十二烷基壳聚糖在制备止血敷料中的应用的制作方法

本发明涉及一种十二烷基壳聚糖的应用，特别是涉及一种十二烷基壳聚糖在制备止血敷料中的应用。

背景技术：

过度失血是战伤致死的主要原因，也是事故和手术治疗过程中致死的主要原因。常规的止血方法如人工挤压、烧灼术和伤口缝合等有时并不能有效止血，还需要止血材料配合使用。常用的止血材料包括明胶、胶原、纤维蛋白胶、α-氰基丙烯酸酯胶、多孔沸石等，尽管这些材料各有优势，但也或多或少存在一些缺陷：明胶和胶原的组织粘附力较差[1]；纤维蛋白胶源自血液，会引发病毒感染[2]；α-氰基丙烯酸酯胶降解过程中会释放出氰和甲醛等有毒物质，造成伤口愈合延迟[3]；多孔沸石在吸收血液中的水分后会放出大量的热[4]等等。研制组织粘附性好、生物安全性高、促进创面愈合、无毒副作用的新型高效止血剂非常重要。

壳聚糖是自然界中唯一的天然碱性多糖,也是少数具有正电荷的天然产物之一。它与血液接触时能引起红细胞和血小板粘附聚集，并通过吸附血浆蛋白、活化补体系统而起到加速止血作用。它还具有良好的生物粘附性和抗菌性，易于形成凝胶、促进上皮修复等优点，是理想的天然止血材料[5]。

最新研究表明，壳聚糖止血产品(Celox^TM和)对于大出血创面的疗效极不稳定，例如，对股动脉出血创面的止血效果仅与普通脱脂纱布相当[6,7]。这可能是由于在不同的研究中，出血创面动物模型的制作、材料的具体使用方法以及止血性能评价指标之间存在差异，但同时也说明壳聚糖材料本身的凝血作用还很有限，不能真正满足临床上大出血创面实际应用的需要。

壳聚糖可溶于稀酸溶液中，重复单元中含有羟基和氨基，在适当的反应条件下，可进行O-、N-和O，N-位反应，引入烷基、羟烷基、羧甲基、季铵基等官能团，得到不同功能的壳聚糖衍生物。最新研究表明，壳聚糖的C2位上引入一定数量的十八烷基苯基团进行疏水改性后，可以显著提高壳聚糖的凝血性能[8，9]，但关于接枝其他疏水性烷基基团，例如十二烷基，是否也会提高材料的凝血作用，以及十二烷基壳聚糖能否对大出血创面起到有效止血作用还未见文献报道。

壳聚糖烷基化改性的主要途径包括：与卤代烷、高级脂肪醛及长链脂肪酰反应等方式[10-12]。其中壳聚糖与高级脂肪醛的反应活性大，反应速率高，是常用的一种方法。该反应通常是在酸性条件下，使醛和壳聚糖的氨基发生反应形成席夫碱(亚胺结构)，然后在还原剂作用下生成烷基化壳聚糖。

壳聚糖能够溶解在体积浓度为1％的醋酸溶液中形成水相，而高级脂肪醛为有机质，由于壳聚糖酸溶液很难在有机相中发生化学反应，因此常在反应体系中加入相转移催化剂以诱导反应进行。但反应生成的中间体席夫碱在水溶液中却极不稳定[13]，易重新分解为初始的反应物，而且还原剂在水中亦易分解，因此寻找合适的溶剂和还原剂是还原氨化法制备烷基化壳聚糖的关键。

参考文献

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[13]邢其毅.基础有机化学(第3版)(下册).高等教育出版社，2005

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种十二烷基壳聚糖在制备止血敷料中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

十二烷基壳聚糖在制备止血敷料中的应用。

上述十二烷基壳聚糖优选下述方法制成：

(1)将粘均分子量为30-100万、脱乙酰度92％-98％的壳聚糖溶于体积浓度为1％的乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解；所述壳聚糖与所述乙酸水溶液的比例为2g:50-100mL；

(2)向步骤(1)获得的溶液中加入氢氧化钠水溶液调节pH至8-12，产生壳聚糖沉淀；过滤，将滤饼溶于二甲基甲酰胺中；所述滤饼干品与二甲基甲酰胺的比例为5g:100-200ml；按壳聚糖重复单元分子个数与月桂醛分子个数之比为5～2:1的比例加入月桂醛，用乙酸调节pH至5-7，室温下搅拌4-8h；在氮气下加入与月桂醛等摩尔的三乙酰氧基硼氢化钠，继续反应12-24h，过滤，滤饼依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤，室温晾干，得到十二烷基壳聚糖粉末。

用十二烷基壳聚糖粉末制备止血海绵的方法为：

将十二烷基壳聚糖与体积浓度为1％的乙酸水溶液混合，使十二烷基壳聚糖的终质量浓度为1-10％，搅拌溶解后，放入模具中-20℃预冻6h，再经冷冻干燥48h得到十二烷基壳聚糖止血海绵。

本发明的优点：

为提高还原氨化反应的稳定性和选择性，本发明分别以二甲基甲酰胺和三乙酰氧基硼氢化钠为反应溶剂和还原剂，通过还原氨化法合成十二烷基壳聚糖，再通过冷冻干燥制成止血海绵。经理化性能测试、微观形貌分析、体外凝血性能和动物模型实验，筛选出综合性能优异的十二烷基壳聚糖止血海绵。

壳聚糖经酸液溶解、碱液处理后，其物理性能会发生改变，导致其在有机溶剂中的溶解性大大提高。尽管还原氨化反应常用的溶剂为1,2,-二氯乙烷和四氢呋喃，但壳聚糖在这两种溶剂中的溶解性均不理想，这里我们尝试以二甲基甲酰胺为反应溶剂，使预处理壳聚糖直接溶解进入有机相。另外，与还原氨化反应常用的还原剂——硼氢化钠，氰基硼氢化钠相比，三乙酰氧基硼氢化钠不仅毒性较低，而且只选择性还原亚胺结构，因此，以三乙酰氧基硼氢化钠为还原剂的烷基化反应，不仅能有效减少反应中副产物的生成，而且能明显节省还原剂用量，反应可控性强。

实验证明：十二烷基壳聚糖制成止血海绵后快速阻止动脉出血，适合灾害救援、反恐处突、野外作业中伤员动脉出血的紧急救治。

附图说明

图1为止血海绵纵切面SEM图(A：CS B：HM-CS1C：HM-CS2D：HM-CS3E：HM-CS4)

图2为止血海绵与血液接触5min时的OD值，(*代表与壳聚糖相比P<0.05)

图3为股动脉止血实验(A为阳性对照，B为CS，C为HM-CS1，D为HM-CS2，E为HM-CS3，F为HM-CS4)

图4HM-CS对动脉出血的止血时间和出血量(A为止血时间；B为出血量。*代表与阳性对照相比P<0.05；#代表与壳聚糖相比P<0.05)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

十二烷基壳聚糖粉末的制备方法，包括如下步骤：

(1)将粘均分子量为65万、脱乙酰度95％的壳聚糖(CS)溶于体积浓度为1％的乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解；所述壳聚糖与所述乙酸水溶液的比例为2g:100mL；

(2)向步骤(1)获得的溶液中加入1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至12，产生壳聚糖沉淀；过滤，将滤饼溶于二甲基甲酰胺中；所述滤饼干品与二甲基甲酰胺的比例为5g:150mL；按壳聚糖重复单元分子个数与月桂醛分子个数之比为2:1的比例加入月桂醛(阿拉丁，上海)，用乙酸调节pH至6.5，室温下搅拌6h；在氮气下加入与月桂醛等摩尔的三乙酰氧基硼氢化钠(STAB-H，克拉马尔，上海)，继续反应18h，过滤，滤饼依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤，室温晾干，得到十二烷基壳聚糖粉末，简称为HM-CS4。

用按壳聚糖重复单元分子个数与月桂醛分子个数之比为5：1，10：3，10：1分别替代本实施例步骤(2)中的壳聚糖重复单元分子个数与月桂醛分子个数之比为2：1，其它同本实施例，得到的十二烷基壳聚糖粉末，简称依次为HM-CS2、HM-CS3、HM-CS1。

用十二烷基壳聚糖粉末制备止血海绵的步骤为：

将上述各十二烷基壳聚糖粉末与体积浓度为1％的乙酸水溶液混合，使十二烷基壳聚糖的质量浓度为4％，搅拌溶解后，放入模具中-20℃预冻6h，，再经冷冻干燥48h得到十二烷基壳聚糖止血海绵。

实施例2

十二烷基壳聚糖粉末的制备方法，包括如下步骤：

(1)将粘均分子量为30万、脱乙酰度92％的壳聚糖溶于体积浓度为1％的乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解；所述壳聚糖与所述乙酸水溶液的比例为2g:50mL；

(2)向步骤(1)获得的溶液中加入1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至8，产生壳聚糖沉淀；过滤，将滤饼溶于二甲基甲酰胺中；所述滤饼干品与二甲基甲酰胺的比例为5g:100ml；按壳聚糖重复单元分子个数与月桂醛分子个数之比为5:1的比例加入月桂醛，用乙酸调节pH至7，室温下搅拌4h；在氮气下加入与月桂醛等摩尔的三乙酰氧基硼氢化钠，继续反应12h，过滤，滤饼依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤，室温晾干，得到十二烷基壳聚糖粉末。

用上述十二烷基壳聚糖粉末制备止血海绵的步骤为：

将上述十二烷基壳聚糖与体积浓度为1％的乙酸水溶液混合，使十二烷基壳聚糖的质量浓度为1％，搅拌溶解后，放入模具中-20℃预冻6h，再经冷冻干燥48h得到十二烷基壳聚糖止血海绵。

实施例3

十二烷基壳聚糖粉末的制备方法，包括如下步骤：

(1)将粘均分子量为100万、脱乙酰度98％的壳聚糖溶于体积浓度为1％的乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解；所述壳聚糖与所述乙酸水溶液的比例为2g:100mL；

(2)向步骤(1)获得的溶液中加入1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至10，产生壳聚糖沉淀；过滤，将滤饼溶于二甲基甲酰胺中；所述滤饼干品与二甲基甲酰胺的比例为5g:200ml；按壳聚糖重复单元分子个数与月桂醛分子个数之比为10:3的比例加入月桂醛，用乙酸调节pH至5，室温下搅拌8h；在氮气下加入与月桂醛等摩尔的三乙酰氧基硼氢化钠，继续反应24h，过滤，滤饼依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤，室温晾干，得到十二烷基壳聚糖粉末。

用上述十二烷基壳聚糖粉末制备止血海绵的步骤为：

将上述十二烷基壳聚糖粉末与体积浓度为1％的乙酸水溶液混合，使十二烷基壳聚糖的终质量浓度为10％，搅拌溶解后，放入模具中-20℃预冻6h，再经冷冻干燥48h得到十二烷基壳聚糖止血海绵。

实验证明，实施例2、实施例3制备的十二烷基壳聚糖粉末，再制备成止血海绵后与相同分子量CS止血海绵的止血效果具有显著差异。

实施例4

用实施例1获得的四种十二烷基壳聚糖止血海绵进行。

1.实验：

(1)HM-CS的结构表征

①取代度

精密称取各组HM-CS止血海绵m(mg)置500ml烧杯中，分别加入摩尔浓度为C1(mol/L)的HCl标准溶液V1(ml)使样品溶解，用摩尔浓度为C2(mol/L)的NaOH标准溶液返滴定，测定电导率值，并作电导率——NaOH体积关系图，求其回归方程后得到等当点的NaOH体积V2(ml)，按下式计算十二烷基壳聚糖的取代度DS：

X＝C1V1-C2V2

161X+203Y+329Z＝m

DS＝Z/(X+Y+Z)

其中X为十二烷基壳聚糖中脱乙酰但未取代单元(相对分子质量161)的物质的量(mmol)；Y为未脱乙酰单元(相对分子质量203)的物质的量(mmol)；Z为十二烷基壳聚糖重复结构单元(相对分子质量329)的物质的量(mmol)；

②相对黏度

乌氏粘度计测定十二烷基壳聚糖粉末的相对粘度。将CS和不同取代度的HM-CS粉末0.1000g溶于0.1mol/LCH3COOH和0.2mol/LNaCl混合溶剂100ml中，搅拌至完全溶解。按照乌氏粘度计操作说明进行操作，分别测定供试液和纯溶剂的流出时间T和T0，每组平行三次测定。按下式计算十二烷基壳聚糖的相对粘度。

ηr＝T/T0

文献15：潘祖仁.高分子化学.第五版.化学工业出版社，2014.1

(2)物理性能表征

①海绵微结构：将HM-CS海绵置液氮中片刻，迅速取出并用锋利的手术刀沿纵面切开。样品固定后，于剖面上喷金，然后用SEM观察其微观结构。

②接触角：将CS和四种HMCS粉末约0.1g溶于1％醋酸溶液中，吸取少量溶液滴入载玻片，真空干燥箱中干燥制成薄膜。取出，用接触角测定仪(FM40Easy Drop)检测水在材料表面的接触角。

③孔隙率、密度：测定材料的孔隙率和密度一般采用的是液体置换法，即用量筒量取V1体积的无水乙醇，剪取一定质量(W)的材料放入量筒中，在真空干燥箱中反复抽真空至无气泡逸出，此时量筒读数为V2，将量筒中的材料移出后，此时量筒读数为V3。按下式计算孔隙率(P)和密度(d)：

P＝(V1-V3)/(V2-V3)×100％，d＝W/(V2-V3)。

文献16：Yanwei Zhao,Lu Liu,Xiang Han,Jing Guan.Preparation of N,O-carboxymethyl chitosan with different substitutional degree and its application for hemostasis.Advanced material research，2013，798-799：1061-1066

(3)体外凝血性能

家兔股动脉插管后取全血，与0.109mol/L枸橼酸钠水溶液按照体积比为9:1的比例混合均匀制成新鲜抗凝血。用分光光度法检测海绵体外凝血性能[16]：将质量为0.1g的海绵片放入小烧杯中，吸取200μL新鲜抗凝血加到海绵上，5min后将100ml蒸馏水沿烧杯壁加到烧杯中，吸取少量溶液，迅速用分光光度计检测溶液在540nm处吸光度(OD)。

文献16：Sun Yushan,Liu Xin,Wang Yue,et al.Research on Haemostatic Function of Biological Medical Textiles.Technical textiles,2000,18(123):28-32

(4)在体凝血性能

健康、成年的新西兰兔30只，雌雄各半，体重均不低于2kg，随机分组，分别为阳性对照组(泰菱可吸收止血纱布)、试验组(壳聚糖止血海绵CS、不同取代度HM-CS海绵)，每组各5只，使动物适应环境，并按GB/T16886.2规定饲养。试验前24h禁止喂食但不禁水。

动物称重后，经耳缘静脉缓慢注射20％乌拉坦，以5ml/kg的剂量执行。切实麻醉后，仰卧绑定，四肢用绷带系于手术台的固定环上，暴露左侧腹股沟，剃毛，备皮区约6cm×8cm，清洁后用碘酒消毒，再用酒精脱碘消毒，铺上创巾，暴露切口部位(试验过程中视动物麻醉的深度追加20％乌拉坦，每次1ml)。用手术刀在左侧股动脉处垂直腹股沟切口，长度约5cm，钝性器械分离肌间结缔组织，暴露并分离股动脉，在近心端和远心端分别使用动脉夹阻断血流，两动脉夹之间距离约1cm。用手术剪将两动脉夹之间的动脉横向剪断，先后放开远心端与近心端的动脉夹，自由出血10s后迅速用三组止血材料敷于创口，并施以适当压力(200g砝码)，观察出血状况，记录敷料止血时间和出血量。

(5)统计学分析

所有实验重复三次，采用SPSS13.0统计分析软件处理数据，数据采用单因素方差分析，通过LSD和S-N-K多重比较法分析组间差异的显著性水平。P值<0.05表示组间具有统计学差异。

2.结果

(1)取代度与相对粘度

取代度与相对粘度数据如表1所示。通过调控反应参数，十二烷基壳聚糖的取代度可以控制在7％～40％之间；改性后，HM-CS1、HM-CS2、HM-CS3、HM-CS4的相对黏度依次降低，提示改性后随着十二烷基基团接枝数量的增加，材料的分子量呈下降趋势。可能的原因是反应过程中壳聚糖大分子有部分降解。

表1.HM-CS的取代度

(2)微结构，

见图1，图1为各种海绵的纵切面微观形貌图。图中显示以十二烷基壳聚糖为原料冻干制成的海绵仍呈疏松多孔结构。

(3)孔隙率、密度和接触角

表2.HM-CS海绵的孔隙率、密度和接触角

如表2所示：随着十二烷基基团取代度的增加，海绵的孔隙率、密度逐渐降低，接触角逐渐增大，其中HM-CS4的接触角最大为80.93°，提示引入十二烷基后，材料的疏水性能明显提高。

(4)体外凝血性能

体外凝血实验发现与纯壳聚糖海绵相比，合成的四种HM-CS材料与血液接触5min时，体系的OD值均明显降低(p<0.05)，其中HMCS-2的OD值最小，提示本发明制备的四种十二烷基壳聚糖海绵的体外凝血性能均明显优于改性前的壳聚糖海绵，当壳聚糖重复单元分子个数与月桂醛分子个数之比为5：1时制备的十二烷基壳聚糖海绵，其体外凝血性能最好。见图2。

(5)股动脉凝血性能，见图3.

图3、图4是泰菱可吸收止血纱布、壳聚糖海绵以及不同取代度十二烷基壳聚糖海绵在兔股动脉出血模型试验中的实验照片与止血效果(凝血时间和出血量)柱形图。其中纯CS虽然可以用于大面积创面的止血，但从图中数据可以看出，纯CS止血时间和出血量较阳性对照组大，通过将十二烷基引入壳聚糖进行改性后，HM-CS2、HM-CS3、HM-CS4材料在止血时间上与纯CS相比明显降低，但与泰菱可吸收止血纱布组相比，出血时间没有显著差异；从出血量来看，HM-CS2、HM-CS3、HM-CS4与壳聚糖组相比明显减少，其中HM-CS4与阳性对照组相比亦显著减少。总结止血时间和出血量两项指标提示，当壳聚糖重复单元分子个数与月桂醛分子个数之比为2：1时制备的十二烷基壳聚糖海绵用于体内止血时，用时最短，出血量最少，止血效果最好。