本发明涉及一种中药材或生物材料的制备方法。更具体地说，本发明涉及一种不含腥味物质及性激素类物质的林蛙油及其处理方法。
背景技术：
：林蛙油(OviductusRanae)，又称哈士蟆油，雪蛤油，是雌性林蛙输卵管的干制品。含有蛋白质(约50％)、脂类、多糖、维生素、核酸和矿物质等多种营养成分。作为我国传统的动物性滋补药材，林蛙油味甘、咸，性平，归肾、肺经，具有“益精补肾、养阴润肺”、抗疲劳、抗衰老、降血脂和调节运动失调等多种功效，对于阴虚体弱、神疲乏力、气血亏损等症都有很好的疗效。另外，由于林蛙油是雌蛙怀卵成熟期的输卵管，它除了含有上述物质，还特别富含三种性激素，即雌二醇、睾酮、孕酮。其中雌二醇和睾酮分别是雌性激素和雄性激素中生理作用最强的激素，具有显著的滋阴强肾激发免疫功能和调节机体作用。近年来，随着生活条件的改善，人们经过对脂肪、蛋白质的过高摄入，导致肥胖者日益增多，而肥胖也会相应地导致雌激素过高，这就带来了诸多健康问题。比如雌激素过高是诱发乳腺癌的一个重要因素，子宫肌瘤是一种依附于雌激素生长的肿瘤。另外，蔬菜、农药和化妆品中都可能含有类雌激素，如果过多食用这些食品(使用这些产品)，所带来的风险就更大。以化妆品为例，它已经成为日常生活必需品，同时其安全性也日益成为消费者共同关注的问题。化妆品中添加的激素包括糖皮质激素、雌激素、雄激素、孕激素等，具有使皮肤光滑白嫩、促进毛发生长、除皱、增加皮肤弹性等作用，但长期使用会产生大量副作用甚至有致癌的危险。欧盟新法(No.1223/2009)和我国《化妆品卫生规范》均规定以上激素为禁用物质，由于林蛙油中富含雌激素类成分，这为其在化妆品中的应用蒙上了一层阴影。因此林蛙油中性激素的高含量对于某些人群，或在某些要求性激素必须是低含量、甚至是零含量的情况下，就成为限制其应用的关键因素。同时人们对林蛙油产品在使用中的性质提出了更高的要求，包括希望其不含有腥味物质。腥味物质虽然不影响林蛙油的功效，但在人们食用及将其应用在诸如化妆品的过程中都会给人们带来非常不好的消费体验。林蛙油不但是一种名贵的中药材，也是一种性能独特的生物材料，其最独特的性质是遇水膨胀，形成具有黏弹性的物理水凝胶。这一性质使得其可以成为某种生物材料或流变性能改进剂，也预示了其应用面的广泛性。然而这一重要特性很容易在人们对林蛙油的各种加工过程中丧失。专利104257693提供了一种不含雌激素的林蛙油及其制备方法：通过乙酸C1-C6烷酯、C1-C4脂肪醇、氯仿、二氯甲烷、乙醚、丙酮等溶液对林蛙油粗粉进行提取，将提取后的粗粉干燥；对提取液进行柱层析，得到含有及不含雌激素的两部分物质，将不含雌激素的部分干燥，与提取后的林蛙油粗粉充分混合，即得样品。此方法的问题是：1、对林蛙油遇水起发的性质影响很大，所得到的粉末样品与水混合很难再形成独特的黏弹性水凝胶，无法进一步发挥流变改进剂的作用，缩小了应用范围；2、由于林蛙油是干燥后的林蛙油输卵管，因此很多有效成分都被包裹在形成输卵管的组织或细胞中，为了提取更加完全，必须多次对样品进行处理，增加了方法的复杂性，且效果一般，同时进一步破坏了林蛙油形成水凝胶的独特性质；3、并未涉及去除腥味方面的问题；4、所用的有些试剂对人体或环境有害。专利CN102599262A提出了一种林蛙油的加工方法及林蛙油饮料：将干林蛙油预处理后用沸水浸泡至温度小于等于70摄氏度，然后加入占干林蛙油质量4-6％的乙醇和4-6％的生姜搅拌，维持温度50-70摄氏度，搅拌后去除生姜和杂质，然后破碎、灭菌，所得悬浊液即为林蛙油。其缺点为：此法是利用添加一些物质来达到掩盖林蛙油腥味的目的，类似这样的方法在很多专利(CN101011148、CN103431259、CN102697055等)中都有所体现。这些除腥方法的本质不是真正将腥味物质去除，而且通过添加调味剂用于掩盖腥味。这会带来两个问题：一是用于掩盖腥味的物质并非是每个人都能喜欢或接受的，比如上例中所用到的姜，可能是某些人极为反感的，所以掩盖了腥味，又带来了另外一种“异味”；另一个问题是新添加的掩盖剂会不同程度地改变林蛙油本身的性质，影响了它在其他方面的应用，降低了使用的广泛性。因此去腥的最好方案应该是真正去除带有腥味的物质。技术实现要素：本发明目的是提供一种去除林蛙油中腥味物质和性激素的方法，依次用盐溶解、破壁处理技术处理林蛙油，提高蛋白质及性激素成分的溶出率，再用水透析去除盐和水溶性腥味物质，再用醇溶剂透析去除脂溶性腥味物质和性激素成分。本发明还有一个目的是提供一种林蛙油盐溶工艺，向林蛙油凝胶中加入中性盐，林蛙油中蛋白质分子与盐离子部分结合，林蛙油从凝胶态变成溶液态，流动性增强，并对蛋白质分子进行保护，防止蛋白质分子在进行高压破壁处理时发生变性，保留林蛙油的凝胶性质。本发明还有一个目的是提供一种林蛙油破壁处理技术，高压下使林蛙油内细胞壁破裂，细胞内物质溶出，提高后续透析处理效率。为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种去除林蛙油中腥味物质和性激素的方法，包括：林蛙油凝胶中加入NaCl、KCl或CaCl2进行盐溶，盐浓度达到0.1～0.5mol/L时林蛙油从凝胶状变成溶液；林蛙油溶液在350～600MPa的压力下进行破壁处理，保压时间5～10分钟；破壁处理后的林蛙油溶液放入截留分子量为500～1000D的透析袋，用水作为透析液对林蛙油溶液进行透析；再用浓度50～85％的低分子醇溶液作为透析液进行透析。优选的是，还包括：对透析处理后的林蛙油溶液进行冷冻干燥处理，制备成干品。优选的是，所述林蛙油水凝胶用林蛙油粉末和去离子水配成，其中，去离子水和林蛙油粉末的液固比为120:1～250:1。优选的是，所述破壁处理采用间歇式冷等静压超高压设备进行高压破壁。优选的是，透析时对透析液进行搅拌。优选的是，用考马斯亮蓝法及苯酚-硫酸法检测水透析完成的透过液中的总蛋白、总多糖类物质。优选的是，经醇溶液透析处理的林蛙油用薄层色谱法检测雌激素留存量。优选的是，所述薄层色谱法采用硅胶G板，展开剂为氯仿-丙酮，用紫外灯观察经硫酸奎宁的乙醇溶液处理过的薄层板是否显色。本发明至少包括以下有益效果：1、整个过程都没有利用对人体或环境有害的溶剂，是一种环境友好、没有任何健康威胁的绿色方法；2、全程在室温或室温以下的温度进行操作，避免了高温对林蛙油有效成分的破坏；3、用此方法获得的样品，不但去除了腥味物质及性激素，同时保留了遇水起发、形成水凝胶的独特性质。为其在多领域成为独特生物材料或流变改进剂奠定了基础，有利于其广泛的应用；4、本发明林蛙油可用于对其腥味敏感的人群，及不含或少含性激素食品、药品及化妆品的开发。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。本发明的一种去除林蛙油中腥味物质和性激素的方法的具体步骤为：步骤1：林蛙油干品用研钵研成粉末，过筛，用去离子水配成液固比为120:1～250:1(v/w)的林蛙油水凝胶。步骤2：再加入NaCl、KCl或CaCl2，使盐浓度为0.1-0.5mol/L，将林蛙油水凝胶进行盐溶。稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，保护林蛙油中的蛋白质类物质不易变性，且能使林蛙油由浓稠的凝胶状态转化为液体，以利于下一步利用超高压技术进行样品细胞破壁并超高压提取。步骤3：将样品置于密封袋中，排气、封口，再置于密封的间歇式冷等静压超高压装置的高压腔中，在常温下对其进行高压处理，施加压力为350-600MPa，保压时间5-10分钟，卸压后取出。进行高压破壁处理后的林蛙油内的蛋白质等物质溶出，易于下一步进行透析分离。步骤4：将样品置于预处理的透析袋中，透析袋选择截留分子量为500-1000D。将透析袋置于较大体积的去离子水中进行透析，为了加快透析速度，可多次更换透析液并使用磁子搅拌。其中，对通过透析袋的物质进行成分分析，利用考马斯亮蓝法及苯酚-硫酸法进行检测，透过液中不含总蛋白、总多糖等大分子；而欲分离出的激素类物质，如雌二醇、睾酮、孕酮的分子量分布于280-320D之间，但因为激素类物质与水不互溶使其不能通过膜得以去除，水作为透析液主要处理掉的物质是盐，同时，水溶性腥味物质通过透析袋除去。步骤5：将透析液换成体积分数为50-85％的乙醇溶液进行透析。雌二醇、睾酮、孕酮等激素类物质易溶于醇，通过透析袋除去，同时，林蛙油中腥味物质同属于醇溶性物质，通过透析袋除去。其中，用薄层色谱法检测是否去除雌二醇、睾酮、孕酮等激素类物质，采用硅胶G板，点样，展开剂为氯仿-丙酮(9:1)，薄层板用硫酸奎宁的乙醇溶液处理，以利于在紫外光下显色。直到薄层色谱没有相应斑点出现，表明完全除去了相应物质。此时，透析袋中留下来的是以蛋白质和多糖为主的大分子物质，它们是林蛙油的重要营养物质以及维持其流变性质的重要组成成分。步骤6：对步骤5中所得样品进行冷冻干燥，得到去除腥味物质及性激素的林蛙油干品。是否去除腥味根据气味评判员的嗅辨结果判断。至少有三位气味评判员，所有人员的评判结果都为无异味，即为达标。<实施例1>步骤1：林蛙油干品用研钵研成粉末，过筛，用去离子水配成液固比为120:1，即120ml的去离子水中加入1g的林蛙油粉末配置成林蛙油水凝胶。步骤2：林蛙油水凝胶中加入NaCl，直至凝胶中的NaCl浓度达到0.1mol/L，将林蛙油水凝胶进行盐溶，使其从凝胶状变为液体状。步骤3：将样品置于塑料袋中，排气、封口，再置于密封的间歇式冷等静压超高压装置的高压腔中，在常温下对其进行高压处理，施加压力至350MPa，保压时间5分钟，卸压后取出。步骤4：将样品置于预处理的透析袋中，透析袋选择截留分子量为500-1000D。将透析袋置于去离子水中进行透析，为了加快透析速度，多次更换透析液并使用磁子搅拌。利用考马斯亮蓝法及苯酚-硫酸法进行检测对透过液中总蛋白、总多糖进行分析，验证透过液中不含上述大分子。步骤5：将透析液换成85％(v/v)乙醇溶液继续进行透析。经过步骤4-5的透析，除去了步骤2所加的盐，再除去水溶性及醇溶性腥味物质及性激素成分。步骤6：对于5中所得样品进行冷冻干燥，得到去除腥味物质及性激素的林蛙油干品。林蛙油是一种脆弱的物质，去腥或性激素的同时往往破坏林蛙油的水凝胶性质，想要保持水凝胶性质，则会很难对其进行分离操作去除不想要的成分，两者很难兼得。本实施例1中制备的林蛙油的优点为：处理之前的林蛙油是干品状态，经实施例1处理后又变为干品，有利于其保存、包装、携带。且实施例1制备的干品经过一系列处理后再经过冷冻干燥即可得到，整个过程都是常温或低温，高压步骤由盐溶作用后得到了保护，透析液绿色环保且不会对样品中的蛋白质造成破坏。因此本实施例制备的干品是除去了腥味、性激素，且遇水能够形成水凝胶的林蛙油，保持了林蛙油的水凝胶特性。下面讨论步骤3中施加压力和保压时间对实验的影响：实验条件与实施例1中的实验条件相同，分别讨论施加压力为0.1、350、400、500和600MPa，保压时间为5、6、7、8、9和10min对处理效果的影响。具体实验方法为：高压破壁作用后，水溶液中蛋白质的浓度以及萃取后检测的雌二醇浓度。蛋白质检测采用考马斯亮蓝法，蛋白质的浓度越高，说明压力处理后，由于破壁作用使得更多的蛋白质溶出；相同的检测条件下，雌二醇的检测浓度越高，表明破壁作用越明显。其中，施加压力和保压时间对破壁效果的影响见表1、表2。雌二醇检测的前处理方法：准确量取盐溶且高压处理后的林蛙油溶液300ml于分液漏斗中，加150ml氯仿萃取、分离；再加入150ml氯仿萃取、分离，合并氯仿层，加入适量无水硫酸钠去除水分，过滤，减压蒸馏挥干氯仿，加5ml甲醇即得待测样品。表1压力对蛋白质溶出的影响(保压时间为10分钟)压力(MPa)蛋白质浓度(μg/mL)雌二醇检测浓度(μg/g)0.1178±107.38±0.13350298±810.01±0.15400343±910.38±0.09500398±711.01±0.14600422±512.25±0.08可见，压力越高破壁效果越好，使得更多的蛋白质和雌二醇溶出，但压力大于600MPa时，易导致林蛙油溶出的蛋白质变性。保压时间对蛋白和雌二醇溶出的影响见表2。表2保压时间对蛋白质溶出的影响(施加压力600MPa)保压时间(min)蛋白质浓度(μg/mL)雌二醇检测浓度(μg/g)5379±910.83±0.086388±1011.28±0.057393±1311.49±0.058398±511.61±0.099407±911.95±0.1010422±512.25±0.08总体来讲，保压时间越长，蛋白质溶出越多，但增加幅度不大。雌二醇的检测浓度有所提高，表明高压的确有较明显的破壁及使内溶物溶出作用，但是保压时间延长增加实验成本，增大溶出的蛋白质变性几率。因此根据表1和2所示，最佳的施加压力为600MPa、保压时间为10min。<实施例2>步骤1：林蛙油干品用研钵研成粉末，过筛，用去离子水配成液固比为250:1(v/w)的林蛙油水凝胶，即250ml的去离子水中加入1g的林蛙油粉末配置。步骤2：凝胶中加入KCl，使盐浓度为0.5mol/L，将林蛙油水凝胶进行盐溶，使其从凝胶状变为液体状。步骤3：将样品置于塑料袋中，排气、封口，再置于密封的间歇式冷等静压超高压装置的高压腔中，在常温下对其进行高压处理，施加压力至600MPa，保压时间10分钟，卸压后取出。步骤4：将样品置于预处理的透析袋中，透析袋选择截留分子量为500-1000D。将透析袋置于较大体积的去离子水中进行透析，为了加快透析速度，可多次更换透析液并使用磁子搅拌。利用考马斯亮蓝法及苯酚-硫酸法进行检测，对透过液中总蛋白、总多糖进行分析，表明透过液中不含上述大分子步骤5：将透析液换成50％(v/v)乙醇溶液继续进行透析。经过步骤4-5的透析，除去了步骤2所加的盐，再除去水溶性及醇溶性腥味物质及性激素成分。步骤6：对于5中所得样品进行冷冻干燥，得到去除腥味物质及性激素的林蛙油干品。对林蛙油干品进行气味检测，三位气味评判员均评判实施例2中林蛙油样品无异味。<实施例3>步骤1：林蛙油干品用研钵研成粉末，过筛，用去离子水配成液固比为200:1(v/w)的林蛙油水凝胶。步骤2：再加入CaCl2，使盐浓度为0.3mol/L，将林蛙油水凝胶进行盐溶。步骤3：将样品置于塑料袋中，排气、封口，再置于密封的间歇式冷等静压超高压装置的高压腔中，在常温下对其进行高压处理，施加压力至500MPa，保压时间7分钟，卸压后取出。步骤4：将样品置于预处理的透析袋中，透析袋选择截留分子量为500-1000D。将透析袋置于较大体积的去离子水中进行透析，为了加快透析速度，可多次更换透析液并使用磁子搅拌。利用考马斯亮蓝法及苯酚-硫酸法进行检测，对透过液中总蛋白、总多糖进行分析，表明透过液中不含上述大分子。步骤5：将透析液换成70％(v/v)乙醇溶液继续进行透析。经过步骤4-5的透析，除去了步骤2所加的盐，再除去水溶性及醇溶性腥味物质及性激素成分。步骤6：对于5中所得样品进行冷冻干燥，得到去除腥味物质及性激素的林蛙油干品。对林蛙油干品进行气味检测，三位气味评判员均评判实施例3中林蛙油样品无异味。通过实施例1-3，讨论不同条件下的配制林蛙油水凝胶的水量、盐的浓度及种类和乙醇溶液浓度对实验的影响，其中，盐的种类及浓度、配制林蛙油凝胶的水量对实验的影响小，但盐的浓度过大往往使蛋白质类物质析出，不利于后续处理，乙醇浓度的影响是最大的，在所取的乙醇浓度范围内，85％效率最高，50％效率最低。超过85％则产生的副作用是：1、蛋白质变性；2、失去遇水形成水凝胶的特性；3、对透析膜的截留分子量有较大影响。小于50％的话，则透析效率大大降低。因此本发明最佳的实验条件为：最佳的施加压力为600MPa、保压时间为10min，乙醇浓度为85％。对比例1用一种专利方法制备不含雌激素的林蛙油，具体为：通过乙酸C1-C6烷酯、C1-C4脂肪醇、氯仿、二氯甲烷、乙醚、丙酮等溶液对林蛙油粗粉进行提取，将提取后的粗粉干燥，对提取液进行柱层析，得到含有及不含雌激素的两部分物质，将不含雌激素的部分干燥，与提取后的林蛙油粗粉充分混合，即得样品。用多种溶剂对样品的提取与分离，并伴随多种溶剂等剧烈条件增加了方法的复杂性，且效果一般，所得到的林蛙油营养物质会受到破坏，并会对林蛙油遇水起发的性质有极大影响，所得到的粉末样品与水混合很难再形成独特的黏弹性水凝胶，无法进一步发挥流变改进剂的作用，缩小了应用范围。本发明与对比例1相比，本发明的优势体现在：1、本发明的去除林蛙油中腥味物质及性激素的方法，利用盐溶加高压及透析膜分离的方法，不仅能够有效的去除性激素和腥味物质，并且分离条件温和、有效，且最大限度地保护了其物理水凝胶的性质。2、本发明所用的溶剂温和、环保，对环境无害，具有绿色环保的优点。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。当前第1页1 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