用于治疗耐药性癌症及用于联合治疗的药物递送缀合物的制作方法

本申请要求保护2014年4月14日提交的美国临时申请系列号61/979,344和2014年9月30日提交的美国临时申请系列号62/057,473的35U.S.C.§119(e)下的优先权，所述申请案二者的公开内容均通过引用明确地结合到本文中。
技术领域：
本文所述的本发明是关于用于治疗耐药性癌症的药物递送缀合物。此外，本文所述的本发明是关于增强其它抗癌剂的功效的药物递送缀合物。发明背景哺乳动物免疫系统提供用于识别和清除病原细胞(例如肿瘤细胞)及其它侵入的外来病原体的方式。虽然免疫系统通常提供强大的防线，但仍有许多这样的实例，其中病原细胞(例如癌细胞)及其它传染物逃脱宿主免疫反应，并伴随宿主致病性增殖或存留。已开发化学治疗剂和放射治疗以消除例如复制的异常新生物。然而，许多当前可用的化学治疗剂和放射治疗方案具有不良的副作用，因其缺乏足够的选择性以优先破坏病原细胞，并因此亦可能伤害正常的宿主细胞(例如造血系统的细胞)及其它非病原细胞。这些抗癌药的不良副作用突出了对于开发对病原细胞群体有选择性且具有降低的宿主毒性的新疗法的需要。本文公开的是，包含由一个或多个非天然氨基酸形成的多价接头的药物递送缀合物，在治疗病原细胞群体上为有效的，且表现出低的宿主动物毒性。发明概述在一个说明性的实施方案中，本公开内容提供用于在宿主动物中治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：给予所述宿主动物治疗上有效量的下式化合物或其药学上可接受的盐，组合以治疗上有效量的至少一种另外的抗癌剂。在另一个说明性的实施方案中，本公开内容提供下式化合物或其药学上可接受的盐,组合以治疗上有效量的至少一种另外的抗癌剂用于在患者中治疗癌症的用途。在一些实施方案中，所述癌症选自癌、肉瘤、淋巴瘤、何杰金病、黑素瘤、间皮瘤、Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、白血病和骨髓瘤。在一些实施方案中，所述癌症选自口腔癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、内分泌癌、皮肤癌、胃癌、食管癌、喉癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、骨癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、乳腺癌、睾丸癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、子宫内膜癌、肝癌和肺癌。在一些实施方案中，所述癌症为卵巢癌。在一些实施方案中，所述癌症为非小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述癌症为子宫内膜癌。在一些实施方案中，所述癌症为三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症为乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症为肺癌。在一些实施方案中，所述另外的抗癌剂具有选自以下的作用方式：插入或抑制大分子生物合成、抑制拓扑异构酶II的进程、使DNA超螺旋松弛、抑制转录、使拓扑异构酶II复合体稳定、防止DNA双螺旋再密封、抑制DNA复制、诱导组蛋白移出染色质；交联DNA、引发DNA修复机制，其继而激活凋亡；抑制血管发生；抑制拓扑异构酶-1；结合微管和/或使之稳定、防止导致凋亡的生理性微管解聚/分解、使导致凋亡开启的癌蛋白bcl-2磷酸化、阻抑微管动态装配与分解；抑制纺锤体功能、阻抑微管动力学、阻抑微管从中心体脱离；以及干扰DNA修复，及其组合。在一些实施方案中，所述另外的抗癌剂选自多柔比星(DOXIL)、顺铂、贝伐单抗(阿瓦斯丁)、托泊替康、甲磺酸艾日布林、多西紫杉醇、紫杉醇和卡铂，及上述抗癌剂的药学上可接受的盐，及其组合。在一些实施方案中，所述另外的抗癌剂为多柔比星(DOXIL)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述另外的抗癌剂为顺铂，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述另外的抗癌剂为贝伐单抗(阿瓦斯丁)，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述另外的抗癌剂为托泊替康，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述另外的抗癌剂为多西紫杉醇，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述另外的抗癌剂为紫杉醇，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述另外的抗癌剂为卡铂，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述另外的抗癌剂为甲磺酸艾日布林。在本发明的另一个说明性且非限制性的实施方案中，本文描述的为下式化合物，B-L-Dx其中B、L、D和x各自如在本文所述的各实施方案和方面中所定义。在另一个实施方案中，含有一种或多种所述化合物的药物组合物亦描述于本文中。在一方面，所述组合物包含用于治疗患有癌症、炎症等的患者的治疗上有效量的一种或多种化合物。要理解的是，所述组合物可包含其它组分和/或成分，包括但不限于其它在治疗上有效的化合物，和/或一种或多种载体、稀释剂、赋形剂等，及其组合。在另一个实施方案中，使用所述化合物和药物组合物用于治疗患有癌症、炎症等的患者或宿主动物的方法，亦描述于本发明中。在一方面，所述方法包括以下步骤：给予患有癌症、炎症等的患者一种或多种本文所述的化合物和/或组合物。在另一方面，所述方法包括给予治疗上有效量的本文所述的一种或多种化合物和/或组合物，用于治疗患有癌症、炎症等的患者。在另一个实施方案中，所述化合物和组合物在制备用于治疗患有癌症、炎症等的患者的药剂的用途，亦描述于本文中。在一方面，所述药剂包含用于治疗患有癌症、炎症等的患者的治疗上有效量的一种或多种化合物和/或组合物。附图简述图1A显示与以100μmol/kg(▲)与EC0923共同给予EC1456以及与未处理(PBS)对照(■)相比，在nu/nu小鼠中每周三次(M/W/F)(TIW)以1μmol/kg给予EC1456达连续两周(●)对于KB肿瘤的体内活性。垂直虚线代表最终给药的日子。图1B显示EC1456未导致任何可见的整体动物毒性，如通过动物体重所确定。图2A显示EC1456对于建立的皮下MDA-MB-231肿瘤的活性。在第17天开始以2μmol/kg(图A)的EC1456(●)静脉内处理具有皮下MDA-MB-231肿瘤(94-145mm3)的动物，每周三次(M/W/F)，达2周时间，并与未处理动物(■)进行比较，如在图5A中所示。N=5只动物/组。垂直虚线=最终给药的日子。图2B显示EC1456未导致整体动物毒性（grosswholeanimaltoxicity），如通过体重变化%所确定。图3A显示EC1456在具有皮下KB-CR2000(耐顺铂)肿瘤(98-148mm3)的动物中的活性，其中在第6天开始以2μmol/kg(●)静脉内给予EC1456，每周三次(M/W/F)，达2周时间，或者与3mg/kg的顺铂一起给予(▲)，每周两次(T/Th)，达2周时间，并与未处理对照(■)进行比较。N=5只动物/组。垂直虚线=最终给药日的日子。图3B显示EC1456未表现出显著的宿主动物毒性。相比之下，顺铂处理在给药期间导致实质性的宿主动物毒性。图4显示与溶媒对照相比，EC1456的最大耐受剂量(MTD)。溶媒对照(■)，0.33µmol/kg的EC1456(●)，0.41µmol/kg的EC1456(▲)，0.51µmol/kg的EC1456(▼)，0.67µmol/kg的EC1456(◆)。图5A显示EC1456连同DOXIL在具有皮下耐长春药属KB-DR150肿瘤的动物中的活性，其中垂直虚线=最终给药日的日子；■为对照；▼为给予EC14562μmol/kg，TIWx2；●为给予DOXIL5mg/kg，BIWx2；为给予EC14562μmol/kg，TIWx2+DOXIL5mg/kg，BIWx2。图5B显示对于相同实验随时间的体重变化%。图6A显示EC1456连同顺铂在具有皮下M109肿瘤的动物中的活性，其中垂直虚线=最终给药日的日子；■为对照；▼为给予EC14562μmol/kg，TIWx2；为给予顺铂3mg/kg，BIWx2；Δ为EC1456+顺铂。图6B显示对于相同实验随时间的体重变化%。图7A显示EC1456连同顺铂在具有皮下KB肿瘤(口腔表皮样癌)的动物中的活性，其中垂直虚线=最终给药日的日子；●为对照；▼为给予EC14561μmol/kg，BIWx2；■为给予EC14561μmol/kg，BIWx2+顺铂3mg/kg，BIWx3；▲为给予顺铂3mg/kg，BIWx3。图7B显示对于相同实验随时间的体重变化%。图8A显示EC1456连同贝伐单抗在具有皮下KB肿瘤的动物中的活性，其中垂直虚线=最终给药日的日子；(a)为对照；(b)为给予EC14561μmol/kg，TIWx2；(c)为给予EC14561μmol/kg，TIWx2+给予阿瓦斯丁5mg/kg，BIWx2；(d)为给予阿瓦斯丁5mg/kg，BIWx2。图8B显示对于相同实验随时间的体重变化%。图9A显示EC1456连同托泊替康在具有皮下P-1606KB肿瘤的动物中的活性，其中垂直虚线=最终给药日的日子；(a)为对照；(b)为给予EC14561μmol/kg，BIWx2；(c)为给予EC14561μmol/kg，BIWx2+给予托泊替康5mg/kg，BIWx2；(d)为给予托泊替康5mg/kg，BIWx2。图9B显示对于相同实验随时间的体重变化%。图10A显示EC1456连同托泊替康在具有皮下P-1609KB肿瘤的动物中的活性，其中垂直虚线=最终给药日的日子；(a)为对照；(b)为给予EC14561μmol/kg，TIWx5；(c)为给予托泊替康5mg/kg，TIWx5；(d)为给予EC14561μmol/kg，TIWx5+给予托泊替康5mg/kg，TIWx5。图10B显示对于相同实验随时间的体重变化%。图11A显示EC1456连同多西紫杉醇在具有皮下P-1609KB肿瘤的动物中的活性，其中垂直虚线=最终给药日的日子；(a)为对照；(b)为给予EC14561μmol/kg，TIWx5；(c)为给予多西紫杉醇7mg/kg，BIWx3；(d)为给予EC14561μmol/kg，TIWx5+给予多西紫杉醇7mg/kg，BIWx3。图11B显示对于相同实验随时间的体重变化%。图12A显示EC1456连同卡铂在具有皮下P-1635KB肿瘤的动物中的活性，其中垂直虚线=最终给药日的日子；●为对照；▲为给予EC14561μmol/kg，TIWx2；为给予卡铂50mg/kgTIW；为给予EC14561μmol/kg，TIW+给予卡铂50mg/kgTIW。图12B显示对于相同实验随时间的体重变化%。图13显示EC1456连同卡铂和紫杉醇在具有皮下KB肿瘤的动物中的活性，其中垂直虚线=最终给药日的日子；■为对照；▲为给予EC14561μmol/kg，BIWx2；▼为给予卡铂30mg/kg，BIWx2+紫杉醇10mg/kg，BIWx2；●为给予EC14561μmol/kg，BIWx2+卡铂30mg/kg，BIWx2+紫杉醇10mg/kg，BIWx2。图14显示EC1456连同紫杉醇在具有皮下ST040肿瘤的动物中的活性，其中垂直虚线=最终给药日的日子；■为对照；▼为给予紫杉醇15mg/kg，SIWx2；(a)为给予EC14561.5μmol/kgBIWx2+给予紫杉醇15mg/kg，SIWx2；(b)为给予EC14563μmol/kgBIWx2+给予紫杉醇15mg/kg，SIWx2。图15显示EC1456连同甲磺酸艾日布林在具有皮下ST502肿瘤的动物中的活性，其中垂直虚线=最终给药日的日子；■为对照；▼为给予甲磺酸艾日布林1mg/kg，SIWx2；(a)为给予EC14562μmol/kgBIWx2+给予甲磺酸艾日布林1mg/kg；(b)为给予EC14564μmol/kgBIWx2+给予甲磺酸艾日布林1mg/kg。图16显示EC1456连同甲磺酸艾日布林在具有皮下ST738肿瘤的动物中的活性，其中垂直虚线=最终给药日的时间；■为对照；▼为给予甲磺酸艾日布林1mg/kg，SIWx2；(a)为给予EC14562μmol/kgBIWx2+给予甲磺酸艾日布林1mg/kg；(b)为给予EC14564μmol/kgBIWx2+给予甲磺酸艾日布林1mg/kg。图17显示EC1456连同紫杉醇在具有皮下ST024肿瘤的动物中的活性，其中垂直虚线=最终给药日的日子；■为对照；▼为给予紫杉醇15mg/kg，SIWx2；(a)为给予EC14562μmol/kgBIWx2+给予紫杉醇15mg/kg，SIWx2；(b)为给予EC14564μmol/kgSIWx2+给予紫杉醇15mg/kg，SIWx2。图18显示EC1456连同紫杉醇在具有皮下LU1147NSCLC肿瘤的动物中的活性，其中垂直虚线=最终给药日的日子；■为对照；▼为给予多西紫杉醇15mg/kg，SIW；(a)为给予EC14562μmol/kgBIWx2+给予多西紫杉醇15mg/kg，SIWx2；(b)为给予EC14564μmol/kgSIWx2+给予紫杉醇15mg/kg。图19显示EC1456连同紫杉醇在具有皮下LU2505NSCLC肿瘤的动物中的活性，其中垂直虚线=最终给药日的日子；■为对照；▼为给予多西紫杉醇15mg/kg，SIW；(a)为给予EC14562μmol/kgBIWx2+给予多西紫杉醇15mg/kg，SIWx2；(b)为给予EC14564μmol/kgSIWx2+给予多西紫杉醇15mg/kg。发明详述本发明的数个说明性的实施方案通过以下列举的条款来阐述：1.一种用于在宿主动物中治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：给予所述宿主动物治疗上有效量的下式化合物或其药学上可接受的盐，组合以治疗上有效量的至少一种另外的抗癌剂。2.条款1的方法，其中所述癌症选自癌、肉瘤、淋巴瘤、何杰金病、黑素瘤、间皮瘤、Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、白血病和骨髓瘤。3.条款1或2的方法，其中所述癌症选自口腔癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、内分泌癌、皮肤癌、胃癌、食管癌、喉癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、骨癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、乳腺癌、睾丸癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、子宫内膜癌、肝癌和肺癌。4.条款1-3中任一项的方法，其中所述癌症为卵巢癌。5.条款1-3中任一项的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌。6.条款1-3中任一项的方法，其中所述癌症为子宫内膜癌。7.条款1-3中任一项的方法，其中所述癌症为三阴性乳腺癌。8.条款1-3中任一项的方法，其中所述癌症为乳腺癌。9.条款1-3中任一项的方法，其中所述癌症为肺癌。10.条款1-9中任一项的方法，其中所述另外的抗癌剂选自多柔比星(DOXIL)、顺铂、贝伐单抗(阿瓦斯丁)、托泊替康、甲磺酸艾日布林、多西紫杉醇、紫杉醇和卡铂，或其药学上可接受的盐。11.条款1-10中任一项的方法，其中所述另外的抗癌剂选自甲磺酸艾日布林、多西紫杉醇和紫杉醇，或其药学上可接受的盐。12.条款1-9中任一项的方法，其中所述另外的抗癌剂为多柔比星(DOXIL)，或其药学上可接受的盐。13.条款1-9中任一项的方法，其中所述另外的抗癌剂为顺铂，或其药学上可接受的盐。14.条款1-9中任一项的方法，其中所述另外的抗癌剂为贝伐单抗(阿瓦斯丁)，或其药学上可接受的盐。14.条款1-9中任一项的方法，其中所述另外的抗癌剂为甲磺酸艾日布林。16.条款1-9中任一项的方法，其中所述另外的抗癌剂为多西紫杉醇，或其药学上可接受的盐。17.条款1-9中任一项的方法，其中所述另外的抗癌剂为紫杉醇，或其药学上可接受的盐。18.条款1-9中任一项的方法，其中所述另外的抗癌剂为卡铂，或其药学上可接受的盐。19.下式化合物或其药学上可接受的盐组合以治疗上有效量的至少一种另外的抗癌剂，用于在患者中治疗癌症的用途。20.条款19的用途，其中所述癌症选自癌、肉瘤、淋巴瘤、何杰金病、黑素瘤、间皮瘤、Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、白血病和骨髓瘤。21.条款19或20的用途，其中所述癌症选自口腔癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、内分泌癌、皮肤癌、胃癌、食管癌、喉癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、骨癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、乳腺癌、睾丸癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、子宫内膜癌、肝癌和肺癌。22.条款19-21中任一项的用途，其中所述癌症为卵巢癌。23.条款19-21中任一项的用途，其中所述癌症为非小细胞肺癌。24.条款19-21中任一项的用途，其中所述癌症为子宫内膜癌。25.条款19-21中任一项的用途，其中所述癌症为三阴性乳腺癌。26.条款19-21中任一项的用途，其中所述癌症为乳腺癌。27.条款19-21中任一项的用途，其中所述癌症为肺癌。28.条款19-27中任一项的方法，其中所述另外的抗癌剂选自多柔比星(DOXIL)、顺铂、贝伐单抗(阿瓦斯丁)、托泊替康、甲磺酸艾日布林、多西紫杉醇、紫杉醇和卡铂，或其药学上可接受的盐。29.条款19-28中任一项的方法，其中所述另外的抗癌剂选自甲磺酸艾日布林、多西紫杉醇和紫杉醇，或其药学上可接受的盐。30.条款19-28中任一项的用途，其中所述另外的抗癌剂为多西紫杉醇和卡铂的组合，或其药学上可接受的盐。31.条款19-28中任一项的用途，其中所述另外的抗癌剂为多柔比星(DOXIL)，或其药学上可接受的盐。32.条款19-28中任一项的用途，其中所述另外的抗癌剂为顺铂，或其药学上可接受的盐。33.条款19-28中任一项的用途，其中所述另外的抗癌剂为贝伐单抗(阿瓦斯丁)，或其药学上可接受的盐。34.条款19-28中任一项的用途，其中所述另外的抗癌剂为托泊替康，或其药学上可接受的盐。35.条款19-28中任一项的用途，其中所述另外的抗癌剂为多西紫杉醇，或其药学上可接受的盐。36.条款19-28中任一项的用途，其中所述另外的抗癌剂为紫杉醇，或其药学上可接受的盐。37.条款19-28中任一项的用途，其中所述另外的抗癌剂为卡铂，或其药学上可接受的盐。38.条款19-28中任一项的用途，其中所述另外的抗癌剂为甲磺酸艾日布林。本发明的数个说明性的实施方案通过下列条款阐述：一种下式化合物和相关化合物，及其药学上可接受的盐：EC1456C110H165N23O45S3准确质量：2624.05分子量：2625.81一种药物组合物，其包含前述条款的化合物，组合以一种或多种载体、稀释剂或赋形剂、或其组合。一种单位剂量或单位剂型组合物，其包含治疗上有效量的前述条款中任一项的化合物，任选组合以一种或多种载体、稀释剂或赋形剂、或其组合。一种用于在宿主动物中治疗癌症的组合物，所述组合物包含治疗上有效量的前述条款中任一项的化合物；或者一种药物组合物，其包含治疗上有效量的前述条款中任一项的化合物，任选进一步包含一种或多种载体、稀释剂或赋形剂、或其组合。一种用于在宿主动物中治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：给予所述宿主动物一种组合物，其包含治疗上有效量的前述条款中任一项的化合物；或者一种药物组合物，其包含前述条款中任一项的化合物，任选进一步包含一种或多种载体、稀释剂或赋形剂、或其组合。前述条款中任一项的化合物在制备用于在宿主动物中治疗癌症的药剂的用途，所述化合物任选组合以一种或多种载体、稀释剂或赋形剂、或其组合。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为耐药性癌症。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为耐长春药属癌症（vinceresistantcancer），例如耐长春碱和/或耐去乙酰长春碱单酰肼癌症。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为耐铂癌症。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为耐顺铂癌症。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为耐紫杉酚家族癌症。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为耐紫杉醇癌症。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为卵巢癌。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为耐药性卵巢癌。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为耐顺铂卵巢癌。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为耐铂卵巢癌，例如NCI/ADR-RES或NCI/ADR-RES相关的卵巢癌。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为耐铂卵巢癌，例如IGROVCDDP或IGROVCDDP相关的卵巢癌。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为乳腺癌。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为耐药性乳腺癌。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为三阴性乳腺癌，例如MDA-MB-231或MDA-MB-231相关的乳腺癌。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为非小细胞肺癌。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述癌症为肝细胞癌瘤或肝细胞癌。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其进一步包括给予宿主动物另外的抗癌剂的步骤，其中以治疗上有效的量给予所述组合物与所述另外的抗癌剂的组合。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其进一步包括给予宿主动物一种或多种另外的抗癌剂的步骤，其中以治疗上有效的量给予所述组合物与所述一种或多种另外的抗癌剂的组合。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述给予步骤包括以另外的亚适治疗剂量给予所述组合物。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述给予步骤包括以另外的较小毒性剂量给予所述组合物。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述给予步骤包括以另外的亚适治疗剂量给予所述另外的抗癌剂。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述给予步骤包括以另外的亚适治疗剂量给予所述一种或多种另外的抗癌剂。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述给予步骤包括以另外的较小毒性剂量给予所述另外的抗癌剂。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述给予步骤包括以另外的较小毒性剂量给予所述一种或多种另外的抗癌剂。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述另外的抗癌剂具有选自以下的作用方式：插入或抑制大分子生物合成、抑制拓扑异构酶II的进程、使DNA超螺旋松弛、抑制转录、使拓扑异构酶II复合体稳定、防止DNA双螺旋再密封、抑制DNA复制、诱导组蛋白移出染色质；交联DNA、引发DNA修复机制，其继而激活凋亡；抑制血管发生；抑制拓扑异构酶-1；结合微管和/或使之稳定、防止导致凋亡的生理性微管解聚/分解、使导致凋亡开启的癌蛋白bcl-2磷酸化、阻抑微管动态装配与分解；抑制纺锤体功能，阻抑微管动力学，阻抑微管从中心体脱离；以及干扰DNA修复，及其组合。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述另外的抗癌剂具有以下作用方式：插入或抑制大分子生物合成、抑制拓扑异构酶II的进程、使DNA超螺旋松弛、抑制转录、使拓扑异构酶II复合体稳定、防止DNA双螺旋再密封、抑制DNA复制、诱导组蛋白移出染色质；交联DNA、引发DNA修复机制，其继而激活凋亡；抑制血管发生；抑制拓扑异构酶-1；结合微管和/或使之稳定、防止导致凋亡的生理性微管解聚/分解、使导致凋亡开启的癌蛋白bcl-2磷酸化、阻抑微管动态装配与分解；抑制纺锤体功能，阻抑微管动力学，阻抑微管从中心体脱离；以及干扰DNA修复，及其组合。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述一种或多种另外的抗癌剂具有以下作用方式：插入或抑制大分子生物合成、抑制拓扑异构酶II的进程、使DNA超螺旋松弛、抑制转录、使拓扑异构酶II复合体稳定、防止DNA双螺旋再密封、抑制DNA复制、诱导组蛋白移出染色质；交联DNA、引发DNA修复机制，其继而激活凋亡；抑制血管发生；抑制拓扑异构酶-1；结合微管和/或使之稳定、防止导致凋亡的生理性微管解聚/分解、使导致凋亡开启的癌蛋白bcl-2磷酸化、阻抑微管动态装配与分解；抑制纺锤体功能，阻抑微管动力学，阻抑微管从中心体脱离；以及干扰DNA修复。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述一种或多种另外的抗癌剂具有以下作用方式：插入或抑制大分子生物合成、抑制拓扑异构酶II的进程、使DNA超螺旋松弛、抑制转录、使拓扑异构酶II复合体稳定、防止DNA双螺旋再密封、抑制DNA复制、诱导组蛋白移出染色质；交联DNA、引发DNA修复机制，其继而激活凋亡；抑制血管发生；抑制拓扑异构酶-1；结合微管和/或使之稳定、防止导致凋亡的生理性微管解聚/分解、使导致凋亡开启的癌蛋白bcl-2磷酸化、阻抑微管动态装配与分解；抑制纺锤体功能，阻抑微管动力学，阻抑微管从中心体脱离；以及干扰DNA修复，及其组合。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述另外的抗癌剂选自多柔比星(DOXIL)、顺铂、贝伐单抗(阿瓦斯丁)、托泊替康、多西紫杉醇、紫杉醇和卡铂，及上述抗癌剂的药学上可接受的盐，及其组合。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述另外的抗癌剂为多柔比星(DOXIL)，或其药学上可接受的盐。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述另外的抗癌剂为顺铂，或其药学上可接受的盐。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述另外的抗癌剂为贝伐单抗(阿瓦斯丁)，或其药学上可接受的盐。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述另外的抗癌剂为托泊替康，或其药学上可接受的盐。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述另外的抗癌剂为多西紫杉醇，或其药学上可接受的盐。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述另外的抗癌剂为紫杉醇，或其药学上可接受的盐。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述另外的抗癌剂为卡铂，或其药学上可接受的盐。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述一种或多种另外的抗癌剂为以下的一种或多种：多柔比星(DOXIL)、顺铂、贝伐单抗(阿瓦斯丁)、托泊替康、多西紫杉醇、紫杉醇和卡铂，及上述抗癌剂的药学上可接受的盐，及其组合。前述条款中任一项的方法或组合物或单位剂量或用途，其中所述一种或多种另外的抗癌剂为紫杉醇与卡铂的组合，或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，本文所述的化合物可通过与相应的细胞表面受体结合而被内摄到靶定的病原细胞中。具体而言，维生素受体(例如叶酸受体)选择性和/或特异性结合维生素，且内摄可例如通过受体介导的胞吞来发生。一旦被内摄，包含在本文所述化合物中的可释放接头便允许将药物负载递送到靶细胞的内部，从而减少对于非靶组织的毒性，这是因为所述可释放接头在本文所述化合物递送至靶细胞之前基本上或者完全保持完整。因此，本文所述的化合物通过将药物递送至胞内生化过程来在胞内起作用，减少了暴露给宿主动物的健康细胞和组织的未缀合药物的量。在另一个方案中，含有叶酸受体结合配体的本文所述的化合物，与不含至少一个非天然氨基酸的对应化合物相比，表现出对叶酸受体更大的特异性。在另一个实施方案中，含有叶酸受体结合配体的本文所述的化合物显示对叶酸受体表达细胞的高活性。在另一个实施方案中，本文所述的化合物表现出针对病原细胞的有力的体外和体内活性，所述病原细胞例如KB细胞，包括耐顺铂KB细胞、NCl/ADR-RES-Cl2细胞、IGROV1细胞和MDA-MB-231细胞。在另一个实施方案中，含有叶酸受体结合配体的本文所述的化合物，未显示与叶酸受体阴性细胞的显著结合。在另一个实施方案中，含有叶酸受体结合配体的本文所述的化合物，优先或唯一地经由高亲和力叶酸受体进入细胞，所述受体例如叶酸受体alpha(α)和/或叶酸受体beta(β)。在另一个实施方案中，本文所述的化合物一般基本上不会经由被动运输进入细胞，例如经由还原性叶酸受体(reducedfolatecarrier,RFC)。在另一个实施方案中，与不含至少一种非天然氨基酸的化合物相比，本文所述的化合物表现出更低的宿主动物毒性。在另一个实施方案中，与不含至少一种非天然氨基酸的化合物相比，本文所述的化合物表现出更高的血清稳定性。在另一个实施方案中，与不含至少一种非天然氨基酸的化合物相比，本文所述的化合物被迅速清除。在另一个实施方案中，与肝清除相比，本文所述的化合物主要经由肾清除来清除。本文所述的化合物可用于人类临床医学和兽医应用二者。因此，含有所述病原细胞群体并用本文所述化合物治疗的宿主动物可以是人，或者在兽医应用的情况下，可以是实验室动物、农业动物、家畜或野生动物。本发明可应用于宿主动物，包括但不限于人、实验室动物例如啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠等)、兔、猴、黑猩猩，家畜例如狗、猫和兔，农业动物例如奶牛、马、猪、绵羊、山羊，和圈养的野生动物，例如熊、熊猫、狮、虎、豹、象、斑马、长颈鹿、大猩猩、海豚和鲸。癌细胞群体可自然产生或通过诸如存在于宿主动物生殖系中的突变或体细胞突变等过程产生，或者其可以是化学、病毒或辐射诱发的。本发明可用于治疗诸如癌、肉瘤、淋巴瘤、何杰金病、黑素瘤、间皮瘤、Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、白血病和骨髓瘤等癌症。所述癌细胞群体可包括但不限于口腔癌、甲状腺癌、内分泌癌、皮肤癌、胃癌、食管癌、喉癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、骨癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、睾丸癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、子宫内膜癌、肝癌和肺癌(包括非小细胞肺癌)。此外，所述另外的抗癌剂可以是这样的抗癌剂，其为细胞毒性的，增强肿瘤渗透性，抑制肿瘤细胞增殖，促进凋亡，降低靶细胞中的抗凋亡活性，用于治疗由传染剂导致的疾病，增强涉及病原细胞的内源免疫反应，或者用于治疗由任何类型的病原细胞导致的疾病状态。另外的说明性的抗癌剂包括肾上腺类皮质激素和皮质激素、烷化剂、抗雄激素、抗雌激素、雄激素、阿克拉霉素(Aclamycin)及阿克拉霉素衍生物、雌激素、抗代谢物(例如阿糖胞苷（cytosinearabinoside）、嘌呤类似物、嘧啶类似物和甲氨蝶呤)、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂及其它铂化合物、他莫昔芬、紫杉酚、紫杉醇、紫杉醇衍生物、泰索帝®、环磷酰胺、道诺霉素、根霉素、T2毒素、植物生物碱、泼尼松、羟基脲、替尼泊苷、丝裂霉素、圆皮海绵内酯（discodermolide）、微管抑制剂、埃博霉素、tubulysins、环丙基苯并[e]吲哚酮、开环环丙基苯并[e]吲哚酮、O-Ac-开环环丙基苯并[e]吲哚酮、博来霉素及任何其它抗生素、氮芥、亚硝基脲、长春花生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨及其类似物和衍生物，如去乙酰基长春碱单酰肼(DAVLBH))、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、别秋水仙碱、硫代秋水仙碱、三苯甲基半胱氨酸、软海绵素B、多拉司他汀(例如多拉司他汀10)、鹅膏蕈碱(例如α-鹅膏蕈碱)、喜树碱、伊立替康以及其它的喜树碱衍生物、格尔德霉素及格尔德霉素衍生物、雌莫司汀、诺考达唑、MAP4、秋水仙酰胺（cocemid）、炎性物质及促炎物质、肽及肽模拟物信号转导抑制剂、及任何其它药物或毒素。可包含在本文所述缀合物中的其它药物包括雷帕霉素(例如西罗莫司或依维莫司)、青霉素、头孢菌素、万古霉素、红霉素、氯林肯霉素、利福平、氯霉素、氨基糖苷类抗生素、庆大霉素、两性霉素B、阿昔洛韦、曲氟尿苷、更昔洛韦、齐多夫定、金刚烷胺、利巴韦林及任何其它的抗微生物化合物。此外，所述一种或多种另外的抗癌剂可以是这样的抗癌剂，其为细胞毒性的，增强肿瘤渗透性，抑制肿瘤细胞增殖，促进凋亡，降低靶细胞中的抗凋亡活性，用于治疗由传染剂导致的疾病，增强涉及病原细胞的内源免疫反应，或者用于治疗由任何类型的病原细胞导致的疾病状态。另外的说明性的抗癌剂包括描述于前述文段中的抗癌剂。此外，所述至少一种另外的抗癌剂可以是这样的抗癌剂，其为细胞毒性的，增强肿瘤渗透性，抑制肿瘤细胞增殖，促进凋亡，降低靶细胞中的抗凋亡活性，用于治疗由传染剂导致的疾病，增强涉及病原细胞的内源免疫反应，或者用于治疗由任何类型的病原细胞导致的疾病状态。另外的说明性的抗癌剂包括肾上腺类皮质激素和皮质激素、烷化剂、抗雄激素、抗雌激素、雄激素、阿克拉霉素及阿克拉霉素衍生物、雌激素、抗代谢物(例如阿糖胞苷、嘌呤类似物、嘧啶类似物和甲氨蝶呤)、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂及其它铂化合物、他莫昔芬、紫杉酚、紫杉醇、紫杉醇衍生物、泰索帝®、环磷酰胺、道诺霉素、根霉素、T2毒素、植物生物碱、泼尼松、羟基脲、替尼泊苷、丝裂霉素、圆皮海绵内酯、微管抑制剂、埃博霉素、tubulysins、环丙基苯并[e]吲哚酮、开环环丙基苯并[e]吲哚酮、O-Ac-开环环丙基苯并[e]吲哚酮、博来霉素及任何其它抗生素、氮芥、亚硝基脲、长春花生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨及其类似物和衍生物，如去乙酰基长春碱单酰肼(DAVLBH))、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、别秋水仙碱、硫代秋水仙碱、三苯甲基半胱氨酸、软海绵素B、多拉司他汀(例如多拉司他汀10)、鹅膏蕈碱(例如α-鹅膏蕈碱)、喜树碱、伊立替康以及其它的喜树碱衍生物、格尔德霉素及格尔德霉素衍生物、雌莫司汀、诺考达唑、MAP4、秋水仙酰胺、炎性物质及促炎物质、肽及肽模拟物信号转导抑制剂、及任何其它药物或毒素。可包含在本文所述缀合物中的其它药物包括雷帕霉素(例如西罗莫司或依维莫司)、青霉素、头孢菌素、万古霉素、红霉素、氯林肯霉素、利福平、氯霉素、氨基糖苷类抗生素、庆大霉素、两性霉素B、阿昔洛韦、曲氟尿苷、更昔洛韦、齐多夫定、金刚烷胺、利巴韦林及任何其它的抗微生物化合物、及其组合。在另一个实施方案中，所述抗癌剂选自克利素(crytophycins)、硼替佐米(bortezomib)、硫代硼替佐米、tubulysins、氨基蝶呤、雷帕霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、多柔比星、柔红霉素、依维莫司、α-鹅膏毒素(amanatin)、疣孢菌素、膜海鞘素B、格尔德霉素、purvalanolA、伊斯平斯(ispinesib)、布地奈德、达沙替尼、埃博霉素、美登素以及酪氨酸激酶抑制剂，包括前述抗癌剂的类似物及衍生物。在另一个实施方案中，所述一种或多种抗癌剂选自以下的一种或多种：克利素、硼替佐米、硫代硼替佐米、tubulysins、氨基蝶呤、雷帕霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、多柔比星、柔红霉素、依维莫司、α-鹅膏毒素、疣孢菌素、膜海鞘素B、甲磺酸艾日布林(Halaven®)、格尔德霉素、purvalanolA、伊斯平斯、布地奈德、达沙替尼、埃博霉素、美登素以及酪氨酸激酶抑制剂，及其组合。本文所述的药物递送缀合化合物可与任何其它已知的药物一起以另外的联合治疗给予，而不论所述另外的药物是否为靶向的。说明性的另外的药物包括但不限于肽、寡肽、逆向逆型寡肽(retro-inversooligopeptides)、蛋白质、其中至少一个非肽键合替换肽键合的蛋白质类似物、脱辅蛋白质、糖蛋白、酶、辅酶、酶抑制剂、氨基酸及其衍生物、受体及其它膜蛋白、抗原及其抗体、半抗原及其抗体、激素、脂质、磷脂、脂质体、毒素、抗生素、镇痛药、支气管扩张剂、β-阻断剂、抗微生物剂、抗高血压剂、心血管药剂(包括抗心律不齐药、强心苷、抗心绞痛药、血管舒张药)、中枢神经系统药剂(包括兴奋剂、向精神药物、抗狂躁药和镇静剂)、抗病毒剂、抗组胺药、癌症药物(包括化学治疗剂、利眠宁、抗抑郁药、H-2拮抗剂、抗惊厥药、止恶心药、前列腺素及前列腺素类似物、肌肉松弛药、抗炎物质、兴奋剂、解充血药、止吐药、利尿剂、解痉药、止喘药、抗帕金森药、祛痰剂、镇咳剂、粘液溶解剂、矿物及营养添加剂。在另一个实施方案中，可将包含治疗因子的至少一种另外的组合物与上文详述方法组合给予宿主或作为上文详述方法的辅剂给予宿主，以增强药物递送缀合物介导的病原细胞群体的清除，或者可给予多于一种另外的治疗因子。所述治疗因子可选自：能够刺激内源免疫反应的化合物、化学治疗剂、或者能够补充所给予的药物递送缀合物的功效的另一种治疗因子。本发明的方法可通过除上述缀合物之外再给予宿主能够刺激内源免疫反应的化合物或组合物(例如细胞因子)来进行，所述化合物或组合物包括但不限于细胞因子或免疫细胞生长因子，例如白介素1-18、干细胞因子、碱性FGF、EGF、G-CSF、GM-CSF、FLK-2配体、HILDA、MIP-1α、TGF-α、TGF-β、M-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、可溶性CD23、LIF、及其组合。可使用这些因子的治疗上有效的组合。在一个实施方案中，例如治疗上有效量的IL-2(例如在每日多剂量方案中的量的范围从约0.1MIU/m2/剂/天至约15MIU/m2/剂/天)，和IFN-α(例如在每日多剂量方案中的量的范围从约0.1MIU/m2/剂/天至约7.5MIU/m2/剂/天)，可连同所述药物递送缀合物一起使用，以在具有病原细胞的宿主动物中消除、减少或中和病原细胞(MIU=百万国际单位；m2=一般人类的近似体表面积)。在另一个实施方案中，以上述对于白介素和干扰素而言治疗上有效的量使用IL-12和IFN-α，以及在又另一个实施方案中，以上述对于白介素和干扰素而言治疗上有效的量使用IL-15和IFN-α。在一个备选的实施方案中，以上述治疗上有效的量组合使用IL-2、IFN-α或IFN-γ和GM-CSF。本发明亦考虑使用任何其它有效的细胞因子的组合，包括其它白介素和干扰素及集落刺激因子的组合。要理解的是，所述接头在某些条件下可以是中性的或可电离的，所述条件例如在体内遇到的生理条件。对于可电离接头，在选定条件下，所述接头可去质子化以形成阴离子，或者进行质子化以形成阳离子。要理解的是，可发生多于一个去质子化或质子化事件。此外，要理解的是，相同的接头可去质子化和质子化以形成内盐或两性离子化合物。本文所用的术语“任选取代的”包括在任选取代的自由基上用其它官能团取代氢原子。所述其它的官能团说明性地包括但不限于氨基、羟基、卤素、巯基、烷基、卤代烷基、杂烷基、芳基、芳基烷基、芳基杂烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基杂烷基、硝基、磺酸及其衍生物、羧酸及其衍生物等。说明的是，任何的氨基、羟基、巯基、烷基、卤代烷基、杂烷基、芳基、芳基烷基、芳基杂烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基杂烷基和/或磺酸均为任选取代的。本文所用的术语“任选取代的芳基”和“任选取代的杂芳基”包括在任选取代的芳基或杂芳基上用其它官能团取代氢原子。所述其它官能团说明性地包括但不限于氨基、羟基、卤素、巯基、烷基、卤代烷基、杂烷基、芳基、芳基烷基、芳基杂烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基杂烷基、硝基、磺酸及其衍生物、羧酸及其衍生物等。说明的是，任何的氨基、羟基、巯基、烷基、卤代烷基、杂烷基、芳基、芳基烷基、芳基杂烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基杂烷基和/或磺酸均为任选取代的。说明性的取代基包括但不限于自由基-(CH2)xZX，其中x为0-6的整数，且ZX选自卤素、羟基、烷酰氧基(包括C1-C6烷酰氧基)、任选取代的芳酰氧基、烷基(包括C1-C6烷基)、烷氧基(包括C1-C6烷氧基)、环烷基(包括C3-C8环烷基)、环烷氧基(包括C3-C8环烷氧基)、烯基(包括C2-C6烯基)、炔基(包括C2-C6炔基)、卤代烷基(包括C1-C6卤代烷基)、卤代烷氧基(包括C1-C6卤代烷氧基)、卤代环烷基(包括C3-C8卤代环烷基)、卤代环烷氧基(包括C3-C8卤代环烷氧基)、氨基、C1-C6烷基氨基、(C1-C6烷基)(C1-C6烷基)氨基、烷基羰基氨基、N-(C1-C6烷基)烷基羰基氨基、氨基烷基、C1-C6烷基氨基烷基、(C1-C6烷基)(C1-C6烷基)氨基烷基、烷基羰基氨基烷基、N-(C1-C6烷基)烷基羰基氨基烷基、氰基和硝基；或者ZX选自-CO2R4和-CONR5R6，其中R4、R5和R6在每次出现时各自独立地选自氢、C1-C6烷基、芳基-C1-C6烷基和杂芳基-C1-C6烷基。本文所用的涉及例如细胞表面受体结合和/或靶向配体、和/或独立选择的药物的术语“自由基”，是指这样的细胞表面受体结合和/或靶向配体、和/或独立选择的药物，如在本文中所述，其中一个或多个原子或基团(例如氢原子，或者杂原子上的烷基基团等)被去除以提供用于与多价接头L缀合的自由基。所述配体自由基和药物自由基在本文中亦可分别指配体类似物和药物类似物。本文所用的术语“离去基团”是指这样的活性官能团，其在与之连接的原子上产生亲电子位点，以使亲核体可添加到所述原子的亲电子位点上。说明性的离去基团包括但不限于卤素、任选取代酚、酰氧基、磺酰氧基等。要理解的是，所述离去基团可在烷基、芳基等上。所述离去基团在本文中亦可指活化基团，例如当所述离去基团存在于芳基上时。此外，常见的肽、酰胺以及酯偶联剂，例如但不限于PyBop、BOP-Cl、BOP、五氟苯酚、氯甲酸异丁酯等，在羰基上形成包含离去基团(如本文所定义)的多种中间体。要理解的是，在本文所公开的每个实例中，用于任何变量的整数范围的叙述，是描述用于所述变量的所述范围、所述范围中的每个独立成员以及每个可能的子范围。例如，n为0-8的整数的叙述，是描述0、1、2、3、4、5、6、7和8的范围、每个值和可选值，例如n为0，或者n为1，或者n为2，等等。此外，n为0-8的整数的叙述，亦是描述每一个子范围，其各自可用于另一个实施方案的基础，例如n为1-8、1-7、1-6、2-8、2-7、1-3、2-4等的整数。本文所用的术语“组合物”一般是指包含规定量的规定成分的任何产物，以及从规定量的规定成分的组合直接或间接得到的任何产物。要理解的是，本文所述的组合物可制备自本文所述的分离的化合物，或者制备自本文所述化合物的盐、溶液、水合物、溶剂化物及其它形式。要理解的是，某些官能团，例如羟基、氨基及类似基团，与水和/或各种溶剂形成复合物和/或配位化合物，呈该化合物的多种自然形态。亦要理解的是，所述组合物亦可制备自本文所述化合物的各种无定型的、非无定型的、部分结晶的、结晶的和/或其它形态形式。亦要理解的是，所述组合物可制备自本文所述化合物的各种水合物和/或溶剂化物。因此，描述本文所述化合物的所述药物组合物，要理解为包含本文所述化合物的各种形态形式和/或溶剂化物或水合物形式的每个或任何组合。此外，要理解的是，所述组合物可自本文所述化合物的各种共结晶（co-crystals）制备。说明的是，组合物可包含一种或多种载体、稀释剂和/或赋形剂。本文所述化合物或包含其的组合物，可以适于本文所述方法的任何常规的剂型以治疗上有效的量配制。本文所述的化合物或包含其的组合物，其包括所述制剂，可通过用于本文所述方法的多种常规途径给予，以及利用已知程序以多种剂型给予(一般参见Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明顿：药学科学及实践)，(第21版，2005))。本文所用的术语“治疗上有效的量”，是指组织系统、动物或人中引发研究者、兽医、医师或其它临床医生正寻求的生物或医药反应的活性化合物或药剂的量，其包括缓解正在治疗的疾病或病症的症状。在一方面，所述治疗上有效的量为这样的量，是可以适用于任何药物治疗的以合理的收益/风险比率治疗或缓解疾病或者疾病的症状的量。然而，要理解的是，本文所述化合物和组合物的总体日常用法，可通过主治医师在可靠医学判断的范围内决定。用于任何具体患者的具体的治疗上有效的剂量水平，会取决于多个因素，其包括正在治疗的病症及所述病症的严重性；所使用的具体化合物的活性；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；给予时间、给予途径以及所使用的具体化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所使用的具体化合物组合使用或偶然一起使用的药物；以及普通技术的研究者、兽医、医师或其它临床医生众所周知的类似因素。本文所用的术语“给予”包括将本文所述化合物和组合物引入患者的所有方式，包括但不限于口服(po)、静脉内(iv)、肌内(im)、皮下(sc)、透皮、吸入、经颊、经眼、舌下、阴道、直肠等。本文所述化合物和组合物可以包含常规无毒的药学上可接受的载体、辅剂和溶媒的制剂和/或单位剂型给予。用于口服给予的说明性的形式包括片剂、胶囊剂、酏剂、糖浆剂等。用于胃肠外给予的说明性的途径包括静脉内、动脉内、腹膜内、硬膜外、尿道内、胸骨内、肌内和皮下，以及任何其它的本领域公认的胃肠外给予途径。根据本文所述的疾病、给予途径和/或是局部给予还是全身给予所述化合物和/或组合物，在本文中考虑广泛范围的容许剂量，其包括落入约1µg/kg-约1g/kg的范围内的剂量。所述剂量可以是单次的或分次的，以及可根据多种方案给予，其包括q.d.、b.i.d.、t.i.d.，或者甚至每两天一次、每周一次、每月一次、每季度一次，等等。在各个所述情况下，要理解的是，本文所述的治疗上有效的量对应于给予情况，或者备选地对应于总的日剂量、周剂量、月剂量或季度剂量，如通过给药方案所确定。本文所述的化合物可使用常规过程制备，其包括描述于国际专利公布号WO2009/002993、WO2004/069159、WO2007/022494和WO2006/012527以及美国专利申请号13/837539中的那些。上述专利各自的公开内容通过引用以其整体结合到本文中。本文引用的各出版物通过引用结合到本文中。下列实施例进一步阐述本发明的具体实施方案；然而，下列说明性的实施例不应以任何方式解释为限制本发明。实施例化合物实施例本文所述的化合物可使用本文所述的过程和合成以及使用一般的有机合成方法来制备。具体而言，用于制备所述化合物的方法描述于美国专利申请公布号2005/0002942，其公开内容通过引用结合到本文中。实施例.叶酸-肽的一般形成。使用标准方法通过聚合物支持的序贯法制备含叶酸的肽基片段Pte-Glu-(AA)n-NH(CHR2)CO2H(3)，例如在酸敏感Fmoc-AA-Wang树脂(1)上的Fmoc策略，如在以下方案中所示：方案(a)20%哌啶/DMF；(b)Fmoc-AA-OH、PyBop、DIPEA、DMF；(c)Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH、PyBop、DIPEA、DMF；(d)1.N10(TFA)-Pte-OH；PyBop、DIPEA、DMSO；(e)TFAA、(CH2SH)2、i-Pr3SiH；(f)NH4OH，pH10.3。要理解的是，使用适当的起始材料可将非天然氨基酸包含在上述过程中。在本文所述过程的这个说明性的实施方案中，R1为Fmoc，R2为需要适当保护的氨基酸侧链，以及DIPEA为二异丙基乙胺。使用了标准偶联程序，例如PyBOP以及本文所述或本领域已知的其它程序，其中所述偶联剂说明性地用作活化试剂以确保有效偶联。在各偶联步骤之后，在标准条件下，例如在用哌啶、氟化四丁胺(TBAF)等处理的情况下，去除Fmoc保护基团。使用了适当保护的氨基酸结构单元，例如Fmoc-Glu-OtBu、Fmoc-D-Glu-OtBu、N10-TFA-Pte-OH等，如描述于方案中，以及在步骤(b)中以Fmoc-AA-OH表示。因此，AA是指适当保护的任何氨基酸起始材料。要理解的是，本文所用的术语氨基酸，意图指具有被一个或多个碳隔开的胺官能团和羧酸官能团二者的任何试剂，并且包括天然存在的α和β氨基酸，以及这些氨基酸的氨基酸衍生物和类似物。具体而言，具有被保护侧链的氨基酸，例如被保护的丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸等，亦可用于本文所述的叶酸-肽合成。另外，γ、δ或更长的同系氨基酸亦可包含在内，作为本文所述的叶酸-肽合成的起始材料。另外，具有同系侧链或备选分支结构的氨基酸类似物，例如正亮氨酸、异缬氨酸、β-甲基苏氨酸、β-甲基半胱氨酸、β,β-二甲基半胱氨酸等，亦可包含在内，作为本文所述叶酸-肽合成的起始材料。将涉及Fmoc-AA-OH的偶联序列(步骤(a)&(b))进行“n”次以制备固体支持肽(2)，其中n为整数且可等于0至约100。在最终偶联步骤之后，去除剩余的Fmoc基团(步骤(a))，并且将所述肽序贯地与谷氨酸衍生物偶联(步骤(c))、脱保护及与TFA保护的蝶酸偶联(步骤(d))。随后，通过用三氟乙酸、乙二硫醇和三异丙基硅烷处理将肽从聚合支持物上切下(步骤(e))。这些反应条件导致同时去除t-Bu、t-Boc和Trt保护基团，所述基团可形成适当保护的氨基酸侧链的一部分。TFA保护基团通过用碱处理去除(步骤(f))以提供所述含叶酸的肽基片段(3)。EC119LCMS[ESI[M+H]+：1046；局部1HNMR(D2O，300MHz)：δ8.68(s，1H，FAH-7)，7.57(d，2H，J=8.4Hz，FAH-12&16)，6.67(d，2H，J=9Hz，FAH-13&15)，4.40-4.75(一系列m，5H)，4.35(m，2H)，4.16(m，1H)，3.02(m，2H)，2.55-2.95(一系列m，8H)，2.42(m，2H)，2.00-2.30(m，2H)，1.55-1.90(m，2H)，1.48(m，2H)ppm。实施例.tubulysin酰肼的制备。通过制备EC0347(TubB-H)来阐述。于-15℃，经由注射器先后将N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，6.1μL)和氯甲酸异丁酯(3.0μL)加入tubulysinB(0.15mg)的无水EtOAc(2.0mL)溶液中。于-15℃在氩气下搅拌45分钟之后，将反应混合物冷却至-20℃，并向其中加入无水肼(5.0μL)。于-20℃在氩气下将所述反应混合物搅拌3小时，用1.0mM磷酸钠缓冲液(pH7.0，1.0mL)淬灭，并注入制备型HPLC中用于纯化。柱：WatersXTerraPrepMSC1810µm，19×250mm；流动相A：1.0mM磷酸钠缓冲液，pH7.0；流动相B：乙腈；方法：在20分钟内10%B-80%B，流速=25mL/min。收集来自15.14-15.54分钟的流分并冻干，产生呈白色固体的EC0347(2.7mg)。通过适当选择tubulysin起始化合物，上述方法同样适用于制备其它tubulysin酰肼。实施例.偶联试剂EC0311的合成。于0℃，向HOBt-OCO2-(CH2)2-SS-2-吡啶HCl(685mg，91%)的无水DCM(5.0mL)混悬液中加入DIPEA(0.60mL)，在氩气下搅拌2分钟，并向其中加入无水肼(0.10mL)。在氩气下于0℃将所述反应混合物搅拌10分钟并于室温搅拌再30分钟，过滤，并通过快速色谱(硅胶，含2%MeOH的DCM)纯化滤液，得到呈澄清稠油的EC0311(371mg)，放置后凝固。实施例.二硫化tubulysin的制备(分步过程)。对EC0312进行阐述。于-15℃，通过注射器先后将DIPEA(36μL)和氯甲酸异丁酯(13μL)加入tubulysinB(82mg)的无水EtOAc(2.0mL)溶液中。于-15℃在氩气下搅拌45分钟之后，向所述反应混合物中加入EC0311的无水EtOAc(1.0mL)溶液。在氩气下于-15℃将所得溶液搅拌15分钟并于室温再搅拌45分钟，浓缩，并通过快速色谱(硅胶，含2-8%MeOH的DCM)纯化残留物，得到呈白色固体的EC0312(98mg)。通过适当选择tubulysin起始化合物，上述方法同样适用于制备其它tubulysin衍生物。实施例.TubulysinB吡啶基二硫化物。类似地，TubulysinB吡啶基二硫化物如本文所述制备。实施例.EC1577MS(ESI，[M+H]+)=1681。局部1HNMR(D2O)：8.96(s)，7.65(d)，6.81(d)，4.66(s)，4.40-4.15(m)，3.90-3.54(m)，3.50-3.18(m)，2.97-2.90(m)，2.51-1.80(m)。实施例.含二硫化物的Tubulysin缀合物的一般合成。用某些天然存在的tubulysin的吡啶基二硫化物衍生物进行阐述，其中R1为H或OH，R10为烷基或烯基。将含巯基的结合的配体-接头中间体置于去离子水中(约20mg/mL，临用前充氩气10分钟)并通过饱和NaHCO3(临用前充氩气10分钟)将所述混悬液的pH调节至约6.9(当pH增加时，混悬液可变成溶液)。根据需要向所述溶液中加入另外的去离子水(约20-25%)，并立即向所述水溶液中加入EC0312的THF溶液(约20mg/mL)。所述反应混合物迅速变均匀。在氩气下搅拌例如45分钟之后，用2.0mM磷酸钠缓冲液(pH7.0，约150体积百分数)稀释所述反应混合物并通过抽真空去除THF。将所得混悬液过滤并可通过制备型HPLC纯化滤液(如本文所述)。将流分冻干以分离缀合物。通过适当选择tubulysin起始化合物，上述方法同样适用于制备其它tubulysin缀合物。实施例.EC1456及其制备描述于WO2014/062697中第76-91页，所述页面通过引用结合到本文中。EC1456根据以下过程制备。实施例.EC1426根据以下过程制备。实施例.另外的tubulsyin及tubulysin中间体可根据描述于WO2012/019123、WO2009/055562、PCT国际申请系列号US2013/034672和美国临时申请系列号61/793082中的过程制备，所述申请案各自的公开内容通过引用以其整体结合到本文中。实施例.EC1454根据以下过程制备。N10-TFA保护的EC1454的固相合成以结合有三苯甲基保护的D-半胱氨酸的树脂开始。将所述树脂用二甲基甲酰胺(DMF)悬浮并用DMF洗涤两次。向反应混合物中加入EC0475(葡糖胺修饰的L-谷氨酸)、六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基磷鎓(PyBOP)和二异丙基乙胺(DIPEA)。至少1小时之后，进行Kaiser检验以确保偶联完成。用DMF将所述树脂洗涤三次，用IPA洗涤三次并用DMF洗涤三次。用含哌啶的DMF将所述树脂缓慢洗涤三次，用DMF洗涤三次并用IPA洗涤三次。进行Kaiser检验以确认脱保护。用DMF将所述树脂洗涤三次并遵循相同过程偶联序列中的下一个氨基酸。单体以下列顺序偶联：1)EC0475，2)Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH，3)EC0475，4)Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH，5)EC0475，6)Fmoc-D-Glu-OtBu和7)N10-TFA-Pte-OH。一旦最终偶联完成，便用甲醇将所述树脂洗涤三次，并通过在室温下使氩气通过所述树脂来干燥。将干燥的树脂用TFA、水、乙二硫醇和三异丙基硅烷的混合物悬浮。1小时之后，通过过滤去除树脂并用TFA洗涤。通过添加到冷的乙醚中将产物沉淀，过滤并用乙醚（ether）洗涤。于室温将所述固体在真空下干燥并储存在冰箱中。将N10-TFAEC1454溶于充氩水(argonspargedwater)中。加入碳酸钠(1M在充氩水溶液中)以达到pH9.4-10.1。将反应混合物搅拌至少20分钟。一旦反应完成，如通过LC所确定，便通过用2MHCl将pH调节至1.9-2.3进行淬灭。使用乙腈和pH5乙酸铵缓冲液作为洗脱剂，通过C18柱色谱纯化产物。收集流分并通过HPLC检验纯度。用旋转蒸发仪浓缩合并的产物流分并随后冻干，得到呈黄色固体的EC1454。MS(ESI，[M+2H]2+)=840.90，[M+H1]+=1681.3。选择的1H-NMR(DMSO，300MHz)δ(ppm)：8.6(s)，7.6(d)，6.6(d)，4.45(s)，4.35(t)，4.15-4.3(m)，3.3-3.6(m)，3.25(m)，3.0(m)，2.7-2.9(m)，2-2.3(m)，1.6-2(m)。将产物储存于-20℃。实施例.EC1456根据以下过程制备。将EC1428溶于乙腈并加入含EC1454的pH7.4磷酸钠缓冲液的溶液。在加入前后对溶液充氩气。将反应混合物搅拌至少15分钟并随后检验完成情况。使用乙腈和pH7.4磷酸缓冲液作为洗脱剂，通过C18柱色谱纯化所需产物。收集产物流分，检验纯度，合并及通过超滤进行浓缩，得到10-20mg/mLEC1456的水溶液。对终产物溶液取样以用于测定并随后储存于冰箱中。用高分辨率WatersAcquityUPLCXevoGs-SQTOF质谱仪获得EC1456的正电喷射质谱。在用UPLC入口系统分离主要组分之后获得光谱，分辨力（resolvingpower）为约35,000。M+H单同位素峰的准确质量测量为2625.0598，其与式C110H166N23O45S3的离子的理论值2625.0570有1.1ppm误差。同位素分布亦符合所述化学式。EC1456的ES+光谱的质谱特征测得离子解读2626.06MW2624药物的(M+H)+离子的13C同位素1313.54MW2624药物的(M+2H)++离子的13C同位素1150.43(M+2H–326)++片段的13C同位素，符合在叔氮上裂解肽键并失去丁酸部分。876.03MW2624药物的(M+3H)+++离子的13C同位素657.27MW2624药物的(M+4H)++++离子的13C同位素将约30mgEC1456样品溶于665μL的氘化二甲基亚砜和重水的9:1混合物。使用安装了含有宽带和质子观察线圈二者的2通道探针的AgilentDD2型光谱仪，于26℃在500MHz获得1HNMR光谱。在同一条件下用相同仪器在125MHz获得13CNMR光谱。所有光谱均参照2.5ppm(1H)和39.50ppm(13C)处的DMSO溶剂残留信号。使用下图中的原子编号，针对两个NMR光谱(1H和13C)在下表中对所有光谱特征赋值，其中*标志表示用于二硫键的连接。赋值是基于1D和2DNMR实验二者进行，包括使用COSY和TCSY2D实验通过键H-H连接性、使用2DNOESY通过空间H-H接近度、使用1DDEPT实验的碳多重性测量以及使用检测质子的2D实验HSQC和HMBC通过键C-H连接性进行。在1D光谱中的大部分重叠情况下(不同质子或碳在相同的化学位移产生共振)，可在2D光谱中解析，在这些情况下，虽然表格反映了从2D光谱测得的化学位移，但仍总计对联合共振物质（co-reconatingspecies）群组的积分。在1D重叠的一些情况下(例如几乎相同的谷氨酸和葡糖胺亚基)，在排除多个原子编号之间的单共振或多重共振的明确赋值的2D相关光谱中亦有重叠，在这些情况下，在单独的表格行中存在用于化学位移和/或原子编号赋值的多入口。NH和OH质子被D2O氘原子交换并且通常在光谱中缺失，在5-10ppm区域的弱宽峰除外。未在表中列举的光谱中的1H峰，包含3.75ppm处的宽HOD峰和2.50ppm处的DMSO峰。虽然所述HOD峰没有掩蔽任何共振，但因宽基线上升所致，使得对4.2和3.4-3.7ppm处附近共振的积分增大。所述DMSO峰掩蔽了H129的共振，因该原因而未对其积分。未在表中列举的光谱中的13C峰，包含39.50ppm处非常大的DMSO溶剂峰。所述DMSO峰掩蔽了来自C91和C93二者的信号。由于因邻近酰胺基团周围的构象变化导致的广泛增宽，C116峰在13C光谱中观察不到。所有三个化学位移(C91、C93、C116)在检测质子的2D相关光谱中均为可见和测量的。对EC1456的质子NMR赋值对EC1456的碳NMR赋值用装配有Ever-Glomid/farIR源、扩展范围溴化钾(KBr)分束器和氘化硫酸三甘氨酸(DTGS)检测器的Nexus6700®傅里叶变换红外(FT-IR)分光光度计(ThermoNicolet)获得EC1456的IR光谱。将衰减全反射(ATR)配件(Thunderdome™，ThermoSpectra-Tech)与锗(Ge)晶体一起用于数据采集。所述光谱代表以4cm-1的光谱分辨率收集的256个共同添加的扫描。使用干净的Ge晶体获得背景数据集。通过获得这两个数据集相对于彼此的比率来获得Log1/R(R=反射率)光谱。使用聚苯乙烯进行波长校正。对EC1456参比物的红外波段赋值特征吸收(s)(cm-1)官能团1700-1500(m，m)芳族C=C弯曲2950-2850(m或s)烷基C-H延伸约3030(v)芳族C-H延伸3550-3200(宽，s)醇/酚O-H延伸3700-3500(m)酰胺C=O延伸用Perkin-ElmerLambda25UV/Vis光谱仪获得紫外光谱EC1456。于25℃用1cm路径长度小室记录使用0.1MNaOH溶剂的40.7uM处的光谱。366nm、288nm和243nm处的局部最大值分别主要是因为蝶酸、苯甲酰胺/酚和噻唑-酰胺子结构所致，尽管所述分子含有在UV区具有重叠吸收的多个发色团。实施例.描述了下述另外的化合物并根据本文所述的一般过程制备。对比性实施例.EC0923EC0923(C27H29N9O12；MW671.57)方法和实施例综述.本文中使用以下缩写：部分响应(PR)；完全响应(CR)，每周三次(M/W/F)(TIW)。方法.相对亲和力测定。叶酸受体(FR)相对于叶酸的亲和力，根据先前描述的方法(Westerhof，G.R.、J.H.Schornagel等(1995)Mol.Pharm.48:459-471)进行略微修改来确定。简单地说，将FR-阳性KB细胞大量接种到24孔细胞培养板中并使之粘附至塑料达18h。将指定孔中经消耗的培养基替换成补充有100nM3H-叶酸的含及不含渐增浓度的试验物质或叶酸的无叶酸RPMI(FFRPMI)。将细胞于37℃培养60min并随后用PBS(pH7.4)漂洗3次。每孔加入五百毫升含1%SDS的PBS(pH7.4)。然后收集细胞裂解物并添加到含5mL闪烁混合液的各小瓶中，并随后对放射性计数。阴性对照管仅含有含3H-叶酸的FFRPMI(无竞争物)。阳性对照管含有终浓度1mM的叶酸，并从所有样品中减去在这些样品中测得的CPM(代表非特异性结合的标记)。相对亲和力定义为取代与KB细胞上的FR结合的50%的3H-叶酸所需化合物的摩尔比的倒数（inversemolarratio），其中叶酸对FR的相对亲和力设为1。方法.细胞DNA合成的抑制。使用体外细胞毒性测定来评价本文所述化合物，所述测定预测所述药物抑制叶酸受体阳性细胞(例如KB细胞、RAW264.7巨噬细胞等)生长的能力。要理解的是，细胞类型的选择可基于所选细胞对形成缀合物的药物的易感性来进行。试验化合物由与各化学治疗药连接的叶酸组成，如根据本文所述的过程制备。将试验细胞暴露给不同浓度的叶酸-药物缀合物，并且亦暴露在不存在或存在至少100倍过量的叶酸的情况下，以评价对叶酸受体介导特异的活性。实施例.本文所述的细胞毒性药物的缀合物对KB细胞有活性。所述活性是通过叶酸受体介导的，如通过使用共同给于叶酸的竞争实验所示。在不存在或存在至少100倍过量叶酸的情况下，于37℃将KB细胞暴露给指定浓度的叶酸-药物缀合物多达7h。然后将细胞用新鲜培养基漂洗一次并于37℃用新鲜培养基培养72小时。使用3H-胸苷掺入测定法评价细胞活力。对于本文所述的化合物，剂量依赖性细胞毒性一般为可测量的，以及在大多数情况下，IC50值(将掺入到新合成DNA中的3H-胸苷降低50%所需的药物缀合物的浓度（concentrationofdrugconjugaterequiredtoreduce3H-thymidineincorporationintonewlysynthesizedDNAby50%)处在较低的纳摩尔范围。尽管不受理论约束，但是如果所述缀合物的细胞毒性在存在过量游离叶酸的情况下降低，则在本文中认为所述结果表明观察到的细胞死亡是通过与叶酸受体结合来介导的。方法.针对不同癌细胞系的体外活性。对不同细胞系得到IC50值。将细胞大量接种到24孔Falcon板中并使之过夜形成几乎汇合的单层细胞。在加入试验化合物之前三十分钟，从各孔中吸出经消耗的培养基并更换成新鲜的不含叶酸的RPMI培养基(FFRPMI)。指定一个亚组的孔接收含100μM叶酸的培养基。将指定孔中的细胞用于确定靶向特异性。不受理论约束，本文中认为在存在过量叶酸的情况下(即其中存在对FR结合的竞争)由试验化合物产生的细胞毒性，对应于总活性的与FR特异性递送不相关的部分。在用1mL含10%热灭活胎牛血清的新鲜FFRPMI漂洗一次之后，各孔接收1mL含渐增浓度试验化合物的存在或不存在100μM游离叶酸的培养基(每个样品4孔)，如所指示的。于37℃将处理的细胞脉冲处理（pulse）2h，用0.5mL培养基漂洗4次，并随后在1mL新鲜培养基中追踪直达70h。从所有孔中吸出经消耗的培养基并更换成含5µCi/mL3H-胸苷的新鲜培养基。37℃孵育另2h之后，每孔用0.5mLPBS将细胞洗涤3次并随后用0.5mL冰冷的5%三氯乙酸处理。15min之后，吸出三氯乙酸并通过添加0.5mL0.25N氢氧化钠溶解细胞材料达15min。将450μL等分试样的各溶解的样品转移到含3mLEcolume闪烁混合液的闪烁瓶中并随后用液体闪烁记数器计数。最终结果表达为相对于未处理对照3H-胸苷掺入的百分比。实施例.本文所述化合物表现出针对病原细胞(例如KB细胞)的有效的体外活性。与不含至少一个非天然氨基酸的化合物相比，本文所述的化合物对叶酸受体表现出更大的特异性。例如，EC1456表现出对叶酸受体约1000倍的特异性，如通过叶酸竞争所确定(特异性=竞争基团和非竞争基团之间在IC50上的差异)，以及与竞争化合物EC0531相比在特异性上的4倍改善，所述EC0531不含具有非天然氨基酸的接头L。实施例.对叶酸受体表达细胞的选择性。本文所述化合物显示对叶酸受体表达细胞的高活性。本文所述化合物未显示与叶酸受体阴性细胞的显著结合。EC1456显示与低FR表达细胞和高FR表达细胞(FR+)的高竞争性结合，并且未显示与不表达FR的细胞(FR-)结合。EC1456在(FR+)和(FR-)细胞系中的活性(a)从0.1-100nM评价针对这些具体选择的(FR-)细胞系(A549、H23、HepG2、AN3CA、LNCaP)的活性；NA=不适用。方法.在小鼠中抑制肿瘤生长。从HarlanSpragueDawley,Inc.(Indianapolis，IN)购买4-7周龄小鼠(Balb/c或nu/nu品系)。常规啮齿类动物食物含有高浓度的叶酸(6mg/kg食物)；因此，在肿瘤植入之前对试验动物维持无叶酸饮食(Harlan饮食TD00434号)达约1周以实现接近正常人血清范围的血清叶酸浓度，并在所述方法期间维持所述饮食（andduringtheMethod）。对于肿瘤细胞接种，将1x106个M109细胞(同基因肺癌)接种到Balb/c品系中，或者将1x106个KB细胞接种到nu/nu品系中，以100μL注入背内侧区(右腋)的皮下组织中。使用测径器每2-3天在两个垂直方向测量肿瘤，并将其体积计算为0.5xLxW2，其中L=最长轴的测量值，以mm计，和W=与L垂直的轴的测量值，以mm计。然后根据已公布的程序(参见例如Lee等“BMS-247550:anovelepothiloneanalogwithamodeofactionsimilartopaclitaxelbutpossessingsuperiorantitumorefficacy(BMS-247550：具有类似于紫杉醇的作用方式但具有更佳抗肿瘤功效的新型埃博霉素类似物)”ClinCancerRes7:1429-1437(2001)；Rose，“Taxol-basedcombinationchemotherapyandotherinvivopreclinicalantitumorstudies(基于泰素的联合化疗及其它体内临床前抗肿瘤研究)”JNatlCancerInstMonogr47-53(1993))计算Log细胞杀伤(LCK)和处理/对照(T/C)值。当皮下肿瘤具有介于50-100mm3之间的平均体积时开始给药(t0)，对于KB肿瘤通常在肿瘤接种之后(PTI)8天，以及对于M109肿瘤为PTI11天。除非另有指示，否则一般每周三次(TIW)给试验动物(5只/组)静脉内注入不同剂量的(例如1µmol/kg-5µmol/kg)所述药物递送缀合物或者注入同等剂量体积的PBS(对照)达3周。每天用PBS新鲜配制给药溶液，并通过小鼠的侧尾静脉给予。方法.常规4T-1肿瘤测定。从Harlan，Inc.，Indianapolis，IN获取6-7周龄小鼠(雌性Balb/c品系)。在开始所述方法之前对小鼠维持Harlan’s无叶酸食物达总共三周，并在所述方法期间维持所述食物。在右腋的皮下组织中接种叶酸受体阴性4T-1肿瘤细胞(每只动物1x106个细胞)。除非本文中另有指示，否则在肿瘤接种之后约5天当4T-1肿瘤平均体积为约100mm3时(t0)，每周三次(TIW)给小鼠(5只/组)静脉内注入不同剂量(例如3μmol/kg)的药物递送缀合物或同等剂量体积的PBS(对照)达3周。在各处理组中使用测径器以2天或3天间隔测量肿瘤生长。使用方程V=axb2/2计算肿瘤体积，其中“a”为肿瘤长度，“b”为宽度，以毫米表达。方法.药物毒性。通过经由心脏穿刺收集血液并提交血清用于在Ani-Lytics，Inc.(Gaithersburg，MD)进行独立分析的液尿素氮(BUN)、肌酸酐、总蛋白、AST-SGOT、ALT-SGPT加标准血液细胞板（standardhematologicalcellpanel）来评价永久药物毒性。此外，通过动物参考病理学实验室(ARUP；盐湖城大学，Utah)的理事会验证的（board-certified）病理学家进行对经福尔马林固定的心、肺、肝、脾、肾、肠、骨骼肌和骨(胫骨/腓骨)的组织病理学评价。方法.如通过体重减轻测量毒性。在肿瘤接种之后(PTI)的选定天数和给药期间确定试验动物的体重变化百分数。对结果作图。实施例.针对肿瘤的体内活性。本文所述化合物显示针对nu/nu小鼠中KB肿瘤的高效力和功效。本文所述化合物显示针对叶酸受体表达肿瘤的特殊活性，及较低的宿主动物毒性。例如，当以1μmol/kgTIW静脉内给予2周时，EC1456显示在4/4实验动物中完全响应。EC1456亦显示通过叶酸受体介导的特殊活性，如通过可用过量的对比化合物EC0923(50或100μmol/kg)竞争而证实，如在图3A中所示。EC1456未显示任何整体动物毒性的迹象，如在图3B中所示。方法.TNBC肿瘤测定。三阴性乳腺癌(TNBC)为以缺乏雌激素、孕酮和Her2/neu的基因表达为特征的亚型。TNBC难以治疗，并且在患者中所得的死亡率据报道不成比例地高于乳腺癌的任何其它亚型。以类似于本文所述的KB和M109模型的方式产生TNBC异种移植模型，通过在nu/nu小鼠中植入MDA-MB-231乳腺癌细胞进行。在皮下肿瘤具有介于110-150(一般130)mm3之间的平均体积时开始给药(t0)，通常在肿瘤接种之后(PTI)17天。除非另有指示，否则一般每周三次(TIW)给试验动物(5只/组)静脉内注入不同剂量的(例如1µmol/kg-5µmol/kg)所述药物递送缀合物或者注入同等剂量体积的PBS(对照)达2-3周。每天用PBS新鲜配制给药溶液，并通过小鼠的侧尾静脉给予。实施例.当针对已建立的三阴性FR-阳性皮下MDA-MB-231乳腺癌异种移植物测试时，发现每周三次以2μmol/kg静脉内剂量给予EC1456达连续2周时间具有高活性。所述处理产生4/5完全响应，其中肿瘤体积减小为0，且在超过约135天的观察窗期间未出现再生长。不受理论约束，在本文中认为对所述试验动物治愈三阴性乳腺癌。EC1456的结果在图5A中显示。在试验动物中，所述抗肿瘤活性未伴随显著的体重减轻，如在图5B中所示。方法.人耐顺铂细胞系。通过在存在渐增顺铂浓度的情况下(100→2000nM；在>12个月的时期内)培养FR-阳性KB细胞来建立人耐顺铂细胞系。所述耐顺铂细胞，标记为KB-CR2000细胞，发现其为致瘤的，并发现其在体内保留其FR表达。确认KB-CR2000肿瘤耐受顺铂治疗。使用高毒性剂量的顺铂处理(平均体重减轻10.3%，如在图6B中所示)，甚至不产生单一部分响应（singlepartialresponse）(PR)，如在图6A中所示。相比之下，发现EC1456对KB-CR肿瘤活性非常强，其中观察到5/5CR。此外，仅在1/5试验动物中观察到肿瘤的再生长。不受理论约束，本文中认为对4/5试验动物治愈耐顺铂癌症，其中在近70天观察期内未出现再生长。此外，与顺铂不同，EC1456在这组小鼠中未导致任何体重减轻，并因此在给药时期内未显示总体动物毒性的任何迹象。实施例.缀合药物与未缀合药物的比较。在体内评价未缀合tubulysinB和未缀合TubB-H(EC0347)药物针对小鼠中的人KB肿瘤的治疗性能。将各未缀合药物的抗肿瘤功效和总体毒性(如通过体重变化而确定)与EC1456缀合物进行比较。EC1456在此模型中产生剂量反应性抗肿瘤活性。在产生极小体重减轻至未产生体重减轻的处理情况下，观察到完全响应。相比之下，即便当给予小鼠毒性很大的剂量时，基于未缀合tubulysin的两种药物仍未得到任何抗肿瘤响应。所述结果在下表中显示。这些结果证实，尽管tubulysinB和TubBH对培养物中的细胞有较高细胞毒性(通常IC50约1nM)，但两种物质在未产生可测量抗肿瘤作用的水下平均在小鼠中得到剂量限制性毒性（dose-limitingtoxicities）。因此，未缀合化合物未显示治疗窗。相比之下，缀合形式的药物，例如缀合的TubBH(EC1456)对具有充分建立的人肿瘤异种移植物的小鼠产生抗肿瘤响应并且不具显著毒性。如本文所述的缀合对高毒性药物提供治疗窗。实施例.本文所述化合物显示在10%血清/FDRPMI中，与叶酸(相对亲和力=1)相比高的叶酸受体亲和力、有效的体外活性、有效的体内活性、对叶酸受体的特异性以及与未缀合药物相比足够高的治疗指数。(a)与叶酸相比；(b)如通过胸苷掺入法所确定；(c)试验化合物与过量叶酸竞争时的IC50；IC50越高，叶酸介导越有特异性；(d)体外特异性=竞争组和非竞争组之间在IC50上的差异；(e)如在nu/nu小鼠的皮下KB肿瘤中所确定；CR=完全响应，其中对于组内的所有试验动物，如本文所定义的肿瘤体积在观察期间为0；(f)母体tubulysin。方法.人血清稳定性。使用常规方案和方法，在人血清中检测本文所述化合物的稳定性。将试验化合物给予试验动物，例如通过皮下注射给予。随时间监测所述缀合物的血浆浓度，以及任选一种或多种代谢物。对结果作图以确定试验化合物及代谢物的Cmax、Tmax、半寿期和AUC。实施例.最大耐受剂量(MTD)。含有包含至少一个非天然氨基酸的接头的本文所述缀合化合物，显示高MTD，其与不具有含一个或多个氨基酸的接头的化合物相比为改进的。在雌性Sprague-Dawley大鼠中通过静脉给予试验化合物，BIW，2周。对比化合物EC0531具有0.33μmol/kg的MTD，而EC1456具有至少0.51μmol/kg的MTD，改善65%，如在图20中所示。使用小于或等于MTD剂量的EC1456未观察到组织病理学变化。实施例.宿主动物A.动物接收和顺应期。从Harlan实验室(Indianapolis，IN)接收健康的雌性Balb/c源nu/nu小鼠。B.动物圈养。抵达之后，将小鼠圈养在位于LSA的Purdue大学内的Lilly动物房。将其立即放入具有玉米芯垫料（bed-o-cobbedding）的无菌独立通风笼盒(IVC)(聚碳酸酯)中。将笼盒放入工业不锈钢IVC装置。每笼分配五只动物。由合格技术人员每2周更换无菌笼盒。C.饮食和饮用水。抵达之后，在研究全程给予小鼠HarlanTeklad，Madison，WI生产的辐照试验饮食01014号，经过水瓶使用高压灭菌RO水作为饮用水。在研究期全程，无限制提供饮食和饮用水。给药后一周给小鼠换用HarlanTeklad，Madison，WI制造的TekladGlobal18%啮齿类动物饮食(2018S号)。D.环境条件。在研究期全程将所有动物圈养在环境受控的房间内。室温设置范围从67℉到77℉。房间的相对湿度范围从30%到70%。设置光照定时器以提供12小时光照/12小时黑暗的光周期。E.观察。每天观察动物健康状况。实施例.试验化合物的体内评价。肿瘤植入。于37℃在5%CO2加湿氛围下，使KB肿瘤细胞在含5%FBS的无叶酸RPMI1640中生长。在开始无叶酸饮食之后3天皮下接种KB肿瘤细胞(每只动物1x106个细胞)。在肿瘤达到100-150mm3之后对小鼠给药。给予的药物溶液的配制。在开始给药时通过以下配制给药溶液：称取适量的各化合物，用PBS(pH7.4)复溶，使药物溶液过滤通过0.22μmPVDF注射器式滤器，并将用于每天给药的等分试样冷冻于-20℃。评价。每周3次监测肿瘤大小并测量体重。注意总体动物形态和行为。当小鼠失去>20%重量或者当肿瘤达到1500mm3大小时，进行安乐死。当小鼠在较短持续时间内减轻大量体重或者当小鼠接近垂死状况时，亦由研究者决定进行安乐死。通过从来自选定组的所有存活动物的心脏穿刺来收集血样。安乐死之后立即获得心、肺、肝、脾、肾、肠、骨、脑和肌肉。取出所述组织并储存于10%中性缓冲的福尔马林中。本文所用的术语“部分响应(PR)”是指对宿主动物中的功效的以下观察结果，其中在预定观察期内，试验化合物显示相比于对照的改进，如通过肿瘤体积所测量的。例如，与起始测量值相比在肿瘤体积上的50%减小，代表部分响应。本文所用的术语“完全响应(CR)”是指对宿主动物中的功效的以下观察结果，其中在预定观察期内，试验化合物显示相比于对照的改进，通过将肿瘤体积减少到定量限度（quantitationlimits）。例如，其中在两个垂直方向的测量值各自为2mm或更少的在肿瘤体积上的减小，代表完全响应。本文所用的术语“治愈(C)”是指对宿主动物中的功效的以下观察结果，其中在预定观察期内，试验化合物通过将肿瘤体积减少到定量限度并且其中所述肿瘤未显示显著再生长来显示相比于对照的改进。例如，其中在两个垂直方向的测量值各自为2mm或更少并且其中所述肿瘤未再生长的在肿瘤体积上的减小，代表治愈。实施例.如在图5A和5B中所示，将多柔比星(DOXIL)的功效与单独的EC1456和与多柔比星组合的EC1456进行比较，所述功效为在缺失NK细胞的免疫缺陷型(XID)nu/nu小鼠中对耐长春药属KB-DR150肿瘤的功效。EC1456显示与多柔比星相比改进的功效。与两种单一疗法相比，EC1456与多柔比星的共同给予显示增强的技术效果。在单独给予EC1456时未观察到总体动物毒性。在单独给予多柔比星以及与EC1456组合给予多柔比星时观察到轻微毒性。不受理论约束，在本文中认为联合治疗中观察到的轻微毒性归因于多柔比星。实施例.如在图6A和6B中所示，将顺铂的功效与单独的EC1456和与顺铂组合的EC1456进行比较，所述功效为在nu/nu小鼠中对M109(肺癌)的功效。EC1456显示与顺铂相比改进的功效。与两种单一疗法相比，EC1456与顺铂的共同给予显示增强的技术效果。在单独给予EC1456时未观察到总体动物毒性。在单独给予顺铂以及与EC1456组合给予顺铂时观察到轻微毒性。不受理论约束，在本文中认为用联合治疗观察到的轻微毒性归因于顺铂。实施例.如在图7A和7B中所示，将顺铂的功效与单独的EC1456和与顺铂组合的EC1456进行比较，所述功效为在nu/nu小鼠中对KB肿瘤(口腔表皮样癌)的功效。EC1456显示与顺铂相比改进的功效。与两种单一疗法相比，EC1456与顺铂的共同给予显示增强的技术效果。在单独给予EC1456时未观察到总体动物毒性。在单独给予顺铂以及与EC1456组合给予顺铂时观察到轻微毒性。不受理论约束，在本文中认为用联合治疗观察到的轻微毒性归因于顺铂。实施例.如在图8A和8B中所示，将贝伐单抗的功效与单独的EC1456和与贝伐单抗组合的EC1456进行比较，所述功效为在nu/nu小鼠中对KB肿瘤的功效。EC1456显示与贝伐单抗相比改进的功效。与两种单一疗法相比，EC1456与贝伐单抗的共同给予显示增强的技术效果。使用单一疗法或联合疗法中的任一种均未观察到总体动物毒性。实施例.如在图9A和9B中所示，将托泊替康的功效与单独的EC1456和与托泊替康组合的EC1456进行比较，所述功效为在nu/nu小鼠中对KB肿瘤的功效。EC1456显示与托泊替康相比改进的功效。与两种单一疗法相比，EC1456与托泊替康的共同给予显示增强的技术效果。使用单一疗法或联合疗法中的任一种均未观察到总体动物毒性。实施例.如在图10A和10B中所示，将托泊替康的功效与单独的EC1456和与托泊替康组合的EC1456进行比较，所述功效为在nu/nu小鼠中对KB肿瘤的功效。EC1456显示与托泊替康相比改进的功效。与两种单一疗法相比，EC1456与托泊替康的共同给予显示增强的技术效果。使用单一疗法或联合疗法中的任一种均未观察到总体动物毒性。实施例.如在图11A和11B中所示，将多西紫杉醇的功效与单独的EC1456和与多西紫杉醇组合的EC1456进行比较，所述功效为在nu/nu小鼠中对KB肿瘤的功效。EC1456显示与多西紫杉醇相比改进的功效。与两种单一疗法相比，EC1456与多西紫杉醇的共同给予显示增强的技术效果。在单独给予EC1456时未观察到总体动物毒性。在单独给予多西紫杉醇以及与EC1456组合给予多西紫杉醇时观察到轻微毒性。不受理论约束，在本文中认为用联合治疗观察到的轻微毒性归因于多西紫杉醇。实施例.如在图12A和12B中所示，将卡铂的功效与单独的EC1456和与卡铂组合的EC1456进行比较，所述功效为在nu/nu小鼠中对KB肿瘤的功效。EC1456显示与卡铂相比改进的功效。与两种单一疗法相比，EC1456与卡铂的共同给予显示增强的技术效果。在单独给予EC1456时未观察到总体动物毒性。在单独给予卡铂以及与EC1456组合给予卡铂时观察到轻微毒性。不受理论约束，在本文中认为用联合治疗观察到的轻微毒性归因于卡铂。实施例.EC1456组合以卡铂/紫杉醇对KB肿瘤的抗肿瘤作用。将KB肿瘤细胞(1x106)皮下接种到nu/nu小鼠中并用随机化小鼠开始治疗。如在图13中所示，各曲线显示5个肿瘤的平均体积。将卡铂与紫杉醇组合的功效与单独的EC1456以及EC1456与卡铂和紫杉醇组合物的组合进行比较，所述功效为在nu/nu小鼠中对KB肿瘤的功效。与单独的EC1456以及卡铂和紫杉醇的组合相比，EC1456与卡铂和紫杉醇的共同给予显示增强的技术效果。在单独给予EC1456时未观察到总体动物毒性。在单独给予卡铂以及与EC1456组合给予卡铂时观察到轻微毒性。不受理论约束，在本文中认为用联合治疗观察到的轻微毒性归因于卡铂。每周两次1μmol/kg的EC1456达2周的时间表显示最小抗肿瘤(20%PR)。卡铂(30mg/kg，BIWx2)在与紫杉醇(10mg/kg，BIWx2)组合时产生好的抗肿瘤活性(80%CR和20%治愈)。然而，当添加到卡铂/紫杉醇组合中时，EC1456导致远远更好的抗肿瘤活性(在100%的小鼠中治愈)。实施例.在PDX肿瘤模型中的抗肿瘤活性本文所用的术语“稳定疾病(SD)”意指疾病在疗程内在患者或动物中无实质进展。使雌性Balb/cnu/nu小鼠在实验的持续时间内自由采食无叶酸食物(Harlan饮食TD01013号)。在各小鼠的右胁皮下接种原代人子宫内膜模型ST040、TNBC模型ST502和ST738以及卵巢模型ST024片段(直径2-4mm)。将小鼠随机分入6个实验组，每组5或3只小鼠，并在无菌条件下用200μL体积的磷酸缓冲盐水(PBS)通过侧尾静脉注入试验物质。这些癌细胞获自SouthTexasAcceleratedResearchTherapeutics，4383MedicalDrive，SanAntonio，TX78229并在此进行研究。通过每周两次测量肿瘤来跟踪各皮下肿瘤的生长，直至达到1200mm3的体积。使用游标卡尺（Verniercalipers）在两个垂直方向测量肿瘤，并将其体积计算为0.5xLxW2，其中L=最长轴的测量值，以mm计，和W=与L垂直的轴的测量值，以mm计。A.子宫内膜PDX肿瘤模型如在图14中所示，用15mg/kg紫杉醇治疗(每周一次达两周)产生最小的抗肿瘤活性，没有显示稳定疾病的动物。当与紫杉醇组合时，1.5μmol/kg的EC1456(每周两次达两周)产生好的抗肿瘤活性，3只动物显示PR和1只动物显示治愈，而3μmol/kg的EC1456(每周一次达两周)得到3只动物显示稳定疾病和2只动物显示PR。B.TNBCPDX肿瘤模型如在图15中所示，用1mg/kg的甲磺酸艾日布林治疗(每周一次达两周)产生最小的抗肿瘤活性，1只动物显示稳定疾病/1只动物显示PR。当与甲磺酸艾日布林组合时，2μmol/kg的EC1456(每周两次达两周)产生协同的抗肿瘤活性，得到5只动物显示CR和2只动物显示治愈，而4μmol/kg的EC1456(每周一次达两周)得到4只动物显示PR和3只动物显示CR。如在图16中所示，用1mg/kg的甲磺酸艾日布林治疗(每周一次达两周)产生某种程度的抗肿瘤活性，5只动物显示稳定疾病/2只动物显示PR。当与甲磺酸艾日布林组合时，2μmol/kg的EC1456(每周两次达两周)产生治愈性抗肿瘤活性，得到7只动物显示治愈，而4μmol/kg的EC1456(每周一次达两周)得到2只动物显示PR和4只动物显示治愈。C.卵巢PDX肿瘤模型如在图17中所示，用15mg/kg的紫杉醇治疗(每周一次达两周)未产生抗肿瘤活性。当与紫杉醇组合时，2μmol/kg(每周两次达两周)和4μmol/kg(每周一次达两周)的EC1456得到治愈性(100%动物显示治愈)抗肿瘤活性。实施例.在HuPrime®NSCLPDX肿瘤模型中的抗肿瘤活性使雌性Balb/cnu/nu小鼠在实验的持续时间内自由采食无叶酸食物(Harlan饮食TD01013号)。在各小鼠的右胁皮下接种原代人NSCLC模型LU1147或LU2505片段(直径2-4mm)。将小鼠随机分入7只小鼠的实验组，并在无菌条件下用200μL体积的磷酸缓冲盐水(PBS)通过侧尾静脉注入试验物质。这些研究在CrownBioscience(Beijing)Inc.，GroundFloor，LightMullerBuilding，ChangpingSectorofZhongguancunScientificPark，No.21HuojuRoad，ChangpingDistrict，Beijing，P.R.China进行。通过每周两次测量肿瘤来跟踪各皮下肿瘤的生长，直至达到1200mm3的体积。使用游标卡尺在两个垂直方向测量肿瘤，并将其体积计算为0.5xLxW2，其中L=最长轴的测量值，以mm计，和W=与L垂直的轴的测量值，以mm计。如在图18中所示，用15mg/kg的多西紫杉醇治疗(一次给药)产生最小的抗肿瘤活性，2只动物显示稳定疾病。当与多西紫杉醇组合时(15mg/kg，一次给药)，2μmol/kg(每周两次达两周)和4μmol/kg(每周一次达两周)的EC1456在显示稳定疾病的动物中产生好的抗肿瘤活性，在两组中有5只PR和2只治愈。如在图19中所示，用15mg/kg的多西紫杉醇治疗(一次给药)在显示稳定疾病的动物中产生某种程度的抗肿瘤活性，有2只PR和2只治愈。然而，与多西紫杉醇组合的2μmol/kg(每周两次达两周)和4μmol/kg(每周一次达两周)的EC1456在两组显示稳定疾病的动物中均产生100%治愈。当前第1页1 2 3