申请所述组合物的试剂盒。一方面，本申请提供用于治疗与升高的铁调素水平相关的障碍或铁内稳态障碍的试剂盒，包含本申请所述抗体或其抗原结合片段和红细胞生成刺激剂。

另一方面，本申请提供用于治疗与升高的铁调素水平相关的障碍或铁内稳态障碍的试剂盒，包含本申请所述抗体或其抗原结合片段，和附着或包装于容器的标签，所述标签描述了与红细胞生成刺激剂联合使用本申请所述抗体或其抗原结合片段。

另一方面，本申请提供用于治疗与升高的铁调素水平相关的障碍的试剂盒，包含红细胞生成刺激剂，和附着或包装于容器的标签，所述标签描述了与本申请所述抗体或其抗原结合片段联合使用红细胞生成刺激剂。

实施例

本发明可通过结合以下非限制性实施例而被更好地理解，所述非限制性实施例只是作为本申请示例性实施方式而被提供。以下实施例是为了更全面地说明实施方式才被提出，但它们不应以任何方式被解释为限制本申请的保护范围。

实施例1.人铁调素的单克隆抗体的开发和抗原设计

背景

铁调素是一种25个氨基酸的调节铁内稳态的肽激素。遗传性或获得性的铁调素缺乏或过量是铁调节主要疾病的主要或作用因素。在其中铁内稳态受到体内铁储存的原发性缺乏或过量干扰的其他疾病中，铁调素血浓度反映了对原发性干扰的生理性应答。尽管铁调素-25指导临床医学中的治疗的潜在重要性，但只有一种人源化单克隆抗体进入到早期I期临床研究中。

哺乳动物中成熟的铁调素的氨基酸序列是高度保守的，特别是N-末端。小鼠和大鼠的铁调素分别与人铁调素有76％和64％的同一度。铁调素的独特结构在进化上高度保守，和N末端的5个氨基酸对于其体外生物活性是绝对必须的，因为N末端氨基酸直接涉及到结合Fpn并导致内化和在溶酶体内降解(Nemeth等，2006)。

在分子水平，这一情况的发生是通过铁调素引起其受体(铁转运蛋白，唯一的人铁通道)的降解，并且在表达铁转运蛋白的情况下在肝细胞、巨噬细胞和内衬肠的细胞内捕捉铁。血浆铁水平降低时，铁调素水平降低，并且铁转运蛋白产生并传输到细胞膜。这允许发生正常铁吸收与循环，并提供造血所需的铁。铁调素-铁转运蛋白铁调节轴是目前临床前和I期试验中几种新型治疗药物开发尝试的靶标。然而，只有一种针对抗铁调素的人源化MAb目前正在早期I期研究中接受评估。

人胚肾(HEK 293)细胞已经用百日青蜕皮酮诱导启动子——该启动子促进高水平表达鼠铁转运蛋白GFP融合蛋白(称为Ec：R50-GFP)——稳定地转染，用来在基于细胞的分析中体外研究铁转运蛋白生物学。

生产针对铁调素-25的抗体的众所周知的困难是由于其紧凑的形状和高度的进化保守性，特别是哺乳动物中肽的N-末端区域，包括用于MAb开发尝试的那些。

其他公司将他们的抗体针对来自铁调素-25的成熟C末端区(铁调素(10-25))[SEQ ID NO:27]的线性肽，其不能用于生物学活性铁调素-25的ELISA检测，并且不能预期其在治疗应用中有效(参见，例如，Geacintov等，US2004/0096990 A1)。

本发明人开发的抗体

利用我们对于铁调素-25的氨基末端的重要性及其低免疫原性的知识，我们设计了一套抗原和免疫的BALB/c小鼠组来产生针对生物活性铁调素-25的单克隆抗体。

我们的抗原设计集中于产生针对铁调素25的N-末端及全长、氧化铁调素-25的MAb。所设计的产生本文所述三种功能性MAb的抗原的实例示于图1和6。

在BALB/c小鼠中体内测试了许多肽抗原的免疫原性并使用很多合成方法来产生对铁调素-25特异性的Mab以增加半抗原(例如，DNP、PamCys)和免疫原性载体蛋白质(例如，KLH、mKLH、白蛋白或者载体蛋白)，并且少数被证明是合适的抗原(图5和6)。

实施例2:杂交瘤实验方案

抗体滴度计算后，使用商业上可获得的融合试剂盒(Hy-Clone)或通过如Kohler和Milstein(同上)所述的常规方法来制备杂交瘤。

本实施例的目的是描述通过在免疫后从淋巴结(LN)和/或脾(S)中分离小鼠淋巴细胞、产生杂交瘤细胞及产生和选择分泌抗原特异性抗体的阳性克隆来产生单克隆抗体。

程序

制备骨髓瘤细胞

融合前两周，在具有10％FCS、8-氮鸟嘌呤和青链霉素(Pen-Strep)的DEME培养基中繁殖Sp2/0骨髓瘤细胞系。细胞融合前一周,在无8-氮鸟嘌呤的情况中培养细胞，每隔一天分割一次细胞。用于融合的细胞密度是2×10⁵/ml，且需要100ml这种细胞。融合前一天分割细胞，并确定细胞存活力；预期存活力大于95％。

用300×g离心10分钟以收获SP2/0细胞，通过添加30ml ClonaCell-HY-融合培养基B洗涤3次。细胞球粒再悬浮在25ml的培养基B中以包含2x10⁷活细胞。重悬浮之后将细胞保持于室温(RT)下。该步骤可与淋巴细胞制备同时进行，或在其之后进行。

分离小鼠淋巴结、脾和淋巴细胞

通过预热至37℃制备用于融合的PEG和培养基(培养基A、B、C)。

只有使用铁调素-25作为抗原经标准血清滴定分析确定为对免疫有反应的小鼠被选择用于杂交瘤融合。在用所选抗原最后一次加强后3天进行杂交瘤融合。

使用窒息和颈部脱位方法处死各小鼠，用75％乙醇喷洒。小鼠腹面朝上置于解剖板上，四肢固定于解剖板上。全部的解剖过程使用无菌技术进行，使用不同无菌仪器(剪刀、手术钳)组进行解剖的各步骤以移除脾和淋巴结(LN)。

LN(和/或脾)置于内有2ml培养基A的6平板的一孔中，并修整掉脂肪和结缔组织。我们在50ml锥形离心管顶部设置了一个一次性的细胞过滤器，转移LN(或脾)至过滤器中和用无菌剪刀将LN(或脾)切成小片，用3mL无菌注射器的活塞研磨组织，并将5-10ml培养基B通过过滤器。我们再一次研磨组织，用10ml培养基B清洗(只有膜留在筛网上)。淋巴细胞轻柔地移液并通过倒置混合，以400×g离心7分钟。丢弃上清液，细胞再悬浮于在10ml培养基B中。随后用血细胞计数器对合适稀释的细胞进行计数。

融合

在50ml试管中以4:1比率混合淋巴细胞和骨髓瘤细胞(约8x 10⁷淋巴细胞，2x10⁷骨髓瘤细胞)。淋巴细胞和骨髓瘤细胞比率范围可以为10:1至1:1。以400×g离心融合细胞10分钟一次，细胞混合物再悬浮于30ml培养基B中，以800g离心5分钟，从而得到良好粘附并促进细胞融合。

从细胞团完全吸出培养基，轻柔地敲击试管底部，因为细胞团必须被破坏来获得最优的融合。使用1ml的移液管在1分钟内慢慢地将一毫升PEG溶液加入到细胞团中而不进行搅拌。在随后的1分钟不断轻柔地敲击试管底部。

4分钟内，在如前所述不断敲击中，将4ml培养基B缓慢添加至融合混合物中。

将10ml培养基B缓慢添加到细胞中，在37℃水浴中孵育15分钟。

缓慢添加30ml培养基A，并将细胞以400×g离心7分钟。丢弃上清液，用40ml培养基A清洗细胞以确保去除所有的PEG。

细胞团缓慢地再悬浮于10ml的Clonacell-HY杂交瘤回收培养基(培养基C)，并被转移到包含20ml培养基C的T-75cm²组织培养烧瓶中(总体积＝30ml)。将细胞在37℃、5％CO2气氛的潮湿保温箱中孵育过夜。

选择和克隆

融合前一天，ClonaCell-Hy杂交瘤选择培养基(培养基D)置于2-8℃下解冻过夜。融合当天，剧烈震荡培养基D来充分混合内容物，并使其升温至室温。

然后将融合细胞悬浮液转移入50ml锥形管中，在室温下400×g离心10分钟，除去并丢弃上清液。细胞再悬浮于10mL总体积的培养基C中。

10mL的细胞悬液转移入90mL的培养基D中，通过轻柔地倒置瓶子几次来彻底混合。杂交瘤细胞悬浮液随后转移至一次性试剂容器中，室温下放置15分钟，从而使任何气泡升至顶端来消散。

使用多通道移液管和无菌移液头，包含杂交瘤细胞的ClonaCell-HY培养基D以每孔60–80μL体积被分配到96平板中。根据接种的体积，这通常产生10-16个板。在湿润的5％CO2保温箱中37℃下孵育平板。在不扰动孵育8天后，检查孔中是否存在集落，并在每孔的半固体培养基上覆盖150μL预热的培养基E，无论是否存在集落，并在所有的孔上进行分析。

平板在湿润的5％CO2保温箱中37℃下额外孵育2-4天。覆盖孵育时间还可被进一步增加以保证检测低表达的杂交瘤。

在不扰动半固体培养基中集落的情况下，小心地除去100μL的覆盖ClonaCell-HY培养基E。使用适于所涉及抗原的分析系统(例如，中性抗生物素蛋白ELISA、小鼠Mab分型等等)来测试上清液的特异性抗体。

抗体检测阳性的孔的内容物轻柔地再悬浮，并转移到包含1mL的培养基E的24平板的孔中以扩增杂交瘤。当阳性孔中包含多于单一集落时，单独收获克隆并转移到单独的孔中用于扩增和再测试以确定哪种克隆产生感兴趣的抗体。

冷冻杂交瘤

细胞以2x10⁶每小瓶的浓度冷冻保存。

在胎牛血清(FBS)中的20％DMSO溶液被置于50mL锥形管中，并允许在冰上冷却。缓慢地添加合适体积的DMSO，充分混合，使用0.2μm过滤器无菌过滤，继续置于冰上。

收获细胞，以2倍所需细胞终浓度再悬浮于冷FBS中(例如，冷冻保藏细胞的浓度为2x10⁶细胞每冷冻管，那么悬浮浓度4x10⁶细胞/mL)。

为了冷冻保藏，以1:1的比例将FBS/20％DMSO溶液缓慢地加入到包含细胞的管中，添加过程中不断进行混合。冷冻培养基中的一毫升细胞转移到每个冷冻管中。最终的细胞悬液在包含10％DMSO的90％FBS中进行计算。

冷冻管立即置于冷冻容器中，随后移至80℃冰箱中过夜。第二天，从冷冻容器中拿出冷冻的小瓶，储存至液氮中。

实施例3：筛选用于抗-铁调素抗体的杂交瘤

在融合后不扰动孵育8天后，筛选所有的孔来鉴别分泌抗人铁调素抗体的鼠杂交瘤。简言之，筛选的前一天，将在碳酸盐涂布缓冲液(pH 9.6)中制备的100μl中性抗生物素蛋白(200ng/孔)加入到酶免疫分析(EIA)板的每孔中，4℃下孵育过夜。第二天洗涤平板，用缓冲液中的1％BSA封闭，向每孔加入1ng K18-生物素铁调素-25示踪剂。孵育一小时后，冲洗平板，每孔中100μl杂交瘤组织培养上清液结合50μl 1％BSA/TBST，平板在摇床(240rpm)上孵育1.5小时。冲洗平板，添加HRP-标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)链检测抗体，孵育再继续1小时。冲洗平板，施用底物，反应10分钟，随后用1NH2SO4终止反应，并在450nM处读取吸光度。第一轮筛选的实例产生了如图2所示在8x12矩阵的OD值。鉴别产生OD>2.0的杂交瘤，在第二轮筛选前进一步扩增。

第二轮筛选包含涉及测试各个杂交瘤针对铁调素-25的特异性。简言之，96孔EIA板用山羊抗小鼠IgG Fc-特异性抗体(1/2,500稀释)涂布过夜，第二天冲洗平板，封闭，将100μl组织培养上清液置于各孔中，室温下孵育1小时。检测用Fc区捕获的存在于组织培养上清液中的小鼠抗体的能力是通过向各孔中添加1ng K18-生物素铁调素-25示踪剂、在摇床上培养1.5小时来进行。冲洗后，在孔中加入HRP标记的链霉抗生物素蛋白(SA-HRP)，孵育一小时，冲洗并通过添加TMB底物10分钟以检测抗体捕获的示踪剂的存在。添加酸来终止反应，并读取450nM处的吸光度。如图3所示的，鉴别产生OD>0.4的杂交瘤，并分克隆以供进一步表征。我们的经验证明了在第二轮筛选中OD超过2.0的杂交瘤对于进一步表征来说是强有力的候选物。

为了测试杂交瘤的功能活性，分克隆第二轮筛选中鉴别的克隆，生长至约70％汇合(confluency)，并如第二轮筛选所述的方式进行筛选。简言之，用山羊抗小鼠IgG Fc特异性抗体涂布96孔平板，第二天冲洗平板并封闭，将组织培养上清液置于各孔中，孵育1小时。

为了制备铁调素的储备溶液，称量约1mg冻干铁调素，在0.5ml的0.016％HCl(无菌组织培养级水中制备)中重组以制成终浓度2mg/ml。

为了精确地确定溶液中铁调素的浓度，在分光光度计上测量215nm和225nm的吸光度。

为了测量样品，制备溶液的1:20稀释液(10μl储备溶液至190μl无菌水)。用10％的0.016％HCl(10μl 0.016％HCl至190μl无菌水)空白(blank)分光光度计。测量215nm和225nm处的吸光度，使用以下肽浓度的公式计算铁调素的浓度。

铁调素-25浓度(mg/ml)的计算为：[铁调素-25mg/ml]＝(A215-A225)x 0.144x 20(20是稀释因子)。

为了储存铁调素-25储备溶液，将100μl体积溶液等分到无菌的0.5ml微量离心管中，-80℃存储。为了进一步稀释铁调素储备溶液为便利的工作溶液，用无菌组织培养级水稀释浓储备溶液至500μg/ml(工作溶液)。

为了确认为制备溶液中的肽浓度，在215nm和225nm处测量吸光度。制备1:10稀释溶液以用于测量。将25μl体积等分到具有旋盖的0.5ml无菌微量离心管中。

合成人铁调素-25与K18-生物素铁调素-25示踪剂竞争MAb结合位点的能力通过添加上述制备的100ng铁调素-25至示踪剂溶液，并且将100μl的这一溶液添加到各孔中，并孵育1.5小时进行检测。洗涤后，添加HRP标记的链霉抗生物素蛋白，孵育一小时，冲洗并通过添加TMB底物来检测结合的示踪剂的存在。加酸来终止反应，读取450nM处的吸光度。杂交瘤上清液的功能活性筛选的实例如图4所示。显示功能活性的杂交瘤通过与只用示踪剂产生的OD值比较，示踪剂+铁调素-25孔中OD值的降低来鉴别(例如杂交瘤5A3；5A3名称之后被改为“MAb 583”)。

产生鼠MAb的困难性的例子如图5所示。多种典型抗原和免疫方法可产生可变数量的应答免疫的小鼠(基于血清滴度)以及产生成功融合的组织。不考虑使用的抗原，功能性铁调素-25特异性小鼠MAb的百分比一致地小于0.06％(图5)。类似地，作为要求发现3种对铁调素-25特异性的鼠MAb的尝试的实例，我们测试了8种抗原，筛选了11,845个杂交瘤，成功率为0.025％(图6)。

实施例4：鼠MAb的纯化

通过接种单个商业上可获得CellMax中空纤维生物反应器(10,000cm²表面积)(Spectrum Labs,Inc.)，其然后在37℃、5％CO2气氛下孵育，产生了大量MAb 583和MAb 1B1。来自每种MAb的约2-3升的总细胞培养上清液以约100ml批进行收获。各批次被离心并在-20℃下冷冻直至纯化。

为了纯化，解冻上清液，再离心并依照制造商的指导手册使用5

ml HiTrap蛋白G柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)通过亲和色谱纯化免疫球蛋白。使用装有BioLogic Maximizer、QuadTec UV-VIS检测器和BioFrac级分收集器的BioRad Biologic DuoFlow中压色谱系统来进行纯化。为了进行SDS-PAGE分析，汇合包含免疫球蛋白的两个先前MAb 583和MAb 1B1纯化的穿流级分，使用HiPrep 26/10脱盐柱(GE Healthcare)进行缓冲液交换。使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid)(BCA,Thermo Scientific)来确定蛋白质浓度，等份在-20℃下冷冻存储。

MAb 581和MAb 1B1(批次3)纯化的实例通过使用了在标准还原条件下运行的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶(12％丙烯酰胺)确认(图7)。如图7所示的，MAb 583和1B1IgG的纯化制剂(道8、9)从各自的杂交瘤培养上清液(道2-5)获得，如通过同时存在正确分子量的重链和轻链蛋白(分别大约50和25kDa)而被证实。另外，纯化的鼠MAb在电泳上等同于小鼠IgG对照(道10)。无血清组织培养基(道6)作为阴性对照。该方法将一致地产生适于进一步结合亲和性(例如Biacore)和特异性研究的纯化MAb。

为了评估生物反应器生产和提纯产率的一致性，发展了MAb活性表征方法来评估已如图7所示各种通过凝胶电泳分析的各个连续纯化批次的MAb 583抗体。这一相同的方法也用于纯化MAb 1B1(数据未显示)。

我们使用了微孔板ELISA来评估抗体活性。从来自生物反应器上清液的各个连续纯化批次(每批次大约100ml)的纯化MAb 583的系列稀释液涂布到板上(0-100ng)，并封闭。整板添加包含0.25％Blotto的NT-生物素铁调素-25示踪剂(TBST,pH 8中1ng/孔)。允许示踪剂结合2小时，在不含Blotto的情况下TBST,pH 8中洗涤孔。添加1:2500的SA-HRP 30分钟，在TBST中洗涤孔，添加TMB底物10分钟。添加终止缓冲液，用分光光度计定量450nm的OD值。值为4的OD表明吸光度超过了分光光度计的分析范围。

下表是确定5个连续MAb 583纯化的结合活性特征的已建立ELISA方法的实例。

数据显示了在批次3之后的批次中，纯化MAb 583的结合活性提高，并且在所进行的最初4次纯化上优化纯化方案之后，在批次4-7之间具有一致性。涂有6.25ng纯化的MAb 583的孔表明，批次4-7在450nm处的光密度为2.7-4，并且在下一稀释(3.12ng/孔)中OD值为1.5-2.3。这个例子表明，用于从生物反应器上清液纯化MAb 583抗体的建立和验证的方案已确立，并且表现出MAb 583和1B1二者的多个纯化批次中是一致的。

实施例5：对铁调素-25和铁调素肽的MAb特异性的表征

在基于溶液的特异性分析中，MAb 583显示了对铁调素-25独特且极佳的特异性。例如铁调素-25涂布至马来酸酐板上，并且未占据的结合位点使用标准方法来淬灭。平行地，20ng的MAb 583与递增浓度的铁调素-25(0至8ng/孔)在低蛋白结合96平板中混合，允许反应一小时。随后将该MAb混合物转移到马来酸酐板上，允许反应2小时，之后冲洗，用HRP-山羊抗小鼠IgG第二抗体来确定与共价结合至平板的铁调素-25结合的MAb 583是否存在。在额外的孵育和冲洗之后，添加底物，使用酸来停止显色，确定OD 450nM。图8表明，溶液中铁调素-25可以以剂量依赖型方式封闭MAb 583上的结合位点。

MAb 583对抗铁调素-20、铁调素-22、铁调素-25和抗菌肽的特异性的另一实例使用基于膜的分析方法说明，例如，但不限于使用标准电泳和免疫印迹条件的非还原三甲基甘氨酸SDS-PAGE(10-20％丙烯酰胺)分析(图9)。如考马斯染色图像中所示的，铁调素-20、-22和-25(道2、3、4)和抗菌肽(道5)都具有约3kDa的类似分子量。相比之下，使用MAb 583探测的Western印迹表明，MAb 583特异性识别铁调素-20、铁调素-22和铁调素-25，但不识别抗菌肽。

为了进一步例证MAb 583和MAb 1B1对于铁调素-22、铁调素-25、NT-生物素铁调素-25示踪剂、K18-生物素铁调素-25示踪剂、K24-生物素铁调素-25示踪剂的特异性，使用标准电泳和免疫印迹方法进行了还原SDS-PAGE(12％丙烯酰胺)分析和Western免疫印迹(图10)。考马斯染色SDS-PAGE分析表明，铁调素-20和铁调素-25(道2、3)和三种形式的生物素标记的示踪剂(道4、5、6)具有相同的分子量。使用MAb 583或MAb 1B1探测的Western印迹表明，这些MAb特异性识别铁调素-20、铁调素-25和三种形式的生物素标记的铁调素-25示踪肽。综上，我们的基于溶液和基于膜的研究表明，MAb 583和MAb 1B1对所有的三种形式的生物素化的人铁调素-25示踪分子具有独特的特异性。

实施例6：MAb 583和1B1的BIAcore表面等离子体共振(SPR)分析

本实施例描述了使用SPR分析MAb583和1B1与铁调素-25相互作用的结合亲和性和解离常数。

SPR在使用CM5传感器芯片的Biacore 3000系统(BIAcore,Piscataway，NJ)上进行。CM5芯片基质由共价连接到金表面的羧甲基化右旋糖酐组成。所有的测量在25℃进行。

通过氨基偶联方案将中性抗生物素蛋白(Sigma,St.Louis,MO)以5000-10000的反应单位(RU)水平固定在CM5传感器芯片上(流动池1至4)。氨基偶联方案包括使用0.4M的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰胺)(EDC)和0.1M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的1:1混合物来活化传感器芯片表面上的右旋糖酐基质，随后注射在10mM醋酸钠缓冲液(pH4)中的中性抗生物素蛋白。

固定中性抗生物素蛋白之后，随后的步骤在HBS-EP缓冲液(pH7.4的10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20)中进行。

通过以流速5μl/分钟注射浓度为200μg/ml各种肽20分钟，将生物素化的铁调素肽(NT-生物素-铁调素-25、K18-生物素-铁调素-25和K24-生物素-铁调素-25)固定在流动池2-4中(每种流动池一种肽种类)。

在生物素-铁调素–25类似物被捕获到芯片之后，注射抗铁调素MAb 583或1B1至流动池1-4中，在HBS-EP缓冲液中浓度为24μg/ml，流速50μl/分钟，持续3分钟。3分钟后，停止注射，随后允许解离6分钟。通过以流速10μl/分钟注射10mM甘氨酸HCl(pH 1.5)1分钟进行再生。

共振信号通过减去对照流动池(池1)的信号来进行非特异性结合的校正，使用BIAevaluation 4.1软件(Biacore)进行分析。

在第一SPR实验中，MAb 583以浓度24μg/ml施用于如上所述制备的Biacore芯片，观察到MAb 583针对三种生物素-铁调素-25类似物的快速结合和很低的解离速率(图11)。图11所示的SPR实验的数据如下表所示。可以观察到MAb 583对NT-生物素铁调素-25的极佳结合亲和性(Ka)和解离常数(Kd)，且分别对K18-生物素铁调素-25和K24-生物素铁调素-25降低约1个级数的亲和性和解离常数。

我们以低约5倍的MAb 583浓度(5μg/ml)重复了图11所示的Biacore实验来针对两种最好的生物素化的铁调素-25抗原(NT-生物素铁调素-25和K18-生物素铁调素-25)评估低得多的抗体摩尔比率的MAb 583(图12)。Biacore图显示了MAb583在该Biacore实验中对评估的K18-生物素铁调素-25和NT-生物素铁调素-25肽都具有极佳的结合亲和性和非常低的解离。图12的Biacore结果示于图13中。

Biacore数据表明MAb 583以高亲和性和低的皮摩尔级解离常数(Kd＝约7.5pM)结合K18-生物素铁调素-25。MAb 583对NT-生物素-铁调素-25具有高的但略微降低的结合亲和性和低的皮摩尔级解离常数，Kd＝约18pM。

这些Biacore实验和结果证实，MAb 583以高亲和性快速地结合铁调素-25，并且以低的pM解离常数从铁调素-25缓慢地解离。MAb 583的表位是N-末端的9个氨基酸，其中前5个N-末端氨基酸(SEQ 25)对于铁调素-25与铁转运体和受体、铁转运蛋白的结合及其内化和降解铁转运蛋白的能力来说都是必不可少的。MAb 583对铁调素–25的N-末端的极佳特异性、亲和性、亲合力和pM Kd表明了它在体外和体内是中和抗体，并且适合进行人源化以用于治疗应用。使用MAb 1B1的Biacore实验的例子如图14-15所示。使用与MAb 583相同的实验条件进行了两次尝试以用MAb 1B1进行SPR分析，在每种情况下，1B1从铁调素-25抗原的解离速率都很低，从而使得使用BIAevaluation 4.1软件的Biacore 3000仪器都无法在20分钟的实验中检测到1B1从铁调素-25抗原的任何解离。因此，这些实验没有能够获得对于图14–15所示Biacore实验的如图13中对于MAb 583所示的统计学信息。

这些实验条件下的SPR分析表明鼠MAb 1B1具有对铁调素-25肽的非同寻常的亲和性，且其亲和常数(KD)可以为≤10^-12-10^-13M，具有这些性质可能适合人源化并且适合于作为铁调素-25特异性Mab进行临床前评估。

实施例7：MAb583和1B1的铁调素特异性和结合实验

583和1B1的特异性和相对结合亲和性使用一系列微滴定板竞争实验进行评估。使用涂布有MAb 583或MAb 1B1的96孔微滴定板进行双重或三重重复的分析。

MAb 583在包含40mM Tris-HCl(pH 7.3)、100mM NaCl的Tris缓冲盐水(TBS)中以1:4000稀释，移液至微滴定板中。

室温(RT)下孵育1小时后，用TBST(包含0.05％20的TBS)洗涤微滴定板，将包含不同量的合成肽和生物素铁调素-25类似物(1-2ng/孔)的100ml标准样品加入各孔中，室温下孵育一小时。

通过链霉抗生物素蛋白-HRP与底物四甲基联苯胺检测竞争；用0.5N的H2SO4终止颜色反应，读取溶液在450nm波长处的光密度。

分析铁调素–25、铁调素–22和铁调素-20对涂布在微滴定板上的MAb 583抗体的结合。生物素化的铁调素–25类似物的结合和结合的NT-生物素铁调素-25的检测用于检测每一种铁调素肽相对于铁调素-25的相对结合程度(图16)。NT-生物素铁调素-25与铁调素肽异构体(铁调素-22和铁调素–20)的竞争曲线相似，表明铁调素异构体确实结合MAb 583，但是随着铁调素异构体尺寸降低，EC50值(亲和性)也降低，如通过回归曲线从铁调素-25至铁调素-22至铁调素-20的右移提示的。

我们使用与上述相同的方法来研究MAbs 583和1B1针对C末端氧化肽的相对结合亲和性，来针对每种MAb评定铁调素上的结合表位。羧基末端肽例如铁调素(10–25)在US专利号7,320,894和7,411,048中进行了描述，通过引用将每个专利关于所述的肽的部分并入本文。

如图17和图18所示，在最多2000ng/ml的任意测试浓度下，铁调素(10–25)肽没有与MAb 583或1B1结合，与NT-生物素铁调素-25也没有。与在这一ELISA实验中合成铁调素-25的极佳竞争性结合相比，MAb 583和小鼠铁调素–25(鼠铁调素–1)或抗菌肽之间也没有观察到结合(图17)。这些实验清楚地证实，MAb 583和1B1不结合铁调素-25的C末端16个氨基酸(铁调素(10–15)中发现的任何表位，因此结合N-末端表位。

阳离子抗微生物肽(抗菌肽)和小鼠铁调素–25(鼠铁调素-1)结构类似，鼠铁调素-1与人铁调素-25有76％氨基酸同一性。我们使用该肽在与MAb 583相同的分析中测试MAb 583与类似肽的交叉反应性。如ELISA实验中清楚显示的，我们没有发现583对这些结构类似的肽的明显结合(图17)。

在如图18所示的类似实验中，在与K18-生物素铁调素-25作为ELISA实验的示踪剂进行的类似实验中，我们没有观察到铁调素(10–25)与MAb 1B1结合(图19)，进一步证实N-末端9个氨基酸是对于1B1的关键表位。重要地，这些数据显示了MAb 583和1B1对铁调素-25的N-末端有极佳的亲和性和特异性。可预见两者都是在体内和体外针对铁转运蛋白受体和铁通道的铁调素生物活性的中和抗体，且一旦人源化，对于治疗剂开发是候选物。

实施例8：使用铁转运蛋白-GFP荧光分析在基于细胞的分析方法中体外分析MAb583中和针对铁调素-25的活性

基于细胞的体外分析

我们在基于细胞的荧光分析使用流式细胞分析方案(如Nemeth等(2006)中所述)体外评估MAb583的中和活性，以评估MAb 583针对人铁调素-25(SEQ ID NO.19)的中和活性。铁调素的N末端5个氨基酸[SEQ ID NO.25]与铁转运蛋白相互作用，并且是铁调素的生物活性所必须的，从而从N端删除各单个氨基酸降低如通过铁转运蛋白降解活性确定的铁调素生物活性(图20-23)。

包含百日青蜕皮酮诱导小鼠铁转运蛋白构建体(Fpn-GFP)的人HEK细胞在包含或不包含10mM百日青蜕皮酮的情况中孵育24小时。用1×Dulbecco’s PBS冲洗3次，顺序用已知量的蛋白A亲和纯化MAb583抗体和已知浓度的生物活性合成人铁调素-25或者对照缓冲液处理细胞另外24小时。

使用TrypLE Express(Invitrogen)脱离细胞，并以1x 10⁶细胞/ml的浓度再悬浮于培养液中。使用流式细胞仪来测量绿色荧光强度。

不表达Fpn-GFP的细胞(不含百日青蜕皮酮)用于建立门控(基线)来排除背景荧光。结果被表示为根据公式(Fx-Fhep)/(F未处理-Fhep)确定的未处理细胞的GFP强度的分数，其中F表示门控绿色荧光的平均值。

用MAb 583处理的Fpn-GFP的流式细胞检测.

在第一实验中，细胞用百日青蜕皮酮诱导过夜，来诱导鼠Fpn-GFP的表达。第二天，通过清洗移除百日青蜕皮酮，加入铁调素-25和583抗体24小时(图20和图21)。

铁调素-25以100ng/ml(37nM)的浓度使用。MAb583以相比于铁调素摩尔浓度的10倍、2倍或三分之一(370nM、74nM和10nM)添加。

对照MAb是在ELISA体外筛选时失败的抗-铁调素单克隆抗体，以最高浓度(370nM)使用。在该实验中，10nM的MAb 583完全中和37nM的铁调素-25，并且抑制了FPN-GFP的铁调素-25降解。

我们在这些基于细胞的MAb583生物活性分析中用以铁调素摩尔浓度的3分之一、6分之一、12分之一以及24分之一添加的MAb583重复实验(图22和图23)。

在该实验中，2.5nM的MAb 583显著中和(～23％降低)37nM铁调素-25及其对生物活性铁调素-25摩尔浓度的1/12的FPN-GFP的生物活性(图22、23)。

我们通过从在使用相同方案的两个额外实验中的对照Fpn-GFP细胞和用不同浓度的MAb 583和铁调素处理的细胞获得细胞内铁蛋白测量也评估了MAb 583的中和活性，包括在基于细胞的流式细胞分析中MAb 583抗体和铁调素-25生物素化肽的浓度(图24-26)。

为了获得细胞内铁蛋白浓度，根据制造商的操作手册(Roche，Indianapolis，IN)使用加入蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液(Boston BioProducts，Ashland，MA)提取总细胞蛋白。

根据制造商的操作手册使用酶联免疫吸附分析(ELISA；Ramco Laboratories,Stafford,TX)来确定铁蛋白的水平，每个样品中总蛋白浓度归一化。总蛋白浓度通过二喹啉甲酸(BCA)分析(Pierce,Rockford,IL)来确定。

图24-26显示了这些分析的结果，其设计用于评估MAb 583中和铁调素-25针对铁转运蛋白的生物活性的能力。

类似于本文所述荧光分析中观察到的结果，2.5-10nM的MAb 583在体外显著中和37nM的铁调素-25及其生物活性，导致降低的FPN-GFP降解和结合铁的细胞内铁蛋白的保留(图24-26)。

实施例9.在C57BL/6小鼠中MAb 583的体内中和活性

为了评估MAb 583的体内中和性质，我们进行了简单但有力的动物实验，其中我们使用亲和纯化的MAb 583抗体检测了两个给药方案中583抗体在体内阻断生物活性铁调素-25的能力。我们测试了通过腹膜内注射施用的单一剂量MAb 583和间隔24小时顺序施用的两个50％剂量MAb 583。

为了开始体内MAb 583实验，我们于实验楼内在商业上可获得的培养箱中饲养40只C57BL/6雄性小鼠(6周龄)，并饲喂低铁饮食(20ppm总铁，Teklad Custom Research Diet，Harlan Laboratories)17天。第一天，40只小鼠随机分成5个实验组，每组8只，并且各组按照如下方法处理。第一组只接受PBS，第2组和第3组分别接受1.0mg和0.5mg MAb 583，第4组接受对照Mab(不适合ELISA的抗-铁调素MAb)，以及第5组接受PBS。24小时后，第3组每只小鼠再接受一次0.5mg的MAb 583。在培养另外24小时后，第1组至第4组接受在PBS中的50μg铁调素-25，第5组小鼠(对照组)接受第二剂PBS(图27)。

处理后2小时，对小鼠进行心脏穿刺来收集血液，允许血液凝结30分钟，使用商业分光光度计(Iron-SL Assay,Genzyme Diagnostics)来评价血清铁水平。

数据的统计分析显示，所得数据在Shapiro-Wilk归一性检验中呈正态分布(P＝0.216)。

数据的等方差检验显示了各组的等效方差(P＝0.360)。

进行了ANOVA检测，其表明处理组间血清铁浓度的平均值具有统计学显著差异(P＝0.008)(图28)。图27图示了这些结果，以及PBS对照和用单独的PBS中铁调素-25处理的小鼠或用与PBS中铁调素-25两个0.5mg剂量MAb 583联合处理的小鼠间存在显著性差异。

所进行检验的效能为α＝0.050:0.748。

对比对照组的多重比较(Holm-Sidak方法)产生了总体显著水平＝0.05。

PBS对照组和用PBS中50μg铁调素-25给药的小鼠组或24小时内两个0.5mg剂量MAb 583给药的小鼠组之间的血浆铁浓度中观察到了显著性差异。施用PBS中50μg铁调素-25后随后施用1.0mg对照抗铁调素Mab(伪Mab)的组与PBS加铁调素-25对照组相比接近显著性差异(P＝0.054；Figure 28)。

这些结果都是很有希望的，并且表明当MAb583和铁调素-25先后IP注射雄性C57BL/6小鼠时，MAb583具有抑制铁调素-25生物活性的体内中和活性。在该体内实验中使用的50μg剂量人铁调素-25之前就显示了在C57BL\6小鼠中诱导最多72小时的严重血铁过少(hypoferrimia)，因此该剂量表示了对MAb 583的中和活性的严格检测(Rivera等，2005)。

实施例10人-小鼠嵌合抗体

小鼠抗铁调素MAB 583的重链和轻链可变结构域被合成且不做任何修饰地克隆入专有哺乳动物表达载体。轻链可变结构域与分泌信号和人κ轻链恒定结构域同框克隆。重链可变结构域与分泌信号和人IgG1恒定结构域同框克隆。所得克隆BAP070-01经序列确认。信号序列以下划线表示如下。

BAP070-01-轻链DNA序列

ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAAGTGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCGTGCATCCAACCTAGAATCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAATCCTGTGGAGGCTGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(SEQ ID NO:37)

BAP070-01-轻链蛋白氨基酸序列

MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKCDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:38)

BAP070-01-重链DNA序列

ATGGCCACAACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTACAACGTACGCTACTAGCTGGTACTGGGGCCAGGGAACGCTGGTCACCGTCAGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCAGCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:39)

BAP070-01-重链蛋白氨基酸序列

MATTMEFGLSWLFLVAILKGVQCQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTTYATSWYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:40)

鼠mAb 583重链可变区序列:

CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTACAACGTACGCTACTAGCTGGTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:53)

小鼠mAb 583轻链可变区序列

GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCGTGCATCCAACCTAGAATCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAATCCTGTGGAGGCTGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCTGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAC(SEQ ID NO:54)

CHO细胞接种到6孔板中，使用专有转染方案用BAP070-01(重组嵌合体)或只用空载体(BAP070)进行转染，并用具有10％血清的DMEM于37℃下培养。转染后48小时收集上清液。使用BioAtla’s定量ELISA法来确定上清液中IgG的浓度。定量ELISA法确定重组BAP070-01的浓度为3650ng/ml。

我们使用BAP070-01MAb 583嵌合体的第一实验设计用来比较MAb583嵌合体与鼠MAb583嵌合体对于铁调素-25的结合活性。从600ng/ml开始两倍随后三倍系列稀释BAP070-1CHO细胞上清液或鼠MAb583(批次10，0.5mg/ml)在具有与马来酸活化孔共价结合的100ng铁调素-25的微孔板中孵育。使用与HRP偶联的抗人IgG(H+L)(1:2500)检测BAP070-01上清液的抗体结合。纯化的MAb 583对照的抗体结合通过使用同一稀释度的兔抗小鼠IgG(H+L)来检测。在孔中加入TMB后5分钟后用1N的HCl终止反应并立即读数。使用Molecular Device SPECTRAmax Plus来测量反应的450nm OD值(图29)。OD值如下表所示，并且在图29中显示了BAP070-01嵌合MAb 583以及纯化的MAb 583对照都有极佳的结合，表明BAP070-01嵌合克隆已成功构建，且鼠重链和轻链CDR区在人IgG框架的环境中正确地发挥作用。这些数据证明了CHO细胞培养物中BAP070-01的克隆和表达，并且嵌合体结合活性足够强以进行人源化的方案。我们进行了附加实验来验证该初步观察结果。

450nm OD值如下所示:

MAb583嵌合体BAP070-01以与本实验中系列稀释的纯化鼠MAb583相比更高的水平明显结合铁调素-25，证明嵌合抗体的特异性及功能性比得上母本鼠MAb583(图29)

这一最初的结合分析是对嵌合体BAP070-01的半定量评估，因为该比较涉及人-鼠嵌合MAb583与纯化的小鼠MAb583的细胞培养上清液。细胞培养上清液中嵌合抗体浓度的定量是使用BCA、使用专有免疫学方法和纯化MAb 583进行。不同的分析可潜在导致ELISA比较中不等量抗体的比较，因此信号的比较。尽管有这些需要注意的问题，MAb583和BAP070-01嵌合体都随着增加的抗体而显示出递增的信号，与对于该比较所预测的。

铁调素-25涂布平板的583嵌合体滴定

为了比较BAP070-01和空载体的结合活性，使用ELISA来测定BAP070。简言之，人铁调素-25(100ng/孔)共价结合至马来酸酐活化的微孔板过夜，随后按照制造商的操作说明来封闭剩余的未结合的活化位点。包含MAb 583嵌合体BAP070-01的系列稀释培养物上清液，或空载体BAP070，加入微孔板中，室温(RT)下孵育2小时。用TMB作为底物使用抗-人IgG-HRP来检测结合的嵌合MAb 583抗体。结果如图30所示。

数据清楚地表明，BAP070-01人-小鼠嵌合抗体特异性识别人铁调素-25，并具有极佳的亲和性，而在本分析中BAP070CHO上清液不存在对铁调素-25的结合(图30)。图29和图30显示的数据表明，纯化的MAb 583和BAP070-01嵌合MAb 583具有非常正面的比较，并且铁调素-25特异性结合BAP070-01嵌合体。还显示了对BAP070-01嵌合体上清液与阴性对照BAP070空载体比较的预期ELISA结果，其使用铁调素-25涂布平板来捕获功能性人IgG抗体和抗人IgG(H+L)用于检测(图30)。

BAP070-01 583嵌合体的G蛋白涂布C-ELISA

为了评估BAP070-01与G蛋白的结合和合成铁调素-25对BAP070-01 583的中和，我们使用NT-生物素铁调素-25作为示踪剂进行C-ELISA分析(图31)。该C-ELISA形式也用于检测NT-生物素铁调素-25示踪剂和BAP070-01嵌合体的结合以及与铁调素-25竞争结合嵌合MAb 583。为了捕获BAP070-01嵌合抗体，我们在碳酸盐涂布缓冲液中用G蛋白(150ng/孔)涂布微孔板过夜。

用TBST清洗平板，加入包含BAP070-01MAb 583嵌合体(150ng/孔)的CHO细胞上清液，允许在室温下结合G蛋白1小时。

用TBST清洗平板，将1ng/孔的NT-生物素铁调素-25与TBST、0.25％BLOTTO中的不同量(0-100ng)的合成铁调素-25标准品混合，并将其加入平板使其竞争性结合。随后用TBST清洗平板，并加入SA-HRP(1:2500)，允许结合1小时。

用TBST清洗平板，加入TBS底物，10分钟后用终止溶液终止反应。在分光光度计上测量450nm处的吸收值。

BAP070-01的C-ELISA分析中的吸光度(OD450)如下表所示。

上表和图31的结果显示了合成的铁调素-25竞争BAP070-10嵌合体结合位点，嵌合MAb583抗体对于铁调素-25和NT-生物素铁调素-25具有特异性。图31所示的标准曲线是使用四参数逻辑回归(Graphpad Prism；San Diego,CA)产生的。我们使用Prism来计算铁调素-25对BAP070-01结合的EC50值以及确定EC50＝54ng/ml(图31)。考虑到该样品是非常好的，其源自粗制上清液而不是EC50≤5.0ng/ml的纯化MAb 583(图16)。

BAP070-01 583嵌合体的中性抗生物素蛋白C-ELISA分析

进行了BAP070-01嵌合MAb 583的另一评估，其使用中性抗生物素蛋白(150ng/孔)在碳酸盐涂布缓冲液中涂布微孔板过夜。用TBST清洗平板。NT-生物素铁调素-25示踪剂以1ng/孔的浓度与不同浓度的铁调素-25(0-100ng/孔)加入，室温下允许结合1小时。在该C-ELISA分析中使用抗人IgG(H+L)-HRP来检测结合的BAP070-01 MAb 583嵌合体。

下表显示了与相对于铁调素-25浓度的重复和平均OD450值。结果表明人铁调素-25明显中和BAP070-01嵌合体上的结合位点，而NT-生物素铁调素-25示踪剂(铁调素类似物)有效结合。

图32提供了图表数据，显示了如上表所示的BAP070-01嵌合体与NT-生物素铁调素-25竞争性结合的结果。如同在任一竞争分析中所预计的，随着增加的未标记抗原(例如铁调素-25)浓度，观察到更低的信号。图32显示了每个铁调素-25增加浓度的两个重复的OD450和平均的OD450值。

综上，我们所提供的实施例10中的数据表明BAP070-01嵌合Mab 583保持了母本小鼠MAb 583抗体的高亲和性和特异性特征，天然小鼠MAb 583抗体的完全人源化将会产生适用于人类临床前期和临床测试的候选治疗抗体。

尽管本申请展示和描述了本发明实施例中的某些实施方式，本领域技术人员清楚所述实施方式仅仅是出于示例目的而提供。本领域技术人员会产生很多变体、改变或替代手段而不背离本发明实施方式。应当理解，本申请所述实施方式中的各种变化方式都可以在实施本发明实施方式时使用。期望通过下面的权利要求定义本发明实施方式的范围，并且所述权利要求范围内的方法和结构及其等效方式也被包含在内。

序列

铁调素MAb H32、583和1B1的可变重链和轻链的CDR-1、CDR-2和CDR-3区的核苷酸比对。CDR具有下划线。框架区没有下划线。

可变重链

CDR-1

SEQ ID NO:1H32

GGTTCTGGCTACACATTCACTGATTATGCTATGCAC

SEQ ID NO:2583

GCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAAC

SEQ ID NO:31B1

GTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAAC

CDR-2

SEQ ID NO:4H32

GGAGTTATTAGTTCTTACTATGGTGATGCTAGCTAC

SEQ ID NO:5583

GGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATAT

SEQ ID NO:61B1

GGCTACATAAGCTACAGTAGTATCACTAACTAC

CDR-3

SEQ ID NO:7H32

TACTGTGCAAGATATAGGGGGCTCTGGTACTTCGATGTCTGGGGC

SEQ ID NO:8583

TTCTGTACAACGTACGCTACTAGCTGGTACTGGGGC

SEQ ID NO:91B1

TACTGTGCTGGTCTTTACTATGTTATGGACCACTGGGGT

可变轻链

CDR-1

SEQ ID NO:10 H32

TCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTAT

SEQ ID NO:11 583

GCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCAC

SEQ ID NO:12 1B1 GCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTAC

CDR-2

SEQ ID NO:13 H32GTATATCGGATGTCCAACCTT

SEQ ID NO:14 583ATCTATCGTGCATCCAACCTA

SEQ ID NO:15 1B1ATTTATCTCACATCCAACCTG

CDR-3

SEQ ID NO:16 H32

TATTGTATGCAACATCTAGAATATCCTTTCACGTTCGGT

SEQ ID NO:17 583

TACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCTGACGTTCGGT

SEQ ID NO:18 1B1

TACTGCCAGCAGTGGAGTAGTGACCCTTTCACGTTCGGC

人铁调素肽(铁调素-25、hep-25、Hep-25、h铁调素-25):SEQ ID NO:19(25aa)DTHFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT

小鼠铁调素-1肽(mhepcidin-1、mhep-1、mHep-1、mHepcidin-1):SEQ ID NO:20:(25aa)DTNFPICIFCCKCCNNSQCGICCKT

大鼠铁调素肽(rhepcidin、rhep、rHep、rHepcidin):SEQ ID NO:21:(25aa)DTNFPICLFCCKCCKNSSCGLCCIT

人铁调素-20肽(铁调素-20、hep-20、Hep-25、hHepcidin-20):SEQ ID NO:22:(20aa)ICIFCCGCCHRSKCGMCCKT

人铁调素-22肽(铁调素-22、hep-22、Hep-22、hHepcidin-22):SEQ ID NO:23:(23aa)HFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT

人铁调素-9肽(铁调素-9、hep-9、Hep-9、hHepcidin-9):SEQ ID NO:24(9aa)DTHFPICIF

人铁调素-5肽(铁调素-5、hep-5、Hep-5、hHepcidin-5):SEQ ID NO:25(5aa)DTHFP

人铁调素10-25肽(铁调素10-25、hep 10-25、Hep 10-25、hHepcidin 10-25):SEQ ID NO:26(16aa)

CCGCCHRSKCGMCCKT

DNP-人铁调素-9KLH肽(DNP-铁调素-9-KLH、DNP-hep-9-KLH、DNP-Hep-9-KLH、DNP-hHepcidin-9-KLH):SEQ ID NO:27

DNP-DTHFPIC(KLH-SMCC)-IF

IgG1重链可变区[智人]GenBank:AAK62671.1

LLESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSMINYYWSWIRQPPGERPQWLGHIIYGGTTKYNPSLESRITISRDISKSQFSLRLNSVTAADTAIYYCARVAIGVSGFLNYYYYMDVWGSGTAVTVSS(SEQ ID NO:29)

IgG1重链可变区[智人]GenBank:AAK19936.1

QVQLQQWGAGLLKPSETLSRTCAVYGGSFSDDYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSEKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARRNDWYPFDYWDEGILVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW(SEQ ID NO:30)

IgG1[小家鼠]GenBank:BAA23565.1

QVQLQQSGAELMKPGASVNISCKASGYIFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNIKYNEKFKGKAIFTVETSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAKTDYYASGYGFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:31)

免疫球蛋白κ轻链可变区[小家鼠]GenBank:ABE03823.1

DIVMTQSPASLDVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMNWYQQKPGQPPKLLIYLASSLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREPPPTFGGGTKLEIKRAD(SEQ ID NO:32)

免疫球蛋白κ轻链可变区[小家鼠]GenBank:ABE03821.1

DVVMTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLANNGRTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSTLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPLTFGAGTKLELKRAD(SEQ ID NO:33)

免疫球蛋白IgG1轻链可变区[智人]GenBank:AAK62672.1

LTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGRNLGWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSDWPRTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:34)

小鼠_VK

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:35)

小鼠_VH

EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKASNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCTRWRRFFDSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:36)

铁调素MAb H32、583和1B1的可变重链和轻链核酸与氨基酸序列

H32 VH

GGTTCTGGCTACACATTCACTGATTATGCTATGCACGGAGTTATTAGTTCTTACTATGGTGATGCTAGCTACTACTGTGCAAGATATAGGGGGCTCTGGTACTTCGATGTCTGGGGC(SEQ ID NO:41)

H32 VH

Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met His Gly Val Ile SerSer Tyr TyrGly Asp AlaSer Tyr TyrCysAlaArg Tyr Arg Gly Leu Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly(SEQ ID NO:42)

583 VH

GCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATTTCTGTACAACGTACGCTACTAGCTGGTACTGGGGC(SEQ ID NO:43)

583 VH

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr PheCysThrThr Tyr AlaThrSerTrp Tyr Trp Gly(SEQ ID NO:44)

1B1 VH

GTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAACGGCTACATAAGCTACAGTAGTATCACTAACTACTACTGTGCTGGTCTTTACTATGTTATGGACCACTGGGGT(SEQ ID NO:45)

1B1 VH

Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Gly Tyr Ile Ser Tyr SerSer Ile ThrAsn Tyr TyrCysAlaGlyLeu Tyr Tyr Val Met Asp His Trp Gly(SEQ ID NO:46)

H32 VL

TCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATGTATATCGGATGTCCAACCTTTATTGTATGCAACATCTAGAATATCCTTTCACGTTCGGT(SEQ ID NO:47)

H32 VL

SerSer Lys SerLeuLeu His SerAsnGlyAsnThr Tyr Leu Tyr Val Tyr Arg Met Ser Asn Leu Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly(SEQ ID NO:48)

583 VL

GCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCACATCTATCGTGCATCCAACCTATACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCTGACGTTCGGT(SEQ ID NO:49)

583 VL

Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Ile Tyr Arg Ala Ser AsnLeu Tyr CysGlnGlnSerAsnGlu Asp Leu Thr Phe Gly(SEQ ID NO:50)

1B1 VL

GCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACATTTATCTCACATCCAACCTGTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTGACCCTTTCACGTTCGGC(SEQ ID NO:51)

1B1 VL

AlaSerSerSer Val Ser Tyr Met Tyr Ile Tyr Leu Thr Ser AsnLeu Tyr CysGlnGlnTrpSerSer Asp Pro Phe Thr Phe Gly(SEQ ID NO:52)

铁调素MAb H32、583和1B1的可变重链与轻链的CDR-1、CDR-2和CDR-3多核苷酸序列。

可变重链

CDR-1

SEQ ID NO:55 H32GGCTACACATTCACTGATTATGCT

SEQ ID NO:56 583GGGTATACCTTCACAAACTATGGA

SEQ ID NO:57 1B1GGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCC

CDR-2

SEQ ID NO:58 H32ATTAGTTCTTACTATGGTGATGCT

SEQ ID NO:59 583ATAAACACCTACACTGGAGAGCCA

SEQ ID NO:60 1B1ATAAGCTACAGTAGTATCACT

CDR-3

SEQ ID NO:61 H32

GCAAGATATAGGGGGCTCTGGTACTTCGATGTC

SEQ ID NO:62 583ACAACGTACGCTACTAGCTGGTAC

SEQ ID NO:63 1B1GCTGGTCTTTACTATGTTATGGACCAC

可变轻链

CDR-1

SEQ ID NO:64 H32

AAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTAC

SEQ ID NO:65 583

GAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTT

SEQ ID NO:66 1B1TCAAGTGTAAGTTAC

CDR-2

SEQ ID NO:67 H32CGGATGTCC

SEQ ID NO:68 583CGTGCATCC

SEQ ID NO:69 1B1CTCACATCC

CDR-3

SEQ ID NO:70 H32ATGCAACATCTAGAATATCCTTTCACG

SEQ ID NO:71 583CAGCAAAGTAATGAGGATCTGACG

SEQ ID NO:72 1B1CAGCAGTGGAGTAGTGACCCTTTCACG

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