一种治疗阿尔茨海默病的藏荆芥西洋蒲公英组合及其制备方法与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉及的是一种治疗阿尔茨海默病的藏荆芥西洋蒲公英组合及其制备方法。

背景技术：

随着世界人口平均寿命的逐年增加，人口老年化日趋严重，神经退行性疾病的患者越来越多，神经退行性疾病已成为危害人类健康的重大疾病之一。神经退行性疾病是以大脑特定区域的迟发性神经细胞退行性病变和细胞丢失为特征的一类慢性、进行性神经疾病。神经退行性疾病主要包括阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)、亨廷顿病(Huntington's disease，HD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(spinal muscular atrophy lateral sclerosis，ALS)等，是进行性发展的致死性复杂疾病(complex diseases)。其中阿尔茨海默病(AD)作为老年性痴呆的主要类型，是发生在老年期及前老年期的一种慢性脑变性疾病；以进行性记忆减退、认知障碍、人格改变为主要特征。随着人类老龄化社会的到来，阿尔茨海默病的发病数量呈逐年上升趋势，在发达国家阿尔茨海默病已成为继心脏病、癌症和中风之后人类第四位的死亡原因。阿尔茨海默病的临床特点是近期记忆和智力功能进行性恶化，其神经病理学特点是在大脑皮层和海马出现大量的由β-淀粉样蛋白沉积构成的老年炎斑(senile plaque,SP)和tau蛋白质过度磷酸化导致的神经纤维缠结(neurofibrilarytangle,NFT)，并伴随出现神经元丧失。

目前，关于阿尔茨海默病的病因尚不明确，发病机制非常复杂，发病过程涉及的环节较多，如基因变异，表观遗传学，内外环境因素，蛋白质异常修饰，氧化应激，脑内免疫和炎症反应等。基于不同的发病机制，目前提出的药物治疗途径有以下几种：(1)作用于胆碱能系统的药物：脑中胆碱能系统与人的学习、记忆功能密切相关。研究发现阿尔茨海默病病人的脑胆碱能系统受到了损害，导致突触部位乙酰胆碱含量的下降。因此，针对提高阿尔茨海默病病人脑中的乙酰胆碱含量，促进胆碱能神经功能的药物应运而生。(2)抗氧化性药物：在阿尔茨海默病中，由于脑的高耗氧量以及内源性自由基清除剂的缺乏，使中枢神经系统特别容易受到自由基的损害。因此，可利用抗氧化剂治疗，通过消除活性氧或阻止其形成，以延缓、阻止神经细胞的退行性变化。(3)抗炎药物：基于流行病学调查，发现服用抗炎药治疗风湿的病人其发病率下降或使的患病时间推迟。目前认为非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAID)抗的机制可能是由于其抗炎作用及抑制小胶质细胞的活性。(4)作用于N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体的药物：应用NMDA受体低亲和性非竞争拮抗剂治疗痴呆，在基础研究中显示了神经保护和提高胆碱能功能的作用。(5)抑制β-淀粉样蛋白形成的药物：β-淀粉样蛋白是阿尔茨海默病病理性产物淀粉斑中的重要成分，是由其前体蛋白(APP)在异常位点断裂形成的断片。β-淀粉样蛋白与病人脑中的炎性反应，自由基的产生和脂质过氧化以及由此继发的细胞凋亡存在着密切联系。因此，干扰β-淀粉样蛋白的形成阻止其毒性效应，有望成为抑制病理发展的重要环节。

近年来，随着对阿尔茨海默病研究的深入，中药、天然药物及其提取物预防和治疗阿尔茨海默病的作用日益受到重视。中药及天然药物由于其所具有的多靶点、多环节治疗的特点，在阿尔茨海默病防治中表现出单靶点治疗的西药所不具备的优势。另外，中药及天然药物经过长期的民间、临床使用，疗效多已被肯定，且使用安全性较高，其使用更利于长期的预防。

藏荆芥(藏药名：萨都那保)为唇形科藏荆芥Nepeta angustifolia C.Y.Wu的全草，性凉，味辛、苦，具有息风止痉，消肿止痛的作用，用于癫痫抽搐、创伤肿痛、卒中、出血性脑梗死、创伤及疼痛等症。研究表明，藏荆芥中含有熊果酸、齐墩果酸甲酯和白桦酸等化学成分。

西洋蒲公英也称药用蒲公英，为菊科植物西洋蒲公英Taraxacum officinale Wigg.的全草，性寒，味甘、苦，具有清热解毒，消肿散结，利尿通淋的作用，用于疔疮肿毒，乳痈，瘰疬，目赤，咽痛，肺痈，肠痈，湿热黄疸，热淋涩痛。据研究报道，其化学主要成分有三萜类(蒲公英甾醇、β-香树脂醇等)、黄酮类(木犀草素、槲皮素、异鼠李素等)、香豆精类(七叶素、东莨菪素等)、倍半萜内酯类(蒲公英内酯、蒲公英酸等)、植物甾醇类、色素类(蒲公英黄质、百合黄素等)、以及挥发油等化学成分。近年来，国内外研究者对西洋蒲公英药理作用进行了大量研究，主要集中在抗炎、抗氧化、抗癌、抗高血糖、抗血栓形成等方面。

目前，尚没有文献报道藏荆芥西洋蒲公英组合及其提取物治疗阿尔茨海默病。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种治疗阿尔茨海默病的藏荆芥西洋蒲公英组合及其制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种治疗阿尔茨海默病的藏荆芥西洋蒲公英组合，以藏荆芥、西洋蒲公英为主要原料，各原料按质量百分比的含量为：藏荆芥20％-40％、西洋蒲公英60％-80％。

所述治疗阿尔茨海默病的藏荆芥西洋蒲公英组合的制备方法包括以下步骤：

(1)取干燥的藏荆芥和西洋蒲公英药材，粉碎，过20目筛，按照体积质量比加入5-8倍量(V/m)50％-80％乙醇，回流提取1-3次，每次提取1-3小时，滤过，滤液合并，在55-75℃条件下减压回收乙醇，得浸膏；

(2)将(1)得到的浸膏中加入3-5倍量(m/m)热水，搅拌分散均匀，放置12-24h；

(3)将(2)分散得到的浸膏液3000-5000rpm/min离心15-30min，弃去上清液，得沉淀，50-70℃条件下真空干燥，粉碎，即为藏荆芥西洋蒲公英组合提取物。

本发明有益效果：本发明将藏荆芥和西洋蒲公英配合使用，对阿尔茨海默病的治疗具有显著的协同增效作用。试验证明：在谷氨酸损伤HT22小鼠海马神经元细胞实验中，藏荆芥西洋蒲公英组合具有抑制细胞内ROS的分泌，减轻细胞损伤，从而起到保护海马神经元细胞的作用；经过大鼠定位航行及空间探索实验，藏荆芥西洋蒲公英组合可以明显提高AD(阿尔茨海默病)模型大鼠的空间学习记忆能力，缩短其逃避潜伏期，且显著增加空间探索实验中原平台穿越次数，同时降低大鼠脑组织氧化损伤程度，抑制脑组织内乙酰胆碱酯酶活性。实验结果还表明，藏荆芥西洋蒲公英组合具有明显的协同增强作用，上述药效作用均强于藏荆芥、西洋蒲公英的单独使用。以上实验结果表明，藏荆芥西洋蒲公英组合可用于治疗老年痴呆症，尤其治疗老年痴呆症前期(如阿尔茨海默痴呆前期)，改善患者认知功能障碍，延缓患者大脑萎缩的发展，提高患者记忆力。基于以上研究结果，本发明的另一个目的在于提供一种制药用途，即：上述的藏荆芥西洋蒲公英组合在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

附图说明

图1：不同给药组海马细胞存活率比较图。(注：与模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与西洋蒲公英组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与藏荆芥组比较，^ΔP<0.05，^ΔΔP<0.01。)

图2：不同给药组海马细胞内活性氧(ROS)相对荧光强度比较图。(注：与模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与西洋蒲公英组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与藏荆芥组比较，^ΔP<0.05，^ΔΔP<0.01。)

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术方案的限制。

实施例1

藏荆芥400g，西洋蒲公英600g

(1)取干燥的藏荆芥和西洋蒲公英药材，粉碎，过20目筛，按照体积质量比加入8倍量(V/m)70％乙醇，回流提取2次，每次提取1.5小时，滤过，滤液合并，在65℃条件下减压回收乙醇，得浸膏；

(2)将(1)得到的浸膏中加入5倍量(m/m)热水，搅拌分散均匀，放置12h；

(3)将(2)分散得到的浸膏液3500rpm/min离心15min，弃去上清液，得沉淀，60℃条件下真空干燥，粉碎，即为藏荆芥西洋蒲公英组合提取物。

实施例2

藏荆芥300g，西洋蒲公英700g

(1)取干燥的藏荆芥和西洋蒲公英药材，粉碎，过20目筛，按照体积质量比加入5倍量(V/m)60％乙醇，回流提取3次，每次提取3小时，滤过，滤液合并，在70℃条件下减压回收乙醇，得浸膏；

(2)将(1)得到的浸膏中加入5倍量(m/m)热水，搅拌分散均匀，放置24h；

(3)将(2)分散得到的浸膏液5000rpm/min离心20min，弃去上清液，得沉淀，50℃条件下真空干燥，粉碎，即为藏荆芥西洋蒲公英组合提取物。

实施例3

藏荆芥200g，西洋蒲公英800g

(1)取干燥的藏荆芥和西洋蒲公英药材，粉碎，过20目筛，按照体积质量比加入7倍量(V/m)50％乙醇，回流提取2次，每次提取2小时，滤过，滤液合并，在55℃条件下减压回收乙醇，得浸膏；

(2)将(1)得到的浸膏中加入3倍量(m/m)热水，搅拌分散均匀，放置18h；

(3)将(2)分散得到的浸膏液4000rpm/min离心30min，弃去上清液，得沉淀，70℃条件下真空干燥，粉碎，即为藏荆芥西洋蒲公英组合提取物。

实施例4

藏荆芥350g，西洋蒲公英650g

(1)取干燥的藏荆芥和西洋蒲公英药材，粉碎，过20目筛，按照体积质量比加入6倍量(V/m)80％乙醇，回流提取1次，每次提取3小时，滤过，滤液合并，在65℃条件下减压回收乙醇，得浸膏；

(2)将(1)得到的浸膏中加入4倍量(m/m)热水，搅拌分散均匀，放置12h；

(3)将(2)分散得到的浸膏液3500rpm/min离心20min，弃去上清液，得沉淀，65℃条件下真空干燥，粉碎，即为藏荆芥西洋蒲公英组合提取物。

实施例5

藏荆芥250g，西洋蒲公英750g

(1)取干燥的藏荆芥和西洋蒲公英药材，粉碎，过20目筛，按照体积质量比加入8倍量(V/m)80％乙醇，回流提取2次，每次提取2小时，滤过，滤液合并，在55℃条件下减压回收乙醇，得浸膏；

(2)将(1)得到的浸膏中加入3倍量(m/m)热水，搅拌分散均匀，放置12h；

(3)将(2)分散得到的浸膏液3000rpm/min离心20min，弃去上清液，得沉淀，55℃条件下真空干燥，粉碎，即为藏荆芥西洋蒲公英组合提取物。

实施例6

藏荆芥西洋蒲公英组合对谷氨酸损伤HT22小鼠海马神经元细胞的保护作用

1实验材料

1.1试剂

DMEM高糖培养基、胎牛血清(Gibco BRL公司)，水溶性维生素E(Trolox)、二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、谷氨酸(Sigma公司)，活性氧(ROS)试剂盒(碧云天生物技术有限公司)。

1.2样品制备

取实施例1制备得到的藏荆芥西洋蒲公英组合提取物适量，用DMSO溶解制成50mg/mL的溶液，于-20℃中保存，相同方法处理藏荆芥和西洋蒲公英提取物。

2实验方法

2.1细胞培养及分组

海马细胞(HT22)购于美国模式生物保藏中心，用含10％胎牛血清的DMEM培养基于恒温培养箱(37℃,5％CO₂)中进行培养，使细胞生长处于数分裂期，育至呈单层贴壁细胞。取孵育好的细胞，用培养基调整细胞密度，按照100μL/孔加到96孔中，使每个孔中的细胞浓度为1×10⁴/mL，在恒温培养箱中培养，24h后吸弃培养液。将96孔板划分为：空白组，谷氨酸组，阳性对照组，藏荆芥组，西洋蒲公英组，藏荆芥西洋蒲公英组合组，每组设6个复孔。

2.2测定细胞存活率

取2.1项下的细胞进行实验，藏荆芥组、西洋蒲公英组、藏荆芥西洋蒲公英组合组分别用含各自提取物溶液浓度为50,100,200μg/mL的培养基预处理2h，然后加入含谷氨酸的培养基，并使谷氨酸的最终浓度为40mmol/L，谷氨酸组加入谷氨酸浓度为40mmol/L的培养基，阳性对照组加入Trolox为50μmol/L和谷氨酸浓度为40mmol/L的培养基，空白组只加培养基，使每孔的最终体积为200μL。在恒温培养箱培养24h后，采用MTT法测定细胞存活率，在酶标仪490nm处测定吸光度。

2.3ROS检测

按照2.2项下方法对细胞进行处理，在谷氨酸和各组提取物共培养24后，吸弃培养液，然后按照ROS试剂盒用荧光分光光度计进行检测。

2.4统计方法

试验数据采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，统计量用均值±标准差(x±s)表示，组间比较用单因素方差分析。

3实验结果

3.1细胞存活率

结果如图1所示，海马细胞用谷氨酸培养后，细胞存活率远远低于空白组。在用谷氨酸和不同的提取物对海马细胞共同培养后，相比谷氨酸组，藏荆芥组、西洋蒲公英组、藏荆芥西洋蒲公英组合组的细胞存活率都显著升高(P<0.05或P<0.01)，并且呈现一定的浓度依赖性，而且在三组提取物中，相同质量浓度下的藏荆芥西洋蒲公英组合组的细胞存活率明显高于西洋蒲公英组和藏荆芥组(P<0.01)，表明藏荆芥与西洋蒲公英合用能明显减轻谷氨酸对海马细胞的损伤，从而提高细胞存活率，表现出明显的协同增强效应。

3.2ROS检测

如图2所示，与正常组相比，谷氨酸组中细胞的ROS荧光强度明显增强(P<0.01)，说明海马细胞经谷氨酸诱导后，细胞分泌ROS的含量显著增加，在用不同的药物进行处理后，与谷氨酸组相比，ROS的荧光强度明显降低(P<0.05或P<0.01)，并呈现一定的浓度依赖性。在三组提取物中，相同质量浓度下的藏荆芥西洋蒲公英组合组的ROS荧光强度明显低于其他两组(P<0.01)，说明藏荆芥与西洋蒲公英合用能显著的抑制细胞内ROS的分泌，其作用明显强于西洋蒲公英组和藏荆芥组，二者具有药效的协同增强作用。

实施例7

藏荆芥西洋蒲公英组合对β-淀粉样蛋白诱导阿尔茨海默病模型大鼠模型的影响

1实验材料与动物

1.1实验材料

Aβ_1-42(β-淀粉样蛋白_1-42)(Sigma公司)，SOD、MDA、GSH-Px、AChE、ChAT试剂盒(南京建成生物工程研究所)，石杉碱甲片(河南太龙药业股份有限公司豫中制药厂)

1.2实验动物及分组

清洁级雄性SD大鼠90只，体重200±20g，由青岛市实验动物和动物实验中心提供，适应性饲养一周后，将所有实验动物进行Morris水迷宫初筛，以筛选出先天性痴呆及其他条件不符合实验条件的大鼠。将筛选合格的70只大鼠随机分为7组：空白对照组、假手术组、模型组、阳性对照组(石杉碱甲，0.036mg/kg/d)、实施例1制备得到的藏荆芥西洋蒲公英组合提取物组(4g/kg/d)、相同方法制备的藏荆芥提取物量组(4g/kg/d)、相同方法制备的西洋蒲公英提取物组(4g/kg/d)。

2实验方法

2.1大鼠学习与记忆行为测试

实验前先将所有实验动物进行Morris水迷宫初筛，以筛选出先天性痴呆及其他条件不符合实验条件的大鼠。水迷宫实验包括以下两个步骤：

(1)定位航行实验：随机从水池4个不同象限将大鼠放入水中，入水时使大鼠面向池壁，记录大鼠在60s内找到水下平台的时间(s)，即逃避潜伏期。最长记录时间为60s，如果大鼠在规定时间内未发现平台，该次逃避潜伏期为60s，由操作者将其引至平台适应10s，依次进行，直至完成4个象限。测试完毕，操作者将大鼠放回笼内。连续训练5天，每天2次，记录每组大鼠在4个象限的逃避潜伏期，该鼠每天的最终结果为2次4个象限潜伏期的平均值。

(2)空间探索实验：第6天将水下平台撤除，将大鼠随机从某一象限入水，记录下大鼠的穿越平台次数，即在60s内经过原平台位置的次数。

2.2阿尔茨海默病动物模型的建立

将Aβ_1-42(β-淀粉样蛋白_1-42)溶于无菌生理盐水，稀释为2μg/μl，置于37℃恒温箱中，孵育3天，待其转变成有神经毒性的凝聚状态。用10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，用量为0.3ml/100mg，随后将其固定在脑立体定位仪上，依据定位图谱，在SD大鼠的大脑海马区位于前囟后3mm，正中矢状缝左右旁开2mm，硬脑膜下3.5mm。用微量注射器向模型组两侧海马区各注射凝聚态Aβ_1-425μl，假手术组注射等量的生理盐水，每侧注射时间约为10min，留针5min，撤针时尽量缓慢，以防药物随针从针孔溢出。结束后，石蜡块堵针孔，碘伏消毒避免感染，缝合头皮。

2.3动物给药

每天各组灌胃给药1次，连续60天。末次给药1h后，各组进行学习与记忆行为测试试验。

2.4海马组织匀浆及指标检测

学习与记忆行为测试试验结束后，处死大鼠，迅速取脑部海马组织，置于4℃预冷生理盐水中，滤纸拭干后，称重，加入9倍体积的生理盐水制成10％脑匀浆液。冷冻离心机3500r·min-1离心15min，取上清液按试剂盒的方法测定SOD、MDA、GSH-Px、AChE、ChAT。

2.5统计方法

试验数据采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，统计量用均值±标准差表示，组间比较用单因素方差分析。

3实验结果

3.1藏荆芥西洋蒲公英组合对阿尔茨海默病模型大鼠学习与记忆行为的影响

表1藏荆芥西洋蒲公英组合对阿尔茨海默病模型大鼠学习与记忆行为的影响(n＝10)

注：与模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与西洋蒲公英组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与藏荆芥组比较，^ΔP<0.05，^ΔΔP<0.01。

表1结果表明，模型组逃避潜伏期明显长于空白组和假手术组，穿越平台次数明显少于空白组和假手术组(P<0.01)，说明本实验造模成功。治疗组中，阳性对照组、西洋蒲公英组、藏荆芥组、藏荆芥西洋蒲公英组合组，与模型对照组比较，逃避潜伏期明显缩短，穿越平台次数增多，均有显著性差异(P<0.05或0.01)。在同等剂量(4g/kg/d)下，藏荆芥西洋蒲公英组合组的逃避潜伏时间均短于西洋蒲公英组和藏荆芥组，有显著性差异(P<0.05或0.01)；而穿越平台次数多于西洋蒲公英组和藏荆芥组，均有极显著性差异(P<0.01)。本实验结果说明，藏荆芥与西洋蒲公英配合使用，可明显改善阿尔茨海默病模型大鼠学习与记忆行为，二者具有显著的协同增强药效作用。

3.2藏荆芥西洋蒲公英组合对阿尔茨海默病模型大鼠海马组织匀浆SOD、MDA、GSH-Px、AChE、ChAT含量的影响

表2藏荆芥西洋蒲公英组合对阿尔茨海默病模型大鼠海马组织匀浆SOD、MDA、GSH-Px、AChE、ChAT含量的影响(n＝10)

注：与模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与西洋蒲公英组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与藏荆芥组比较，^ΔP<0.05，^ΔΔP<0.01。

自由基引起的氧化损伤在阿尔茨海默病患者神经元退变和死亡过程中起着非常重要的作用，因此提高机体的抗氧化能力在老年痴呆症的治疗过程中有重要的意义。超氧化物歧化酶(SOD)对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，它能有效清除超氧阴离子自由基保护细胞免受损伤。丙二醛(MDA)是体内过氧化作用的最终产物，其含量高低间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是一种重要的催化过氧化氢分解的酶，可以起到保护细胞膜的结构和功能完整的作用。表2结果显示，模型组大鼠海马组织中，SOD、GSH-Px活性显著低于正常组(P<0.01)，MDA含量明显高于正常组(P<0.01)。治疗组中，阳性对照组、西洋蒲公英组、藏荆芥西洋蒲公英组合组，与模型对照组比较，SOD、GSH-Px活性显著增加，MDA含量明显降低，均有显著性差异(P<0.05或0.01)。在同等剂量(4g/kg/d)下，藏荆芥西洋蒲公英组合组SOD、GSH-Px活性增加明显，而MDA含量则显著降低，与西洋蒲公英组和藏荆芥组比较，均有显著性差异(P<0.05或0.01)。

乙酰胆碱(Ach)是一种神经递质,与胆碱能系统功能的损害程度密切相关。ChAT是Ach的合成酶,而AchE则是Ach的分解酶,二者间接反映Ach在脑组织中的变化,维持着脑组织中Ach含量的动态平衡。ChAT活性降低，AchE活性增强，则Ach的分解比合成速度快,致使Ach含量减少,胆碱能神经传递受损,中枢神经系统功能障碍,从而导致发生阿尔茨海默病。表2结果显示，模型组AChE活性增强，ChAT活性下降，与正常组比较，均有极显著性差异(P<0.01)。治疗组中，阳性对照组、西洋蒲公英组、藏荆芥西洋蒲公英组合组，与模型对照组比较，AChE活性显著降低，而ChAT活性明显提高，均有显著性差异(P<0.05或0.01)。在同等剂量(4g/kg/d)下，藏荆芥西洋蒲公英组合组AChE活性有大幅度降低，而ChAT活性提升明显，与西洋蒲公英组和藏荆芥组比较，均有显著性差异(P<0.05或0.01)。

表2实验结果说明，藏荆芥与西洋蒲公英配合使用，能降低大鼠海马组织的氧化损伤程度，提高海马组织中胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性，降低乙酰胆碱酯酶(AChE)活性，对阿尔茨海默病具有很好的防治作用。二者作为组合使用，可明显起到协同增强药效的作用，在同等剂量条件下，药效作用明显优于西洋蒲公英和藏荆芥单独使用。

综合上述体外和体内药效学实验结果，本发明的藏荆芥西洋蒲公英组合具有治疗阿尔茨海默病作用，藏荆芥与西洋蒲公英配合使用，具有明显的协同作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。