一种卡介苗干粉微针疫苗及其制备方法与流程

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种卡介苗干粉微针疫苗，还涉及该干粉微针疫苗的制备方法，该卡介苗干粉微针疫苗可以取代传统的注射器皮内接种方法。

背景技术：

结核病是当前危害最大的细菌性传染病，全世界有三分之一的人受到感染，其中5％～10％在一生中迟早会发生临床疾病。2015年世界结核病报道显示，新发病例约900万，死亡150万左右。目前唯一获得许可的预防结核病的疫苗为卡介苗(BCG)。卡介苗(BCG)问世已有80年，是目前使用最广泛的疫苗之一。1921年，BCG疫苗首次被用于人体免疫。1974年，BCG被纳入WHO的扩大免疫规划，随后总免疫覆盖率在肺结核(TB)高发国家高达80％以上。在将BCG纳入儿童计划免疫的国家，BCG在新生儿和婴儿中的接种率达到了80％以上。BCG对儿童期脑膜炎和播散性TB具有可靠的保护效果。目前，每年约有1亿儿童接种BCG。

卡介苗的接种方式有口服、划痕和皮下注射接种三种方式。(1)皮内法：即皮内注射法。注射部位在左上臂三角肌下端外缘，注射后应起一皮丘。结核菌素试验阴性者，所用菌苗每毫升含卡介苗0.5mg或0.75mg，用0.1mL做皮内注射用，严禁注入皮下。此法阳转率高且稳定。(2)皮上划痕法：皮上划痕所用卡介苗是乳白色混悬液，每1mL内含菌量50～75mg。在左上臂三角肌下端外缘，用酒精消毒皮肤，待干后，滴2～3滴摇匀的菌苗液，用消毒的针划一“井”字，各长1～1.5cm，间隙0.5cm，以出现红痕为宜，涂匀菌苗，使其渗入皮内，菌苗干后才可穿衣服。此法操作简单，易于普及和推广，局部反应轻，淋巴结反应较少。(3)口服法：只限于出生后2个月以内的婴儿。经临床验证，以皮内法和口服法阳转率较高，皮上划痕法阳转率较低。

WHO推荐采用皮内接种法，即使用注射器和针头在上臂的三角肌区域注射。皮内注射接种虽然可以产生较好的免疫效果，但也有些不利因素存在。首先，由于接种技术要求较高，需要专业人员操作；其次，注射接种后皮肤会产生红肿、水泡、溃烂等不良反应，还会留下疤痕，其炎症反应会导致有的婴幼儿发烧；最后，皮内注射接种需要注射器，会形成生物废料需要处理，而且卡介苗的保存需要低温，导致一些偏远落后地区接种卡介苗不便。

微针卡介苗接种技术很好的解决了上述的皮内接种的不良因素。目前的微针疫苗一般是将疫苗与可溶性材料混合后制备微针，这种制备方法只能投递灭活疫苗或蛋白质，其保存时间较短，可溶性聚合物高分子材料对活性生物大分子的免疫原性的影响也难以评估。而中空结构微针多采用金属，硅等材料，一般用于液体制剂的投递，由于难以解决液体泄露的问题，现在实际应用很少。本发明利用可溶性中空微针作为卡介苗投递工具，将卡介苗(BCG)以干粉的形式直接投递到皮内，从而激活免疫细胞，达到免疫效果。疫苗以干粉的性质投递到皮肤内，可以最大限度的保存物质的生理活性，并减轻对皮肤的刺激作用。BCG以干粉状态装载在微针中，常温状态下保存期大大延长，并且极大的节约运输和保存成本，此外，BCG直接以干粉的形式封闭于微针中，使微针在相同尺寸下的装载量显著的提高，从而使卡介苗以免疫贴片进行人体免疫成为可能，克服了目前的微针贴片普遍存在载药量少、难以满足临床上的实际需要等问题。本发明技术操作简单，免疫接种时不需专业人员操作，且无生物废料产生。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种卡介苗干粉微针疫苗，基于该微针疫苗的接种克服了注射接种卡介苗易产生红肿、水泡、疤痕、炎症等不良反应，同时卡介苗以干粉的状态装载在中空结构的微针中，载药量可满足临床需要，还可以在常温状态下保存长达三个月，极大的节约了运输和保存成本，并且接种时无需专业人员操作，也无生物废料产生。

本发明的再一个目的是在于提供了一种卡介苗干粉微针疫苗的制备方法。当前卡介苗采用的是皮内接种方式，卡介苗冻干粉需要在4℃保存，疫苗中除了菌体外还有一些其它稳定成分，使用前需要计算好稀释量，加相应的稀释液重新转化成液体，再吸取相应的剂量用于婴幼儿接种。在这些过程中存在一系列可能的失误因素，导致免疫接种失败或者炎症反应加重等不良反应。本发明提供的微针卡介苗干粉接种技术优化了卡介苗的制备，只需要将BCG培养到对数生长期后直接收集细菌，再用PBS洗涤数次，不添加任何辅助剂，直接真空冷冻干燥，再研磨成均匀粉末即可。这种制备方法不仅简化了卡介苗的操作步骤，缩短了制作时间，还节省了制作成本。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种卡介苗干粉微针疫苗，其特征在于，由卡介苗干粉、中空的微针阵列及基底贴片组成，卡介苗干粉装载在中空的微针阵列中，所述的中空微针阵列的成分为15％质量浓度透明质酸钠盐，所述的基底贴片的成分为10％质量浓度的透明质酸钠盐。

一种卡介苗干粉微针疫苗的制备方法，其步骤是：

1.卡介苗干粉的制备：将卡介苗(BCG)培养于7H9液体培养基中，至对数生长期离心收获细菌，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤3次，冷冻干燥，研磨成粉末；

2.卡介苗干粉的装填：

(1)将15％(w/v)的透明质酸钠盐(HA)置于微针模具中，4℃1500rpm水平离心10min；将模具取出旋转180度放置，4℃2200rpm水平离心20min；将模具取出旋转180度放置，4℃3000rpm水平离心30min，通过上述操作，使透明质酸钠盐充分进入微针模具中，形成针头；去除模具表面多余的透明质酸钠盐，干燥后形成中空结构的微针阵列；

(2)将卡介苗干粉倒入制备好的微针中空结构中，4℃3000rpm水平离心10min，将模具取出旋转180度放置，继续水平离心10min，如此反复离心3次，使粉末进入微针中空部分，并去除模具表面多余的干粉；

(3)在模具表面再加入10％(w/v)的透明质酸钠盐，4℃3000rpm离心10min；将模具取出旋转180度放置，4℃3000rpm继续离心10min；将模具取出，干燥，脱模。

作为优选，所述的微针的高度为200-500μm。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.目前的卡介苗需要保存在4℃冰箱中，从而增加了保存好运输的成本，使用时需要按比例重新稀释，再由专业人员注射接种；本发明采用的微针贴片将卡介苗密封在微针中空结构中，可在室温保存3个月以上，使用操作简单，只需将微针贴片压入皮肤即可，无需专业人员操作，可以自己接种，而且不需要其它的辅助稀释液和注射器，是“即开即用”型疫苗。

2.本发明的另外一个优点就是微针卡介苗干粉免疫无皮肤刺激反应。传统皮内注射接种以产生“卡疤”为接种成功标志，95％以上婴幼儿接种后皮肤会出现红肿、溃烂，最终留下疤痕，有的婴幼儿还有发热，淋巴结肿大等不良副反应发生。本发明将卡介苗分装在微针列阵中，相当于多点同时微量免疫，无任何皮肤刺激反应，无疼，不留疤痕，减少了家属对接种卡介苗不良影响的心理排斥。

3.通过一些列实验对比显示，微针卡介苗干粉贴片免疫与传统皮内接种免疫效果一致；在激发NK细胞活性方面优于传统皮内接种免疫，推测可能是多点微量免疫可以更好的激活先天性免疫反应。

4.与现有的卡介苗制剂相比，微针卡介苗干粉制备方法简单，只需收集细菌后用PBS洗涤，冷冻干燥，再研磨成粉状即可，无需准备稀释液备用。干粉中除了细菌，无任何培养液或保护剂成分，从而进一步减少了皮肤刺激反应的可能性。

5.本发明所采用的微针采用可溶性材料HA制备，并带有中空结构。早期的微针主要采用不溶性材料制备的实体微针，不溶性材料制备的微针使用时可能会断裂，使针头滞留于皮肤内，从而带来难以估计的危险；不溶性材料如玻璃等还可以制备中空微针，其用途是注射液体制剂，这种微针前端均有开口，容易造成液体泄露，从而难准确评估药物的投递量。可溶性材料制备微针是目前的主流，可溶性材料制备微针投递药物时，一般是将药物与高分子聚合物混合后再通过聚合反应制备微针，微针溶解与药物释放同步进行，这种微针不适合携带减毒苗或者活性生物分子，荷载量也有限。本发明采用的微针不但是可溶性材料制备，还具有中空结构，可以携带任何粉末状物质，包括活性疫苗和蛋白等，保存期长，荷载量大，适合于临床推广。

附图说明

图1为空心微针与装载有BCG干粉微针的对比图。其中上层为空心微针，下层为装载有BCG干粉的微针以及其底部观察图。

图2为共聚焦显微镜下装填有SRB染色的BCG干粉的微针图。

图3为酶标仪检测SRB-BCG的发射荧光的最大吸收波长。

图4为SRB-BCG在640nm波长下荧光吸收值与重量的标准曲线。

图5为SRB-BCG干粉荷载量检测。随机检测9根微针中BCG干粉的含量，实验重复三次，每次检测6个微针贴片。

图6为微针卡介苗保存期测定。以制备好微针卡介苗当天为“0”天，分别在干燥，避光环境存放30天，60天，90天后，随机从微针贴片剪取24针，用PBS溶解后，用平板计数法计数(n＝6)。

图7为实施例3中接种后皮肤炎症检测结果。ID表示皮内注射组，PBS表示注射对照组，MN空针对照组，BCG-MN表示微针卡介苗免疫组。其中7-A为接种处皮肤的反应，ID组出现红肿，水泡，疤痕，MN组和BCG-MN组无任何皮肤反应，PBS组在第1天和第3天都可看见注射的针眼；7-B为接种第三天后接种处皮肤的HE染色镜检图，ID组可以看见大量炎性细胞浸润，而BCG-MN组无炎性细胞产生；7-C为表皮温度测定结果，ID组相对于其它试验组，接种部位表皮温度在第2,3,4,5,6,7,8天有显著上升(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

图8为接种后NK细胞、T细胞免疫反应的检测结果。其中A为免疫后一周采取外周血检测NK细胞内因子IL-2活性，发现BCG微针免疫组(BCG-MIN)NK细胞分泌IL-2的量显著高于MN组和PBS组；B为免疫后一周采取外周血检测NK细胞细胞内因子TNF-α活性，结果发现NK细胞TNF-α的分泌在各组无显著性差异；C与D分别为免疫后第4周采外周血检测T细胞内因子IFN-γ活性，结果发现ID组和BCG-MN组IFN-γ的分泌在CD4⁺T细胞(C)和CD8⁺T细胞(D)中均显著高于MN组和PBS组，BCG-MN组IFN-γ的值稍高于ID，但无显著性差异；E和F分别为免疫后第4周采外周血检测T细胞内因子TNF-α，结果发现CD4⁺T细胞在ID组和BCG-MN组中分泌TNF-α的量均显著高于MN组和PBS组(E)，但在CD8⁺T细胞中无差异(F)，*P<0.05，NS：无显著性差异。

图9为免疫4周后抗体(IgG、IgG1、gG2a)的检测结果。其中A、B、C分别为IgG、IgG1、gG2a的检测结果，结果显示，ID组与BCG-MN组(BCG干粉免疫组)产生的3种抗体无显著性差异，*P<0.05,***P<0.001。

图10为免疫3个月后脾、肺细胞因子的检测结果。其中A-D分别为脾脏细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12和IL-17的检测结果，E-H分别为肺脏细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12和IL-17的检测结果。结果表明，BCG-MN组(BCG干粉免疫组)和ID组一样，均能显著刺激相应细胞因子的产生，且BCG-MN组与ID组无显著性差异。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

具体实施方式

本发明是针对卡介苗的预防接种建立了一种新的微针贴片疫苗，详细步骤如下：

实施例1

卡介苗干粉微针疫苗的制备方法，其步骤是：

1.将卡介苗BCG(ATCC-35733，其它卡介苗疫苗株均可)培养于7H9液体培养基中(BBL^TM Mycoflasic Middlebrook 7H9broth with glycerol prepared media，BD)于37℃培养4周；10000rpm离心5min，收集细菌，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤3次，离心后用PBS重悬，置于4℃预冷2h，再置于-20℃预冷2h，再置于-76℃冷冻2h，之后置于冷冻干燥仪中抽干，以上皆为无菌操作；将BCG干粉倒入灭菌好的研磨器中充分研磨，再将研磨好的细菌倒入无菌保存管中，4℃密封保存备用。

2.按两步法制备微针：将15％(w/v)的透明质酸钠盐(HA)50μL置于微针聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具中，所述的模具规格为1cm×1.3cm，微针高度为200-500μm，4℃1500rpm水平离心(离心机Thermo GP8R)10min；将模具取出旋转180度放置，4℃2200rpm水平离心20min；将模具取出旋转180度放置，4℃3000rpm水平离心30min，通过上述操作，使透明质酸钠盐充分进入微针模具中，形成针头；用棉拭子擦去模具表面多余的透明质酸钠盐，收集备用，将模具置于负压干燥器中，常温干燥过夜，使之形成中空结构的微针阵列；再将2mg的BCG干粉倒入制备好的微针中空结构中，4℃3000rpm水平离心10min，将模具取出旋转180度放置，继续水平离心10min，如此反复离心3次，使粉末进入微针中空部分，用棉拭子擦去表面多余粉末；在模具表面再加入10％(w/v)的透明质酸钠盐(HA)30μL，4℃3000rpm离心10min；将模具取出旋转180度放置，4℃3000rpm继续离心10min；再将模具取出，置于干燥器中常温干燥3h，干燥后用镊子取出，即为装填好BCG干粉的微针贴片。

实施例2

卡介苗干粉微针疫苗中BCG干粉荷载量和保存期测定，其步骤是：

1.按实施例1中步骤1所述方法收集BCG，用1mL PBS洗涤后重悬，加入0.5g磺酰罗丹明B(SRB)粉末，染色10min后用PBS洗涤数次，直至洗涤液无色；再按实施例1中步骤1所述方法制成干粉，并按步骤2所述方法制成200μm高度的染色的BCG微针贴片；称取1mg染色好的BCG干粉，用PBS倍比稀释，于640nm测定吸光度，制成标准曲线；在制备的6张装载了染色BCG干粉的微针贴片中，从每张微针贴片上剪取9根微针溶解于PBS中，分别在640nm比色，根据标准曲线计算出单针的平均荷载量，该实验重复3次。

实验结果显示(见图5)，9针的荷载量在2.2-2.3μg之间，单针平均荷载量为0.25μg，可信区间95％。

2.按实施例1所述方法制备24片装载有BCG干粉的微针贴片，每6片为一组，分为4组保存，以制备当天为0天，分别保存30天，60天，90天；每次从6片贴片中分别剪取24根微针，溶于200μL PBS中，倍比稀释后，分别将溶液涂抹于7H10琼脂平板上(BD,Deep Fill)，每个梯度3个平板，37℃培养30天计数。

结果显示，微针卡介苗干粉在常温下保存90天后，其活菌数未见显著减少。

实施例3

接种卡介苗干粉微针疫苗后皮肤炎症检测，其步骤是

1.将5周龄BALB/c小鼠分为4组：注射器皮内注射组(ID)，BCG干粉微针贴片组(BCG-MN)，PBS对照组(PBS)和微针空针贴片对照组(MN)，每组小鼠7只；各组小鼠麻醉后用脱毛膏去毛，注射器皮内注射组每只注射6μg/20μL的BCG菌液，BCG干粉微针贴片组每只压入24针/片，PBS组皮内注射20μL PBS，空针组每只压入未装填BCG的24针/片。

2.接种后每天检测小鼠皮肤接种部位温度变化，并于第1、3、5、10天对接种部位拍照，观察皮肤表面炎症反应。

结果显示(见图7A)，ID组在1-3天出现红肿，在第5天出现水泡，水泡消失后出现疤痕，直至第10天疤痕仍可观察到；而MN组和BCG-MN组无任何皮肤反应，PBS组在第1天和第3天都可看见注射的针眼，之后痊愈，无可见皮肤反应。各实验组在第3天从各组随机取出一只小鼠，处死后剥离接种部位皮肤，用多聚甲醛(4％)固定后，制备组织切片，HE染色观察病理变化。组织切片HE染色镜检发现，ID组可以看见大量炎性细胞浸润，而BCG-MN、MN及PBS组无炎性细胞产生(图7B)。表皮温度监测显示，ID组相对于其它试验组，接种部位表皮温度在第2,3,4,5,6,7,8天有显著上升，也说明了ID组皮肤炎症反应强烈(图7C)。

实施例4

接种卡介苗干粉微针疫苗后免疫效应检测，其步骤是：

一、细胞因子检测

实验对象为实施例3中步骤1所述方法处理的小鼠，分别在第1周和第4周按下述步骤处理：

1.小鼠眼眶采血：在EP管中加入10μL肝素(作用是防止血液凝固)，用毛细管插入麻醉的小鼠眼眶外周静脉窦，将血引流到EP管中，每只取200μL；装有血液的EP管直接离心(4℃，3500rpm，5min)，用移液枪(20μL)小心吸走上层血清，保留血细胞；用100μL PBS重悬血细胞，转移到流式管中(100μL)，再加破红剂1.5-4mL；置于冰上5min，4℃1800rpm离心3min；离心结束后，倒掉上清液，在试管架上刮一下流式管，以方便收集沉淀；加入1mL PBS洗涤，同样的离心条件下离心5min，去上清液，重复洗涤一次；加入细胞培养基1mL(含10％FBS及P/S双抗)，按上述条件离心洗涤，弃上清；每管再加100uL培养基，混匀后将细胞转入96孔细胞培养板中；加刺激蛋白(ESAT-6，Ag85,CFP-10以及TB 10.4)刺激，终浓度为2μg/mL，37℃培养过夜；第二天再加阻断剂1μL(Golgiplug，1:1000)，继续培养5小时。

2.将96孔板中细胞重新吹起，转入流式管中，做好标记，用含2％FBS的PBS 1mL洗2次，条件同上。

3.分别加入下述表面标记抗体1μL，免疫后第一周采血检测NK细胞(CD49b-PE)内因子IL-2的分泌(IL-2–PE-cy7)；免疫后第4周采血检测T细胞(CD4-FITC，CD8-Percp-cy5.5)内因子IFN-γ、TNF-a和IL-2的分泌(IFN-γ-FITC,IL-2–PE-cy7，TNF-a-APC)；放在试管架上用锡纸包住，室温静置30min，用1mLPBS洗涤2次。加破固定液200μL，放入4℃冰箱20min，再加入1×wash液(BD)1mL，室温放置15min，离心去掉上清液；重复再做一遍；每个样品中加入100μL wash液，加入各种抗体(IFN-γ，TNF-α，IL-2)各1μL，放置在4℃冰箱中锡纸包住孵育30min，按上述操作再用1mLwash液清洗2遍，用200μLwash液重悬，锡纸包住，上流式细胞仪检测。

细胞因子检测结果显示(见图8)，与ID组一样，BCG-MN组可以有效刺激T细胞活化，并且在刺激NK细胞活化方面要优于ID组。

二、抗体检测

1.免疫4周后，按上述步骤1所述方法采血，离心后收集血清。

2.收集BCG培养物，在4℃下17700g离心30min；用PBS两次清洗菌体后，将沉淀重悬于含有脱氧胆酸钠[5-15％(w/v)，0.1-0.25mL/g]的缓冲液[30mM Tris,2mM EDTA,pH 8.5]中；1h后，样品再次按照上述方法离心，收集上清，再将上清用超速离心机在4℃条件下70,000g离心4h；去上清，将沉淀重悬于缓冲液[30mM Tris,2mM EDTA,pH 8.5]中，用滤器[0.45μm和0.2μm]过滤后并且储存于4℃备用。

3.将上述步骤2提取好的BCG抗原100μL包被ELISA板，脱脂牛奶封闭2h，洗涤后分别加入HRP交联的羊抗鼠IgG(NA931V,GE healthcare,dilution1:6,000),IgG1(A90-105P,Bethyl,dilution 1:10,000),IgG2a(61-0220,Life Technologies,dilution 1:2,000)，37℃作用1h后洗涤3次，加入显色液50μL于暗处作用20min，再加终止液4％H₂SO₄ 50μL，酶标仪检测490nm下吸光度。

实验结果表明(见图9)，BVG-MN组与ID组一样，可以有效的刺激宿主产生特异性抗体。

三、脾脏与肺脏细胞因子检测

1.实验准备：取12孔培养板，装2mL DEME培养液，置于冰上，小鼠麻醉后，用70％酒精喷表面灭菌，置于泡沫板上，用PBS灌洗肺脏；取肺，脾脏，放到12孔培养板中；

2.肺脏处理：EP管中加入0.5mL的冰浴的CD液(HBSS缓冲液[不含钙镁，含酚红]+150U/mL collagenase+10U/mL DNAse II)，把肺放入，反复剪碎，再加入0.5mLCD和2.5μL氯化钙(0.8mM)，放入37度水浴锅，每隔15min涡旋一次，消化1h；全部倒入装有培养基的小平皿中70μm滤网中研磨，用1mLPBS冲洗EP管，倒入滤网。研磨完后，用1mL PBS冲洗滤网一次，全部转入到50mL的离心管中，管口放滤膜(40μm滤膜)，用1Ml PBS洗涤滤网；收集滤液，放入4度1500rpm离心3min；离心后去上清液，加入4mL ACK冰浴破红10min。沉淀再用10mL PBS洗涤2遍；沉淀洗涤之后，用1mL DMEM培养基重悬，细胞计数板边上滴10μL台盼蓝，取10μL细胞液，混合均匀，细胞计数，调整好细胞浓度(2×10⁶cells/mL)；转移到培养液中(DMEM加10％FBS以及100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素)，96孔板，每个加200μL细胞培养液(或12孔板，每孔加1mL)。

3.脾脏处理：脾细胞取出来之后，放在12空板中，用适量培养基冰浴，再置于用70μm滤网中磨碎，用1mLPBS冲洗滤网；收集滤液，用40μm滤网过滤到50mL离心管，用1mLPBS冲洗滤网；4度 1500rpm离心3min，弃上清，加ACK 4mL破红冰浴 10min(破红后总是有絮状组织沉淀，所以可以考虑先破红，再过滤)；再4℃1500rpm离心3min，PBS 10mL洗涤2次，用DMEM培养基加2mL重悬脾细胞，计数。经验表明，所得活细胞数均为2x10⁶个/mL左右。

4.将脾脏和肺脏细胞调整到2x10⁶个/mL，各取200μL转移到96孔板种(或1mL到12孔板)，根据所需做的ELISA量而定，做好标记。

5.按实施例4中所述方法加入刺激蛋白(各种刺激蛋白终浓度2ug/ml)刺激细胞培养72h后，离心取上清液，放入冰箱保存，用相应的ELISA试剂盒(eBiosciences)检测，分析细胞因子。

实验结果表明(见图10)，BCG-MN组与ID组均能显著刺激脾脏和肺脏细胞产生TNF-α、IL-6、IL-12和IL-17因子。

通过上述一系列实验证实，BCG干粉微针贴片接种技术具有与传统注射器皮内接种相近的免疫效果，在刺激NK细胞免疫效应方面优于传统皮内注射接种方法。此外，在皮肤刺激，疫苗运输和保存等方面更具有注射器皮内接种方法难以比拟的优势。