熊果酸的用途的制作方法

本发明涉及医药技术领域，特别涉及熊果酸的用途。

背景技术：

慢性肾小球肾炎，简称慢性肾炎(CGN)，是一种链球菌感染的变态反应性疾病。慢性肾炎发病少数为急性肾炎迁延不愈所致，绝大多数起病即为慢性。有些慢性肾炎患者过去有急性肾炎史，肾炎症状已消失多年，误认为已经痊愈，其实其患肾炎后肾脏受到损伤一直在继续缓慢进行，经若干年后，肾病受损伤程度越来越重，肾功能逐步下降，其肾炎的症状又复出现，而成为慢性肾小球肾炎。而多数人的肾脏炎症从开始即为隐匿性，病人无明显急性肾小球肾炎的表现，但炎症呈缓慢发展，经若干年后变成慢性肾小球肾炎。

慢性肾炎临床主要表现有水肿、高血压、蛋白尿和血尿等症状，由于病理改变各种各样，症状表现不一样。严重者可能出现尿毒症。

慢性肾炎是由急性肾炎转变而来，是一种常见的慢性肾脏疾患，以男性患者较多，病程持续1年以上，发病年龄大多在20-40岁。急性肾炎起病急，以浮肿、血尿症状为最多见。

慢性肾炎表现各异，有的无明显症状，有的有明显血尿、浮肿、高血压，并有全身乏力、纳差腹胀、贫血等兼症。多数患者呈进行性加重，但有些患者的症状可部分或全部缓解，病程长达20－30年。若血压持续升高，可见头晕、头痛胸闷、视力模糊等症。

中医学属“水肿”、“腰痛”、“虚劳”、“血尿”、“淋症”等范畴，是导致终末期肾衰竭的主要病因，积极预防和治疗本病可以有效延缓其进展。目前西医治疗本病疗效不甚理想，中医药或中西医结合治疗有望提高疗效，改善预后。

目前中医治疗CGN主要分为以下几类：1、中医证候研究，如王亿平等用参地颗粒(红参、茯苓、熟地黄、五味子、桑螵蛸、鸡内金等)治疗脾肾亏虚证CGN30例。2、辨证治疗，李良将临床CGN病人按照辨证施治方法分别针对脾肾气虚证用四君子汤、脾肾阳虚证用附桂理中汤、肝肾阴虚证用六味地 黄汤、气阴两虚证用生脉汤等，并随证加减治疗。3、中药复方治疗，王黎萍常规西医治疗，加用慢肾宁合剂(黄芪、桂枝、淫羊霍、生地黄、阿胶、茯苓等)。刘洪章常规西医治疗，加服真武汤(茯苓、芍药、白术、生姜、附子)。盖云等将脾肾气虚证的原发性CGN患者氯沙坦加用肾四方(炙黄芪、石苇、芡实、卫茅、僵蚕)。唐英等常规西医治疗，加用黄芪注射液合脉络宁注射液(牛膝、玄参、石斛、金银花等)静脉滴注。4、单味中药治疗，临床西药治疗基础上加用中药单味药制剂如白芍总苷胶囊、雷公藤多苷、黄葵胶囊等。5、针灸治疗，关鑫等对CGN脾肾气虚证患者分为对照组及治疗组各30例，2组均口服施以氯沙坦钾治疗，加用温针灸(气海、中极、中脘、阴陵泉等穴)效果良好。6、循证医学研究，郑海生等用系统评价的方法，选择在西医基础治疗之上结合中医川芎为主的活血通络法治疗CGN与单纯西医治疗CGN的随机对照试验研究，共纳入7篇随机/半随机对照临床试验并进行Meta分析。结果显示，中医活血通络法治疗CGN组在总体疗效方面优于西药治疗组(P＜0.01)。

传统中药牛膝在治疗CGN过程中起到重要作用，多个文献报道组方中均含有牛膝药材，未见熊果酸临床口服治疗CGN的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供熊果酸的用途。熊果酸具有抑制LPS诱导的MC细胞中NF-κB蛋白表达，影响细胞炎症相关因子IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1的释放。实验表明，熊果酸还能够用于制备治疗慢性肾炎药物。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了熊果酸在制备NF-κB表达抑制剂中的应用。

Western blot实验结果表明熊果酸具有抑制LPS诱导的MC细胞中NF-κB蛋白表达，影响细胞炎症相关因子IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1的释放。

本发明还提供了熊果酸在制备IL-6表达抑制剂中的应用。

本发明还提供了熊果酸在制备TNF-α表达抑制剂中的应用。

本发明还提供了熊果酸在制备TGF-β表达抑制剂中的应用。

本发明还提供了熊果酸在制备MCP-1表达抑制剂中的应用。

本发明还提供了熊果酸在制备治疗/或预防慢性肾炎药物中的应用。

在本发明一些具体实施方案中，所述慢性肾炎包括IgA肾病、非IgA系膜增生性肾炎、慢性肾脏病蛋白尿、高血压型慢性肾炎、混合型慢性肾炎和/或急性发作型慢性肾炎。

在本发明一些具体实施方案中，所述药物以熊果酸计，施药剂量为1.25～5mg/kg。

在本发明一些具体实施方案中，所述药物包括熊果酸及药学上可接受的辅料。

在本发明一些具体实施方案中，所述药物的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、注射剂、口服液、丸剂、散剂。

本发明公开了熊果酸在制备NF-κB表达抑制剂中的应用。Western blot实验结果表明熊果酸具有抑制LPS诱导的MC细胞中NF-κB蛋白表达，影响细胞炎症相关因子的释放。影响细胞炎症相关因子IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1的释放。实验表明，熊果酸还能够用于制备治疗慢性肾炎药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示熊果酸对MC细胞NF-κB蛋白表达的影响；

图2示熊果酸对慢性肾炎模型大鼠IL-6的影响；

图3示熊果酸对慢性肾炎模型大鼠TGF-β1的影响；

图4示熊果酸对慢性肾炎模型大鼠1CAM的影响；

图5示熊果酸对慢性肾炎模型大鼠MCP-1的影响。

具体实施方式

本发明公开了熊果酸的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的熊果酸的用途中所用原料及试剂均可由市场购得。本专利获得国家自然科学基金面上项目(81273723,81473633)、江苏高校优势学科建设工程资助项目支持。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1、试验材料

1.1实验仪器

IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1检测试剂盒(森贝伽，南京)，SpectraMax190酶标仪(Molecular devices，美国)，奥林巴斯AU-2700全自动生化分析仪

1.2供试样品

熊果酸，将提取物用0.5％CMCNa溶液配制成相应浓度。

2细胞及动物

肾小球系膜细胞(MC)购自武汉大学典藏细胞库，成年雄性SD大鼠，体质量(220±20)g(上海斯莱克实验动物中心)。

阿霉素模型是研究人类早期慢性肾炎的经典模型(参见文献：魏明刚,孙伟,陈继红，等雷至胶囊对阿霉素肾病模型基质金属蛋白酶及其抑制物的作用，时珍国医国药,2011,22(2):399-401.)病理主要表现为肾小球微小病变为主,随着病情的进展表现为肾小球局灶阶段性硬化为主,最终导致肾脏纤维化和肾功能衰竭。病变发生与足细胞损伤、大量蛋白尿和肾脏实质的纤维化息息相关。因此选择阿霉素慢性肾炎模型研究熊果酸对肾脏病的防治作用。

3试验方法

3.1细胞培养

肾小球系膜细胞(MC)加入10％FCS的DMEM培养液,放入CO2恒温培养箱(37℃,5％CO2,饱和湿度)培养。2-3d换1次液。

3.2细胞增殖检测

取细胞悬液于相差显微镜下计数,用含10％FCS的DMEM培养液调整细胞浓度到7×10⁴/mL转种于96孔培养板中，100μL/孔，则每孔细胞数为7×10³/mL。37℃，5％CO₂,饱和湿度条件下培养24h，各孔均换液，加入不含FCS的DMEM培养液200μL以同步各组细胞于G0期。空白对照组(简称 空白组,加入5％正常人血清)、熊果酸组(10μg/mL)、脂多糖(LPS)组(加入LPS10g/L和5％正常血清)、LPS+熊果酸组(加入LPS 10g/L和熊果酸10μg/mL)共4个组,每组设有6个复孔。于培养24h时分别取出相应的培养板,每孔加入MTT20μL(5mg/mL),继续培养4h,小心吸弃各孔培养液,加入100μL DMSO,室温避光,轻轻振荡10min,使结晶充分溶解。选择490nm波长,在酶标仪上读出OD值。

3.3ELISA法测定系膜细胞IL-1β

用含10％FCS的DMEM调整细胞浓度到5×10⁴-5×10⁵/ml转种于6孔培养板中，37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养24h,各孔均换液,加入不含FCS的DMEM培养液1ml以同步各组细胞于G0期。然后分为:空白对照组(加10％FBS)‘LPS组(LPS10μg/ml)；LPS+熊果酸组(10μg/ml+10μg/ml LPS),共3组,每组设复孔4个。5％CO2,饱和湿度条件下继续培养。于培养24h时分别取出相应的培养板，收集各组上清液,采用ELISA方法,酶标仪测定490nm吸光度,据标准曲线测定其中IL-1B的浓度。

3.4Western blotting检测NF-κB表达

使用蛋白裂解液提取培养细胞的总蛋白，BCA方法检测蛋白浓度，调整浓度后取30μL加入上样缓冲液煮沸变性。样品经SDS-PAGE后转移至PVDF膜。应用封闭液封闭，一抗室温2h或4℃过夜后室温孵育二抗1h，洗膜后进行成像检测。

3.5熊果酸对阿霉素诱导的肾炎大鼠生化指标及细胞因子表达的影响

成年雄性SD大鼠32只，体质量(220±20)g，购入后适应饲养1周，普通饮食，自由饮水，1周后开始实验。随机分为空白对照组、模型组、洛丁新组、熊果酸组。各组一次性尾静脉注射0.2％阿霉素溶液，每只按照6mg/kg剂量，进行造模，对照组注射等量生理盐水。第2周确定造模成功后，灌胃熊果酸，按照5g/kg、2.5g/kg、1.25g/kg计算药物浓度和使用量。分别在第7天、28天、42天和56天应用金属代谢笼留取大鼠24h尿液，8周后大鼠眼眶静脉取血后留取血清，应用奥林巴斯AU-2700全自动生化分析仪检测血清白蛋白、肌酐和血尿素氮。8周后取血液进行IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1含量测定。组织蛋白变性后在10％SDS-PAGE中分离，湿转法将蛋白转移至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭2h，加入NF-kB p65Ⅰ抗4℃摇床振荡孵育过夜， 第2天回收Ⅰ抗，TBST缓冲液洗涤3次，每次10min，加入Ⅱ抗，室温摇床振荡孵育2h，ECL化学发光法显影，Image J软件对结果进行灰度分析。

4试验结果

4.1熊果酸对细胞增殖的影响，见表1。

表1 熊果酸对细胞增殖的影响

熊果酸可以抑制肾小球系膜细胞增殖，但与空白组比较没有显著差异。LPS诱导条件下肾小球系膜细胞增殖明显增加(P＜0.05)，加入熊果酸可以明显(P＜0.05)抑制LPS诱导的肾小球系膜细胞增殖，并且随着作用时间的增加，抑制效果明显增加(P＜0.05)。

4.2熊果酸对细胞上上清液中IL-1β的影响，见表2。

表2 熊果酸对细胞上上清液中IL-1β的影响

LPS诱导的肾小球系膜细胞中炎症因子IL-1β表达水平显著增加(P＜0.05)，加入熊果酸后炎症因子IL-1β表达水平明显下降(P＜0.05)，且随着作用时间的增加，抑制效果显著增强(P＜0.05)。

4.3熊果酸对信号通路的影响

如图1所示，Western blot实验结果表明，熊果酸具有抑制LPS诱导的MC细胞中NF-κB蛋白表达，影响细胞炎症相关因子的释放。

4.4熊果酸对大鼠肾组织中IL-6、TGF-β1、ICAM-1、MCP-1表达水平的影响，见表3，见图2、图3、图4和图5所示。

表3 熊果酸对炎症因子的影响

阿霉素诱导的大鼠生化指标明显提升，熊果酸高中低剂量组可显著(P＜0.05)降低大鼠肾组织样本中IL-6、TGF-β1、ICAM-1、MCP-1表达水平，其中高剂量组与阳性药物组作用相近。

4.5熊果酸对慢性肾脏蛋白尿中的影响，见表4。

表4 大鼠尿蛋白含量的变化(mg/24h)

与模型组比较**P＜0.01，***P＜0.001

当肾小球、肾小管发生病变时，如各期肾炎、肾病以及高血压发生肾动脉硬化时，均可出现蛋白尿。阿霉素诱导的大鼠肾脏病模型中可以明显观察到尿蛋白含量的增加，模型组接受熊果酸治疗后，尿蛋白含量明显降低(P＜0.05)，其中熊果酸高剂量组大鼠尿蛋白含量与阳性药物组相比无显著变化(p>0.01)，显示熊果酸具有良好的抑制慢性肾脏病大鼠尿蛋白含量的效果。

4.6熊果酸对慢性肾炎中肌酐和尿素氮的影响，见表5。

表5 大鼠血肌酐和血尿素氮变化

与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01

试验结果表明，阿霉素造模8周后，大鼠血肌酐含量由正常组38.01增加至50.05，熊果酸中剂量组降低血肌酐含量至42.93(μmol/L)，与模型组对比，具有极显著差异，熊果酸高剂量组降低尿蛋白含量至41.67(μmol/L)，与模型组对比，具有极显著差异。大鼠尿素氮含量由正常组5.09(mmol/L)增加至 10.32(mmol/L)，熊果酸中剂量组降低血肌酐含量至7.85(mmol/L)，与模型组对比，具有极显著差异(P＜0.01)，熊果酸高剂量组降低尿蛋白含量至6.35(mmol/L)，与模型组对比，具有极显著差异(P＜0.01)。

实施例2

我院门诊和住院患者中资料完整的临床病历30例。患者中女性12例，男性18例，平均年龄(35.2±8.5)岁，病程(11.5±5.8)月。患者临床症状、肾脏病理和实验室检查符合慢性肾小球肾炎的临床诊断，并且排除继发性肾炎可能。按照随机原则分为对照组与治疗组，对照组结合24h尿蛋白定量数据使用基础治疗1～3项，治疗组在基础治疗基础上联合熊果酸治疗。

基础治疗1患者24h尿蛋白定量如果大于1g，西药应用强的松1mg/(kg·d)(或者静滴等效剂量甲基强的松龙)。

基础治疗2应用降脂药、保护胃黏膜药物和钙片以及抗血小板聚集药物等对症治疗。

基础治疗3参考《美国NKF-K/DOQI工作组制定的治疗指南》关于慢性肾脏病合并高血压的临床用药指导原则首先选择贝那普利或者厄贝沙坦，必要时联合用药，使血压控制达标即等于或者小于130/80mmHg(17.29/10.64kPa)。

治疗组，在基础治疗基础上联合熊果酸(1mg/kg·d)。

观察终点时间及考察指标，规律治疗3个月进行血肌酐和尿素氮对比疗效分析。

结果见表6。

表6 治疗前后肾功能指标的比较

与对照组比较*P＜0.05

结果表明，联合熊果酸对肾炎患者进行治疗3月后，血肌酐和尿素氮水平下降幅度大于对照组(P＜0.05)，说明熊果酸在临床治疗慢性肾小球肾炎中具有很好的疗效。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。