可负载细胞因子且生理环境下稳定的纳米颗粒制备方法与流程

本发明涉及一种可负载细胞因子的纳米生物材料，特别是一种可负载细胞因子且生理环境下稳定的纳米颗粒制备方法。

背景技术：

壳聚糖(chitosan,CS)化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，是甲壳素脱乙酰基的产物。由于其具有良好的生物相容性和生物可降解性，目前广泛应用于生物载药材料的研制，尤其是应用于纳米载药颗粒的的基本材料。肝素作为一种糖胺聚糖广泛存在于机体内。SDF-1α、VEGF和NGF等细胞因子已经证实N端具有可与肝素结合的保守序列，能与肝素特异性结合，可以负载于含有肝素成分的纳米颗粒。而壳聚糖分子链上含有丰富的自由氨基和阳离子成分，而肝素是含有负电荷的羧基。将壳聚糖溶解于含有1％醋酸去离子水溶液中，通过5％的NaOH调节pH，使溶液pH为5左右。随后在磁力搅拌器搅拌时逐滴加入低分子肝素钠溶液。通过调整壳聚糖和肝素的浓度以及体积比能够构建出不同粒径参数的纳米微粒。目前已经有通过自组装的方法构建出可装载VEGF的壳聚糖/肝素纳米颗粒，研究显示了良好的载药性能，并能一定程度上促进生物基质材料的体内再生。但是由于壳聚糖只能溶于酸性液体(pH<6.0)。而生理条件下的pH为7.35-7.45。因此壳聚糖只能在酸性条件下制备出纳米颗粒，一旦恢复到生理pH，壳聚糖纳米颗粒就会团聚沉淀，这一缺陷极大的限制了壳聚糖纳米颗粒的体内研究和应用。且壳聚糖溶媒一般由醋酸配制，而醋酸是弱酸，因此构建的壳聚糖纳米悬液中具有较多的H⁺储备。一旦将醋酸缓冲的壳聚糖/肝素纳米颗粒，注入体内，势必造成注射部位的内环境酸化紊乱，这一缺陷极大的限制了壳聚糖纳米颗粒的在体应用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种能够稳定存在于生理溶液中，提高纳米颗粒生物相容性的可负载细胞因子且生理环境下稳定的纳米颗粒制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种可负载细胞因子且生理环境下稳定的纳米颗粒制备方法，具体包括步骤为：1)将低分子肝素溶于去离子水配制成浓度为0.05-0.45mg/ml的低分子肝素溶液；2)将分子量为4500D-5500D，脱乙酰程度>90％的壳寡糖溶于去离子水配制成浓度为0.75-1.25mg/ml的壳寡糖溶液；3)在室温下将低分子肝素溶液逐滴加入在磁力搅拌器搅拌下的壳寡糖溶液中，低分子肝素溶液与壳寡糖溶液混合比例R为5:4<R<5:2，或者4:15<R<1:5搅拌参数为700-800转/分，使两者充分结合呈微球；4)搅拌完成后，利用1％醋酸溶液或者1％氢氧化钠溶液将搅拌后的壳寡糖/肝素悬液的PH值滴定至7.35-7.45；5)将超声振荡仪置入滴定好的壳寡糖/肝素悬液中进行超声振荡(参数：500-700w，持续2-6s，间隔1-5s，8-12个周期)，使微球粒径进一步减小形成纳米颗粒，即得壳寡糖-肝素纳米颗粒。

壳聚糖-肝素纳米颗粒需要先通过交联剂附着于血管支架上才能进行在体实验研究。而壳寡糖作为低聚的壳聚糖，具有较好的溶解度，能够直接溶于生理pH溶液中，发明人在背景技术研究的基础上做了进一步的改进，通过调整配方，增加超声振荡处理，采用壳寡糖和低分子肝素构建新型的壳寡糖-肝素纳米颗粒，使其能够稳定存在于生理溶液中，这极大的增加了壳寡糖-肝素纳米颗粒的生物相容性。

与现有技术相比，本发明所具有的有益效果为：本发明构建出的壳寡糖/肝素纳米颗粒不仅具有较好的粒径参数以及形貌(表1，图2)，并且能够稳定存在于7.35-7.45的pH溶液中，这使得壳寡糖/肝素纳米颗粒具有更好的生物相容性。因此壳寡糖/肝素纳米颗粒可以直接负载所需的药物(如细胞因子、抗生素，见图3)后直接注入目标组织，更好的发挥药物的生理功能。

附图说明

图1为本发明壳寡糖/肝素纳米颗粒制备流程图。

图2为实施例组3的纳米颗粒的粒度分布图。

图3为实施例组3的纳米颗粒在电镜下的形貌图(B-D)。

图4为本发明壳寡糖-肝素纳米颗粒负载细胞因子示意图。

图5A为间充质干细胞(MSC)迁移实验示意图。

图5B显示在图5A的下室添加负载不同浓度的SDF-1α的纳米颗粒与SDF-1α溶液后，进行24小时的细胞迁移实验后，细胞迁移数目的比较；

图5C、图5D显示将纯纳米颗粒(NP)、将10ng/ml的SDF-1溶液以及负载10ng/ml的SDF-1的纳米颗粒添加到图5A的下室后，分别进行迁移实验12、24、36小时，比较各组诱导细胞迁移的数目(放大倍数：100×，*P<0.05,**P<0.01)由结果可知，负载于纳米颗粒后，SDF-1不仅可以保持诱导细胞迁移的活性，还能使SDF-1发挥更好的趋化性能，36h细胞迁移数目高于SDF-1组。

图6A表示不同浓度的VEGF促进内皮细胞生殖的作用比较。

图6B表示负载不同浓度的VEGF的纳米颗粒与不同浓度的VEGF溶液促进内皮细胞生殖的作用比较。

图7A、图7B表示负载于纳米颗粒的VEGF与纯VEGF溶液在小鼠体内消散速度比较(*P<0.05,**P<0.01)。

具体实施方式

如图1所示，具体步骤为：1)将低分子肝素溶于去离子水配制成浓度为0.25mg/ml的低分子肝素溶液；2)将分子量为5000D，脱乙酰程度>90％的壳寡糖溶于去离子水配制成浓度为1.0mg/ml的壳寡糖溶液；3)在室温下按表1所示的不同比例关系分别将低分子肝素溶液逐滴加入在磁力搅拌器搅拌下的壳寡糖溶液中，形成组1、组2、组3、组4，搅拌参数均为750转/分，使各组低分子肝素溶液和壳寡糖溶液充分结合呈微球；4)搅拌完成后，利用1％醋酸溶液或者1％氢氧化钠溶液将搅拌后的壳寡糖/肝素悬液滴定至7.35-7.45；5)将超声振荡仪置入滴定好的壳寡糖-肝素悬液中进行超声振荡(参数：400-600w，持续3s，间隔2s，10个周期)，使微球粒径进一步减小形成纳米颗粒，即得壳寡糖/肝素纳米颗粒，如图4所示。通过粒度分析仪和透射电镜对制备好的纳米颗粒进行表征，表征参数详见表1、图2、图3。

表1 壳寡糖/肝素纳米颗粒的配比以及粒径参数

注：CSO，壳寡糖；heparin，肝素；PDI，多分散系数

壳寡糖/肝素纳米颗粒由于生物相容性更好，因此可以不需要交联剂附着于支架材料上即可直接进行实验研究和在体应用。发明人的研究已经证明壳寡糖-肝素纳米颗粒能够高效负载细胞因子(SDF-1α和VEGF)，详见表2。

表2 各组纳米颗粒SDF-1α和VEGF的封装率(EE)

由表2可知，组1-组4的封装率都非常高，封装率越高载药能力越强，而实际应用中细胞因子的需求远低于表2中的负载量。由此可见，本发明制备的壳寡糖-肝素纳米颗粒能够高效负载细胞因子。

另外，发明人通过如图5A所示的间充质干细胞(MSC)迁移实验(将间充质干细胞MSC接种于容器上室，将纳米颗粒NP、SDF-1或者负载SDF-1的纳米颗粒添加到容器下室，中间用聚碳酸酯膜隔开)证明了壳寡糖-肝素纳米颗粒所负载的SDF-1子能够有效地发挥其诱导干细胞迁移的生理活性(如图5B-图5D)；通过脐静脉内皮细胞增殖实验证明了壳寡糖/肝素纳米颗粒所负载的VEGF能够有效的发挥其促进内皮细胞增殖的生理活性(如图6A、图6B)。图6A表示不同浓度的VEGF促进内皮细胞生殖的作用比较。图6A中内皮细胞添加剂包括各种细胞因子以及其他添加物，是最强的促进内皮细胞增殖的添加剂，在此作为背景参考。图6B表示负载不同浓度的VEGF的纳米颗粒与不同浓度的VEGF溶液促进内皮细胞生殖的作用比较。

为了证明本发明制备的壳寡糖-肝素纳米颗粒具有更好的使细胞因子局限于靶位的效果，发明人进行了荧光分子成像实验。发明人分别将100ul的CY5荧光标记的VEGF和100ul，cy5标记的VEGF负载于壳寡糖-肝素纳米颗粒后，注入小鼠背部皮下后，利用荧光分子成像(FMT)系统分别在不同时间点观察荧光的消散速度，以此观察两组VEGF在局部停留的时间，从结果可知，负载于壳寡糖-肝素纳米颗粒后，VEGF消散速度明显慢于对照组(如图7A、图7B所示)，很明显，这样更有利于细胞因子在局部更好的发挥。