本发明涉及药物化学领域，更具体地涉及酰胺类药物及其在抑制瞬时受体电位通道蛋白(trpa1)方面的应用。
背景技术：
瞬时受体电位通道(transientreceptorpotential，trp)是一类存在于细胞膜上的重要阳离子通道构成的蛋白超家族，首次由minke等在研究果蝇视觉传导系统时发现。后续研究又发现了一系列trp家族通道成员。依据约30种在哺乳类动物中发现的trp通道的序列同源性，一共划分为6个亚家族，即trpc、trpv、trpm、trpml、trpa和trpp。trp通道的c端和n端均位于细胞膜内，并且含有s1-s6的6次跨膜结构域。其中结构域s1-s4上配体结合的反应位点可能是门控小孔，但在s4结构域缺少正电荷氨基酸残基作为电压门控通道，大多数的trp具有很弱的电压敏感性，缺乏选择作用(pca/pna比值小于10)。s5-s6跨膜结构域亲水区形成孔道，并且在细胞质内的s6末端单环构成一个低限阀，它可以通过开关调控阳离子进入通道。
trpa1中的字母“a”指的是锚蛋白(ankyrin)，它在trp家族中被区分出来是因为trpa1的n端至少存在14个锚蛋白重复序列，高于其他亚家族的3～4个重复序列。2个螺旋的钙结合基序结构域存在于trpa1的n端，但结构域的作用尚不清楚。除了n端的重要功能，人们发现trpa1的c端单个氨基酸的突变会大幅降低trpa1的电流。最新研究表明，一个位于trpa1的s4跨膜结构的获得性功能突变会导致家族性发作的疼痛综合征，这个发现提供了第一例疼痛相关的trp离子通道疾病。
激活trpa1通道有多种途径，tpr通道一般均可被磷脂酶c激活，g蛋白偶联受体在trpa1的激活中发生了作用；在配体激活途径中，一系列的化学刺激均可激活trpa1，已被报道的激动剂包括:桂皮醛(肉桂)、大蒜素和蒜臭素(大蒜)、异硫氰酸盐类(芥子油、绿芥末、山葵)、丙烯醛(香烟)、9-四氢大麻酚(大麻)、二烯丙基二硫化物、芥末油(芥末)、icilin、水杨酸甲酯(冬青油)等。有文献报道，薄荷作为trpm8的激动剂，对trpa1具有双峰效应：在高浓度时抑制trpa1，低浓度时激活trpa1。除外源性激动剂外，最新研究表明，在组织损伤、炎症、氧化应激过程中释放的内源性化合物4-羟基壬烯酸和15-脱氧-12，14前列腺素j2可以激活trpa1。最新研究发现，在trpa1的激活过程中，激动剂通过与tpra1的n端半胱氨酸残基共价相互作用激活trpa1。除以上两种生物化学激活途径外，trpa1通道也可被伤害性低温和机械刺激激活。
近年研究发现，trpa1通道与疼痛、神经病变等疾病相关。目前，国内研究较少，但国外制药公司已经开发了一系列嘧啶二酮类trpa1抑制剂，trpa1通道也成为新型镇痛药的研究热点。目前多种技术手段，包括rna干扰、基因敲除等已经明确了在疼痛感受中trpa1的作用。trpa1拮抗剂的急性疼痛和慢性疼痛的1期和2期临床试验正在规划阶段，以取代传统使用的阿片肽类镇痛药。trpa1作为镇痛药物的新靶点，必将开拓新型镇痛药的研究方向。
人们还在不断深入了解trpa1通道的功能和作用，最新研究发现其阻断剂具有抗抑郁和抗焦虑作用。此外，trpa1已经被证实为治疗炎症、呼吸障碍(哮喘、咳嗽、慢性堵塞性肺病)、瘙痒、尿路感染和炎症性肠病的靶标。各大制药公司在这研究领域也非常活跃。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种抑制瞬时受体电位通道蛋白(trpa1)活性的化合物及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种式a所示的化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备一药物组合物或制剂，所述药物组合物或制剂用于(a)抑制瞬时受体电位通道蛋白trpa1；(b)治疗与瞬时受体电位通道蛋白相关的疾病；
式中，
r1为-lp-z,其中各l为二价连接基团，p为1-3的整数，
l为取代或未取代的-o-c1-c8亚烷基、取代或未取代的c3-c8酯基，所述取代基指具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、-oh、-nh2、-cn、苯基、c5-c7环烷基、-(ch2)m-杂环，所述杂环为含有1-3个选自n、o、s的杂原子的5-7元杂环，m为0-5的整数；
z为
在另一优选例中，所述的酯基为-(c1-c8亚烷基)
在另一优选例中，所述的酯基为
在另一优选例中，所述的z为
在另一优选例中，所述的z为
在另一优选例中，所述的z为
在另一优选例中，所述的杂环为噻吩。
在另一优选例中，所述的杂环为四氢呋喃。
在另一优选例中，所述的m为0。
在另一优选例中，所述的m为1。
在另一优选例中，所述的a式化合物包括以下化合物或其药学上可接受的盐：
在另一优选例中，所述的a式化合物包括选自下组的一种或多种化合物：
在另一优选例中，所述的瞬时受体电位通道蛋白trpa1为人瞬时受体电位通道蛋白trpa1。
在另一优选例中，所述的与瞬时受体电位通道蛋白相关的疾病选自下组：疼痛、炎症、呼吸障碍、瘙痒、尿路障碍、炎症性肠病。
在另一优选例中，所述的呼吸障碍选自下组：哮喘、咳嗽、慢性堵塞性肺病。
在另一优选例中，所述的药物组合物所述药物组合物中含有0.001-99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％的式a化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，按组合物的总重量计。
在另一优选例中，所述的药物组合物或制剂还可含有其他药物活性成分或药学上可接受的载体。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它含有(a)活性成分，所述活性成分包括选自下组的至少两种化合物或其药学上可接受的盐，及其光学异构体或其药学上可接受的盐；
以及(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，当所述活性成分含有两种组分时，两种组分的重量比为1:20至20:1，较佳地1:10至10:1，更佳地1:5至5:1。
在另一优选例中，在所述的药物组合物中，组分(a)的总量为0.001-99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％，按组合物的总重量计。
在另一优选例中，所述的药物组合物或制剂还可含有其他药物活性成分或药学上可接受的载体。
在本发明的第三方面，提供了一种药盒，所述的药盒包括：
(1)第一容器，以及位于所述容器内的第一药物组合物，所述的第一药物组合物含有式1化合物或其药学上可接受的盐，及其光学异构体或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体；
(2)第x容器，以及位于所述容器内的第x药物组合物，所述的第n药物组合物含有第x化合物或其药学上可接受的盐，及其光学异构体或其药学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体；其中，x为2或3；
其中，第一化合物和第n化合物均为选自下组的化合物：
以及(3)任选的使用说明书。
在本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性的抑制瞬时受体电位通道蛋白trpa1活性的方法，其特征在于，将瞬时受体电位通道蛋白与式a化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐进行接触，从而抑制瞬时受体电位通道蛋白的活性，其中所述的式a化合物如本发明第一方面中所述。
在本发明的第五方面，提供了一种抑制抑制瞬时受体电位通道蛋白trpa1的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用式a化合物，其中所述的式a化合物如本发明第一方面中所述。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1所示为化合物1抑制trpa1活性的量效关系曲线图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现了一类结构如式a所示酰胺类化合物可以显著地抑制trpa1的活性。实验表明，所述的式a化合物对trpa1有较好的抑制效果。本发明的式a化合物可用于治疗与trpa1靶点相关的疼痛、炎症、呼吸障碍、瘙痒、尿路障碍、炎症性肠病等。在此基础上，完成了本发明。
术语
术语“c1-c8亚烷基”指具有1-8个碳原子的直链或支链亚烷基，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、或类似基团。
术语“c1-c6烷基”指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、或类似基团。
术语“c3-c6环烷基”指具有3-6个碳原子的环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、或类似基团。
术语“c1-c3亚烷基”指具有1-3个碳原子的直链或支链亚烷基，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、或类似基团。
术语“c5-c7环烷基”指具有5-7个碳原子的环烷基，例如环戊基、环己基、或类似基团。
术语“c1-c6卤代烷基”指具有1-6个碳原子的卤素取代的直链或支链烷基，例如卤代甲基、卤代乙基、卤代丙基、卤代异丙基、卤代丁基、卤代异丁基、或类似基团。
术语“5-7元杂环”指具有一个或多个，优选1-3个杂原子的环状结构，所述的环可以是饱和或不饱和的环。
术语“卤素”指f、cl、br和i。
活性成分
如本文所用，“本发明化合物”、或“式a化合物”可互换使用，指式a所示的化合物、或其消旋体、对应异构体、或其药学上可接受的盐。应理解，该术语还包括上述组分的混合物。
本发明化合物不仅对trpa1具有抑制作用，对trp家族中其它成员也有一定的抑制作用。
式中，各基团的定义如上所述。
在本发明中，还包括式a化合物的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
本发明的式a化合物可采用现有技术中本领域技术人员熟知的方法进行制备，对各个步骤的反应参数没有特别限制。此外，本发明的典型化合物也可通过市售方式获得。
如本文所用，在式a化合物中，如果存在手性碳原子，则手性碳原子可以为r构型，也可以为s构型，或二者的混合物。
度洛西汀(duloxetine)是2002年上市的第三代抗抑郁药，临床使用其盐酸盐，商品名cymbalta(欣百达)。由美国礼来公司(elililly)研发上市。度洛西汀是一种新型的5-羟色胺(5-ht)和去甲肾上腺素(ne)高度特异性的双重抑制剂，通过抑制神经元突触对5-羟色胺(5-ht)和去甲肾上腺素(ne)的再摄取，增加神经递质水平，从而显著改善抑郁患者的情绪不适症状和疼痛性躯体症状而产生抗抑郁作用。萘呋胺酯为外周血管扩张药，对抗由5-羟色胺受体(s2受体)引起的血管收缩和血小板聚集，促进血液循环，保护内皮细胞，降低血液粘度。在局部缺血状态下，可提高三磷酸腺昔的浓度，增强细胞氧化能力。盐酸普萘洛尔非选择性β-受体阻断药，阻断心肌的β受体，对β1和β2受体均有拮抗作用。减慢心率,抑制心脏收缩力与传导、循环血量减少、心肌耗氧量降低。临床主要用于治疗多种原因所致的心律失常，也可用于心绞痛高血压嗜铬细胞瘤(手术前准备)等。
瞬时受体电位通道蛋白(trpa1)
瞬时受体电位通道蛋白(transientreceptorpotential,trpa1)是一类存在于细胞膜上的重要阳离子通道构成的蛋白超家族。研究发现，trpa1通道与疼痛、神经病变等疾病相关。此外，已经被证实，trpa1还是治疗炎症、呼吸障碍、瘙痒、尿路感染和炎症性肠病的靶标。
用途
本发明还提供了一种抑制瞬时受体电位通道蛋白trpa1的方法，以及治疗与瞬时受体电位通道蛋白相关的疾病的方法。
本发明的上述式a化合物可用于抑制trpa1，进而预防或治疗与瞬时受体电位通道蛋白相关的疾病。
在本发明中，与瞬时受体电位通道蛋白相关的疾病的例子包括(但并不限于)：疼痛、炎症、呼吸障碍、瘙痒、尿路障碍、炎症性肠病。较佳地，所述的呼吸障碍选自下组：哮喘、咳嗽、慢性堵塞性肺病。
在一实施例中，本发明提供了一种体外非治疗性的抑制瞬时受体电位通道蛋白trpa1活性的方法，包括：例如在体外培养体系中，将瞬时受体电位通道蛋白或表达所述蛋白的细胞与式a化合物(或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐)进行接触，从而抑制瞬时受体电位通道蛋白的活性。
本发明还提供了一种抑制瞬时受体电位通道蛋白trpa1的方法，该方法可以是治疗性的或非治疗性的。通常，该方法包括步骤：给需要的对象施用本发明的式a化合物。
优选地，所述对象包括人和非人哺乳动物(啮齿动物、兔、猴、家畜、狗、猫等)。
组合物和施用方法
本发明提供了一种用于抑制瞬时受体电位通道蛋白(trpa1)活性的组合物。所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、食品组合物、膳食补充剂、饮料组合物等。
在本发明中，所述的药物组合物可直接用于疾病治疗，例如，用于呼吸障碍的治疗。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明化合物以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。
以药物组合物为例，本发明的组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。
此外，本发明的瞬时受体电位通道蛋白(trpa1)抑制剂还可与其他治疗剂一起使用。
对于本发明的药物组合物，可通过常规的方式施用于所需的对象(如人和非人哺乳动物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、注射、雾化吸入等。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的式a化合物对trpa1具有显著的抑制效果。
(b)本发明的典型式a化合物具有优良的安全性，毒副作用很小或几乎无毒副作用。
(c)本发明的式a化合物对于与trpa1靶点相关的多种疾病的治疗具有良好的开发应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
材料
化合物1、2和3为市售的以下化合物：
通用方法
ionworksbarracuda(iwb)自动化膜片钳检测：将稳定表达mtrpa1的hek293细胞，含有15g/mlblasticidinshcl、200g/mlhygromycinb和10％fbs血清的dmem培养基，置于t175的培养瓶中，放入37℃、5％co2的培养箱中培养，待细胞密度生长到～80％时，移走培养液，用无钙镁的磷酸缓冲液(pbs)冲洗一遍，加入3ml的trypsin消化2分钟，加入7ml培养液终止消化。将细胞收集到15ml的离心管中以800转/每分钟的速度离心3分钟，去除上清液后，将细胞加入适当体积的细胞外液重悬，使细胞密度控制在2～3×106/ml，并用于iwb实验。细胞外液配方(inmm)：140nacl,5kcl,1mgcl2,10hepes,0.5egta,10glucose(ph7.4)；细胞内液配方(inmm)：140cscl,10hepes,5egta,0.1cacl2,1mgcl2(ph7.2)。两性霉素b与实验当天用dmso新鲜配制成28mg/ml，再用细胞内液配制成0.1mg/ml的终浓度。
iwb实验使用人口膜片箝(populationpatchclamp,ppc)板，全部检测过程由仪器自动完成。在ppc板的384孔中加入细胞外液，并在ppc板下(即plenum内)加入细胞内液后，加入6l的细胞液进行封接测试，最后将plenum中的细胞内液换成含两性霉素b的细胞内液，使封接的细胞穿孔后形成全细胞记录模式。记录tpra1电流的采样频率为10khz，细胞钳制在0mv，电压刺激命令(channelprotocol)为一个300ms从-100mv到+100mv的斜坡(ramp)电压，每10s施加电压刺激，mtrpa电流由300maitc诱发。
数据记录和电流幅度测量导出由iwb软件完成(version2.5.3，moleculardevicescorporation，unioncity，ca)。封接阻抗低于20mω的孔将不记录数据统计。原始电流数据由软件进行漏减矫正，trpa1电流幅度在+100mv时测得。实验的每块ppc板都将有一个hc030031的剂量效应数据作为阳性对照，如hc030031的ic50值超过以往每块板上得到的ic50平均值的3倍时，将进行复测。化合物剂量效应曲线和ic50由graphpadprism5.02(graphpadsoftware,sandiego,ca)进行拟合计算。
实施例1
用以上所述方法，对化合物1、2和3进行了ic50抑制活性测试。
结果如下表1所示：本发明所述化合物1、2和3均为瞬时受体电位通道蛋白(trpa1)活性抑制剂，所述化合物1、2和3对trpa1的活性有显著的抑制作用。
表1
实施例2
药盒
制备以下一种药盒，所述的药盒包括：
(1)第一容器，以及位于所述容器内的第一药物制剂(片剂)，该制剂含有以下活性成分；
(2)第二容器，以及位于所述容器内的第一药物制剂(如片剂)，该制剂含有以下活性成分；
以及(3)使用说明书。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。