本发明涉及生物工程医疗材料领域，尤其涉及一种组织工程角膜缘的制备方法。
背景技术：
角膜缘干细胞(1imbal stem cells，LSCs)位于角巩膜交界处，是角膜上皮细胞自我更新、修复及再生的基础，也是角结膜之间重要的屏障结构，对维持角膜透明性、稳定性和正常生理功能的发挥具有极其重要的作用。严重的眼表疾病，如炎症、眼表热化学伤、眼表免疫性疾病等可损伤角膜缘区，导致LSCc的缺失及屏障结构的破坏，从而引起一系列的眼表反应，甚至导致失明。目前LSCs移植是主要的治疗方法。然而LSCs供体的严重匮乏和体外培养扩增的困难使得众多患者丧失了治疗的机会。因此寻找合适的细胞来源改善LSCs失代偿对于损伤后角膜上皮的修复及稳定眼表的重建具有重要的临床意义。
角膜缘区独特的三维组织结构及基底膜成分是LSCs赖以生存及干细胞特性维持的重要基础之一。人类角膜缘基质是构建组织工程LSCs植片的最佳支架材料，但同样受到供体来源匮乏的限制。目前，猪的多种脱细胞组织材料已成功应用于组织工程器官再造领域的研究。随着生物组织工程学的广泛和深入研究，脱细胞处理和病毒灭活等工艺制备的异种角膜基质材料在动物水平和临床应用中取得了初步的治疗效果，但鲜有脱细胞角膜缘基质的相关报道。猪角膜与人类角膜在解剖学、应力-应变关系和强度等方面十分相似，并且免疫源性低、来源广泛，是较为理想的支架材料来源。
技术实现要素：
本发明提供了一种构建组织工程角膜缘的方法。对猪角膜缘材料进行脱细胞处理，将脱细胞角膜缘基质作为载体，用种子细胞进行体外扩增培养，构建一种组织工程LSCs植片，此方法将为LSCs失代偿患者的治疗提供新的思路。
具体的技术方案如下：
一种构建组织工程角膜缘的方法，包括以下步骤：
(1)将含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质置于添加了去垢剂和核酸酶的脱细胞角膜缘保护液中进行震荡脱细胞处理；
(2)将所述脱细胞后的角膜缘置于脱细胞角膜缘保护液中漂洗，得到脱细胞角膜缘；
(3)将种子细胞接种在脱细胞角膜缘上进行体外扩增，行气液界面培养，当种子细胞在脱细胞角膜缘上扩增达到3～5层时，得到组织工程角膜缘。
其中，所述脱细胞角膜缘保护液为含有5～12g/L透明质酸、5～20g/L硫酸软骨素、3～10g/L右旋糖酐和2.5～5mg/L妥布霉素的PBS缓冲液，其pH值优选为7.2～7.4，渗透压优选为300～400mOsm。
所述去垢剂包括Triton、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠中的一种或多种，其在所述脱细胞角膜缘保护液中的浓度优选为0.2～0.5％。
所述核酸酶包括DNA酶和/或RNA酶，所述核酸酶在所述脱细胞角膜缘保护液中的浓度优选为100～2000U/ml。
本发明中，脱细胞处理的条件为：摇床转速100～150转/分钟，温度20～30℃，时间2～4小时。
本发明中，所述种子细胞是指自体角膜缘细胞和/或干细胞、口腔黏膜上皮细胞和/或干细胞、或hES分化的角膜上皮细胞和/或干细胞。
本发明中，所述种子细胞接种到所述脱细胞角膜缘上的细胞密度为1～5×104/cm2。
种子细胞体外扩增的条件为：条件培养基，扩增温度为37℃，CO2体积浓度为5％，静置培养。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明方法所用的角膜缘材料来源于猪眼球，来源广泛，成本低。
2、本发明所获取的角膜缘支架制作流程简单、脱细胞彻底；同时所采用的种子细胞具有体外增殖能力强、容易复层等优点，保证了组织工程角膜缘的稳定性。
3、本发明所述的组织工程角膜缘材料，在组织结构、生物功能等方面均与人角膜缘相似，采用组织工程角膜缘材料可替代人角膜缘，用于治疗眼化学伤和热烧伤、复发性翼状胬肉、Stevens-Johnson综合征、慢性复发性角膜结膜炎等疾病导致的角膜缘部受损或功能不良。
具体实施方式
本发明构建组织工程角膜缘的方法为：将猪角膜缘材料进行脱细胞处理，以脱细胞角膜缘基质作为载体，将种子细胞进行体外扩增培养，构建组织工程角膜缘上皮植片。
本发明在制备脱细胞角膜缘基质载体的过程中全程在脱细胞角膜缘保护液中进行。脱细胞角膜缘保护液成分为含有5～12g/L透明质酸、5～20g/L硫酸软骨素、3～10g/L右旋糖酐和2.5～5mg/L妥布霉素的PBS缓冲液，优选为含有7～10g/L透明质酸、10～15g/L硫酸软骨素、5～8g/L右旋糖酐和3～4mg/L妥布霉素的PBS缓冲液。
首先将含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质置于添加了去垢剂和核酸酶的所述脱细胞角膜缘保护液中进行震荡脱细胞处理。其中，猪角巩膜缘基质要求含lmm巩膜，2mm外周角膜，厚约0.2mm。
去垢剂可以采用本领域的常规去垢剂。优选为包括Triton、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠中的一种或多种。去垢剂在所述脱细胞角膜缘保护液中的浓度为0.2～0.5％，优选为0.3～0.4％。核酸酶包括DNA酶、RNA酶及其他核酸酶及组合。在本发明实施例中优选为DNase I。核酸酶在所述脱细胞角膜缘保护液中的浓度为100～2000U/ml，优选为500～1500U/ml。
脱细胞处理优选在摇床中进行。震荡脱细胞处理的条件为：摇床转速100～150转/分钟，优选为120～140转/分钟；温度为20～30℃，优选为24～27℃；震荡时间为2～4小时，进一步为3h。
将脱细胞后的角膜缘置于脱细胞角膜缘保护液中漂洗，去除脱细胞用试剂和细胞碎片，完成载体的制备。漂洗时间至少为2h，优选为3h以上，进一步为5h以上，最好不超过10h。
将种子细胞接种在脱细胞角膜缘上进行体外扩增。所述种子细胞是指患者自体健眼角膜缘细胞和/或干细胞、自体口腔黏膜上皮细胞和/或干细胞、或hES分化的角膜上皮细胞和/或干细胞。所述种子细胞接种到所述脱细胞角膜缘上的细胞密度为1～5×104/cm2，进一步优选为2～3×104/cm2。所述种子细胞体外扩增的条件为：条件培养基，37℃，5％CO2，静置培养。
所述自体角膜缘细胞和/或干细胞的条件培养基含有以下成分：DMEM/F12(3:1)、5％胎牛血清(FBS)、0.1mM谷氨酰胺、1μM霍乱毒素、0.4mg/ml氢化可的松、2μM三碘甲腺原氨酸钠、1×转铁硒化钠(ITS)、10ng/ml重组表皮生长因子(EGF)；
所述口腔黏膜上皮细胞和/或干细胞的条件培养基含有以下成分：DMEM/F12(3:1)、5％胎牛血清(FBS)、0.1mM谷氨酰胺、1μM霍乱毒素、0.4mg/ml氢化可的松、2μM三碘甲腺原氨酸钠、1×转铁硒化钠(ITS)、10ng/ml重组表皮生长因子(EGF)；
所述hES分化的角膜上皮细胞和/或干细胞的条件培养基含有以下成分：DMEM/F12(3:1)、10％胎牛血清(FBS)、0.1mM谷氨酰胺、1μM霍乱毒素、0.4mg/ml氢化可的松、2μM三碘甲腺原氨酸钠、1×转铁硒化钠(ITS)、10ng/ml重组表皮生长因子(EGF)；
接种后的种子细胞经过10～20天体外扩增培养后，行气液界面培养1周，上皮细胞达到3～5层时所述组织工程角膜缘构建成功。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
切取含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质，含lmm巩膜，2mm外周角膜，厚约0.2mm。
1、载体的制备
全程使用保护液对角膜缘组织进行保护，保护液成分为：PBS缓冲液中添加6g/L透明质酸，7g/L硫酸软骨素，6g/L右旋糖苷和2.5mg/L妥布霉素，调整pH值为7.2，渗透压为310mOsm；
将角膜缘置于含0.2％Triton+200U/ml DNA酶的保护液中，设定摇床速度为100转/分钟，温度为25℃，消化3小时去除角膜中的DNA成分；将脱细胞后的角膜缘置于保护液中漂洗4小时，得到脱细胞角膜缘载体。
2、组织工程角膜缘构建
将角膜缘细胞或干细胞按2×104/cm2的密度接种到脱细胞角膜缘上，37℃、5％CO2，条件培养基上静置培养15天，再行气液界面培养1周，当种子细胞在脱细胞角膜缘上扩增达到3～5层时，组织工程角膜缘构建成功。
实施例2：
切取含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质，含lmm巩膜，2mm外周角膜，厚约0.2mm。
1、载体的制备
全程使用保护液对角膜缘组织进行保护，保护液成分为：PBS缓冲液中添加8g/L透明质酸，10g/L硫酸软骨素，5g/L右旋糖苷和3mg/L妥布霉素，调整pH值为7.3，渗透压为320mOsm；
将角膜缘置于含0.3％十二烷基硫酸钠+1000U/ml DNA酶的保护液中，设定摇床速度为150转/分钟，温度为20℃，消化4小时去除角膜中的DNA成分；将脱细胞后的角膜缘置于保护液中漂洗3小时，得到脱细胞角膜缘载体。
2、组织工程角膜缘构建
将角膜缘细胞或干细胞按2×104/cm2的密度接种到脱细胞角膜缘上，37℃、5％CO2，条件培养基上静置培养15天，再行气液界面培养1周，当种子细胞在脱细胞角膜缘上扩增达到3～5层时，组织工程角膜缘构建成功。
实施例3：
切取含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质，含lmm巩膜，2mm外周角膜，厚约0.2mm。
1、载体的制备
全程使用保护液对角膜缘组织进行保护，保护液成分为：PBS缓冲液中添加5g/L透明质酸，18g/L硫酸软骨素，10g/L右旋糖苷和4mg/L妥布霉素，调整pH值为7.4，渗透压为340mOsm；
将角膜缘置于含0.5％十二烷基磺酸钠+500U/ml DNA酶的保护液中，设定摇床速度为120转/分钟，温度为30℃，消化2小时去除角膜中的DNA成分；将脱细胞后的角膜缘置于保护液中漂洗5小时，得到脱细胞角膜缘载体。
2、组织工程角膜缘构建
将口腔黏膜上皮细胞或干细胞按3×104/cm2的密度接种到脱细胞角膜缘上，37℃、5％CO2，条件培养基上静置培养12天，再行气液界面培养1周，当种子细胞在脱细胞角膜缘上扩增达到3～5层时，组织工程角膜缘构建成功。
实施例4：
切取含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质，含lmm巩膜，2mm外周角膜，厚约0.2mm。
1、载体的制备
全程使用保护液对角膜缘组织进行保护，保护液成分为：PBS缓冲液中添加12g/L透明质酸，15g/L硫酸软骨素，8g/L右旋糖苷和5mg/L妥布霉素，调整pH值为7.2，渗透压为380mOsm；
将角膜缘置于含0.2％十二烷基硫酸钠+2000U/ml DNA酶的保护液中，设定摇床速度为100转/分钟，温度为25℃，消化2小时去除角膜中的DNA成分；将脱细胞后的角膜缘置于保护液中漂洗5小时，得到脱细胞角膜缘载体。
2、组织工程角膜缘构建
将hES分化的角膜上皮细胞或干细胞按5×104/cm2的密度接种到脱细胞角膜缘上，37℃、5％CO2，条件培养基上静置培养10天，再行气液界面培养1周，当种子细胞在脱细胞角膜缘上扩增达到3～5层时，组织工程角膜缘构建成功。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。