Tau显像配体和其在Tau蛋白病的诊断和治疗中的用途的制作方法

相关申请的交叉引用本申请要求美国临时专利申请系列号62/021,897(2014年7月8日提交；待决)的优先权，该申请通过引用以其整体并入本文。有关联邦资助研究或开发的声明本发明在由国立卫生研究院(nih)颁予的批准号ns077239、ag032611和ag020197下的政府支持之下做出。政府在本发明中拥有一定的权利。序列表的参考根据37c.f.r.1.821以及下面的条款，本申请包括一个或多个序列表，所述序列表以计算机可读介质的形式公开(文件名：sig-09-0927-wo-pct_sequence_listing_st25.txt，创建于2015年7月3日，且大小28,918字节)，通过引用将所述文件以其整体并入本文。发明领域本发明涉及基于抗体的探针(包括单结构域抗体片段、scfv分子、抗体、抗体片段、双抗体和其表位结合结构域)，其能够免疫特异性且选择性结合至tau的包含磷酸-丝氨酸的表位，比如，例如tau-磷酸-丝氨酸396/404肽。这样的显像配体可用于检测病理tau蛋白构象异构体(如果存在于生物样品中)，特别是与阿尔茨海默病或其他tau蛋白病(tauopathy)的诊断结合，从而提供针对阿尔茨海默病和其他tau病理(taupathologies)的诊断。本发明的scfv分子具有作为用于阿尔茨海默病和相关tau蛋白病的诊断标记物的用途以及作为用于这些病况的治疗的药物组合物的用途。发明背景阿尔茨海默病是痴呆的最常见的形式，其影响着全世界两千多万的人。该疾病的诊断，尤其是在早期的诊断，是麻烦和困难的，因此存在对tau蛋白病，比如阿尔茨海默病的精确诊断的需求。在脑脊液中异常tau的抗体检测已经显示出一些前景(blennow等,“cerebrospinalfluidandplasmabiomarkersinalzheimerdisease,”nat.rev.neurol.6,131-144(2010)和weiner等,“thealzheimer’sdiseaseneuroimaginginitiative:areviewofpaperspublishedsinceitsinception,”alzheimers.dement.9,e111-e194(2013))。多年以来，在脑脊液中磷酸化-tau蛋白(phospho-tauprotein)的抗体检测已经显示对于阿尔茨海默病的诊断的一些用途(blennow等,“cerebrospinalfluidandplasmabiomarkersinalzheimerdisease,”nat.rev.neurol.6,131-144(2010)；lewis,j.等,“neurofibrillarytangles,amyotrophyandprogressivemotordisturbanceinmiceexpressingmutant(p301l)tauprotein,”nat.genet.25,402-405；weiner,m.w.等(2013)“thealzheimer’sdiseaseneuroimaginginitiative:areviewofpaperspublishedsinceitsinception,”alzheimers.dement.9：e111-e194)，这意味着在该领域进一步开发是值得的(见congdon,e.e.(2014)“harnessingtheimmunesystemfortreatmentanddetectionoftaupathology,”j.alzheimers.dis.40:s113-s121)。但是，在其他tau蛋白病中csftau水平相较于对照通常是不改变的(theunis,c.等“efficacyandsafetyofaliposome-basedvaccineagainstproteintau,assessedintau.p301lmicethatmodeltauopathy,”plos.one.8,e72301(2013)；hales,c.m.等(2013)“fromfrontotemporallobardegenerationpathologytofrontotemporallobardegenerationbiomarkers,”int.rev.psychiatry25:210-220)，且显像染料可能不能检测所有tau蛋白病中的病理tau(fodero-tavoletti,m.t.等(2014)“assessingthk523selectivityfortaudepositsinalzheimer’sdiseaseandnon-alzheimer’sdiseasetauopathies,”alzheimers.res.ther.6:11)。使这些tau病变(lesion)协同淀粉样β(aβ)显像是更可能导致精确诊断的，因为tau聚集体(tauaggregate)的区域式样在不同tau蛋白病之间不同。更进一步，除了阿尔茨海默病，所有这些都部分通过缺少aβ沉积而被定义。使用良好结合至β-折叠的化合物的aβ斑块的体内显像已经处于临床应用中(mason,n.s.等(2013)“positronemissiontomographyradioligandsforinvivoimagingofabetaplaques,”j.labelledcomp.radiopharm.56:89-95)。若干这样的基于染料的tau结合配体最近已经在临床前研究中被鉴定，并且其中一些已经被评估(fodero-tavoletti,m.t.等(2014)“assessingthk523selectivityfortaudepositsinalzheimer’sdiseaseandnon-alzheimer’sdiseasetauopathies,”alzheimers.res.ther.6:11；fodero-tavoletti,m.t.等(2011)“18f-thk523:anovelinvivotauimagingligandforalzheimer’sdisease,”brain134:1089-1100；zhang,w.等(2012)“ahighlyselectiveandspecificpettracerforimagingoftaupathologies,”j.alzheimers.dis.31:601-612；chien,d.t.等(2013)“earlyclinicalpetimagingresultswiththenovelphf-tauradioligand[f-18]-t807,”j.alzheimers.dis.34:457-468；maruyama,m.h.等(2013)“imagingoftaupathologyinatauopathymousemodelandinalzheimerpatientscomparedtonormalcontrols,”neuron79:1094-1108；okamura,n.等(2005)“quinolineandbenzimidazolederivatives:candidateprobesforinvivoimagingoftaupathologyinalzheimer’sdisease,”j.neurosci.25:10857-10862；harada,r.,等(2013)“comparisonofthebindingcharacteristicsof[18f]thk-523andotheramyloidimagingtracerstoalzheimer’sdiseasepathology,”eur.j.nucl.med.mol.imaging40:125-132；ono,m.等(2011)“rhodanineandthiohydantoinderivativesfordetectingtaupathologyinalzheimer’sbrains,”acschem.neurosci.2:269-275；xia,c.f.等(2013)“[(18)f]t807,anoveltaupositronemissiontomographyimagingagentforalzheimer’sdisease,”alzheimers.dement.9:666-676；chien,d.t.(2014)“earlyclinicalpetimagingresultswiththenovelphf-tauradioligand[f18]-t808,”j.alzheimers.dis.38:171-184；villemagne,v.l.等(2014)“invivoevaluationofanoveltauimagingtracerforalzheimer’sdisease,”eur.j.nucl.med.mol.imaging41:816-826；okamura,n.等(2014)“non-invasiveassessmentofalzheimer’sdiseaseneurofibrillarypathologyusing18f-thk5105pet,”brain137:1762-1771)。基于tau的配体的希望和前景是其比aβ配体更好地监控神经变性的状态和发展。基于抗体的探针可能提供对于检测tau病变更强的特异性。尤其地，结合至tau的较小的抗体片段作为配体用于在体内显像以在阿尔茨海默病或其他tau蛋白病患者中检测tau病变是引人注目的。在癌症领域，治疗用抗体已经常规地作为显像剂被共同开发，并且一些这样的抗体和fab分子被fda批准用于肿瘤显像(kaur,s.等“recenttrendsinantibody-basedoncologicimaging,”cancerlett.315,97-111(2012))。本申请发明者已经发现，为检测tau病变提供优异特异性的抗体衍生的显像配体，尤其是较小的单链可变区抗体片段(scfv分子)，对于tau聚集体的体内显像是引人注目的。设想这些抗体衍生的显像配体可用于监控tau病理的疾病发展、tau靶向疗法的效力以及鉴定aβ阴性tau蛋白病(aβnegativetauopathies)。发明概述本发明涉及基于抗体的探针(包括单结构域抗体片段、scfv分子、抗体、抗体片段、双抗体和其表位结合结构域)，其能够免疫特异性且选择性结合至tau的包含磷酸-丝氨酸的表位，比如例如，tau-磷酸-丝氨酸396/404肽。这样的显像配体可用于检测病理tau蛋白构象异构体(如果存在于生物样品中)，特别是与阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的诊断结合，从而提供对阿尔茨海默病和其他tau病理的诊断。本发明的scfv分子具有作为用于阿尔茨海默病和相关tau蛋白病的诊断标记物的用途以及作为用于这些病况的治疗的药物组合物的用途。具体地，本发明涉及一种能够免疫特异性结合至磷酸化tau肽的结合分子，所述磷酸化tau肽具有由tau396/404肽的氨基酸序列(seqidno:7):tdhgaeivykspvvsgdtsprhl组成的氨基酸序列，其中在其11和19位(如下划线所示)的丝氨酸残基被磷酸化，其中所述结合分子另外能够以相较于结合至非-磷酸化tau更高的选择性免疫特异性结合至磷酸化tau。本发明也涉及这样的结合分子的实施方式，其中所述分子为抗体或包括其表位结合片段。本发明还涉及任何这样的结合分子的实施方式，其中所述结合分子包括这样的表位结合片段，更具体而言，其中分子为分离的cdr、单结构域抗体片段、scfv或双抗体。本发明尤其涉及任何这样的结合分子的实施方式，其中在外周注射到接受者中后，所述分子立即实质上与tau聚集体共定位。本发明也涉及这样的结合分子的实施方式，其中表位结合片段包括以下中的任一个、任两个、任三个、任四个、任五个或全部六个：(a)具有seqidno:12的氨基酸序列的轻链cdr1；(b)具有seqidno:13的氨基酸序列的轻链cdr2；(c)具有seqidno:14的氨基酸序列的轻链cdr3；(d)具有seqidno:15的氨基酸序列的重链cdr1；(e)具有seqidno:16的氨基酸序列的重链cdr2；和/或(f)具有seqidno:17的氨基酸序列的重链cdr3。本发明也涉及这样的结合分子的实施方式，其中结合分子是scfv235(seqidno:18)。本发明也涉及任何这类结合分子的实施方式，所述分子被可检测地标记，特别是任何这类结合分子，其中可检测标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记。本发明也涉及任何如上描述的结合分子的用途，所述用途用于检测或测量磷酸化tau蛋白质在接受受试者的脑或生物流体(例如，脑脊液、血液、血清、血浆等)中的存在或量。本发明尤其涉及这类的用途，其中检测或测量包括在体内或体外使结合至磷酸化tau蛋白的结合分子显像，更具体而言，其中检测或测量用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的tau蛋白病。本发明也涉及用于治疗受试者的阿尔茨海默病或另外的tau蛋白病的体内药物，其中药物包括治疗阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的有效量的如权利要求1-8中任一项的结合分子，以及一种或更多种载体、稀释剂和/或稳定剂。本发明也涉及用于治疗受试者的阿尔茨海默病或另外tau蛋白病的这类体内药物的用途。本发明尤其涉及如上叙述的用途，其中受试者是人。本发明也涉及试剂盒，所述试剂盒用于检测或测量磷酸化tau蛋白质在接受受试者的脑中的存在或量，或用于诊断受试者中的阿尔茨海默病或另外tau蛋白病，其中试剂盒包括任何如上叙述的结合分子。本发明还涉及如上叙述的任何用途，或涉及如上叙述的任何药物，或涉及如上叙述的任何试剂盒，其中tau蛋白病选自包括以下的组：额颞痴呆(frontotemporaldementia)、与17号染色体连锁的帕金森症(ftdp-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、皮克氏病(pick'sdisease)、进行性皮质下神经胶质增生症、单纯缠结性痴呆(tangleonlydementia)、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化症(diffuseneurofibrillarytangleswithcalcification)、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森症-痴呆综合症、拳击员痴呆、唐氏综合症、吉斯特曼-施特劳斯病(gerstmann-straussler-scheinkerdisease)、哈勒沃登-施帕茨病(hallerworden-spatzdisease)、包涵体肌炎、克雅氏病(creutzfeld-jakobdisease)、多系统萎缩、尼曼匹克症c型(niemann-pickdiseasetypec)、朊蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、肌强直性营养不良、非-guanamian运动神经元疾病伴随神经元纤维缠结(non-guanamianmotorneurondiseasewithneurofibrillarytangles)、脑炎后帕金森综合征、急性创伤性脑损伤和慢性创伤性脑病。附图说明图1a-1b显示随机选择的自抗体6b2g12产生的scfv克隆(图1a和1b)与seqidno:27的非磷酸化表位或与seqidno:28的磷酸化tau表位的结合。图1a的克隆是针对磷酸化表位(seqidno:28)淘选的。图1b克隆是针对非磷酸化表位(seqidno:27)淘选的。图2a-2e：scfv235选择性地结合至磷酸化-tau表位和结合至阿尔茨海默患者的脑匀浆中的tau蛋白。图2a显示在elisa中，相较于其非磷酸化等价表位(ser396/404)，scfv235选择性地结合至磷酸化-tau-丝氨酸396/404(p-ser396/404)表位。图2b显示scfv235特异性地结合至阿尔茨海默病的脑匀浆的tau。孵育来自患阿尔茨海默病的个体的脑匀浆与scfv235造成了在50-70kda范围的tau条带的免疫沉淀。通过cp27(人tau)和多克隆的总tau抗体(totaltauantibody)(dako)的蛋白质印迹显示类似的结果，其中没有其他条带被检测出。为了比较，脑匀浆的低速上清液(lss)被显示在与具有若干另外的tau阳性条带的相同的印迹(blot)相邻的泳道中。图2c:孵育来自患阿尔茨海默病的个体的脑匀浆与6b2g12造成了在50-70kda范围的tau条带的免疫沉淀以及在20-30kda范围的降解片段。通过cp27(人tau)和多克隆的总tau抗体(dako)的蛋白质印迹显示cp27对于完整的tau和dakotau对于较小的tau片段的更好的检测。为了比较，脑匀浆的低速上清液(lss)被显示在与具有另外的tau阳性条带的相同印迹的相邻泳道中。图2d：显示四个人脑切片的差别染色的结果。行1：来自阿尔茨海默病个体ad-1的脑切片；行2：来自阿尔茨海默病个体ad-2的脑切片；行3：来自皮克氏病个体的脑切片；行4：来自健康对照个体的脑切片。栏a：用hoechst染色的切片，以显示核；栏b：用scfv235染色的切片；栏c：用phf1染色的切片；栏d：融合(merged)的切片，以显示定位(见箭头)。用scfv235对人脑切片的染色揭示广泛的神经元(neuronal)的染色，这显示了通过phf1染色的部分定位。在对照人组织中观察到非常有限的染色。比例尺(scalebar)＝20μm。图2e：显示scfv235结合至阿尔茨海默病人脑切片上的病理tau，但展示对于对照人脑切片的有限的结合。图3a-3d：在颈动脉内或静脉内注射荧光标记scfv235或6b2g12后的p301l、htau/ps1、htau、tg-swdi和野生型鼠中的tau包涵体(inclusion)的体内显像。来自各组的代表性图像图像在不同的板块(panel)显示。图3a：颈动脉内显像。图像在注射前(栏a)和在注射后特定的间隔(栏b、栏c和栏d)记录图像。行1：p301l转基因小鼠(12月大)的图像，所述小鼠被注射以近红外染料(680nm)标识的scfv235，并且在注射前(栏a)以及在注射后38分钟(栏b)、82分钟(栏c)和220分钟(栏d)显像。全身都检测到信号，信号在脑中强度最高，且随时间缓慢减小。脑信号在注射后35-38分钟达到峰值(高于注射前基线信号1714％)，以及在注射后82和330分钟保持强烈(分别为1675％和1468％)。行2：来自注射scfv235的htau/ps1转基因小鼠(22月)的图像，在注射前记录的和在注射后37分钟(栏b)、65分钟(栏c)和176分钟(栏d)记录。仍然，最强的信号在脑中被检测到，并且其随时间逐渐减小。脑信号在注射后37分钟达到峰值(高于注射前基线信号1443％)，以及在注射后65和176分钟保持强烈(分别为1144％和1093％)。行3：注射scfv235的wt小鼠(9月)的图像，在注射前和在注射后37分钟(栏b)、75分钟(栏c)和265分钟(栏d)。在注射后检测到非常有限的脑信号，其中在周边(periphery)无信号。行4：注射6b2g12的p301l转基因小鼠(10月)的图像，在注射前记录的和在注射后37分钟(栏b)、170分钟(栏c)和291分钟(栏d)记录的。在脑中信号最强并且随时间逐渐减小，其中类似的信号自注射后20-95分钟获得(高于基线值600-632％)，在描绘的170和291分钟适度地下降(分别为497％和431％)。行5：注射6b2g12的wt小鼠(8月)的图像，在注射前记录的和在注射后37分钟(栏b)、90分钟(栏c)和225分钟(栏d)记录的。事实上，没有检测到信号。比例尺显示最大像素强度，然而感兴趣的区域(roi)是合计像素强度的总辐射效率(tre)。图3b：颈动脉内注射，后ivis(体内显像系统)脑信号随时间的定量分析：在注射scfv235的p301l小鼠中检测到最高信号。较年长的鼠(11和12月)分别有2.23e+11和2.64e+11的总辐射效率(tre)峰值，然而较年轻的小鼠(3和8月)具有较低的峰值信号(分别为1.88e+11和1.86e+11)。注射6b2g12后，相同的p301l模型(7-10月)具有强的但较少的脑信号，范围从2.20e+11到1.16e+11。在注射scfv235的年长htau/ps1小鼠(22月；峰值为1.40e+11)中观察到类似的信号强度，但在7月大的htau/ps1小鼠中是有限的，其被确认缺少tau病理。wt鼠(12-13月)和一只htau小鼠(13月)在所有时间点具有低的信号并且没有tau病理。在年长的htau/ps1小鼠(23月)和p301l小鼠(7月)中仅仅注射荧光-标签，产生比注射scfv235或抗体的wt小鼠中更高的脑信号，但是其实质上比任何注射scfv235或6b2g12的tau蛋白病小鼠中的少。这些注射两种染料的小鼠被确认具有广泛的tau病理(见图4b)。图3c：静脉内显像。在注射前(栏a)和在注射后特定的间隔(栏b、栏c和栏d)记录图像。行1：p301l转基因小鼠(13月大)的图像，所述小鼠被注射以近红外染料(680nm)标识的scfv235，并且在注射前(栏a)显像，以及在注射后18分钟(栏b)、210分钟(栏c)和11520分钟(第8天)(栏d)显像。在18分钟检测到峰值脑信号(高于注射前基线1754％)，在210分钟信号较少(从峰值信号下降18％)，其在8天已经实质上减弱(下降43％)。行2：来自tg-swdiaβ斑块小鼠(12月)的图像，在注射前记录的，和在注射后25分钟(栏b)、60分钟(栏c)和11520分钟(第8天)(栏d)记录的。在注射后检测到非常有限的脑信号，其中在周边无信号。行3：注射6b2g12的p301l转基因小鼠(7月)的图像，在注射前和在注射后25分钟(栏b)、120分钟(栏c)和11520分钟(第8天)(栏d)。脑信号在25分钟是强的(高于注射前基线1211％)，在35分钟达到峰值(1445％)，在120分钟信号较少(从峰值信号下降11％)以及到8天和12天变弱得多(分别下降67％和70％)。行4：注射6b2g12的tg-swdi小鼠(12月)的图像，注射前记录的和在注射后25分钟(栏b)、180分钟(栏c)和11520分钟(第8天)(栏d)记录的。在注射后检测到非常有限的脑信号，其中在周边无信号.图3d：静脉内注射后ivis脑信号随时间的定量分析：scfv235和6b2g12被注射到p301l小鼠中。这些小鼠在注射后可以在相较于颈动脉内注射的小鼠较早的时间点被显像，因为颈动脉内途径需要较长的术后(postoperative)护理以防止流血。峰值信号通常在注射后第一小时之内获得，这取决于动物，对于所有探针间隔类似。相较于对照igg，对于scfv235和6b2g12的整体信号实质上更高，即使注射igg的小鼠有最强的tau病理(见表6)。一只注射6b2g12的小鼠(b15)具有与注射igg的小鼠相当的ivis信号，但具有更适中的tau病理。在14天中，对于个体p301l小鼠，信号以不同的速率逐渐减退。用任一探针，在注射tg-swdi的或wt小鼠中在所有时间点检测到非常有限的信号。图4a-4d：注射的scfv235和6b2g12与神经元内神经元内的(intraneuronal)tau蛋白、内体-自噬体-溶酶体的标记物和小神经胶质的共定位。在颈动脉内注射和ivis显像之后3-4小时去除脑，将其固定，冠状切片和针对以下进行染色：(1)具有tau5的tau(总tau)、mc1(构象的)、phf1(磷酸化-tau)，和(2)初级内体(eea1)；(3)次级内体/溶酶体(rab7)；和(4)自噬体(lc3，p62)。切片也与小神经胶质染色(iba-1)。图4a：使注射scfv235的p301l小鼠(行1-2、4和7：小鼠“a12”；行3：小鼠“bb8”；行5-6：小鼠“a13”)显像以鉴定核(栏a)、通过scfv235显像(栏b)、显像以显示phf1(栏c)以及建立合并(merged)的图像(栏d)。图像显示与mc1、tau5和phf1的部分共定位，以及与rab7、eea1、lc3和p62的完全共定位。图4b：使注射scfv235的htau/ps1小鼠(行1、5、7-8：小鼠“a47”；行2-4和6：小鼠“b32”)显像以鉴定核(栏a)、通过scfv235显像(栏b)、显像以显示phf1(栏c)以及建立合并的图像(栏d)。图像显示注射的scfv235与mc1、tau5和iba-1(未显示)部分共定位以及与phf1、rab7、eea1、lc3和p62抗体的完全共定位。图4c：使注射6b2g12的p301l小鼠(行1和7：小鼠“a52”；行2-6：小鼠“a50”)显像以鉴定核(栏a)、通过scfv235显像(栏b)、显像以显示phf1(栏c)以及建立合并的图像(栏d)。图像显示与mc1、tau5、phf1、rab7、eea1、lc3和p62的部分共定位。图4d：使注射scfv235(行1-3)的wt小鼠或注射6b2g12(行4-6)的wt小鼠显像以鉴定核(栏a)、通过scfv235显像(栏b)、显像以显示phf1(栏c)以及建立合并的图像(栏d)。除了用tau5检测到的正常tau之外，图像显示来自抗体片段的有限的信号和通过抗体标记物的有限的染色。用hoechst核染色将核染成蓝色。比例尺＝10μm。箭头指向部分共定位的神经元。当完全共定位时没有使用箭头。图5显示在p301l(f6)和htau/ps1(a47)缠结小鼠中颈动脉内注射后，scfv235与病理tau在脑神经元内共定位，但在对照野生型小鼠(r1)中没有可检测的吸收。图6a-6f显示了观察到的ivis信号和(图6a-6b)脑组织探针信号(scfv235：r＝0.98，6b2g12：r＝0.87)以及和(图6c-6d)tau病理(scfv235：r＝0.94，6b2g12：r＝0.75)的良好的关联。脑组织探针信号也很好地与(图6e-6f)脑tau病理(scfv235：r＝0.99，6b2g12：r＝0.97)关联。发明详述本发明涉及基于抗体的探针(包括单结构域抗体片段、scfv分子、抗体、抗体片段、双抗体和其表位结合结构域)，其能够免疫特异性且选择性结合至tau的包含磷酸-丝氨酸的表位，比如，例如，tau-磷酸-丝氨酸396/404肽。这样的显像配体可用于检测病理tau蛋白构象异构体(如果存在于生物样品中)，特别是与阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的诊断结合，从而提供对阿尔茨海默病和其他tau病理的诊断。本发明的scfv分子具有作为用于阿尔茨海默病和相关tau蛋白病的诊断标记物的用途以及作为用于这些病况的治疗的药物组合物的用途。本发明的基于抗体的探针对于检测患有ad或其他tau蛋白病患者中的tau病变提供比β折叠染料更好的特异性。尤其地，结合至tau的较小的抗体片段作为用于体内显像的配体是引人注目的。它们相比于抗体较小的尺寸导致其更好地接近tau聚集体。另外的优点是它们与具有较长的半衰期的未修饰抗体相比，相对快速的从循环中清除。在癌症领域里，治疗用抗体已经常规的作为显像剂被共同开发，并且若干这样的抗体和fab’s或更小的双抗体和具有更好的药代动力学性质的scfv分子作为肿瘤显像剂被批准或提出(见kaur,s.等(2012)“recenttrendsinantibody-basedoncologicimaging,”cancerlett.315:97-111；olafsen,t.等(2010)“antibodyvectorsforimaging,”semin.nucl.med.40:167-181)。i.tau和本发明优选的免疫源性tau肽如本文所用，术语“tau”与tau蛋白是同义词，其指任何tau蛋白同等型(例如在uniprot中鉴定为p10636,1-9)。相对于如下所示的seqidno：1给出tau的氨基酸编码，met是氨基酸1。“p-tau”指在一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基处已经被磷酸化的tau蛋白。例如p-ser396/404指tau的多肽，其包括seqidno:1的氨基酸序列，其中丝氨酸残基396和404被磷酸化的：seqidno:1：tau是可溶的微管相关蛋白，其在细胞周期期间，被许多激酶动态地磷酸化和脱磷酸。tau稳定微管的能力取决于其磷酸化作用的程度。在其脱磷酸形式中，蛋白质能够与微管蛋白相互作用以稳定微管以及促进微管蛋白组装到微管(其形成细胞的细胞骨架并且是有丝分裂纺锤体的重要成分，有丝分裂纺锤体在有丝分裂中拉开真核生物的染色体)中。在其磷酸化形式中，tau能够从微管分离，从而允许有丝分裂发生。tau的磷酸化因此充当神经元内的直接微管结合-分离开关(pedersen,j.t.等(2015)“tauimmunotherapyforalzheimer’sdisease,”trendsmol.med.2015apr3.pii:s1471-4914(15)00058-1；1-9页，通过引用以其整体并入本文)。tau的高度磷酸化(hyperphosphorylation)可造成成对螺旋丝体和直丝体的不可溶的自组装“缠结体”的形成，本文中称为“tau聚集体”。这样的tau聚集体可为细胞内的(例如神经元内的)，但也可在细胞外形成。tau聚集体的存在损害了tau稳定微管的能力，因此引起微管解体、树突脊(dendriticspinal)塌陷瓦解和轴突的降解。正常tau平均包含两个磷酸化位点；高度磷酸化tau丝体平均七到八个磷酸化位点。高度磷酸化tau是细胞内的神经元纤维缠结的主要成分，细胞内的神经元纤维缠结是阿尔茨海默病的主要标志。ii.本发明优选的抗体和表位结合片段如本文所用，术语“抗体”指完整的免疫球蛋白以及具有其表位结合片段的分子。天然产生的抗体典型地包括四聚体，所述四聚体通常由至少两条重链(h)和至少两条轻链(l)组成。每条重链包括重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区，重链恒定区通常包括三个结构域(ch1、ch2和ch3)。重链可为任何同种型，包括igg(igg1、igg2、igg3和igg4亚型)、iga(iga1和iga2亚型)、igm和ige。每条轻链包括轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区(cl)。轻链包括κ链和λ链。重链和轻链可变区典型地负责抗原识别，同时重链和轻链恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(clq)，的结合。vh和vl区可进一步再划分成高变区，术语为“互补决定区”，其被散布以具有更保守序列的区域，术语为“构架区”(fr)。每个vh和vl均由三个cdr结构域和四个fr结构域组成，其从氨基-末端到羧基-末端以如下的顺序排列：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。尤其相关的抗体和它们的表位结合片段，所述表位结合片段已经被“分离”，以便存在于这样的物理环境中：所述物理环境与其天然产生的物理环境不同，或与已经被修饰以便在氨基酸序列方面与天然产生的抗体不同的物理环境不同。可获得展示表位-结合能力的抗体片段(包括fab和(fab)2片段)，例如，通过完整抗体的蛋白酶切割获得。更优选的，这样的片段为单结构域抗体片段、scfv分子和抗体的表位结合结构域等，其使用重组技术形成。例如，虽然fv片段的两个结构域，vl和vh，通过不同的基因编码，但是，可使用重组方法，通过柔性连接体(典型地具有大约10、12、15或更多氨基酸残基)将这样的基因序列或它们的编码cdna连接，这使得他们被制成单蛋白链，在其中vl和vh区缔合以形成单价表位-结合分子(被称为单链fv(scfv)分子；见例如，bird等(1988)science242:423-426；和huston等(1988)proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)85:5879-5883)。可选地，通过采用太短的(例如，少于大约9个残基)而不能使单多肽链的vl和vh区结缔合在一起的柔性连接体，可形成双特异性抗体、双抗体或类似的分子(其中两个这样的多肽链缔合在一起，以形成二价表位-结合分子)(双抗体的描述，见例如，pnasusa90(14),6444-8(1993))。单结构域抗体片段仅具有一个可变结构域(例如，vl或vh)。本发明包括的表位结合片段的实例包括(i)fab'或fab片段、由vl、vn、cl和ch1结构域组成的单价片段或单价抗体，如wo2007059782中所描述的；(ii)f(ab')2片段、包括通过在铰链区二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(iii)基本上由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)基本上由vl和vh结构域组成的fv片段，(v)dab片段(ward等nature341,544-546(1989))，其基本上由vh结构域组成并且也称为结构域抗体(domainantibodies)(holt等；trendsbiotechnol.2003nov；2i(ll)：484-90)；(vi)骆驼科动物抗体或纳米抗体(revets等；expertopinbiolther.2005jan；5_(l)：lll-24)和(vii)分离的互补决定区(cdr)。更进一步，虽然两个fv片段的结构域，vl和vh，通过单独的基因编码，但可使用重组方法，通过合成连接体将他们连接，这使得它们可被制成单蛋白链，在其中vl和vh区配对以形成单价分子(被称为单链抗体或单链fv(scfv)，见例如，bird等science242,423-426(1988)和huston等pnasusa85,5879-5883(1988))。本文进一步讨论这些和本发明上下文中的其他有用的抗体片段。也应该理解，术语抗体，除非另外特指，也包括抗体样(antibody-like)多肽，比如嵌合抗体和人源化抗体，以及任何已知技术提供的保持与抗原的特异性结合能力的抗体片段(抗原-结合片段)，所述已知技术比如酶法切割、肽合成和重组技术。产生的抗体可具有任何同种型。如本文所用，"同种型"指免疫球蛋白类别(例如，iggl、igg2、igg3、igg4、igd、iga、ige或igm)，其是通过重链恒定区基因编码的。同种型的选择通常通过期望的效应子功能来引导，比如adcc诱导。示例性的同种型是iggl、igg2、igg3和igg4。可使用人轻链恒定区的任一个，κ或λ。如需要，本发明的抗-tau抗体的类别可通过已知方法转换。例如，本发明的抗体原本为igm，可被类别转换为本发明的igg抗体。另外，类别转换技术可用于将igg亚类转变为另外的亚类，例如从iggl转换到igg2。因此，本发明的抗体的效应子功能，可通过同种型转换成例如igg1、igg2、igg3、igg4、igd、iga、ige或igm抗体而被改变，用于各种治疗用途。在一个实施方式中，本发明的抗体是igg1抗体，例如igg1，使用本领域技术人员已知的惯用技术手段获得这样的抗体片段。例如，f(ab')2片段可通过用胃蛋白酶处理抗体而产生。得到的f(ab')2片段可被处理以减少二硫键，从而产生fab'片段。fab片段可通过用木瓜蛋白酶处理igg抗体而获得；fab'片段可通过胃蛋白酶消化igg抗体而获得。f(ab')片段也可通过如下描述的经硫醚键或二硫键结合fab'而产生。fab’片段是通过切断f(ab')2的铰链区的二硫键获得的抗体片段。fab’片段可通过用还原剂，比如二硫苏糖醇处理f(ab')2片段而获得。抗体片段也可通过编码这些片段的核酸在重组细胞中的表达而产生(见例如，evans等,j.immunol.meth.184,123-38(1995))。例如，编码部分f(ab')2片段的嵌合基因可包括编码ch1结构域和h链的铰链区的dna序列，之后是翻译终止密码子，以产生截短的抗体片段分子。能够结合至期望的表位的合适的片段可容易地被筛选，用于与完整的抗体以同样的方式应用。在一个实施方式中，这样的抗体片段是单价抗体，优选如pct公布wo2007/059782(其通过引用以其整体并入本文)中所描述的单价抗体，其具有铰链区的缺失。可通过包括以下步骤的方法构造这样的抗体：i)提供编码所述单价抗体的轻链的核酸构建物，所述构建物包括编码选择的抗原特异性抗α-突触核蛋白抗体的vl区的核苷酸序列，以及编码ig的恒定cl区的核苷酸序列，其中编码选择的抗原特异性抗体的vl区的所述核苷酸序列和编码ig的cl区的所述核苷酸序列可操作地连接在一起，并且其中，在igg1亚型的情况下，编码cl区的核苷酸序列已经被修饰，这样在存在多克隆人igg或当施用于动物或人类时，cl区不包含能够与包含同样的cl区的氨基酸序列的其他肽形成二硫键或共价键的任何氨基酸；ii)提供编码所述单价抗体的重链的核酸构建体，所述构建体包括编码选择的抗原特异性抗体的vh区的核苷酸序列和编码人ig的恒定ch区的核苷酸序列，其中编码ch区的所述核苷酸序列已经被修饰，这样对应于铰链区的区域，以及如ig亚型、其他ch区的区域比如ch3区所要求的，不包括任何这样的氨基酸残基：所述氨基酸残基，在存在多克隆人igg或当施用于动物或人类时，参与与包含人ig的ch区的同样的氨基酸序列的其他肽形成二硫键或共价的或稳定的非共价的重链间键，其中编码选择的抗原特异性抗体的vh区的所述核苷酸序列和编码所述ig的ch区的所述核苷酸序列可操作地连接在一起；iii)提供细胞表达系统以产生所述单价抗体；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共同表达(i)和(ii)的核酸构建体产生所述单价抗体。类似地，在一个实施方式中，抗体是单价抗体，其包括：(i)如本文所描述的本发明的抗体的可变区或所述区的抗原结合部分，和(ii)免疫球蛋白的ch区或其包括ch2和ch3区的片段，其中ch区或其片段已经被修饰，以便对应于铰链区的区域以及，如果免疫球蛋白不是igg4亚型，ch区的其他区，比如ch3区，不包括任何这样的氨基酸残基：所述氨基酸残基在多克隆的人igg的存在下，能够与相同的ch区形成二硫键或与相同的ch区形成其他共价的或稳定的非共价的重链间键。在进一步的实施方式中，单价抗体的重链已经被修饰，这样全部铰链被删除。在另外的实施方式，所述单价抗体的序列已经被修饰，这样其不包括针对n-连接糖基化的任何接受位点。如本文所用，如果抗体或其表位结合片段相对于可选的表位更经常、更快速、以更大的持久性和/或更大的亲和力或亲合力与另一分子的区域(即，表位)反应或缔合，则认为所述抗体或其表位结合片段“免疫特异性”结合该表位。通过阅读该定义，也应理解，例如，特异性结合第一靶标的抗体或其表位结合片段可能特异性或优先结合第二靶标或可能不特异性或优先结合第二靶标。。如本文所用，在抗体或其结合片段与预定抗原结合的背景中，当通过例如biacore3000仪器中的表面等离子体共振(spr)技术(优选使用抗体作为配体以及抗原作为分析物)测定时，术语“结合”通常指以对应于大约10-7m或更少的，比如大约10-8m或更少的，比如大约10-9或更少的kd的亲和力进行结合，以及其以对应于kd的亲和力与预定抗原结合，相比于与非特异性抗原(例如，bsa，酪蛋白)而不是预定抗原或密切相关的抗原结合的亲和力，所述kd为至少十分之一，比如至少其百分之一，例如至少千分之一，比如至少万分之一，例如至少十万分之一。亲和力较低的量取决于抗体的kd，这样当抗体的kd非常低时(也就是，抗体是高度特异的)，那么针对抗原的亲和力比针对非特异性抗原的亲和力小的量是至少10,000倍。术语"kd"(秒-1或1/s)，如本文所用，指特定抗体-抗原互相作用的解离速率常数。所述值也称为koff值。术语"ka"(m-1x秒-1或1/m)，如本文所用，指特定抗体-抗原互相作用的缔合速率常数。术语"kd"(m)，如本文所用，指特定抗体-抗原互相作用的解离平衡常数。术语"ka"(m-1或1/m)，如本文所用，指特定抗体-抗原互相作用的缔合平衡常数且其通过ka除以kd获得。如本文所用，如果相对于其结合(如果其完全结合)至具有相同氨基酸序列的非-磷酸化肽表位，抗体或其表位结合片段以更高的亲合力免疫特异性结合磷酸化肽表位，则认为所述抗体或其表位结合片段“选择性”结合该表位。最优选的，这样的较高的亲和力为至少10倍、至少30倍、至少100倍、至少300倍、至少1,000倍、至少3,000倍或至少10,000倍。相对于非-磷酸化肽，scfv235“选择性地”结合至磷酸化p-ser396/404肽(展示大约4,000倍的“选择性”)。抗体或其表位结合片段对于磷酸化tau的“选择性”的程度，通过经elisa或biacore比较这样的抗体的scfv免疫特异性地结合至非-磷酸化靶tau肽的亲和力与结合至其磷酸化变体的亲和力而确定。术语"表位"意思是能够特异地结合至抗体的抗原决定簇。表位通常由分子比如氨基酸或糖侧链的表面基团组成，且通常有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位区别在于在变性溶剂的存在下，与构象表位的结合消失，但与非构象表位的结合并不消失。表位可包括直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性的组分)和其他氨基酸残基，其他氨基酸氨基并不直接参与结合，比如被特异性抗原结合肽有效封闭的氨基酸残基(也就是说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹(footprint)内)。如本文所用，术语“抗体的表位结合片段”意思是能够免疫特异性结合至表位的抗体的片段。表位结合片段可包含这样的抗体的cdr结构域中的1个、2个、3个、4个、5个或全部6个，并且，虽然能够免疫特异性结合至这样的表位，但其对与与这样的抗体的表位不同的这类表位可展示免疫特异性、亲和性或选择性。优选地，然而，表位结合片段包含这样的抗体的全部6个cdr结构域。抗体的表位结合片段可为单多肽链(例如scfv)或可包含两条或更多条多肽链，每条多肽链各具有氨基-末端和羧基末端(例如，双抗体、fab片段、fab2片段等)。本发明的抗体和它们的tau表位结合片段优选为“人源化”的，尤其在用于治疗目的而采用的情况下。术语“人源化的”指嵌合分子，通常使用重组技术制备，其具有衍生于来自非人类物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的剩余的免疫球蛋白结构。抗原结合位点可包括融合至人恒定结构域的完整非人抗体可变结构域或仅仅包括移植到人可变结构域的适当的人框架区的这样的可变结构域的互补决定区(cdr)。这样的人源化分子的框架残基可为野生型的(例如全人的)或它们可被修饰以包含未在人抗体中发现的一个或多个氨基酸取代，所述人抗体的序列用作人源化的基础。人源化减少或消除分子的恒定区在人个体中作为免疫原的可能性，但是仍保留对外源可变区的免疫应答的可能性(lobuglio,a.f.等(1989)“mouse/humanchimericmonoclonalantibodyinman:kineticsandimmuneresponse,”proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)86:4220-4224)。另外的方法不仅关注提供人衍生的恒定区，而且还修饰可变区，以尽可能接近人的形式来重塑(reshape)它们。已知重链和轻链的可变区都包含三个互补-决定区(cdr)，侧翼是四个框架区(fr)，所述cdr对所讨论的抗原响应不同并且决定结合能力，所述框架区(fr)在给定物种中相对保守并且推定其为cdr提供支架。当针对特定抗原制备非人抗体时，可通过将源自非人抗体的cdr移植在待修饰的人抗体中存在的fr上而“重塑”或“人源化”可变区。已经报道了该方法应用于各种抗体：sato,k.等(1993)cancerres53:851-856.riechmann,l.等(1988)“reshapinghumanantibodiesfortherapy,”nature332:323-327；verhoeyen,m.等(1988)“reshapinghumanantibodies:graftinganantilysozymeactivity,”science239:1534-1536；kettleborough,c.a.等(1991)“humanizationofamousemonoclonalantibodybycdr-grafting:theimportanceofframeworkresiduesonloopconformation,”proteinengineering4:773-3783；maeda,h.等(1991)“constructionofreshapedhumanantibodieswithhiv-neutralizingactivity,”humanantibodieshybridoma2:124-134；gorman,s.d.等(1991)“reshapingatherapeuticcd4antibody,”proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)88:4181-4185；tempest,p.r.等(1991)“reshapingahumanmonoclonalantibodytoinhibithumanrespiratorysyncytialvirusinfectioninvivo,”bio/technology9:266-271；co,m.s.等(1991)“humanizedantibodiesforantiviraltherapy,”proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)88:2869-2873；carter,p.等(1992)“humanizationofananti-p185her2antibodyforhumancancertherapy,”proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)89:4285-4289；andco,m.s.等(1992)“chimericandhumanizedantibodieswithspecificityforthecd33antigen,”j.immunol.148:1149-1154。在一些实施方式中，人源化抗体保存所有的cdr序列(例如，人源化的小鼠抗体，其包含来自小鼠抗体的所有六个cdr)。在其他实施方式中，人源化抗体具有相对于初始抗体被改变的一个或多个cdr(一个、两个、三个、四个、五个或六个)，其也称为“源自”初始抗体的一个或多个cdr的一个或多个cdr。人源化抗体的能力是熟知的(例如，见美国专利号5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,407,213；6,881,557)。在一个实施方式中，本发明的抗体是人抗体。合适的人抗体可使用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因小鼠或转染色体小鼠产生。这样的转基因小鼠和转染色体小鼠包括在本文分别称为humab小鼠和km小鼠的小鼠，其在本文统称为“转基因小鼠”。humab小鼠包含人免疫球蛋白基因微基因座(minilocus)和靶向突变，所述微基因座编码未重排的人重链可变和恒定(μ和y)以及轻链可变和恒定(k)链免疫球蛋白序列，所述靶向突变使内源μ和k链基因座失活(lonberg,n.等nature368,856-859(1994))。因此，这样的小鼠展示小鼠igm或igk的减少的表达，以及响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因，经历类别转换和体细胞突变，以产生高亲和性人igg，单克隆抗体(lonberg,n.等(1994),同上；在下文中的综述，lonberg,n.,handbookofexperimentalpharmacology113,49-101(1994)；lonberg,n.和huszar,d.,intern.rev.immunol.vol.1365-93(1995)；和harding,f.和lonberg,n.,ann.n.y.acad.sci764536-546(1995))。在taylor,l.等nucleicacidsresearch20,6287-6295(1992)；chen,j.等internationalimmunology5,647-656(1993)；tuaillon等j.immunol.152,2912-2920(1994)；taylor,l.等,internationalimmunology6,579-591(1994)；fishwild,d.等naturebiotechnology14,845-851(1996)中详细描述了humab小鼠的制备。也见us5,545,806、us5,569,825、us5,625,126、us5,633,425、us5,789,650、us5,877,397、us5,661,016、us5,814,318、us5,874,299、us5,770,429、us5,545,807、wo98/24884、wo94/25585、wo93/1227、wo92/22645、wo92/03918和wo01/09187。hco7小鼠在它们的内源轻链(κ)基因具有jkd扰乱(disruption)(如chen等emboj.12，821-830(1993)中所描述)，在它们的内源重链基因中具有cmd扰乱(如wo01/14424的实施例1中所描述的)，具有kco5人κ轻链转基因(如在fishwild等naturebiotechnology14,845-851(1996)中所描述)，和具有hco7人重链转基因(如us5,770,429中所描述)。hcol2小鼠在它们的内源轻链(κ)基因中具有jkd扰乱(如chen等emboj.12，821-830(1993)中所描述)，在它们的内源重链基因中具有cmd扰乱(如wo01/14424的实施例1中所描述的)，具有kco5人κ轻链转基因(如在fishwild等naturebiotechnology14,845-851(1996)中所描述)，和具有hcol2人重链转基因(如wo01/14424的实施例2中所描述的)。在km小鼠品系(strain)中，内源小鼠κ轻链基因已经被同型结合地(homozygously)扰乱，如chen等emboj.12,811-820(1993)中所描述，以及内源小鼠重链基因已经被同型结合地扰乱,如wo01/09187的实施例1中所描述。该小鼠品系携带人κ轻链转基因kco5，如fishwild等,naturebiotechnology14,845-851(1996)中所描述。该小鼠品系也携带包含染色体14片段hcf(sc20)的人重链转染色体，如wo02/43478中所描述。根据熟知的技术，这些转基因小鼠的脾细胞可用于产生分泌人单克隆抗体的杂交瘤。本发明的人单克隆或多克隆抗体，或本发明的来源于其他物种的抗体，也可通过产生另一非人类哺乳动物或植物以及以可回收的方式从其产生抗体而经转基因产生，所述非人类哺乳动物或植物对于感兴趣的免疫球蛋白重链和轻链序列是转基因的。就哺乳动物中的转基因产生而言，抗体可自山羊、奶牛或其他哺乳动物的奶中产生并从其中回收。见例如，us5,827,690、us5,756,687、us5,750,172和us5,741,957。在一些抗体中，仅需要部分的cdr，即结合所需要的cdr残基的亚群(subset)，称为sdr，以在人源化抗体中保持结合。未接触抗原的和不在sdr中的cdr残基可基于之前的研究从位于chothia高变环之外的kabatcdr的区域中鉴定(例如，cdrh2中的残基h60-h65通常是不需要的)(见kabat等(1992)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,nationalinstitutesofhealthpublicationno.91-3242；chothia,c.等(1987)“canonicalstructuresforthehypervariableregionsofimmunoglobulins,”j.mol.biol.196:901-917)，其通过分子建模和/或经验进行，或如gonzales,n.r.等(2004)“sdrgraftingofamurineantibodyusingmultiplehumangermlinetemplatestominimizeitsimmunogenicity,”mol.immunol.41:863-872中所描述的进行。在这样的人源化抗体中，在一个或更多个供体cdr残基不存在的位置或在整个供体cr被省略的位置，占据所述位置的氨基酸可为在受体抗体序列中占据相应位置(通过kabat编号)的氨基酸。待包括的受体在cdr中对供体氨基酸的这样的取代的数目反应了竞争考虑(competingconsideration)的平衡。这些取代潜在地有利于减小在人源化抗体中的小鼠氨基酸数目，因此减小潜在的免疫原性。但是，取代也可引起亲和力的改变，优选避免亲和力的显著下降。在cdr内的取代位置和用以取代的氨基酸也可根据经验选择。cdr残基的单氨基酸的改变可导致功能性结合的丧失(rudikoff,s.等(1982)“singleaminoacidsubstitutionalteringantigen-bindingspecificity,”proc.natl.acad.sci.(usa)79(6):1979-1983)这一事实提供了系统地鉴定可选的功能性的cdr序列的方法。在用于获得这样的变异的cdr的一个优选的方法中，编码cdr的多核苷酸被诱变处理(例如，通过随机诱变或通过定点方法(例如，用编码突变基因座的引物的聚合酶链介导的扩增))，以产生具有取代的氨基酸残基的cdr。通过比较在原始的(功能性的)cdr序列中的相关残基的身份与取代的(非功能性的)变异的cdr序列的身份，可以确定这个取代的blosum62.iij取代分数。blosum系统提供通过分析序列数据库产生的氨基酸取代的矩阵，用于可靠地比对。(eddy,s.r.(2004)“wheredidtheblosum62alignmentscorematrixcomefrom？,”naturebiotech.22(8):1035-1036；henikoff,j.g.(1992)“aminoacidsubstitutionmatricesfromproteinblocks,”proc.natl.acad.sci.(usa)89:10915-10919；karlin,s.等(1990)“methodsforassessingthestatisticalsignificanceofmolecularsequencefeaturesbyusinggeneralscoringschemes,”proc.natl.acad.sci.(usa)87:2264-2268；altschul,s.f.(1991)“aminoacidsubstitutionmatricesfromaninformationtheoreticperspective,”j.mol.biol.219,555-565。目前，最先进的blosum数据库是blosum62数据库(blosum62.iij)。表1代表blosum62.iij取代分数(分数越高，取代越保守，因此取代将更可能不影响功能)。如果例如包括产生的cdr的抗原-结合片段不能结合至ror1，则blosum62.iij取代分数视为不够保守，因此具有更高的取代分数的新的候选取代被选择和产生。因此，例如，如果原始残基是谷氨酸(e)，以及非功能性取代残基是组氨酸(h)，则blosum62.iij取代分将为0，并且优选更保守的变化(比如，变化至天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或赖氨酸)。本发明因此考虑使用导向的或随机的诱变以鉴定改进的cdr。在本发明上下文中，可通过在下面三个表中的一个或多个中反应的氨基酸的种类内的取代，来限定保守的取代：保守取代的氨基酸残基的种类：可选的保守氨基酸残基取代类别：可选的氨基酸残基的物理和功能分类：更保守的取代基团包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。另外的氨基酸基团也可使用例如creighton(1984)proteins:structureandmolecularproperties(2ded.1993),w.h.freemanandcompany中描述的原则被配制。可选地，噬菌体展示技术可用于增加(或减小)cdr亲和力。该技术称为亲和力成熟(affinitymaturation)，其采用诱变或“cdr步移”以及再选择，其使用靶抗原或其抗原片段以来鉴定这样的抗体：当与初始抗体或亲本抗体相比时，所述抗体具有以更高(或更低)亲和力结合抗原的cdr(见例如，glaser等(1992)j.immunology149:3903)。诱变处理整个密码子而非单核苷酸产生了氨基酸突变的半随机的库。文库可由变异的克隆池构造，每个变异的克隆的差异在于单cdr中的单个氨基酸改变，并且其包含代表对于每个cdr残基的每个可能的氨基酸取代的变体。对于抗原具有增加的(或减小的)结合亲和力的突变体，可通过使固定的突变体与标记的抗原接触来筛选。任何本领域已知的筛选方法可用于鉴定对抗原具有增加或减小的亲和力的突变抗体(例如elisa)(见wu等1998,proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)95:6037；yelton等1995,j.immunology155:1994)。随机化轻链的cdr步移也可被使用(见，schier等1996,j.mol.bio.263:551)。完成这样的亲和力成熟的方法在如下文献中被描述：krause,j.c.等(2011)“aninsertionmutationthatdistortsantibodybindingsitearchitectureenhancesfunctionofahumanantibody,”mbio.2(1)pii:e00345-10.doi:10.1128/mbio.00345-10；kuan,c.t.等(2010)“affinity-maturedanti-glycoproteinnmbrecombinantimmunotoxinstargetingmalignantgliomasandmelanomas,”int.j.cancer10.1002/ijc.25645；hackel,b.j.等(2010)“stabilityandcdrcompositionbiasesenrichbinderfunctionalitylandscapes,”j.mol.biol.401(1):84-96；montgomery,d.l.等(2009)“affinitymaturationandcharacterizationofahumanmonoclonalantibodyagainsthiv-1gp41,”mabs1(5):462-474；gustchina,e.等(2009)“affinitymaturationbytargeteddiversificationofthecdr-h2loopofamonoclonalfabderivedfromasynthetichumanantibodylibraryanddirectedagainsttheinternaltrimericcoiled-coilofgp41yieldsasetoffabswithimprovedhiv-1neutralizationpotencyandbreadth,”virology393(1):112-119；finlay,w.j.等(2009)“affinitymaturationofahumanizedratantibodyforanti-ragetherapy:comprehensivemutagenesisrevealsahighlevelofmutationalplasticitybothinsideandoutsidethecomplementarity-determiningregions,”j.mol.biol.388(3):541-558；bostrom,j.等(2009)“improvingantibodybindingaffinityandspecificityfortherapeuticdevelopment,”methodsmol.biol.525:353-376；steidl,s.等(2008)“invitroaffinitymaturationofhumangm-csfantibodiesbytargetedcdr-diversification,”mol.immunol.46(1):135-144；和barderas,r.等(2008)“affinitymaturationofantibodiesassistedbyinsilicomodeling,”proc.natl.acad.sci.(usa)105(26):9029-9034。术语"转基因的非人类动物"指这样的非人类动物，其基因组包含一个或多个人重链和/或轻链转基因或转染色体(整合或非整合到动物天然基因组dna中)，且其能够表达全人抗体。例如，转基因小鼠可具有人轻链转基因以及人重链转基因或人重链转染色体，以便当用tau抗原和/或表达tau细胞对小鼠免疫时，小鼠产生人抗-tau抗体。人重链转基因可整合到小鼠的染色体dna中，如转基因小鼠的情况，例如humab小鼠，比如hco7或hcol2小鼠，或者人重链转基因可保持在染色体外，如wo02/43478中所描述的转染色体km小鼠的情况。这样的转基因的和转染色体的小鼠(本文统称为"转基因小鼠")，通过经历v-d-j重组和同种型转换，能够针对给定的抗原产生多种人单克隆抗体的同种型(比如igg、iga、igm、igd和/或ige)。本发明的抗体或其表位结合片段作为tau显像探针的用途，因它们的特异性而具有极好的潜力。由于血脑屏障的总体的不渗透性，已经发现较小的单链可变抗体片段(scfv分子)作为体内显像配体以检测tau病变是优选的。scfv分子作为抗体的重(h)链结构域和轻(l)链结构域的可变区，彼此通过大约10到大约25个氨基酸残基的短的连接体肽相连，的融合蛋白而形成。为了柔性，连接体通常富含甘氨酸(例如，ggggsggggsggggs(seqidno:2)(fisher,a.等(2009)“efficientisolationofsolubleintracellularsingle-chainantibodiesusingthetwin-argininetranslocationmachinery,”j.nol.biol.385(1):299-311；bird,r.e.等(1988)“single-chainantigen-bindingproteins,”science242:423-426；huston,j.s.等(1988)“proteinengineeringofantibodybindingsites:recoveryofspecificactivityinananti-digoxinsingle-chainfvanalogueproducedinescherichiacoli,”proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)85:5879-5883)，以及为了溶解性，连接体富含丝氨酸或苏氨酸，且可将重链可变结构域的n-末端与轻链可变结构域的c-末端连接，反之也可(huang,l.等(2013)“single-chainfragmentvariablepassiveimmunotherapiesforneurodegenerativediseases,”int.j.mol.sci.14(9):19109-19127；ahmad,z.a.等(2012)“scfvantibody:principlesandclinicalapplication,”clin.dev.immunol.2012:980250；huhalov,a.等(2004)“engineeredsinglechainantibodyfragmentsforradioimmunotherapy,”q.j.nucl.med.mol.imaging48(4):279-288)。这样的连接体的实例是gstsgsgkpgsgegstkg(seqidno:3)(whitlow,m.等(1993)“animprovedlinkerforsingle-chainfvwithreducedaggregationandenhancedproteolyticstability,”proteineng.6:989–995)。本发明特别优选的连接体具有氨基酸序列(seqidno:4):ssggggsggggggssrss。为了有助于纯化和/或回收，scfv可包括多组氨酸(polyhistidine)(“his-标签(his-tag)”)(例如(seqidno:5)hhhhhh)。his-标签的组氨酸残基的咪唑侧链可以以可逆的配位键与某些过度金属离子，比如co2+、zn2+以及特别是ni+2，接合。因此，当his-标识的scfv分子被应用至包含这样的金属离子的基质时，它们特异性地结合至基质，而大部分未标识的蛋白并非如此。scfv可另外地或可选地包括“ha-标签”，比如(seqidno:6)gaypydvpdyas。人流感血凝素(ha)是人病毒的感染性所需要的表面糖蛋白。ha-标签源于人流感血凝素(ha)表面糖蛋白，并且允许使用抗ha-标签抗体(微孔过滤器(millipore))检测scfv。scfv分子可直接地被表达或作为融合蛋白表达，其连接至前导肽的n-末端，所述前导肽被切割以产生scfv(见例如，huston,j.s.等(1988)“proteinengineeringofantibodybindingsites:recoveryofspecificactivityinananti-digoxinsingle-chainfvanalogueproducedinescherichiacoli,”proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)85:5879-5883)。例如，scfv可被融合至修饰的trple前导肽(mle))，并且通过asp-pro肽键的酸切割而被切去(piszkiewicz,d.等(1970)“anomalouscleavageofaspartyl-prolinepeptidebondsduringaminoacidsequencedeterminations,”biochem.biophys.res.commun.40(5):1173-1178；fraser,k.j.等(1972)“specificcleavagebetweenvariableandconstantdomainsofrabbitantibodylightchainsbydiluteacidhydrolysis,”biochemistry11(26):4974-4977；poulsen,k.等(1972)“anactivederivativeofrabbitantibodylightchaincomposedoftheconstantandthevariabledomainsheldtogetheronlybyanativedisulfidebond,”proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)69(9):2495-2499)。在进一步的实施方式，scfv可被连接至另外的scfv(其可为相同的或不同的)以形成二价分子。这可通过产生具有两个vh区和两个vl区的单肽链完成，产生串联的scfv分子(xiong,c.-y.等(2006)“developmentoftumortargetinganti-muc-1multimer:effectsofdi-scfvunpairedcysteinelocationonpegylationandtumorbinding,”proteinengineeringdesignandselection19(8):359-367；kufer,p.等(2004)“arevivalofbispecificantibodies,”trendsinbiotechnology22(5):238-24)。可选地，通过形成scfv，其重链可变结构域与其轻链可变结构域通过连接体而分离，所述连接体太短以至于不允许这样的结构域彼此复合(complex)以及形成表位-结合位点，可以迫使两个scfv分子作为双抗体二聚化(hollinger,p.等(1993)“diabodies”:smallbivalentandbispecificantibodyfragments,”proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)90(14):6444-6448)。已经证明双抗体的解离常数是相应的scfv分子的至少四十分之一，这意味着它们对其靶具有远远更好的亲和力。因此，双抗体药可以相比于其他治疗用抗体少得多的剂量被施用，并且能够在体内高特异性地靶向肿瘤(adams,g.p.等(1998)“prolongedinvivotumourretentionofahumandiabodytargetingtheextracellulardomainofhumanher2/neu,”brit.j.cancer77(9):1405-1412)。还是短仍较短的连接体(一个或两个氨基酸)导致三聚体的形成，所谓三抗体(triabodies)或三抗体(tribodies)。也已经产生四抗体。它们相比于双抗体，显示与其靶的甚至更高的亲和力(legall,f.等(1999)“di-,tri-andtetramericsinglechainfvantibodyfragmentsagainsthumancd19:effectofvalencyoncellbinding,”febsletters453(1):164-168)。所有这些形式均可由可变scfv分子构成，以形成对两种或更多不同表位具有特异性的二聚体、三聚体等等(例如，双特异性双抗体等)(dincq,s.等(2001)“expressionandpurificationofmonospecificandbispecificrecombinantantibodyfragmentsderivedfromantibodiesthatblockthecd80/cd86-cd28costimulatorypathway,”proteinexpress.purificat.22(1):11-24)。如下述讨论，合适的scfv分子从scfv分子的文库被分离，所述scfv分子使用组合的噬菌体展示技术自tau抗体杂交瘤产生(见例如，美国专利号5,565,332；5,580,717；5,733,743；6,265,150；和winter,g.等(1994)“makingantibodiesbyphagedisplaytechnology,”annu.rev.immunol.12.433-455)。很多磷酸化-tau-选择性scfv分子被鉴定，并且它们对tau的反应性通过免疫沉淀、人和小鼠的tau蛋白病组织的染色以及亲和力分析被确认。这些scfv分子的外周注射在转基因的tau蛋白病小鼠中导致了强的体内脑信号，但在野生型小鼠中或淀粉样β斑块小鼠中却没有。显示显像信号与探针和神经元内的tau聚集体的共定位关联得非常好。它们都与内体、自噬体和溶酶体的标记物结合，意味着在这些降解途径中它们的互相作用。这样的特异性的抗体衍生的显像探针具有作为用于ad和相关tau蛋白病的诊断标记的极好的潜力。这样的努力导致优选的抗-磷酸化-tau396,404抗体6b2g12的分离，其针对具有氨基酸序(seqidno:7):tdhgaeivykspvvsgdtsprhl的肽(对应于tau蛋白(seqidno:1)的氨基酸残基386-408)被引起(elicited)。在seqidno:7的11和19位的加下划线的丝氨酸残基(对应于tau(seqidno:1)的396和404位)被磷酸化。采用的免疫原包含该肽，被修饰以包含n-末端半胱氨酸残基，其与钥孔血蓝蛋白(klh)缀合。抗体6b2g12的轻链可变结构域具有氨基酸序列(seqidno:8)(cdr加下划线)：抗体6b2g12的重链可变结构域具有氨基酸序列(seqidno:9)(cdr加下划线)：使用抗体以形成scfv分子：scfv235。scfv235的轻链可变结构域具有氨基酸序列(seqidno:10)(cdr加下划线并且以斜体显示与亲本抗体的区别)：scfv235的重链可变结构域具有氨基酸序列(seqidno:11)(cdr加下划线)：因此，scfv235和抗体6b2g12的轻链可变结构域cdr1都有氨基酸序列(seqidno:12)：kssqsllysngktyln。scfv235和抗体6b2g12的轻链可变结构域cdr2都有氨基酸序列(seqidno:13)：lvsklds。scfv235和抗体6b2g12的轻链可变结构域cdr3都有氨基酸序列(seqidno:14)：vqgthsplt。scfv235和抗体6b2g12的重链可变结构域cdr1都有氨基酸序列(seqidno:15)：eytfteytkh。scfv235和抗体6b2g12的重链可变结构域cdr2都有氨基酸序列(seqidno:16)：sinpnngdtyynqkftd。scfv235和抗体6b2g12的重链可变结构域cdr3都有氨基酸序列(seqidno:17)：gdsawfay。scfv235的完整序列是(seqidno:18)：其中氨基酸残基1-114是scfv235(seqidno:10)的轻链可变结构域的氨基酸残基，氨基酸残基115-132是连接体(seqidno:4)的氨基酸残基，氨基酸残基133-249是scfv235(seqidno:11)的重链可变结构域的氨基酸残基。在优选的实施方式中，scfv235作为融合蛋白被制备，所述融合蛋白包括具有氨基酸序(seqidno:19)：iqeefkmkktaiaiavalagfatvaqaa的n-末端前导肽部分，和/或c-末端序列肽部分。c-末端序列肽部分可包括：抗体恒定结构域，比如(seqidno:20)：akttppsvtsgqagq(hussein,a.h.等(2007)“constructionandcharacterizationofsingle-chainvariablefragmentantibodiesdirectedagainstthebordetellapertussissurfaceadhesinsfilamentoushemagglutininandpertactin,”infect.immun.75(11):5476-5482)、his-标签，比如(seqidno:5)：hhhhhh)、和/或ha-标签，比如(seqidno:6)：gaypydvpdyas、或其任意组合或亚组合以及以任何顺序的任何组合或亚组合。优选的c-末端肽部分具有氨基酸序列(seqidno:21)：akttppsvtsgqagqhhhhhhgaypydvpdyas，因此包括(以从n-末端至c-末端的方向)seqidno:20、seqidno:5和seqidno:6。因此，在优选的实施方式中，scfv235融合蛋白将包括seqidnos:22-26中的任何氨基酸序列(在其中scfv融合物的n-末端和/或c-末端肽部分加下划线)：seqidno:22(seqidnos:19和18的融合):seqidno:23(seqidnos：18和20的融合)：seqidno:24(seqidnos:18和21的融合)：seqidno:25(seqidnos:19、18和20的融合)：seqidno:26(seqidnos:19、18和21的融合):虽然scfv能够经过血脑屏障运输，但是可使用各种辅助的方法以进一步促进这样的运输(huang,l.等,(2013)“single-chainfragmentvariablepassiveimmunotherapiesforneurodegenerativediseases,”int.j.mol.sci.14(9):19109-19127)。通过受体介导的胞吞转运使有限的蛋白和肽的组穿过血脑屏障运输(hervé,f.等(2008)“cnsdeliveryviaadsorptivetranscytosis,”aapsj.10(3):455-472)，三个研究最透彻的配体是胰岛素、铁-转铁蛋白(iron-transferrin)和ldl-胆固醇(bickel,u.等(2001)“deliveryofpeptidesandproteinsthroughtheblood-brainbarrier,”adv.drugdeliv.rev.46:247-279；tuma,p.l.等(2003)“transcytosis:crossingcellularbarriers,”physiol.rev.83:871-932)。因此，穿过血脑屏障的scfv的运输可通过融合scfv至抗体或其表位结合片段来促进，所述抗体或其表位结合片段对于这样的配体的受体(例如，人胰岛素受体(hir)、转铁蛋白受体(tfr)、低密度脂蛋白受体-相关蛋1(lrp1)和2(lrp2)、无毒白喉毒素受体/肝素结合表皮生长因子样生长因子等)是免疫特异性的。得到的融合蛋白可通过其与受体的结合而被运输穿过血脑屏障(boado,r.j.等(2010)“igg-singlechainfvfusionproteintherapeuticforalzheimer’sdisease:expressioninchocellsandpharmacokineticsandbraindeliveryintherhesusmonkey,”biotechnol.bioeng.105:627–635；jones,a.r.等(2007)“blood-brainbarriertransportoftherapeuticsviareceptor-mediation,”pharm.res.24(9):1759-1771；wang,y.y.等(2009)“receptor-mediatedtherapeutictransportacrosstheblood-brainbarrier,”immunotherapy1(6):983-993；lajoie,j.m.等(2015)“targetingreceptor-mediatedtransportfordeliveryofbiologicsacrosstheblood-brainbarrier,”annu.rev.pharmacol.toxicol.55:613-631；pardridge,w.m.(2102)“drugtransportacrosstheblood-brainbarrier,”j.cereb.bloodflowmetab.32(11):1959-1972；bhaskar,s.等(2010)“multifunctionalnanocarriersfordiagnostics,drugdeliveryandtargetedtreatmentacrossblood-brainbarrier:perspectivesontrackingandneuroimaging,”part.fibre.toxicol.7:3pp.1-25)。scfv可被增大以包含多聚阳离子肽，所述多聚阳离子肽帮助吸附介导的胞吞转运。合适的多聚阳离子肽包括六亚甲基二胺、腐胺、亚精胺和精胺(hervé,f.等(2008)“cnsdeliveryviaadsorptivetranscytosis,”aapsj.10(3):455-472；kandimalla,k.k.等(2006)“physiologicalandbiophysicalfactorsthatinfluencealzheimer’sdiseaseamyloidplaquetargetingofnativeandputrescinemodifiedhumanamyloidbeta40,”j.pharmacol.exp.ther.318:17-25)。通过酰胺化其部分或全部羧基基团(例如，scfv的羧基-末端基团、或谷氨酸或天冬氨酸残基的羧基侧链)的处理，scfv可被增大，以包括多聚阳离子基团。可选地，scfv可被增大以包含细胞穿透肽(“cpp”)(rao,k.s.等(2009)“targetinganti-hivdrugstothecns,”expertopin.drugdeliv.6(8):771-784；mathupala,s.p.等(2009)“deliveryofsmall-interferingrna(sirna)tothebrain,”expertopin.ther.pat.19(2):137-140；hervé,f.等(2008)“cnsdeliveryviaadsorptivetranscytosis,”aapsj.10(3):455-472)。这样的肽包括hiv-1反式激活转录活化因子(tat)肽、单纯疱疹病毒1型转录因子(hsvvp-22)肽，触角足突变(antennapedia)和穿膜肽(penetratin)(wadia,j.s.等(2004)“transducibletat-hafusogenicpeptideenhancesescapeoftat-fusionproteinsafterlipidraftmacropinocytosis,”nat.med.10:310-315；richard,j.p.等(2003)“cell-penetratingpeptides.areevaluationofthemechanismofcellularuptake,”j.biol.chem.278:585-590；temsamani,j.等(2004)“theuseofcell-penetratingpeptidesfordrugdelivery,”drugdiscov.today9:1012-1019)。iii.本发明的抗体和抗体片段的用途本发明涉及tau-免疫特异性、磷酸化-tau-选择性抗体或其tau-免疫特异性、磷酸化-tau-选择性结合片段，在诊断和/或治疗受试患者中的阿尔茨海默病或tau蛋白病中的用途。对于这样的诊断用途，这样的用途可涉及在受试者(例如在体内)中检测病理tau构象异构体的存在，检测使用本发明的6b2g12抗体或其表位结合片段(特别是scfv235)，其已优选被可检测地标记(这样的分子本文统称为本发明的诊断分子)。可选地，这样的用途可涉及使用本发明的诊断分子在体外检测病理tau构象异构体的存在(例如，在活组织检查样本或死后样本中)。在一个实施方式中，这样的tau-免疫特异性、磷酸化-tau-选择性抗体或tau-免疫特异性、磷酸化-tau-选择性结合片段可为人源化抗体。对于这样的治疗用途，这样的用途可涉及施用治疗有效量的本发明的6b2g12抗体或其表位结合片段(特别是scfv235)至患者，所述患者具有阿尔茨海默病或这样的tau蛋白病的一种或多种症状，因此需要这样的治疗，或其可涉及施用预防有效量的本发明的6b2g12抗体或其表位结合片段(特别是scfv235)至患者，所述患者未展示这样的症状，或展示指示初期阿尔茨海默病或tau蛋白病的轻微痴呆或tau蛋白病前的症状，这样的分子本文统称为本发明的治疗分子。如上所述，优选的scfv抗体(scfv235)对于p-ser396/404具有特异性，但是可协同scfv235使用对于其他tau肽(一种或多种)具有特异性的scfv分子，例如us2008/0050383中描述的那些。如本文所用的术语“tau蛋白病”，包含涉及微管蛋白tau在脑中病理性聚集的任何神经变性疾病。因此，除了家族性和偶发性阿尔茨海默病之外，本发明的tau蛋白病还包括，但不限于：额颞痴呆、与17号染色体连锁的帕金森症(ftdp-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、皮克氏病、进行性皮质下神经胶质增生症、单纯缠结性痴呆、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森症-痴呆综合症、拳击员痴呆、唐氏综合症、吉斯特曼-施特劳斯病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克雅式病、多系统萎缩、尼曼匹克症c型、朊蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、肌强直性营养不良、非-guanamian运动神经元疾病伴随神经元纤维缠结、脑炎后帕金森综合征、急性创伤性脑损伤和慢性创伤性脑病。iv.本发明的tau-结合分子的产生本发明的tau-结合分子优选地经编码其组成多肽链的核酸分子的重组表达而产生。因此，本发明因此也涉及编码本发明的抗体或其片段的这样的一种或多种多肽链的表达载体。在本发明上下文中，表达载体可为任何合适的dna或rna载体，包括染色体的、非染色体的和合成核酸载体(包括合适的表达调控元件的组的核酸序列)。这样的载体的实例包括sv40的衍生物、细菌质粒、噬菌体dna、杆状病毒、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体dna的组合的载体和病毒核酸(rna或dna)载体。在一个实施方式中，编码抗-tau抗体的核酸包括在裸dna或rna载体中，其包括，例如，线性表达元件(例如，如在sykes和johnston,natbiotech12,355-59(1997)中所描述的)、压缩核酸载体(例如，如us6,077,835和/或wo00/70087中所描述的)、质粒载体，比如pbr322、puc19/18或puc118/119、"蠓(midge)"最小尺寸核酸载体(例如，如在schakowski等,moither3，793-800(2001)中所描述的)，或如沉淀(precipitated)核酸载体构建体，比如，cap04-沉淀构建体(例如，如下面文献中所描述的：wo00/46147；benvenisty和reshef,pnasusa83,9551-55(1986)；wigler等cell14,725(1978),andcoraroandpearson,somaticcellgenetics2,603(1981))。这样的核酸载体和其用途是本领域所熟知的(见例如，us5,589,466和us55,973,972)。在一个实施方式中，载体适合在细菌细胞中表达抗-tau抗体或其tau结合片段。这样的载体的实例包括表达载体，比如bluescript(stratagene)、pin载体(vanheeke&schuster，jbiolchem264，5503-5509(1989)、pet载体(novagen，madison，wi)等等)。表达载体也可，或可选地，为适合在酵母系统中表达的载体。可采用任何适合在酵母系统中表达的载体。适合的载体包括，例如，包括组成型或诱导型启动子，比如α因子、醇氧化酶和pgh的载体(在以下中评述：f.ausubel等编辑,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingandwileyintersciencenewyork(1987)；和grant等,methodsinenzymol153,516-544(1987))。在本发明的表达载体中，编码抗-tau抗体的核酸分子(或编码其tau结合片段的核酸分子)可包括任何合适的启动子、增强子和其他表达促进元件，或与任何合适的启动子、增强子和其他表达促进元件结合。这样的元件的实例包括强表达启动子(例如，人cmvie启动子/增强子以及rsv、sv40、sl3-3、mmtv和hivltr启动子)、有效的多聚腺苷终止序列、在大肠埃希氏菌(e.coli)中的质粒的复制起点、抗生素抗性基因作为选择标记物和/或常见的克隆位点(例如，多连接体)。与组成型启动子相对，核酸也可包括诱导型启动子，比如cmvie(本领域技术人员应认识到，这样的术语事实上是对于在某条件下基因表达的程度的描述词)。在甚至更进一步的方面，本发明涉及重组真核或原核生物宿主细胞，比如转染瘤，其产生如本文定义的本发明的抗体或如本文定义的本发明的双特异性分子。宿主细胞的实例包括酵母、细菌和哺乳动物细胞，比如cho或hek细胞。例如，在一个实施方式中，本发明提供包括稳定地整合到细胞基因组中的核酸的细胞，所述细胞基因组包括编码用于本发明的抗-tau抗体或其tau结合片段的表达的序列。在另外的实施方式中，本发明提供包括非整合核酸的细胞，比如质粒、黏粒、噬菌粒或线性表达元件，其包括编码用于本发明的抗-tau抗体或其这样的片段的表达的序列。在进一步的方面，本发明涉及用于产生本发明的抗-tau抗体的方法，所述方法包括步骤a)培养本发明的如上文所述的杂交瘤或宿主细胞，和b)从培养基纯化本发明的抗体。一般而言，可通过包括任何合适数量的被修饰的氨基酸和/或与这样的缀合的取代基结合来修饰产生的抗-tau抗体和其tau结合片段。在这样的情况中，通常通过至少实质上保持与非衍生化的亲本抗-tau抗体相关的抗-tau选择性和/或抗-tau特异性的能力来确定适合性。包括一种或多种被修饰的氨基酸在以下方面可以是有利的：例如增加多肽血清半衰期、降低多肽抗原性或增加多肽储存稳定性。氨基酸在重组产生过程中，经例如共翻译或后翻译被修饰(例如，在哺乳动物细胞中表达过程中，在n-x-s/t基序的n-连接的糖基化)或通过合成方法被修饰。修饰氨基酸的非限制性实例包括糖基化氨基酸、含硫氨基酸、异戊二烯化(例如，法尼化(farnesylated)、牻牛儿基牻牛儿基化(geranylgeranylated))氨基酸、乙酰化氨基酸、酰化氨基酸、peg化(pegylated)氨基酸、生物素化(biotinylated)氨基酸、羧化氨基酸、磷酸化氨基酸等等。在全部文献中充满了足以引导技术人员修饰氨基酸的参考文献。示例性的方案可见于walker(1998)proteinprotocolsoncd-rom,humanapress,totowa,nj。修饰的氨基酸可选自，例如，糖基化氨基酸、peg化氨基酸、法尼化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸或与有机衍生剂缀合的氨基酸。如上所述，当需要增加施用的本发明的治疗分子的半衰期时，可使这样的分子形成为包括碳水化合物部分，比如聚氧乙烯化多元醇或聚乙二醇(peg)(例如，分子量在大约1,000和大约40,000之间的peg，比如在大约2,000和大约20,000之间，例如，大约3,000-12,000g/mol之间)(moosmann,a.等(2014)“purificationofpegylatedproteins,withtheexampleofpegylatedlysozymeandpegylatedscfv,”methodsmol.biol.1129:527-538；jevsevar,s.等(2010)“pegylationoftherapeuticproteins,”biotechnol.j.5:113-228)，或通过糖基化、或通过添加或结合蛋白，蛋白比如人血清白蛋白(müller,m.r.等(2012)“improvingthepharmacokineticpropertiesofbiologicsbyfusiontoananti-hsasharkvnardomain,”mabs.4(6):673-685；stork,r.等(2008)“n-glycosylationasnovelstrategytoimprovepharmacokineticpropertiesofbispecificsingle-chaindiabodies,”j.biol.chem.283:7804-7812；alt,m.等(1999)“noveltetravalentandbispecificigg-likeantibodymoleculescombiningsingle-chaindiabodieswiththeimmunoglobulingamma1fcorch3region,”febslett.454:90-94；peterst.等(1985)“serumalbumin,”adv.proteinchem.37:161-245)。示例性的多聚合物和将其连接至多肽的方法是已知的(见例如，美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546)。v.本发明的药物组合物本发明的tau-结合分子通常作为药物组合物施用，药物组合物包括活性治疗剂和各种其他药学上可接受的组分。见remington:thescienceandpracticeofpharmacy(第21版)(2005)(troy，d.b.等(eds.)lippincottwilliams&wilkins(publs.)，baltimoremd)，其在此通过引用以其整体并入本文。优选的形式取决于意图的施用模式和治疗应用。取决于期望的制剂，组合物也可包括药学上可接受的、非毒性载体、赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、清洁剂(例如非离子清洁剂，比如tween-20或tween-80)、稳定剂(例如糖或蛋白游离氨基酸(protein-freeaminoacids))、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或其他材料，所述其他材料是适合包括到药物组合物中的且其为通常用于配制用于动物或人施用的药物组合物的媒介。选择稀释剂以不影响组合的生物活性。这样的稀释剂的实例是蒸馏水、磷酸盐-缓冲生理盐水、林格式溶液、葡萄糖溶液和hank’s溶液。另外，药物组合物或制剂也可包括其他载体、或非毒性、非治疗性、非免疫源性稳定剂等等。可在本发明的药物组合物中采用的合适的水性的和非水性的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、葡萄糖、多元醇(比如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)和其合适的混合物、植物油，比如橄榄油、玉米油、花生油、棉花籽油和芝麻油、羧甲基纤维素胶体溶液、西黄芪胶和可注射的有机酯，比如油酸乙酯和/或各种缓冲剂。其他的载体在药物学领域是熟知的。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及无菌粉末，用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备。这样的介质和剂用于药学上活性物质的用途在本领域是已知的。除了目前与活性化合物不兼容的任何传统的介质或剂之外，考虑其在本发明药物组合物中的用途。组合物也可包括大的、缓慢代谢的大分子，比如蛋白质、多糖如壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如，乳胶官能化的琼脂糖(sepharose)、琼脂糖(agarose)、纤维素等等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(例如，油滴或脂质体)。基于对本发明选择的化合物或药物组合物针对抗原结合的期望生物学性质没有显著消极影响(例如，少于实质影响(10％或更少的相对抑制、5％或更少的相对抑制等等))，鉴定药物组合物的载体和其他组分的适合性。本发明的药物组合物也可包括药学上可接受的抗氧化剂，例如(1)水可溶性的抗氧化剂，比如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等等；(2)油-可溶性的抗氧化剂，比如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(bha)、丁基羟基甲苯(bht)、卵磷脂、棓酸丙酯、α-生育酚等等；和(3)金属螯合剂，比如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸、磷酸等等。本发明的药物组合物也可在组合物中包括等渗剂(isotonicityagents)，比如糖、多元醇，比如甘露醇、山梨醇、甘油或氯化钠。本发明的药物组合物也可包含一种或多种适于选择的施用途径的佐剂，比如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂，其可提高药物组合物的保存期或有效性。本发明的化合物可与保护化合物不快速释放的载体一起制备，比如控释制剂，包括植入物(implant)、透皮贴片和微胶囊化递送系统。这样的载体可包括明胶、单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、可生物降解的、生物相容的聚合物，比如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸，胶原、聚原酸酯和聚乳酸，单独地或同蜡或其他本领域熟知的材料一起。用于制备这样的制剂的方法通常是本领域技术人员所知道的。见例如，sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems,j.r.robinson编辑,marceldekker,inc.,newyork,1978。在一个实施方式中，本发明的化合物可被配制以保证在体内适当地分布。用于肠胃外施用的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及无菌粉末，用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备。这样的介质和剂用于药学上活性物质的用途是本领域已知的。除了目前与活性化合物不兼容的任何传统的介质或剂之外，考虑其在本发明药物组合物中的用途。补充性的活性化合物也可包括到组合物中。用于注射的药物组合物通常在制造和储存条件必须为无菌和稳定的。组合物可作为溶液、微乳剂、脂质体、或适合高药物浓度的其他有序结构(orderedstructure)被配制。载体可为水性溶剂或非水性溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(比如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)和其合适的混合物、植物油，比如橄榄油和可注射的有机酯，比如油酸乙酯。可保持适当的流动性，例如，通过使用涂层比如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持要求的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂(isotonicagents)，例如，糖、多元醇，比如甘油、甘露醇、山梨醇或氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收的剂来实现可注射的组合物的延长的吸收，所述延迟吸收的剂例如，单硬脂酸盐和明胶。可通过在合适的溶剂中掺入需要量的活性化合物与一种例如如上面列举的成分或成分的组合(如需要)，然后进行杀菌微滤，来制备无菌可注射溶液。通常，通过在无菌媒介中掺入活性化合物制备分散体，所述无菌媒介包含基本分散介质和需要的其他成分，比如来自上面列举的那些。在无菌粉末用于无菌可注射溶液的制备的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)以产生活性成分的粉末加上来自其之前的无菌-过滤溶液的任何另外的期望成分。可通过在合适的溶剂中掺入需要量的活性化合物与一种如上面列举的成分或成分的组合(如需要)，然后进行杀菌微滤，来制备无菌可注射溶液。通常，通过在无菌媒介中掺入活性化合物制备分散体，所述无菌媒介包含基本分散介质和需要的来自上面列举的其他成分。在无菌粉末用于无菌可注射溶液的制备的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)以产生活性成分的粉末加上来自其之前的无菌-过滤溶液的任何另外的期望成分。对于肠胃外施用，本发明的剂通常与药物载体一起在生理上可接受的稀释剂中被配制为物质的溶液或悬夜的可注射剂量，所述药物载体可为无菌液体，比如水、油、盐水、甘油或乙醇。另外，助剂(auxiliarysubstances)，比如润湿或乳化剂、表面活性剂、ph缓冲物质等等可在组合物中存在。药物组合物的其他组分是石油来源，动物来源、植物来源或合成来源那些。花生油、大豆油和矿物油都是有用的材料的实例。一般而言，乙二醇，比如丙二醇或聚乙二醇，是优选的液体载体，尤其对于可注射溶液来说。本发明的剂可以储库(depot)注射剂或植入物制剂的形式施用，所述制剂形式可以这样的方式被配置，以允许活性原料的缓释。示例的组合物包括大约5mg/ml的scfv235，其在水性缓冲溶液中配制，缓冲溶液由50mml-组氨酸、150mmnacl组成，用hcl调节至ph6.0。通常，组合物因此被制备为可注射的，作为液体溶液或悬夜；适合注射前的液体媒介中的溶液或悬夜的固体形式也可被制备。制剂也可在脂质体或微粒，比如聚交酯、聚乙醇酸交酯或共聚物，中被乳化或胶囊化，以增强佐剂效果(langer,等science249:1527(1990)；hanes,等advanceddrugdeliveryreviews28:97-119(1997)，其通过引用以其整体并入本文)。适合其他施用模式的另外的制剂包括口服制剂、鼻内制剂和肺部制剂、栓剂和经皮肤应用。vi.本发明的药物组合物的施用本发明的分子可经肠胃外、局部的、口服的或鼻内的途径施用，用于预防性和/或治疗性治疗。肌肉注射(例如，进入手臂或腿肌肉中)和静脉内输注是本发明的分子的优选的施用方法。在一些方法中，这样的分子作为缓释组合物或设备施用，所述设备比如medipadtm设备(elanpharm.technologies,都柏林,爱尔兰)。在一些方法中，本发明的分子被直接注射到已经积累沉积物的特定的组织中，例如颅内注射。在一个实施方式中，本发明的药物组合物经肠胃外施用。如本文所用的短语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”表示非肠内和局部施用的施用模式，通常通过注射，包括表皮、静脉内、肌肉、动脉内、鞘内、囊内、颅内、眶内、心内、皮内、腹膜内、腱内(intratendinous)、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下的、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸内、硬膜外和胸骨内注射、皮下和输注。在一个实施方式中，药物组合物通过静脉内或皮下注射或输注来施用。在预防性应用中，药物组合物或药物被施用至易患阿尔茨海默病的患者，或有阿尔茨海默病风险的另外的患者，施用的量足以消除或降低风险、减少严重性或延迟疾病发作，包括疾病的生化的，组织学的和/或行为症状，在疾病的发展过程中存在的其并发症和中间的病理表型。在治疗应用中(例如，在涉及已经被诊断为患有阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的患者的应用中)，本发明的治疗分子被施用至这样的患者，施用的量足以治愈、治疗或至少部分抑制疾病的症状(如生化的、组织学的和/或行为评估所证明的)，所述症状包括在疾病的发展过程中其并发症和中间的病理表型。在一些实施方式中，施用本发明的治疗分子降低或消除在还未发展特征性阿尔茨海默病理的患者中的轻微认知损伤。本发明提供的治疗分子，用于治疗上述病况的有效剂量可随着许多不同的因素而变化，因素包括施用方法、靶位点、患者的生理状态、施用的其他药品以及治疗是预防性的还是治疗性的。治疗剂量通常被滴定(titrated)以最优化其安全和效力。在给予剂量的任何给定日，剂量范围可为大约0.0001至大约100mg/kg宿主体重，更通常大约0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg体重范围内。示例的剂量因此包括：从大约0.1至大约10mg/kg/体重、从大约0.1至大约5mg/kg/体重、从大约0.1至大约2mg/kg/体重、从大约0.1至大约1mg/kg/体重，例如大约0.15mg/kg/体重、大约0.2mg/kg/体重、大约0.5mg/kg/体重、大约1mg/kg/体重、大约1.5mg/kg/体重、大约2mg/kg/体重、大约5mg/kg/体重或大约10mg/kg/体重具有本领域普通技术的医生或兽医可容易地确定或指定需要的药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可从在药物组合中采用低于达到期望的治疗效果所需要的水平的抗-tau抗体或片段的剂量开始，然后逐渐增加剂量，直到达到期望的效果。总的来说，本发明组合物的合适的每日剂量将为有效产生治疗效果的最低的剂量水平的化合物的量。这样的有效剂量通常取决于上面描述的因素。施用可为例如静脉内、肌肉、腹膜内或皮下施用，例如靠近靶位点施用。如需要，药物组合物的有效的每日剂量可以两个、三个、四个、五个、六个或更多个的亚剂量(sub-doses)在全天以合适的间隔分别施用，任选地，以单位剂量形式施用。虽然单独施用本发明的化合物是可能的，但优选以上面所描述的药物组合物来施用化合物。示例的治疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6月施用一次。在一些方法中，一种、两种或更多种抗体(或其表位结合片段)将与本发明的治疗分子的施用结合施用，在这种情况下，每种这样的施用分子的剂量落入所描述的范围内。施用的剂量和频率，可随治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在长的时间段内，以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔的相对高的剂量，直到疾病的发展被减轻或终止为止，以及优选地，直到患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可使用预防性剂量方案向患者施用这样的治疗分子。为了治疗目的，本发明的分子通常在多个时机被施用。在单次剂量(例如，大丸药或输注)之间的区间可为每周的、每月的或每年的。在一些方法中，剂量被调整，以实现1-1000μg/ml的血浆浓度，以及在一些方法中，实现25-300μg/ml的血浆浓度。可选地，本发明的治疗分子可作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较不频繁的施用。剂量和频率随着抗体在患者中的半衰期而变化。总的来说，人抗体显示最长的半衰期，接下来是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。scfv分子通常有短的血清半衰期。本发明的另一方面是联合疗法，其中识别tau蛋白或其免疫源性表位的另外的抗体或其表位结合片段，联合本发明的治疗分子被施用。在促淀粉样变性(amyloidogenic)疾病，比如阿尔茨海默病和唐氏综合症的情况下，清除淀粉状蛋白-β(aβ)沉积的免疫调节是新兴疗法。靶向aβ的免疫疗法持续导致认知改善。很可能tau和aβ病理是协同作用的。因此，同时把两个病理的清除都作为目标的联合疗法，相较于把每个单独作为目标更有效。在帕金森疾病和相关神经变性疾病的情况，清除α-突触核蛋白蛋白质的聚集形式的免疫调节也是新兴疗法。同时把tau和α-突触核蛋白蛋白质的清除作为目标的联合疗法可比把每个单独作为目标更有效。vii.本发明的tau-结合分子的用途a.诊断用途使用本发明的诊断分子，检测病理tau构象异构体在受试者中的存在，可通过如下方式实现：从受试者获得生物样品(例如，血液、尿、脑脊液)，使生物样品与所述诊断抗体接触以及检测诊断分子与受试者的样品中的病理tau蛋白构象异构体的结合。用于进行在生物样品中的病理tau蛋白的检测的试验可容易地适用于本发明的诊断分子的检测，这在本领域是熟知的，并且包括，但不限于，elisa、免疫组织化学、蛋白质印迹。可选地，可通过使用体内显像技术，实现使用本发明的诊断分子检测在受试者中病理tau蛋白构象异构体的存在。体内显像涉及向受试者施用具有对病理tau肽的抗原特异性的诊断抗体，并且检测诊断抗体试剂在体内与病理tau蛋白构象异构体的结合。本发明的诊断分子可通过注射(例如，静脉内注射、颈动脉内注射等等)被施用到患者身体中，或通过颅内注射直接施用到脑中。这样的分子的剂量应为从大约0.0001mg/kg宿主体重至大约100mg/kg宿主体重，并且更通常地从大约0.01mg/kg宿主体重至大约5mg/kg宿主体重。例如，剂量可为大约1mg/kg体重或大约10mg/kg体重或在大约1-10mg/kg的范围内。典型地，本发明的诊断分子被标记，虽然在一些方法中，分子可为未标记的，并且二级标记剂被用于与这样的分子结合(使用在本领域已知的技术，与分子直接连接或缀合，或通过中间体(比如，例如，本领域已知的连接体)与分子间接连接或缀合)。标记的选择取决于检测的手段。例如，荧光标记(比如，稀土螯合物(例如铕螯合物))、荧光素(fluorescein)-型标记(例如，荧光素、异硫氰酸荧光素、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、二氯三嗪基胺荧光素)、若丹明型标记(例如alexa568(invitrogen)、或丹磺酰氯(dansylchloride))、vivotag680xlfluorochrometm(perkinelmer)、藻红素、7-羟基香豆素、丽丝胺(lissamine)、花菁、藻红素、德克萨斯红(texasred)、bodipyfl-(invitrogen)或其类似物，是适合光学检测的。可采用化学发光标记(例如，鲁米诺(luminol)、荧光素酶、虫荧光素(luciferin)和水母发光蛋白)。这样的诊断和检测也可通过将本发明的诊断分子与可检测的物质连接来完成，所述可检测的物质包括但不限于，各种酶，酶包括但不限于，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶，或通过将其与辅基复合物(prostheticgroupcomplexes)连接来完成，所述辅基复合物比如，但不限于，链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。也可采用顺磁性标记和放射性同位素标记，其优选地使用正电子放射断层成像术(positronemissiontomography)(pet)或单光子计算机断层成像术(single-photonemissioncomputedtomography)(spect)被检测。放射性标记包括但不限于，铋(213bi)、碳(11c、13c、14c)、铬(51cr)、钴(57co、60co)、铜(64cu)、镝(165dy)、铒(169er)、氟(18f)、钆(153gd、159gd)、镓(68ga、67ga)、锗(68ge)、金(198au)、钬(166ho)、氢(3h)、铟(111in、112in、113in、115in)、碘(121i、123i、125i、131i)、铱(192ir)、铁(59fe)、氪(81mkr)、镧(140la)、镥(177lu)、锰(54mn)、钼(99mo)、氮(13n、15n)、氧(15o)、钯(103pd)、磷(32p)、钾(42k)、镨(142pr)、钷(149pm)、铼(186re、188re)、铑(105rh)、铷(81rb、82rb)、钌(82ru、97ru)、钐(153sm)、钪(47sc)、硒(75se)、钠(24na)、锶(85sr、89sr、92sr)、硫(35s)、锝(99tc)、铊(201tl)、锡(113sn、117sn)、氙(133xe)、镱(169yb、175yb、177yb)、钇(90y)和锌(65zn)；使用各种正电子放射断层成像术的正电子发射金属和非放射性顺磁性金属离子(比如，顺磁性铝(al)离子、钡(ba)离子、钙(ca)离子、铈(ce)离子、镝(dy)离子、铒(er)离子、铕(eu)离子、钆(gd)离子、钬(ho)离子、铱(ir)离子、锂(li)离子、镁(mg)离子、锰(mn)离子，钼(m)离子、钕(nd)离子、锇(os)离子、氧(o)离子、钯(pd)离子、铂(pt)离子、铑(rh)离子、钌(ru)离子、钐(sm)离子、钠(na)离子、锶(sr)离子、铽(tb)离子、铥(tm)离子、锡(sn)离子、钛(ti)离子、钨(w)离子和锆(zi)离子，以及尤其是co+2、cr+2、cr+3、cu+2、fe+2、fe+3、ga+3、mn+3、ni+2、ti+3、v+和v+4)。制备放射性标记的氨基酸和相关的肽衍生物的方法在本领域是已知的(见例如，junghans等，在以下中：cancerchemotherapyandbiotherapy655-686(第二版，chafner和longo，编辑，lippincottraven(1996))和美国专利号4,681,581；4,735,210；5,101,827；5,102,990；re35,500；5,648,471和5,697,902。例如，可通过氯胺t法缀合放射性同位素(lindegren,s.等(1998)“chloramine-tinhigh-specific-activityradioiodinationofantibodiesusingn-succinimidyl-3-(trimethylstannyl)benzoateasanintermediate,”nucl.med.biol.25(7):659-665；kurth,m.等(1993)“site-specificconjugationofaradioiodinatedphenethylaminederivativetoamonoclonalantibodyresultsinincreasedradioactivitylocalizationintumor,”j.med.chem.36(9):1255-1261；rea,d.w.等(1990)“site-specificallyradioiodinatedantibodyfortargetingtumors,”cancerres.50(3suppl):857s-861s)。通过将在受试者中或来自受试者的样品中标记病理tau构象异构体、tau聚集体和/或神经元纤维缠结的数目、大小和/或强度与相应的基线值比较，来进行诊断。基线值可代表在非患病个体的群体中的平均水平。基线值也可代表相同受试者中测定的从前的水平。上面描述的诊断方法也可用于监控受试者对治疗的响应。在该实施方式中，在治疗开始前，确定病理tau在受试者中的存在的检测。在该时间点，病理tau在受试者中的水平被用作基线值。在治疗过程中的各种时间点，重复病理tau蛋白构象异构体、tau聚集体和/或神经元纤维缠结的检测，并且测量值此后与基线值比较。相对于基线的值的减小，表示对治疗的积极的响应。随着从脑中清除病理tau，值也可在生物流体中临时增加。本发明进一步涉及用于进行上述诊断和监控方法的试剂盒。典型地，这样的试剂盒包含本发明的诊断抗体。试剂盒也可包括可检测标记。诊断抗体本身可包含可检测标记(例如，荧光分子、生物素等等)，其是直接可检测的或经二级反应(例如与链酶抗生物素的反应)可检测的。可选地，可应用包含可检测标记的第二剂，第二剂对于初级抗体有结合特异性。在适合用于在生物样品中测量病理tau蛋白的诊断试剂盒中，试剂盒的抗体可预结合(pre-bound)至固相，比如预结合至微量滴定盘(microtiterdish)的孔被提供。b.治疗用途为诊断的目的，可体内检测标记的抗-tau抗体或其结合片段的存在。在一个实施方式中，这样的诊断包括：a)施用有效量的这样的标记分子至受试者；b)在施用后等待一段时间间隔，以允许标记的分子集中在聚集的tau的位点(如果有)，并且允许未结合的标记分子被清除至背景水平；c)测定背景水平；和d)检测受试者中的这样的标记的分子，这样超过背景水平的标记的分子的检测指示受试者有tau蛋白病或指示这样的tau蛋白病的严重性。根据这样的实施方式，抗体被标记以适合使用本领域技术人员已知的具体显像系统检测的显像部分标记。背景水平可通过各种本领域已知的各种方法测定，所述方法包括比较检测的标记分子的量与之前针对特定显像系统确定的标准值。可用在本发明的诊断方法中的方法和系统，包括但不限于，计算机断层成像术(ct)、全身扫描，比如正电子放射断层成像术(pet)、磁共振显像(mri)和超声波扫描术。如本文所用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指改善、减缓或逆转疾病或病症的发展或严重性，或改善、减缓或逆转这样的疾病或病症的一种或多种症状或副作用。为本发明的目的，“治疗(treatment)”或“治疗(treatment)”还指用于获得有益或期望的临床结果的方法，其中“有益或期望的临床结果”包括，但不限于，减轻症状、减小病症或疾病的程度、稳定(即，不恶化)疾病或病症状态、延迟或减缓疾病或病症状态的发展、疾病或病症状态的改善或缓和，以及疾病或病症的缓解，无论部分的还是全部的，可检测的还是不可检测的。当用于本发明的抗体时，“有效量”是指，以剂量和在需要的时间段足以实现意图的生物效果或期望的治疗结果的量，所述生物效果或期望的治疗结果包括但不限于临床结果。当用于本发明的抗体时，短语“治疗有效量”旨在表示这样的抗体的量：所述抗体的量足以改善、缓和、稳定、逆转、减缓或延迟病症或疾病状态的发展，或病症或疾病症状的发展。在实施方式中，本发明的方法使抗体与其他化合物联合施用。在这样的例子，“有效量”是足以引起意图的生物效果的联合的量。如上所述，本发明的一方面涉及预防或治疗受试者中的阿尔茨海默病或其他tau蛋白病的方法，其通过施用有效量的抗体6b2g12或其表位结合片段(特别是scfv235)，以预防或治疗这样的阿尔茨海默病或其他tau蛋白病。可提供这样的施用，以促进从受试者的脑清除tau聚集体，或提供这样的施用，以减缓受试者中的缠结相关的行为表型。另外，这样的施用可预防性地提供，以延迟、阻碍、减弱或预防阿尔茨海默病或与神经元纤维缠结相关的其他tau蛋白病的发作。足以实现治疗性或预防性治疗的量分别被定义为治疗有效剂量或预防有效剂量。在预防性和治疗性方案两者中，通常以若干剂量施用剂，直到实现充分的免疫反应。典型地，如果免疫反应开始衰落，监控免疫反应并且给予重复剂量。这样的抗体或其表位结片段的治疗有效剂量或预防有效剂量可根据因素变化，所述因素比如疾病状态，年龄，性别和个体重量，以及分子在受试者中引发期望的响应的能力。治疗有效量也是这样的量之一：其中，有益治疗效果超过任何抗体或抗体部分的有毒的或伤害的效果。服从治疗的患者包括患有阿尔茨海默病或患有这样的其他tau蛋白病的个体，所述个体显示临床公认的这样的病况的症状或适应症，以及目前没有显示这样的病况的症状的患者。虽然阿尔茨海默病仅在死后活组织检查中被确认诊断，但临床上使用“阿尔茨海默病和相关病症协会(“adrda”)标准(carrillo,m.c.等(2013)“revisitingtheframeworkofthenationalinstituteonaging-alzheimer’sassociationdiagnosticcriteria,”alzheimersdement.9(5):594-601；budson,a.e.等(2012)“newcriteriaforalzheimerdiseaseandmildcognitiveimpairment:implicationsforthepracticingclinician,”neurologist18(6):356-363；sarazin,m.等(2012)“clinicalandresearchdiagnosticcriteriaforalzheimer’sdisease,”neuroimagingclin.n.amer.22(1):23-32；husain,m.m.(2005)“clinicaldiagnosisandmanagementofalzheimer’sdisease,”neuroimagingclin.n.amer.15(4):767-777；small,g.w.等(1997)“diagnosisandtreatmentofalzheimerdiseaseandrelateddisorders.consensusstatementoftheamericanassociationforgeriatricpsychiatry,thealzheimer’sassociation,andtheamericangeriatricssociety,”jama278(16):1363-1371)诊断患有阿尔茨海默病的个体。可选地，可通过相关风险因素(例如，已经发现与阿尔茨海默病或这样的其他tau蛋白病具有高于50％的一致性(coincidence)的一种或多种因素)的存在，将这样的个体与患有与阿尔茨海默病或其他tau蛋白病无关的疾病或病况的那些个体区别开。这样的相关风险因素包括这样的发现：患者的亲属经历过阿尔茨海默病或这样的其他tau蛋白病，或存在高胆固醇血症或动脉粥样硬化的家族史。这样的相关风险因素尤其包括这样的发现：患者具有与这样的实际的疾病的发生相关(例如，被发现与其具有高于50％的一致性)的一种或多种基因或生化标记物。这样的倾向于阿尔茨海默病的风险的基因标记物的实例包括在app基因中的相关突变，例如，在app基因的717位和670和671位的突变(分别指hardy和swedish突变)。已知的基因风险的其他合适的标记物包括在早老素基因(ps1和ps2)和在apoe4基因(bekris，l.m.等(2010)“geneticsofalzheimerdisease,”j.geriatr.psychiatryneurol.23(4):213–227)中的相关突变。这样的ps1突变包括取代：r35q；a79v；v82l；l85p；v89l；v94m；v96f；v97l；f105i；f105l；f105v；l113p；l113q；y115c；y115d；y115h；t116i；t116n；p117a；p117l；p117r；p117s；e120d；e120d；e120g；e120k；e123k；n135d；n135s；a136g；m139i；m139i；m139k；m139t；m139v；i143f；i143m；i143n；i143t；i143v；m146i；m146i；m146i；m146l；m146l；m146v；t147i；l153v；y154c；y154n；h163r；h163y；w165c；w165g；l166h；l166p；l166r；s169l；s169p；s170f；l171p；l173f；l173w；l174m；l174r；f175s；f177l；f177s；s178p；g183v；e184d；v191a；g206a；g206d；g206s；g206v；g209e；g209r；g209v；s212y；i213f；i213l；i213t；h214d；h214y；g217d；g217r；l219f；l219p；q222h；q222r；q223r；l226f；l226r；i229f；a231t；a231v；m233i；m233l；m233l；m233t；m233v；l235p；l235v；f237i；f237l；k239n；t245p；a246e；l248r；l250s；l250v；y256s；a260v；v261f；v261l；l262f；c263f；c263r；p264l；g266s；p267l；p267s；r269g；r269h；l271v；v272a；e273a；t274r；r278i；r278k；r278s；r278t；e280a；e280g；l282f；l282r；l282v；p284l；p284s；a285v；l286p；l286v；t291p；e318g；r358q；s365a；r377m；g378e；g378v；l381v；g384a；f386s；s390i；v391f；l392p；l392v；g394v；n405s；a409t；c410y；v412i；l418f；l420r；l424f；l424h；l424r；l424v；a426p；a431e；a431v；a434c；l435f；p436q；p436s；和i439s。这样的ps2突变包括取代：r29h；g34s；r62c；r62h；r71w；a85v；t122p；t122r；s130l；v139m；n141i；l143h；v148i；r163h；m174v；s175c；y231c；q228l；m239v；m230i；a252t；p334r；t430m；和d439a。这样的apoe4等位基因包括ε4等位基因、ε3等位基因和ε2等位基因(verghese,p.b.等(2011)“apolipoproteineinalzheimer'sdiseaseandotherneurologicaldisorders,”lancetneurol.10(3):241-252)。另外，一些诊断测试可用于鉴定患有阿尔茨海默病的个体。这些包括csftau和aβ42水平的测量。提高的tau和减小的aβ42水平意味着阿尔茨海默病的存在。在阿尔茨海默病的情况下，事实上任何人都有患阿尔茨海默病的风险。因此，本发明的治疗分子可预防性地施用至普通人群，而不需要针对受试患者的风险的任何评估。本发明方法尤其可用于预防性治疗具有已知的阿尔茨海默病的遗传风险的个体。在无症状的患者中，治疗可开始于任何年龄(例如，10、20、30)。然而，通常，在患者达到40、50、60、70、80或90岁的年龄以前没有必要开始治疗。治疗典型地需要在一段时间施用多个剂量。通过分析抗体或活化的t-细胞或b-细胞对治疗剂随时间的响应，治疗可被监控。如果响应失败，指示加强剂量。在潜在唐氏综合症的患者的情况下，治疗可在产前开始，这通过在妊娠期间施用治疗剂至母亲，或患者出生后不久时施用。本发明提供：1.一种结合分子，其能够以相较于非-磷酸化tau2000倍的选择性，免疫特异性结合至磷酸化tau，其中分子是抗体或其表位结合片段。2.这类这样的结合分子的实施方式，其中分子是抗体的表位结合片段。3.这样的抗体的表位结合片段的实施方式，其中抗体的表位结合片段是scfv或双抗体。4.任何如上描述的结合分子的实施方式，其中分子免疫特异性结合至tau396/404肽(seqidno:7)：tdhgaeivykspvvsgdtsprhl，其中在其11和19位的丝氨酸残基是磷酸化的。5.任何如上描述的结合分子的实施方式，其中表位结合片段包括以下中的一种或多种：(a)具有seqidno:12的氨基酸序列的轻链cdr1；(b)具有seqidno:13的氨基酸序列的轻链cdr2；(c)具有seqidno:14的氨基酸序列的轻链cdr3；(d)具有seqidno:15的氨基酸序列的重链cdr1；(e)具有seqidno:16的氨基酸序列的重链cdr2；或(f)具有seqidno:17的氨基酸序列的重链cdr3。6.任何如上描述的结合分子的实施方式，其中表位结合片段包括：(a)具有seqidno:12的氨基酸序列的轻链cdr1；(b)具有seqidno:13的氨基酸序列的轻链cdr2；(c)具有seqidno:14的氨基酸序列的轻链cdr3；(d)具有seqidno:15的氨基酸序列的重链cdr1；(e)具有seqidno:16的氨基酸序列的重链cdr2；和(f)具有seqidno:17的氨基酸序列的重链cdr3。7.如上描述的结合分子的实施方式，具有(a)具有seqidno:12的氨基酸序列的轻链cdr1；(b)具有seqidno:13的氨基酸序列的轻链cdr2；(c)具有seqidno:14的氨基酸序列的轻链cdr3；(d)具有seqidno:15的氨基酸序列的重链cdr1；(e)具有seqidno:16的氨基酸序列的重链cdr2；和(f)具有seqidno:17的氨基酸序列重链cdr3。其中分子是scfv235(seqidno:18)。8.如上描述的任何结合分子的实施方式，其被可检测地标记。9.任何上述被可检测地标记的结合分子的实施方式，其中可检测标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记。10.(a)任何上述被可检测地标记的结合分子用于制备用于检测或测量磷酸化tau蛋白质在接受受试者的脑中的存在或量的药物的用途的实施方式，或(b)任何上述被可检测地标记的结合分子的实施方式的用途，用于检测或测量磷酸化tau蛋白质在接受受试者的脑中的存在或量。11.(a)任何上述被可检测地标记的结合分子用于制备用于检测或测量磷酸化tau蛋白质在接受受试者的脑中的存在或量的药物的用途的实施方式，或(b)被可检测地标记的结合分子的任何上述实施方式的用途，用于检测或测量磷酸化tau蛋白质在接受受试者的脑中的存在或量；其中，检测或测量包括结合至磷酸化tau蛋白的结合分子的体内显像。12.(a)任何上述被可检测地标记的结合分子用于制备用于检测或测量磷酸化tau蛋白质在接受受试者的脑中的存在或量的药物的用途的实施方式，或(b)被可检测地标记的结合分子的任何上述实施方式的用途，用于检测或测量磷酸化tau蛋白质在接受受试者的脑中的存在或量；其中检测或测量包括结合至磷酸化tau蛋白的结合分子的体外显像。13.(a)(1)任何被可检测地标记的如上描述的结合分子的实施方式；或(2)任何上述被可检测地标记的结合分子的实施方式，其中可检测标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记；用于制备用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的tau蛋白病的药物的用途；或(b)(1)被可检测地标记的结合分子的任何上述实施方式的用途，用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的tau蛋白病；或(2)被可检测地标记的结合分子的任何上述实施方式的用途，其中可检测标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记，用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的tau蛋白病。14.(a)(1)任何被可检测地标记的如上描述的结合分子的实施方式；或(2)任何上述被可检测地标记的结合分子的实施方式，其中可检测标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记；用于制备用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的tau蛋白病的药物的用途；或(b)(1)被可检测地标记的结合分子的任何上述实施方式的用途，用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的tau蛋白病；或(2)被可检测地标记的结合分子的任何上述实施方式的用途，其中可检测标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记，用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的tau蛋白病；其中药物是施用至受试者的体内药物。15.(a)(1)任何被可检测地标记的如上描述的结合分子的实施方式；或(2)任何上述被可检测地标记的结合分子的实施方式，其中可检测标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记；用于制备用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的tau蛋白病的药物的用途；或(b)(1)被可检测地标记的结合分子的任何上述实施方式的用途，用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的tau蛋白病；或(2)被可检测地标记的结合分子的任何上述实施方式的用途，其中可检测标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记，用于诊断受试者的阿尔茨海默病或另外的tau蛋白病；其中药物与受试者的活组织检查样本在体外被孵育。16.任何这样的用途的实施方式，其中tau蛋白病选自包括以下的组：额颞痴呆、与17号染色体连锁的帕金森症(ftdp-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、皮克氏病、进行性皮质下神经胶质增生症、单纯缠结性痴呆、弥漫性神经元纤维缠结伴钙化症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森症-痴呆综合症、拳击员痴呆、唐氏综合症、吉斯特曼-施特劳斯病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、克雅氏病、多系统萎缩、尼曼匹克症c型、朊蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、肌强直性营养不良、非-guanamian运动神经元疾病伴随神经元纤维缠结、脑炎后帕金森综合征、急性创伤性脑损伤和慢性创伤性脑病。实施例接下来的实施例示例了在本发明的诊断或治疗方法中的组合物的各种方法。实例意图是说明性的，但不以任何方式限制本发明的范围。实施例1scfv235的分离scfv分子产生自杂交瘤克隆6b2g12(相对tau蛋白的p-ser396/404培养)(congdon,e.e.等(2013)“antibodyuptakeintoneuronsoccursprimarilyviaclathrin-dependentfcgammareceptorendocytosisandisaprerequisiteforacutetauproteinclearance,”j.biol.chem.288:35452-35465；gu,j.等(2013)“twonoveltauantibodiestargetingthe396/404regionareprimarilytakenupbyneuronsandreducetauproteinpathology,”j.biol.chem.288(46):33081-33095)。简而言之，杂交瘤细胞系6b2g12在rpmi培养基中，在37℃，与5％co2一起生长，所述rpmi培养基包含链霉素(50μg/ml)和青霉素g(50u/ml)，并且按照rna分离试剂盒(promega)的方案，将它的mrna分离和纯化，随后储存在-80℃。按照第一链cdna合成试剂盒(takar试剂盒(tak6115a))的方案，构造第一链cdna。使用肽(keckfoundation，耶鲁大学)筛选具有表达对p-ser396,404tau表位免疫特异的scfv分子的能力的克隆，所述肽具有tau-丝氨酸396/404(seqidno:27)的序列：renakaktdhgaeivykspvvsgdtsprhl和tau-磷酸-丝氨酸396/404(seqidno:28)的序列：renakaktdhgaeivykspvvsgdtsprhl其中在seqidno:28的18和26位(对应于tau(seqidno:1)的396和404位)的加下划线的丝氨酸残基被磷酸化。为了结合研究，这些肽也用于淘选、elisa和biacore中。产生数以千计的克隆，其中随机选择的90个克隆的结合在图1a-1b中描绘。在这些选择的scfv分子中是scfv235(见图1a)。可溶性抗体的产生如在barbas,c.f.,iii等(2001)“phagedisplay:alaboratorymanual,”coldspringharborpress,coldspringharbor,ny中所描述，产生scfv。简而言之在具有50μg/ml的羧苄青霉素和20ml的1mmgcl2每升的超级肉汤(sb)培养基(每升10gmops、30g胰蛋白胨、20g酵母提取物)中，在感受态非抑制剂(non-suppressor)大肠埃希氏菌细胞(top10细胞，invitrogen)中产生scfv235。通过添加1mmiptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)诱导培养物，然后，如在barbas,c.f.,iii等,(2001)中所描述的，从小球分离scfv235。实施例2scfv235的表征当肽被涂布在elisa板上(图2a)时，以及在biacore中，当分子被固定化并且结合肽在溶液中时，那些中的单构建体scfv235都显示优越的磷表位(phospho-epitope)特异性。更进一步，scfv235或它的亲本抗体6b2g12，在患阿尔茨海默病的个体的脑匀浆中免疫沉淀tau蛋白(图2b-2c)，并且，在固定的阿尔茨海默的和皮克氏病的脑组织上显示与病理tau的部分共定位染色(图2d-2e)。显著地，scfv235仅检测全长的tau蛋白条带，然而6b2g12结合至全长的和降解的tau片段。按照qiagen试剂盒方案，使用装载入重力栏(gravitycolumn)的ni-nta琼脂糖树脂纯化his-标识的scfv235。然后，在pbs中透析抗体片段，并且用于进一步鉴定。纯化scfv的磷-选择性在elisa试验中被首次确认，如由asuni,a.a.等(2007)“immunotherapytargetingpathologicaltauconformersinatanglemousemodelreducesbrainpathologywithassociatedfunctionalimprovements,”j.neurosci.27:9115-9129所描述，在其中，tau-磷酸-丝氨酸396/404和tau-丝氨酸396/404肽被涂布在板上，在4℃过夜，并且，在封闭后，用2.5μgscfv235孵育2h。使用hrp缀合的抗-ha第二抗体在450nm检测结合的scfv235。表面等离子体共振(spr)分析通过spr，在biacore2000(gehealthcare)中，根据制造商的说明书和如之前(krishnaswamy,s.等(2009)“cloningantifungalsinglechainfragmentvariableantibodiesbyphagedisplayandcompetitivepanningelution,”anal.biochem.395:16-24；krishnaswamy,s.等,(2011)“isolationandcharacterizationofrecombinantsinglechainfragmentvariableanti-idiotypicantibodyspecifictoaspergillusfumigatusmembraneprotein,”j.immunol.methods366:60-68)所描述的，测量scfv235和它的亲本抗体6b2g12与它们的靶分子的结合的结合动力学。简而言之，将scfv235/抗体(10μg/ml)稀释在10mm乙酸钠中，ph5.0，并且，通过胺连接试剂盒，将其固定在单独的cm5传感器芯片上(以5μl/min流速，接触时间7min)。未反应的表面-结合的物质通过乙醇胺封闭。以同样的方式制备但不含有scfv235或抗体的每个传感器芯片的一个通道(channel)，被用于监控肽的非特异性结合。所有的测量以5μl/min的流速，在25℃，在hbs-ep缓冲剂(ph7.4，10mmhepes，150mmnacl，3.4mmedta和0.005％表面活性剂p20)中完成。在每个测量之后，芯片表面用包含500mmnacl和0.1m甘氨酸hcl，ph8.0的10μl的缓冲剂再生。在各种浓度测定tau-磷酸-丝氨酸396/404和tau-丝氨酸396/404肽的结合，并使用biaevaluation软件，以kd＝koff/kon计算平衡解离常数(kd)。表5和表6总结了6b2g12抗体和scfv235的结合的特异性和动力学。相对于非-磷酸化肽(seqidno:27)，scfv23对磷酸化肽(seqidno:28)的选择性(1/[1.04x10-6/4.06x10-3])是3.9x103。因此，对磷酸化p-ser396/404肽，scfv235的亲和力是抗体6b2g12的大约2,508分之一(即，对于磷酸化-tau-丝氨酸396/404，[6b2g12缔合/6b2g12解离]与[scfv235缔合/scfv235解离]的比＝2,508)，并且对非-磷酸化p-ser396/404肽，scfv235的亲和力是抗体6b2g12的162万分之一(即，对于非-磷酸化tau396/404，[6b2g12缔合/6b2g12解离]与[scfv235缔合/scfv235解离]的比＝162万)。因此，对于非-磷酸化肽，抗体6b2g12的ka大约是其对于磷酸化肽的ka的三分之一，并且，对于非-磷酸化肽，抗体6b2g12的kd是其对于磷酸化肽的kd的两倍。相比之下，并且预料不到地，衍生于该抗体的scfv235，对于非-磷酸化肽，显示的ka是其对于磷酸化肽的ka大约400分之一，以及对于非-磷酸化肽，显示的kd是其对于磷酸化肽的kd大约十分之一。免疫沉淀依照试剂盒说明书的方案，磁珠his-标签分离和磁珠蛋白质g试剂盒(dynabeadshis-tagisolationanddynabeadsproteingkit)(invitrogen)被用于在ad脑匀浆(250μg)中，通过scfv235或抗体(10μg)的tau的免疫沉淀。拉下的(pulleddown)的蛋白质在10％丙烯酰胺胶上被分离，接下来进行蛋白质印迹。将蛋白质从胶转移至消化纤维素膜上。在室温，在pbs中用5％脱脂奶封闭膜1小时。然后，用cp27(人特异性tau抗体)或总tau抗体(dako)的1:1000稀释液孵育印迹，在4℃过夜。这之后，与hrp缀合的第二抗体在包含5％脱脂奶的pbs中孵育2h。在洗涤后，在膜上的蛋白质通过增强化学发光(ecl；pierce)被检测。免疫反应的条带的图像使用fujilas-4000显像系统获取。scfv分子特异性地拉下在50-70kda的范围的tau条带，其在ad和皮克氏病脑切片中结合至病理tau，并且，在biacore上具有对磷表位的亲和力(1.04x10-6–6.05x10-8m)和对非磷表位的亲和力(4.06x10-3–1.86x10-8m)。人脑组织染色使用fluor568蛋白质标记试剂盒(molecularprobes，invitrogen)，按照试剂盒说明书，标记his-标签纯化的scfv235。使用标准程序，将一些ad、皮克氏病和年龄匹配的对照脑(nationaldiseaseresearchinterchange)用568-标记的scfv235染色。简而言之，在二甲苯中将负载石蜡包埋的脑切片的载玻片脱蜡，并且经过梯度乙醇净化，在pbs中洗涤，接着在0.3％甲酸中进行表位暴露(unmasking)，在pbs洗涤后，与10μg/ml的scfv235和phf1tau抗体培养物上清液的1:1000稀释液的混合物在4℃孵育过夜。结合的phf1用荧光-标识的第二抗体检测(alexafluor488山羊抗-小鼠igg，1:500稀释度，lifetechnologies)。用dapi检测核，用prolonggold不变色剂(antifadereagent)组装(mounting)介质(lifetechnologies)为载玻片盖片(coverslipped)。根据荧光团的特征使用波长和滤波器，在fluoview1000激光扫描共聚焦显微镜(olympus)上捕捉图像。实施例3动物、标记的抗体的注射和ivis显像鉴于其优越的特性，scfv235被选择用于在小鼠中的体内现象。将小鼠放在aaalac认可的设备中，并且任意地接受食物和水。在iacuc认可的方案下进行实验。使用三种不同的转基因的缠结模型：htau(andorfer,c.等(2003)“hyperphosphorylationandaggregationoftauinmiceexpressingnormalhumantauisoforms,”j.neurochem.86:582-590)；htau/ps1(boutajangout,a.等(2010)“immunotherapytargetingpathologicaltaupreventscognitivedeclineinanewtanglemousemodel,”j.neurosci.30:16559-16566)，和jnpl3(lewis,j.等(2000)“neurofibrillarytangles,amyotrophyandprogressivemotordisturbanceinmiceexpressingmutant(p301l)tauprotein,”nat.genet.25:402-405)。对照为野生型小鼠和转基因的aβ斑块小鼠(tg-swdi(davis,j.等(2004)“early-onsetandrobustcerebralmicrovascularaccumulationofamyloidbeta-proteinintransgenicmiceexpressinglowlevelsofavasculotropicdutch/iowamutantformofamyloidbeta-proteinprecursor,”j.biol.chem.279:20296-20306)。如asuni,a.a.等(2007)“immunotherapytargetingpathologicaltauconformersinatanglemousemodelreducesbrainpathologywithassociatedfunctionalimprovements,”j.neurosci.27,9115-9129所描述，进行颈动脉内注射。简而言之，小鼠用2％异氟烷麻醉，并用1.5％异氟烷保持在30％o2中。在暴露颈动脉鞘之后，经正中切口，将左颈总动脉(cca)、颈外动脉(eca)和颈内动脉(ica)暴露。将丝缝合线系在eca的远端，以及左cca、ica和翼腭动脉被暂时系上。连接至pe-10导管(bectondickinson,sandiego,ca)的30注射计量针(gaugeneedle)被安装至1ml注射器，然后，将在400-500μlpbs中的250μg的标记scfv235在10–15min的时间段内施用到颈总动脉中。胶被用在注射位点以防止术后流血。可选地，使用相同剂量，注射到小鼠股静脉中。将右大腿内侧(medialside)剃毛，并且用betadine溶液和70％乙醇清洁。在大腿的内侧(internalside)的皮肤上做平行于静脉的小切口(0.5cm)。当皮肤的直切小口打开时，股静脉是可见的。连接至pe-10导管的30注射计量针被安装至1ml注射器，在3-5min的时间段内，通过向上刺入到股静脉中的针，手动地施用。一旦针被去除，用棉签压紧刺入位置以避免流血。一旦流血停止，用4/0编织丝线，使用单间断缝合缝合皮肤。为了ivis显像，将scfv235或6b2g12与vivotag680xlfluorochrometm(perkinelmer)缀合。将小鼠头和身体剃毛，以避免由皮毛引起的光衍射。在注射后，以图3a-3d中详细描述的各种间隔，使用675nm的激发滤光片和cy5.5发射滤光片，在ivisluminaxr(perkinelmer)中，使小鼠显像。用荧光团标识的scfv235进行颈动脉内注射导致在转基因的tau蛋白病小鼠(n＝6)中的脑内与染色的神经元内的tau聚集体的部分(tau-5)到完全共定位(phf-1)，但在wt小鼠中没有(n＝4)。更进一步，与已知包含tau聚集体的内体-自噬体-溶酶体的标记物共定位的scfv，意味着这样的互相作用在这些降解途径中发生。当在右颈动脉内注射后大约30min显像时，通过活的小鼠中的ivis显像的初步发现显示，与野生型小鼠相比，来自转基因小鼠的右脑的实质上更强的信号。在若干小时内，该信号逐渐削弱并从大脑蔓延至周边。ivis图像的分析根据在线方案，使用来自perkinelmer的livingimaging软件分析图像。计算在概述的(outlined)感兴趣的区域(脑)中的总辐射效率(合计信号强度)。如下计算总辐射效率：小鼠脑切片的免疫组织化学显像后，如asuni,a.a.等(2007)“immunotherapytargetingpathologicaltauconformersinatanglemousemodelreducesbrainpathologywithassociatedfunctionalimprovements,”j.neurosci.27,9115-9129所述，处理组织。简而言之，用pbs经主动脉灌流小鼠，去除大脑，并且在2％plp中过夜固定，放置于在20％甘油磷酸盐缓冲液中的2％dmso中过夜，然后，切片以检测680xl-scfv235信号，并且通过与内体/自噬体/溶酶体系统和tau蛋白的标记物的共染色以决定scfv亚细胞定位。制备连续冠状的40μm的脑切片，以及按照标准方案对自由浮动的切片进行免疫荧光染色。简而言之，在pbs洗涤、0.3％triton-x-100的透化作用和在5％bsa之中封闭后，用抗体(1:500-1:1000)孵育组织，在4℃过夜[tau(tau5、mc1、phf1)、小神经胶质(iba1)、初级内体(eea1)、次级内体(rab7)、次级内体/溶酶体(lamp2、p62)和自噬体(lc3和p62)。结合的抗体用alexafluor488山羊抗-小鼠/兔igg(invitrogen)检测，以及核用dapi检测。在用prolonggold盖片后，用lsm700zeiss共焦激光扫描显微镜分析组织。通过每个标记染色的程度和它们的共定位被评级，评级使用0-4的半定量评定表(semi-quantitativescale)，其中1-4指示这些参数的增加的程度(1：最小的；2：适中的；3:中等的；4：广泛的)。针对：1)注射的荧光-标识的scfv/抗体的残留信号；2)脑tau病理的程度；3-4)注射的scfv/抗体信号与3)tau抗体染色或4)内体/溶酶体/自噬体抗体染色的共定位的程度，进行这样的分析。统计学通过spearman秩相关分析图6a-6f中描述的不同参数之间的相关性分析。当scfv235或抗体脑组织信号为一个参数时，只包括注射后数小时内去除的小鼠脑，因为脑组织信号随时间减弱。对于ivis信号和tau病理之间的相关性，包括所有注射的小鼠。显像分析当近红外-染料-标记的-scfv235被注射到右颈动脉内(250μg/450-500μl)中时，使用体内显像系统(“ivis”)的显像研究揭示，来自转基因的(“tg”)tau蛋白病小鼠的强的脑信号。信号保持高且相对稳定，至少高达250-300min(图3a-3d)。具有p301ltau突变的jnpl3小鼠(lewis,j.等(2000)“neurofibrillarytangles,amyotrophyandprogressivemotordisturbanceinmiceexpressingmutant(p301l)tauprotein,”nat.genet.25:402-405)，显示相比于htau/ps1小鼠(boutajangout,a.等(2010)“immunotherapytargetingpathologicaltaupreventscognitivedeclineinanewtanglemousemodel,”j.neurosci.30:16559-16566)更强的信号，htau/ps1小鼠有更轻微的总体tau病理。来自scfv235注射的p301l小鼠的脑信号在35-38min达到峰值(高于注射前基线信号1714％)，并且在注射后82和330分钟保持强烈(分别为1675％和1468％)。在htau/ps1小鼠中，scfv235脑信号在37分钟达到峰值(高于注射前基线信号1443％)，并且在注射后65和176分钟保持强烈(分别为1144％和1093％)。相比于p301l小鼠，htau/ps1模型在脑中和周边都有更少的信号。在每个基因型内较年长的小鼠相比于较年轻的小鼠有更强的信号，这是预期的，因为那些应该有更高级的tau病理。在注射相同探针的野生型(wt)小鼠或仅接受荧光染料而没有scfv的缠结小鼠中观察到最小的信号。衍生scfv的抗体6b2g12，在以相同的剂量并且经相同的途径注射时，提供类似的结果，虽然它的信号强度实质上更小。在注射后20-95分钟的显像，显示高于基线值600-632％的信号，其中在描绘的170和291分钟具有适中的下降(分别为497％和431％)。较年长的(11-12月)的注射以scfv235的p301l小鼠具有峰值脑信号[总辐射效率(tre)]，分别为2.23x1011和2.64x1011，然而较年轻的小鼠(3和8月)具有较低的峰值信号，分别为1.88x1011和1.86x1011。相同的p301l模型(7-10月)在注射6b2g12后，有强而较小的脑信号，范围从2.20x1011到1.16x1011。类似的信号强度，在年长的注射scfv235的htau/ps1小鼠(22月；峰值在1.40x1011)被观察到，但在7月大的htau/ps1小鼠中有限，这被确认缺少tau病理。wt小鼠(12-13月)和一只htau小鼠(13月)在所有时间点有低的信号并且没有tau病理。在年长的htau/ps1小鼠(23月)和p301l小鼠(7月)中单独注射荧光-标签，产生相比于用scfv235或6b2g12注射的wt小鼠中较高的脑信号，但其实质上低于用scfv或抗体注射的任何tau蛋白病小鼠中的信号。这两种染料注射的小鼠被确认有广泛的tau病理。为进一步分析以证实scfv或抗体在脑中的存在和亚细胞定位，脑随后被去除(图4a-4d)。二者都首先在神经元中检测到、与病理tau蛋白部分共定位，并且专有地在内体-自噬体-溶酶体系统中。较小的部分在小神经胶质中检测到。具有有限tau病理的转基因小鼠(由于年轻的年龄，模型区别或模型内变化性)在诊断配体注射后，有弱的ivis脑信号。发明者也评估了使用静脉内(i.v.)途径的可行性，其应为更有用的，可适用于多种注射和用于临床应用。重要的是，当以相同的剂量使用这种施用途径时，对于两种配体也都观察到了强的脑信号，这指示即使通过首次经过肝清除，也有足够量的配体进入脑，以允许我们清楚地检测tau病变。在i.v.注射的小鼠中，实施较长的显像单元(session)，其显示在8-14天，信号的逐渐清除(图3c-3d)。对于皮内(i.c.)注射，注射scfv的小鼠显示相比于注射tau抗体的小鼠通常更强的信号。在i.v.注射的p301l小鼠中，在18min检测到峰值scfv235脑信号(高于注射前基线1754％)和在210min较小的信号(从峰值信号下降18％)，其在8天已经实质上减退(下降43％)。在注射6b2g12抗体的小鼠中，脑信号在25分钟是强的(高于注射前基线1211％)，在35分钟达到峰值(1445％)，和在120分钟较小的信号(从峰值信号下降11％)，以及到8天和12天，变弱得多(分别下降67％和70％)。注射对照混合的(pooled)igg的p301l小鼠有适中的ivis信号，虽然其有非常广泛的tau病理，并且脑信号不与tau标记物共定位。这与发明者之前在颈动脉内注射对照igg之后的p301l小鼠中的组织发现是一致的(asuni,a.a.等(2007)“immunotherapytargetingpathologicaltauconformersinatanglemousemodelreducesbrainpathologywithassociatedfunctionalimprovements,”j.neurosci.27:9115-9129)。野生型(wt)或有aβ斑块的小鼠(tg-swdi，(davis,j.等(2004)“early-onsetandrobustcerebralmicrovascularaccumulationofamyloidbeta-proteinintransgenicmiceexpressinglowlevelsofavasculotropicdutch/iowamutantformofamyloidbeta-proteinprecursor,”j.biol.chem.279:20296-20306)，在所有时间点，有最小的脑信号，突出了探针对于tau病理特异性。对于i.c.注射，scfv或tau抗体与病理tau共定位，并且在神经元内，在内体-自噬体-溶酶体系统中检测到探针(图3a-3d、图4a-4d)，以及一定程度上在小神经胶质中检测到探针。颈动脉内注射到p301l(f6)和htau/ps1(a47)缠结小鼠中后，发现scfv235与病理tau在脑神经元内共定位(图5)。脑在最后显像单元后被收集。tau聚集体用phf-1和tau-5抗体检测到，并显示与scfv235部分共定位。使用核特异性染色以鉴定细胞核。图5也显示对照野生型小鼠(r1)在颈动脉内注射后没有可检测的scfv235的脑吸收。tau-5主要染色正常的轴突tau并且未观察到病理phf1染色。总之，在两个施用途径之后，来自脑切片的ivis信号、残留的scfv或抗体信号的程度和tau病理的程度之间的比较，揭示这些参数之间良好的相关性(图4a-4d、表7、表8(a-c部分)、图5和图6a-6f)，scfv:ivis信号vs.脑组织scfv信号，r＝0.93，p<0.0006；ivis信号vs.脑tau病理，r＝0.86，p<0.0002；脑组织scfv信号vs.脑tau病理，r＝0.87，p<0.01；6b2g12:ivis信号vs.脑组织6b2g12信号，r＝0.87，p＝0.1；ivis信号vs.脑tau病理，r＝0.9，p<0.0004；脑组织6b2g12信号vs.脑tau病理，r＝0.8，p＝0.05。这些发现指示，该特定scfv、亲本抗体和总体方法非常有效地检测和评估在活的动物中的tau病理的程度。因此，总之，单克隆tau抗体的scfv分子使用噬菌体展示技术产生。在广泛的表征后，scfv235作为诊断显像探针在活的tau蛋白病小鼠中被评估。在外周注射到两个tau蛋白病缠结小鼠模型中后，scfv235都一致地显示强的脑信号，但在野生型或aβ斑块小鼠中没有。亲本抗体的施用导致类似的结果，但是较小的信号强度。两个探针都与神经元内的tau聚集体和内体/自噬体/溶酶体途径的标记物共定位。数据显示，经外周施用的tau抗体和它们的衍生物可用于在活的动物中使tau脑病变显像。重要地是，脑信号强度与tau病理的程度关联得很好，对该方法的实验和临床应用有重大意义。其可以这种形式被用于在tau蛋白病的动物模型中非侵入性监控tau病理和治疗效力，并且，这样的配体有作为用于相同目的的临床pet配体的极好的潜力。ivis信号、在脑组织中的残留探针信号和tau病理之间的良好的相关性，确定了该方法对于在人和相关动物模型中的阿尔茨海默病和其他tau蛋白病的诊断中是有用的，并且其提供了在这样的患者或相关动物模型中监控治疗效力的手段。scfv分子或其亲本抗体主要在神经元内被检测到，其与内体-自噬体-溶酶体系统中的病理tau蛋白共定位。这与颈动脉内注射或施用这样的分子到衍生自tau蛋白病小鼠的脑片培养物后观察到的标记的tau抗体和它们的fab片段的类似的分布是一致的(gu,j.等(2013)“twonoveltauantibodiestargetingthe396/404regionareprimarilytakenupbyneuronsandreducetauproteinpathology,”j.biolchem.288:33081-33095；congdon,e.e.等(2013)“antibodyuptakeintoneuronsoccursprimarilyviaclathrin-dependentfcgammareceptorendocytosisandisaprerequisiteforacutetauproteinclearance,”j.biolchem.288:35452-35465；asuni,a.a.等(2007)“immunotherapytargetingpathologicaltauconformersinatanglemousemodelreducesbrainpathologywithassociatedfunctionalimprovements,”j.neurosci.27:9115-9129；krishnamurthy,p.k.等(2011)“mechanisticstudiesofantibody-mediatedclearanceoftauaggregatesusinganexvivobrainslicemodel,”front.psychiatry2:59)。但是，这是首次报道在体内使用抗体或它们的片段作为显像剂检测这样的聚集体。靶向aβ、α-突触核蛋白或tau蛋白的之前的临床前和临床研究显示，抗体大量进入具有这些肽/蛋白质的聚集体的脑中，大概是由于导致血脑屏障打开的相关炎症(congdon.e.e.等(2014)“harnessingtheimmunesystemfortreatmentanddetectionoftaupathology,”j.alzheimers.dis.40:s113-s121；lemere,c.a.等(2010)“canalzheimerdiseasebepreventedbyamyloid-betaimmunotherapy？,”nat.rev.neurol.6:108-119)。针对与scfv相比抗体的较低的信号，有若干可能的解释。抗体是scfv的尺寸的约6倍(150kdavs.25kda)，这可导致较少的脑和神经元的吸收。注射都为相同的重量(250μg)，因此，与片段相比，包含了六分之一的抗体的分子。基于标识的多克隆抗-tau小鼠igg的脑吸收的之前的研究，选择该初始剂量(asuni,a.a.等(2007)“immunotherapytargetingpathologicaltauconformersinatanglemousemodelreducesbrainpathologywithassociatedfunctionalimprovements,”j.neurosci.27:9115-9129)。相比于scfv，抗体对于tau更高的亲和力可抵消这些问题。在有限tau病理的tg小鼠中，弱的ivis脑信号进一步支持这样的结论：即在tg小鼠中增强的信号并不仅是tau超表达的反映，而是指示tau病理的存在。jnpl3(p301l)小鼠展示比htau/ps1小鼠更强的脑和周边信号。在脑内部，这与更严重的tau病理拟合。在p301l小鼠中观察到的更强的周边信号似乎部分来源于脊髓，已知脊髓在该模型中有广泛的tau病变(lewis,j.等“neurofibrillarytangles,amyotrophyandprogressivemotordisturbanceinmiceexpressingmutant(p301l)tauprotein,”nat.genet.25,402-405)。而且，它的突变tau转基因的朊蛋白启动子造成了比在htau/ps1模型中更加全面的tau表达。这可在各种器官中导致tau聚集。对于动物研究，ivis显像比正电子放射断层成像术(pet)研究成本效益更好，并且涉及简单得多的探针制备；其用近红外染料来标记，而非更复杂的放射性标记程序，该程序可能要求现场式回旋加速器(on-sitecyclotron)。因此，ivis显像对于探针开发以选择用于随后pet研究的配体是理想的。这样的研究进一步指示，对于监控tau病理的发展和筛选tau治疗介导的tau聚集体的清除，其是有效的方法，其中在纵向研究过程中，每个动物作为其自己的对照。发现有利地支持tau抗体和/或它们的scfv分子用于在体内检测tau病变的能力和用途。相比β折叠结合染料，靶向不同表位的taus抗体-衍生探针(例如，scfv235)被认为在每个个体中提供对tau蛋白的病理特征(profile)的更详细的描述。设想该信息能够引导治疗方案，其可包括主动tau免疫疗法或被动tau免疫疗法，所述tau免疫疗法靶向通过显像检测到的相同的tau表位。这样的定制方法可能更有效地延缓被靶向的tau蛋白病的发展(见例如，gu,j.等(2013)“twonoveltauantibodiestargetingthe396/404regionareprimarilytakenupbyneuronsandreducetauproteinpathology,”j.biolchem.288:33081-33095；congdon,e.e.等(2013)“antibodyuptakeintoneuronsoccursprimarilyviaclathrin-dependentfcgammareceptorendocytosisandisaprerequisiteforacutetauproteinclearance,”j.biolchem.288:35452-35465；boutajangout,a.等(2010)“immunotherapytargetingpathologicaltaupreventscognitivedeclineinanewtanglemousemodel,”j.neurosci.30:16559-16566；asuni,a.a.等(2007)“immunotherapytargetingpathologicaltauconformersinatanglemousemodelreducesbrainpathologywithassociatedfunctionalimprovements,”j.neurosci.27:9115-9129；boutajangout,a.等(2011)“passiveimmunizationtargetingpathologicalphospho-tauproteininamousemodelreducesfunctionaldeclineandclearstauaggregatesfromthebrain,”j.neurochem.118:658-667；boimel,m.等(2010)“efficacyandsafetyofimmunizationwithphosphorylatedtauagainstneurofibrillarytanglesinmice,”exp.neurol.224,472-485(2010)；chai,x.等(2011)“passiveimmunizationwithanti-tauantibodiesintwotransgenicmodels:reductionoftaupathologyanddelayofdiseaseprogression,”j.biolchem.286:34457-34467(2011)；bi,a.等(2011)“tau-targetedimmunizationimpedesprogressionofneurofibrillaryhistopathologyinagedp301ltautransgenicmice,”plos.one.6:e26860；d’abramo,c.等(2013)“taupassiveimmunotherapyinmutantp301lmice:antibodyaffinityversusspecificity,”plosone8:e62402；troquier,l.等(2012)“targetingphospho-ser422byactivetauimmunotherapyinthethy-tau22mousemodel:asuitabletherapeuticapproach,”curr.alzheimerres.9,397-405；kfoury,n.等(2012)“trans-cellularpropagationoftauaggregationbyfibrillarspecies,”j.biol.chem.287:19440-19451；theunis,c.等(2013)“efficacyandsafetyofaliposome-basedvaccineagainstproteintau,assessedintau.p301lmicethatmodeltauopathy,”plos.one.8:e72301：yanamandra,k.等(2013)“anti-tauantibodiesthatblocktauaggregateseedinginvitromarkedlydecreasepathologyandimprovecognitioninvivo,”neuron80:402-414；castillo-carranza,d.l.等(2014)“specifictargetingoftauoligomersinhtaumicepreventscognitiveimpairmentandtautoxicityfollowinginjectionwithbrain-derivedtauoligomericseeds,”j.alzheimers.dis.40:s97-s111；castillo-carranza,d.l.等(2014)“passiveimmunizationwithtauoligomermonoclonalantibodyreversestauopathyphenotypeswithoutaffectinghyperphosphorylatedneurofibrillarytangles,”j.neurosci.34:4260-4272)。选择性生物标记物对于确定靶接合、清除和疾病发展的有用性对于避免在从前的阿尔茨海默的临床免疫疗法试验中的冗长、昂贵和不确定的研究是重要的。这些tau病变的显像将非常有助于评价未来试验的效力以及诊断aβ阴性tau蛋白病。实施例4在转基因的tau蛋白病小鼠体内对tau聚集体的特异性和表位依赖性检测如上所述，使用体内显像系统(ivis)，自抗体6b2g12产生的单链可变抗体片段(scfv)的外周注射在转基因的tau蛋白病小鼠中导致强的体内脑信号，但在野生型或淀粉样β斑块小鼠中没有(krishnaswamys.等(2014)“antibody-derivedinvivoimagingoftaupathology,”j.neurosci.34:16835-16850；通过引用并入本文)。用亲本6b2g12抗体观察到类似的特异性，但较弱的信号。重要地，显像信号的强度与tau病理的程度和探针与神经元内tau聚集体共定位很好地相关。两个特性都与内体、自噬体和溶酶体的标记物有关，指示在这些降解途径中它们的互相作用。通过施用不同的tau抗体的单静脉内注射，对各种tau抗体针对在相同转基因的tau蛋白小鼠(p301l，htau)中的不同的tau表位的信号强度进行比较。有时在相同的动物中比较两种不同的剂量(50μgvs.250μg)。注射以至少一周的间隔被分开，以允许脑信号减退至基线背景值。如预期的，对于所有的抗体，较大的剂量产生若干倍的脑信号，意味着它们的脑吸收在较低的剂量并未饱和。通常，相比于：(1)由较低的亲和力(nm至μm)、但更多磷-选择性的抗体提供的信号，所述抗体免疫特异性地结合至相同的p396,404表位；(2)由高亲和力(nm)抗体提供的信号，所述抗体免疫特异性结合至区别于p396,404表位的表位；或(3)由低亲和力抗体提供的信号，所述抗体免疫特异性结合至构象tau表位，施用6b2g12抗体(nm至pm亲和力)导致大约2-3倍更强的信号。这些不同很可能反映在这些动物中的这些tau抗体表位的相对突出(prominence)和抗体的亲和力。所有被评价的抗体显示对tau病理的特异性，相比于在aβ斑块-(tg-swdi)或野生型小鼠中非常弱的脑信号，其导致在tau蛋白病小鼠中更强得多的脑信号。用对照igg抗体也检测到有限的信号。重要地，观察到的信号与tau病理的程度很好地关联，并且，静脉注射的抗体与染色神经元的tau聚集体(phf1、mc1和tau-5)和内体、自噬体和溶酶体的标记物(eea1、lc3、p62和rab7)部分共定位，如通过6b2g12抗体已经观察到的那样。总体上，这些发现指示，针对不同表位的tau抗体可被用于评估在小鼠模型中的体内表位突出。这样的具有甚至更好的脑穿透的显像探针的较小抗体片段导致更强的脑信号(比如scfv235)，具有作为临床显像配体的极好的潜力。本说明书提到的所有出版物和专利通过参考并入本文，达到如同具体和单独指出每个单个出版物或专利申请通过参考以其整体并入的相同程度。尽管已经结合其具体实施方式描述了本发明，但是应当理解，其能够被进一步修改，并且本申请旨在覆盖大体上根据本发明原理并且包括与本公开的偏离的本发明的任何变型、用途或改变，只要在本发明所属领域的已知或习惯实践内并且如可应用至本文之前所阐释的本质特征。序列表<110>纽约大学e·m·西古德松<120>tau显像配体和其在tau蛋白病的诊断和治疗中的用途<130>sig01-09-wo-pct1400.0007wo<160>28<170>patentin版本3.5<210>1<211>441<212>prt<213>智人<220><221>misc_feature<222>(1)..(441)<223>人tau蛋白<400>1metalagluproargglngluphegluvalmetgluasphisalagly151015thrtyrglyleuglyasparglysaspglnglyglytyrthrmethis202530glnaspglngluglyaspthraspalaglyleulysgluserproleu354045glnthrprothrgluaspglyserglugluproglysergluthrser505560aspalalysserthrprothralagluaspvalthralaproleuval65707580aspgluglyalaproglylysglnalaalaalaglnprohisthrglu859095ileprogluglythrthralagluglualaglyileglyaspthrpro100105110serleugluaspglualaalaglyhisvalthrglnalaargmetval115120125serlysserlysaspglythrglyseraspasplyslysalalysgly130135140alaaspglylysthrlysilealathrproargglyalaalapropro145150155160glyglnlysglyglnalaasnalathrargileproalalysthrpro165170175proalaprolysthrproproserserglygluproprolyssergly180185190aspargserglytyrserserproglyserproglythrproglyser195200205argserargthrproserleuprothrproprothrarggluprolys210215220lysvalalavalvalargthrproprolysserproserseralalys225230235240serargleuglnthralaprovalprometproaspleulysasnval245250255lysserlysileglyserthrgluasnleulyshisglnproglygly260265270glylysvalglnileileasnlyslysleuaspleuserasnvalgln275280285serlyscysglyserlysaspasnilelyshisvalproglyglygly290295300servalglnilevaltyrlysprovalaspleuserlysvalthrser305310315320lyscysglyserleuglyasnilehishislysproglyglyglygln325330335valgluvallysserglulysleuaspphelysaspargvalglnser340345350lysileglyserleuaspasnilethrhisvalproglyglyglyasn355360365lyslysilegluthrhislysleuthrphearggluasnalalysala370375380lysthrasphisglyalagluilevaltyrlysserprovalvalser385390395400glyaspthrserproarghisleuserasnvalserserthrglyser405410415ileaspmetvalaspserproglnleualathrleualaaspgluval420425430seralaserleualalysglnglyleu435440<210>2<211>15<212>prt<213>人工序列<220><223>包含甘氨酸的连接体<400>2glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser151015<210>3<211>18<212>prt<213>人工序列<220><223>包含甘氨酸的连接体<400>3glyserthrserglyserglylysproglyserglygluglyserthr151015lysgly<210>4<211>18<212>prt<213>人工序列<220><223>包含甘氨酸的连接体<400>4serserglyglyglyglyserglyglyglyglyglyglyserserarg151015serser<210>5<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>包含组氨酸的连接体("his-标签")<400>5hishishishishishis15<210>6<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>人流感血凝素(ha)衍生的连接体("ha-标签")<400>6glyalatyrprotyraspvalproasptyralaser1510<210>7<211>23<212>prt<213>智人<220><221>misc_feature<222>(1)..(23)<223>磷酸化-tau386-408表位<220><221>misc_feature<222>(11)..(11)<223>磷酸化-丝氨酸残基<220><221>misc_feature<222>(19)..(19)<223>磷酸化-丝氨酸残基<400>7thrasphisglyalagluilevaltyrlysserprovalvalsergly151015aspthrserproarghisleu20<210>8<211>114<212>prt<213>小家鼠<220><221>misc_feature<222>(1)..(114)<223>抗体6b2g12的轻链可变结构域<400>8gluleuaspvalglnmetthrglnthrproleuthrleuservalthr151015ileglyglnproalaserilesercyslysserserglnserleuleu202530tyrserasnglylysthrtyrleuasntrpleuleuglnargprogly354045glnserprolysargleuiletyrleuvalserlysleuaspsergly505560valproaspargphethrglyserglyserglythraspphethrleu65707580lysileserargvalglualagluaspleuglyvaltyrtyrcysval859095glnglythrhisserproleuthrpheglyalaglythrlysleuglu100105110leulys<210>9<211>117<212>prt<213>小家鼠<220><221>misc_feature<222>(1)..(117)<223>抗体6b2g12的重链可变结构域<400>9leugluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysprogly151015alaservallysilesercyslysthrserglutyrthrphethrglu202530tyrthrlyshistrpvallysglnserhisglylysserleuglutrp354045ileglyserileasnproasnasnglyaspthrtyrtyrasnglnlys505560phethrasplysalathrleuthrvalasplysserserthrthrala65707580sermetgluleuargserleuthrphegluaspseralavaltyrtyr859095cysalametglyaspseralatrpphealatyrtrpglyglnglythr100105110leuvalthrvalser115<210>10<211>114<212>prt<213>小家鼠<220><221>misc_feature<222>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