本发明属于免疫学和分子生物学领域，涉及一种结核病免疫诊断分子标识及其制备疫苗的应用。
背景技术：
结核分枝杆菌是对人类健康威胁最大的病原体之一，结核病是当今世界上成年人中的主要传染病，已对国际公共卫生构成严峻挑战。结核菌在感染人体以后，多处于潜伏状态或持续感染状态，它能在感染宿主细胞内逃避宿主的防御作用而大量繁殖并和宿主达到一种微妙的平衡，感染者一生中的任何时候都有可能发病。一般情况下，10％的感染者将发展为活动性肺结核。一个未经治疗的活动性肺结核病人，一年能传染10－15人。
近五十年来，结核病的控制理论与技术、临床诊断治疗水平与研究均有长足的进步。由于有效化疗药物(异烟肼、利福平、吡嗪酰铵、链霉素、乙胺丁醇等)的普遍应用和卡介苗在世界范围的推广，使得结核病的发病率曾一度降低，以至于人们乐观地认为，结核病将同天花一样被人类彻底消灭。但在八十年代中期，由于过分乐观的估计形势，减少投资、缩减机构，放松对结核病的治疗与管理，结核病又在许多国家死灰复燃，发病率在全世界范围内再次回升。1993年WHO宣布结核病处于“全球紧急状态”，并呼吁“迅速采取行动与结核病危机进行斗争”，这在WHO历史上发表这样的声明尚属首次。耐药及耐多药结核病也已成为当前结核病控制工作中的重大威胁。
结核病的预防状况，WHO已将牛分枝杆菌卡介苗Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin(BCG)列入扩大免疫计划范畴。然而，针对肺结核的免疫保护作用的报道差异甚大，从0～80％不等。另外，随着HIV感染的流行，已有报告AIDS病人接种BCG后引起全身播散性感染。
目前结核病毒诊断方法有：(一)痰菌检查：痰涂菌检查和痰结核菌检查简便易行，准确性较高，痰中查出结核菌，就能确诊患了结核病。一般初次就诊要查三个痰标本，即夜间痰、清晨痰和即时痰。它虽然是诊断肺结核“金指标”但诊断率低，培养周期长。痰结核菌培养，结果可信度高，并能做结核菌药敏试验，但需时6－8周，应用受到限制。(二)Ⅹ射线检查：胸部Ⅹ线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受。胸部CT可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般Ⅹ线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆，需要专业医生确证。(三)肺结核病免疫学诊断：1.常用的有结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)试验，该试验阳性是感染过结核菌的证据之一，但是假阳性率高，容易误诊。2.血中、痰中结核抗体检测阳性也有助于诊断，也容易出现假阳率。3.BACTEC法测结核分枝杆菌的代谢物，一般两周可分离出分枝杆菌，但菌量多少能影响阳性结果出现的天数。4.聚合酶链反应(PCR)，优点是敏感性可达98％－100％，缺点是特异性较差。(四)其他检查：只能作为辅助诊断，不能作为诊断依据。1.纤维支气管镜检查，可以直接观察或间接判断支气管、肺内病变，并且有活组织检查、灌洗、录像、拍摄气管内照片等功能，对于诊断和鉴别诊断特别有用。2.胸腔镜和纵隔镜检查，均可用于观察胸腔、纵隔内肿大淋巴结，并可取出活组织检查以利诊断和鉴别诊断。3.超声波检查，主要用于胸腔积液的诊断和鉴别诊断。
因此，迫切需要能快速诊断结核病、高效能预防、控制结核病的手段。
技术实现要素：
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，基于结核分枝杆菌H37Rv得到了两个分离的多肽(蛋白)，分别命名为Rv0237和Rv1111c。并且本发明人惊奇地发现，这两个多肽能够作为抗原，在体液免疫反应中具有较高的反应强度，并且良好的灵敏度和特异性，具有用于制备抗结核药物特别是抗结核疫苗的潜力。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及(分离的)多肽在制备抗结核病的药物或者抑制结核分枝杆菌的药物中的用途，其中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
Rv0237蛋白的氨基酸序列：(359aa)
STTSGASPATPVAVPVPRSCAEPAGIPALLSPRDKLAQLLVVGVRDAADAQAVVTNYHVGGILIGSDTDLTIFDGALAEIVAGGGPLPLAVSVDEEGGRVSRLRSLIGGTGPSARELAQTRTVQQVRDLARDRGRQMRKLGITIDFAPVVDVTDAPDDTVIGDRSFGSDPATVTAYAGAYAQGLRDAGVLPVLKHFPGHGRGSGDSHNGGVTTPPLDDLVGDDLVPYRTLVTQAPVGVMVGHLQVPGLTGSEPASLSKAAVNLLRTGTGYGAPPFDGPVFSDDLSGMAAISDRFGVSEAVLRTLQAGADIALWVTTKEVPAVLDRLEQALRAGELPMSAVDRSVVRVATMKGPNPGCGR(SEQ ID NO:1)
Rv1111c蛋白的氨基酸序列：(185aa)
TALFDSIARKLSSLMTGDSDDDGGRRSAQRPARTRSRHARPPSEDNREPIAERRSRRRPRPQNDPHPRRNAHERPAPRSSRFDSYRSYQPSEPSGPAEPVNRYERRGARYQPYARYEPTYEPQRRRARPSEPTNPTHHPISQVRYRGSATRDARRDNYREEQRFDRRDRSRAPRRPPAESWEYDV(SEQ ID NO:2)
本发明的实施例2的实验结果表明，Rv0237和Rv1111c三次实验结果的平均反应强度均大于2，且重复性好，可以应用于制备抗结核病的药物或者抑制结核分枝杆菌的药物，例如作为疫苗候选物
本发明的另一方面涉及(分离的)多核苷酸在制备抗结核病的药物或者抑制结核分枝杆菌的药物中的用途，其中，所述多核苷酸的核酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
编码Rv0237的核酸序列：(1080bp)
TCGACGACCTCCGGCGCGTCGCCCGCAACTCCGGTAGCCGTTCCCGTGCCCCGGAGCTGCGCCGAGCCGGCGGGGATCCCGGCGCTGCTGTCCCCCCGTGACAAGCTGGCCCAGCTGCTGGTGGTCGGCGTGCGAGATGCTGCGGACGCCCAAGCCGTGGTCACCAACTACCACGTCGGCGGCATCCTCATCGGCAGCGACACCGACCTGACGATTTTTGACGGCGCGCTGGCCGAGATCGTTGCCGGCGGGGGTCCGCTGCCGCTGGCGGTGAGTGTCGACGAGGAAGGCGGGCGGGTGTCCCGGTTGAGGTCGCTGATCGGCGGTACGGGGCCGTCGGCCCGCGAACTGGCACAAACCCGAACCGTCCAGCAGGTGCGCGACTTGGCTCGAGACCGCGGCCGGCAGATGAGAAAGCTGGGTATCACCATCGACTTCGCCCCGGTGGTCGACGTCACCGACGCCCCGGATGACACGGTGATCGGGGACCGGTCGTTCGGCTCGGATCCGGCTACGGTCACCGCGTATGCCGGGGCGTACGCGCAGGGTCTGCGCGATGCCGGGGTGCTGCCGGTGCTCAAGCATTTCCCCGGTCACGGGCGTGGCTCGGGTGATTCGCACAACGGGGGTGTCACGACACCACCGCTTGATGACCTGGTGGGCGATGACCTGGTGCCCTACCGAACGCTGGTGACCCAGGCGCCGGTCGGTGTGATGGTGGGTCATCTGCAGGTTCCTGGGTTGACCGGCTCCGAGCCGGCCAGTCTGAGCAAGGCCGCGGTGAACCTGCTGCGCACCGGCACGGGATACGGCGCACCGCCGTTCGATGGTCCAGTGTTCAGCGACGACCTCTCTGGTATGGCCGCGATCTCAGACCGGTTTGGCGTCAGCGAGGCGGTGTTGCGCACCTTGCAAGCCGGTGCCGATATCGCACTGTGGGTTACCACCAAAGAGGTGCCCGCGGTGCTGGACCGCCTGGAACAGGCGCTGCGCGCCGGTGAATTGCCGATGTCGGCGGTCGACCGGTCGGTGGTGCGGGTGGCGACCATGAAGGGGCCCAACCCGGGGTGTGGCCGTTAG(SEQ ID NO:3)
编码Rv1111c的核酸序列：(555bp)
ACGGCTCTGTTCGACAGCATCGCCAGGAAGCTCAGCTCGCTGATGACCGGCGATTCGGACGACGACGGCGGCCGGCGGTCGGCCCAGCGGCCTGCCCGTACTCGTTCCCGACACGCCCGACCCCCGTCGGAGGACAACCGCGAACCCATAGCCGAGCGTCGATCGCGCCGCCGCCCTAGGCCGCAGAATGATCCGCACCCGCGCCGCAATGCCCACGAACGGCCGGCACCGCGCAGCAGCCGCTTCGATTCTTACCGCAGCTACCAGCCGTCCGAACCCTCCGGGCCTGCCGAGCCCGTCAACCGGTACGAACGTCGGGGTGCTCGATACCAGCCCTATGCGCGCTACGAGCCCACCTACGAGCCCCAACGCCGACGCGCCCGTCCCAGCGAGCCAACCAACCCGACACACCATCCGATCTCGCAGGTCCGCTACCGCGGGTCAGCTACTCGCGACGCGCGGCGGGACAACTACCGCGAGGAGCAGCGGTTCGATCGGCGGGATCGTTCGCGGGCACCGCGCAGACCACCGGCTGAATCCTGGGAATACGACGTC(SEQ ID NO:4)
本发明的再一方面涉及重组载体在制备抗结核病的药物或者抑制结核分枝杆菌的药物中的用途，其中，所述重组载体含有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的多核苷酸。
本发明的再一方面涉及宿主细胞在制备抗结核病的药物或者抑制结核分枝杆菌的药物中的用途，其中，所述宿主细胞含有重组载体，所述重组载体含有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的多核苷酸。
本发明的再一方面涉及多肽在制备诊断结核病的药物或者检测结核分枝杆菌的药物中的用途，其中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
本发明的再一方面涉及多核苷酸在制备诊断结核病的药物或者检测结核分枝杆菌的药物中的用途，其中，所述多核苷酸的核酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
根据上面的任一项所述的用途，其中，所述结核病为肺结核。
根据上面的任一项所述的用途，其中，所述结核分枝杆菌为结核分枝杆菌H37Rv。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其含有氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽，以及药学上可接受的辅料。
本发明的再一方面涉及一种疫苗组合物，其含有氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽，以及疫苗用辅料例如佐剂。在本发明的一个实施方案中，所述疫苗组合物为疫苗制剂。
本发明的再一方面涉及一种预防和/或治疗结核病例如肺结核的方法，包括给予受试者(例如接种)有效量的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽、本发明的药物组合物或者本发明的疫苗组合物的步骤。
给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体多肽，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。
可改变药物组合物中各活性成分(多肽)的实际剂量水平，以便所得的活性成分的量能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体多肽的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，给药剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如结核病特别是肺结核)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如结核病特别是肺结核)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
术语“结核杆菌”，包括但不限于，例如，结核分枝杆菌；术语“结核分枝杆菌”包括但不限于，结核分枝杆菌H37Rv。
术语“抗结核病”包括但不限于预防和/或治疗结核病。
术语“结核病”，包括但不限于，例如由“结核杆菌”感染引起的疾病和/或病症，例如肺结核。
发明的有益效果
体液免疫实验表明，作为抗原，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的蛋白具有良好的灵敏度和特异性，并且反应强度显著高于阳性对照38kDa，具有应用于制备抗结核药物例如抗结核疫苗的潜力。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下面的实施例1－3中，如果没有特别说明，使用的蛋白样品为Rv0237蛋白以及Rv1111c蛋白；其可以人工化学合成得到，也可以由相应的编码核苷酸序列通过重组表达载体和重组宿主细胞表达纯化得到。其中，编码Rv0237的核酸序列和编码Rv1111c的核酸序列可以克隆自结核分枝杆菌H37Rv或人工化学合成得到。
实施例1：质谱鉴定实验
1.实验材料和仪器
目标蛋白样品：制备的Rv0237蛋白(SEQ ID NO:1)以及Rv1111c蛋白(SEQ ID NO:2)。
仪器：Ultimate 3000Nano-LC system(Dionex,USA)、线性离子阱多级串联质谱仪(linear trap quadruple，LTQ)，Orbitrap Velos mass spectrometer(Thermo Scientific,Germany)。
数据处理软件：MassLynx version 4.1(Dionex,USA)，Xcalibur software v2.2.6(Thermo)，MASCOT version 2.2(Matrix Sciences,UK)。
2.实验方法
(1)目标蛋白进行SDS PAGE后，去离子水冲洗胶片15分钟；切下目的片段，1－2mm大小；放到蛋白低吸附的离心管中，用100μL的ddH2O在碟子里冲洗胶粒并重复一次，弃去液体，加入40μL的(ACN)/ddH2O(50/50)，弃去液体，孵育15分钟；弃去液体，加入100μL 100mM碳酸氢铵，孵育15分钟，再加入100μL乙氰，孵育15分钟；重复以上步骤；取出所需胶量(根据估测各取10μg)；加入200μLACN脱水，5分钟，弃去；真空干燥样品30分钟，样品必须非常干燥。
(2)还原蛋白和烷基化：在样品中加入40μL10mM二硫苏糖醇1M贮存液(DTT，1M)/100mM碳酸氢铵，使胶粒完全没入液体中，56℃水浴45分钟，取出样品放凉。
(3)立即加入40μL 55mM碘乙酰胺(IAA1M贮存液)/100mM碳酸氢铵室温孵育30分钟，避光。
(4)洗涤：弃去胶粒中的溶液，加入100mM碳酸氢铵40μL，孵育15分钟；加入40μL乙腈，孵育15分钟；弃去液体，加入100μL ACN干燥5分钟，弃去；真空干燥样品30分钟。
(5)胰蛋白酶消化蛋白：加入10μL胰蛋白酶溶液(足量，胰蛋白酶和蛋白的质量比为1：10)，4℃孵育45分钟(冰浴)。37℃孵育过夜(12－16小时)；
(6)抽提蛋白：吸取上清，放入低吸附蛋白离心管中，在胶片上加入20μL的25mM碳酸氢铵，孵育15分钟；加入等量的CAN使之成1:1溶液Ambic/ACN，孵育15分钟；重复以上步骤；吸取上清，保存，在胶片上加入20μL的5％的甲酸，孵育15分钟；加入等量的ACN，孵育15分钟；吸取上清，保存，吸取上清，保存；加入0.1M DTT使蛋白的终浓度为1mM。彻底干燥，30℃大约1小时；用5％的甲酸重新溶解，使终浓度为500fmol/μL，
(7)除盐：用ZipTip c18除盐(www.merckmillipore.com,Germany)按说明书进行。
(8)上样：样品上样体积10μL加6μL到分离柱C18precolumn(Symmetry C18,5μm,180μm X 20mm)，用5％的乙腈(含0.05％甲酸以10μL/min的流速洗脱5分钟,上样到C-18分析柱(Waters ACQUITY UPLC BEH130C18,1.7μm,100μm X 100mm)恒温35℃。洗脱盐梯度从5％到35％，带阳性的肽通过电喷雾进行分析，喷雾电压为2.0kV。通过Orbitrap(m/z＝445.120025)实时获取MS数据(m/z 300-1,800,R＝60,000at m/z 400)。原始数据通过Xcalibur software v2.2.6(Thermo)获取。肽段到蛋白搜索软件MASCOT version 2.2，搜索数据库:3,988 entries of H37Rv genome and 247known contaminant protein sequences，搜索参数和修饰：max missed cleavage:1；固定修饰:Carbamidomethylation(C)；可变修饰:Oxidation(M)；Carbamyl(N-term),Deamidated(NQ)；Precursor ion mass tolerance:±50ppm；fragment mass tolerance:±0.6Da.High peptide confidence(p<0.01)and the false positive rate(FPR)was controlled at under 1％,missed cleavages permitted:2。
3.实验结果
见下面的表1和表2。
表1：质谱鉴定蛋白信息表
注：PSMs：peptide spectrum matches(肽谱符合数)
表2：鉴定蛋白二级质谱后肽信息表
注：PSMs：peptide spectrum matches(肽谱符合数)
表1的实验结果表明，表1中每项蛋白都是唯一的蛋白，与NCBI原始序列比对，蛋白得分值和覆盖率都很很高，符合鉴定标准。
表2是鉴定出的氨基酸序列和得分情况，每一个蛋白都有二十多条肽段被鉴定出来，符合大于2条肽段相符即为该蛋白的标准，其他各项都说明肽的正确性和各个标准(一般鉴定出的肽多于两条就无需质谱图了)。由此可见，制得的蛋白为确为H37Rv标准株蛋白。
实施例2：体液免疫实验
体液免疫抗原能与体内产生的专一性的结合，阻止它感染正常细胞，并与巨噬细胞结合，使巨噬细胞吞噬抗原，达到消菌的目的，因此体液免疫反应强度高的蛋白同样可以刺激机体产生抗体，达到免疫保护作用。
1.实验材料
蛋白样品：Rv0237蛋白以及Rv1111c蛋白。阳性对照38kDa(Immuno Diagnostics Inc.USA)。
主要试剂：鼠源二抗高通量试剂盒，PS-MK15 Wes-Mouse 12-230 kDa master kit with split buffer for 200 data(Immuno Diagnostics Inc.USA)。链霉素标记羊抗人IgG，Thermo Scientific,Germany)。
2.实验原理和方法
采用Western Blot方法。Western Blot技术是一种经典的蛋白质检测技术，传统的方法是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗(同位素或非同位素的酶)来检测。现有的新仪器protein simple(请参见http://www.proteinsimple.com/)完全可以替代传统的方法，并且用使用试剂和抗原等都是微量进行，并且有专用的试剂盒，节省时间，规范实验步骤，定量准确。
38kDa(Rv0934,GenBank登录号为：NC_000962.2，gi:15608080)最为常用，是最早发展的商用诊断试剂盒抗原。对活动性肺结核的诊断非常有效，其缺点是对不同人群的灵敏度波动较大，尤其对涂片阴性结核患者和合并HIV感染的结核患者效果较差。它是一种磷酸盐转运蛋白，属于膜结合脂蛋白，含量高于BCG(牛分枝杆菌卡介苗，Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin)10倍，也是目前最为常用的结核诊断抗原之一。在用于结核病血清学检测时，Wilkinson等用38kD抗原检测肺结核病人血清，其灵敏度和特异性分别为65.6％和95.8％。因此本实验用38kDa作为阳性对照，检测表达抗原的抗原体液免疫效果。
实验方法按照试剂盒说明书给定的方法进行，具体步骤如下：
(1)样品准备
分别将目标蛋白样品和阳性对照38kDa(Immuno Diagnostics Inc.USA)，按照500ng/μl稀释蛋白样品加入5x蛋白上样缓冲液。
一抗制备：
A.选择临床检查90位ESAT-6阳性的肺结核病人，抽取抗凝血，离心取上清，每人200微升混合。按照每100μl血浆:100微克大肠杆菌粉末的比例，加入预先制备好的大肠杆菌粉末，混匀，4℃孵育过夜。离心收取上清，再用磁珠吸附方法去除血清中的杂蛋白。按照和原液血浆等体积用抗体稀释液1:100倍稀释，待用。
其中，所用大肠杆菌粉末参考如下方法制备：
接种E.coli BL21(DE3)至100mL LB培养基中，220rpm，37℃培养过夜，次日收集菌体；10mL PBS重悬E.coli BL21(DE3)菌体，再加入40mL预冷的丙酮，4℃条件下充分混匀；12000rpm，4℃离心10min收集菌体，使用丙酮洗涤两次；取出菌体放在干净的纸上待其自然风干备用。
B.磁珠吸附IgG处理方法
磁珠处理方法：
250μL ddH2O洗涤50μL磁珠，500μL IgG Binding buffer(20mM Na3PO4，pH7.5)平衡50μL磁珠。
磁珠处理血清：
已处理磁珠(50μL)加入500μL血清混匀，室温孵育30min，分钟，然后置于磁力架上，弃上清。
50μL磁珠加入250μL 0.1M Gly-Hcl pH为2.7洗脱缓冲液洗脱，收集上清，使IgG与磁珠分离，收集上清。
在收集的上清中加入60μL Tris-Hcl pH为9.0中性缓冲液中和至PH为7.0，分装-80℃保存，可用于体液免疫实验。
二抗准备：链霉素标记羊抗人IgG，用抗体稀释液进行1:200倍稀释。
(2)上样
按照assay plate(25x6)要求进行。A行分别加入抗原(5μl)，A行第一孔为系统对照，其他孔为样品孔。在样品孔加入一孔5μl的38kDa为阳性对照，其他孔为加入5μl蛋白样品，B行为10μl的一抗稀释液，C行为一抗，加入稀释后一抗即10μl血清，第一孔为抗体稀释液，D行为二抗，加入二抗(10μl)，第一孔为链霉素过氧化物酶，E行加入10μl系统发光过氧化混合物，F行空白。再加入三行(3x5)洗液500μl，洗去未结合的一抗及二抗，离心10分钟，去掉气泡，待上样。
(3)上机
打开compass software v2.7，打开wes界面，设定方法采用仪器默认设定程序：毛细管电泳时间是25min，电泳时电压为375伏，抗体稀释时间5min，一抗、二抗孵育时间均为30min，洗板时间系统默认。打开capillary cartridge支撑架，放入apillary cartridge，撕掉assay plate的封口膜，关门。点击开始按钮开始运行机器。机器会自动运行并进行图片收集和反应强度取值。
调整系统标准分子量，之后在edit下的analysis菜单下调节曝光时间，在edit下copy选择图片格式保存图片。程序设定好后，在file下点击保存整个运行文件。可以输出反应强度的峰值面积，然后计算靶蛋白和阳性对照的峰面积比，作为反应强度。阳性对照38kDa的反应强度视为1。
实验完成后再重复2次。
3.实验结果
如下面的表3所示。
表3：反应强度结果
由表3可见，Rv0237和Rv1111c三次实验结果的平均反应强度均大于2，且重复性好，可以作为疫苗候选物。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院病原生物学研究所
<120> 一种结核病免疫诊断分子标识及其制备疫苗的应用
<130> 1602
<160> 4
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 359
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 1
Ser Thr Thr Ser Gly Ala Ser Pro Ala Thr Pro Val Ala Val Pro Val
1 5 10 15
Pro Arg Ser Cys Ala Glu Pro Ala Gly Ile Pro Ala Leu Leu Ser Pro
20 25 30
Arg Asp Lys Leu Ala Gln Leu Leu Val Val Gly Val Arg Asp Ala Ala
35 40 45
Asp Ala Gln Ala Val Val Thr Asn Tyr His Val Gly Gly Ile Leu Ile
50 55 60
Gly Ser Asp Thr Asp Leu Thr Ile Phe Asp Gly Ala Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Val Ala Gly Gly Gly Pro Leu Pro Leu Ala Val Ser Val Asp Glu Glu
85 90 95
Gly Gly Arg Val Ser Arg Leu Arg Ser Leu Ile Gly Gly Thr Gly Pro
100 105 110
Ser Ala Arg Glu Leu Ala Gln Thr Arg Thr Val Gln Gln Val Arg Asp
115 120 125
Leu Ala Arg Asp Arg Gly Arg Gln Met Arg Lys Leu Gly Ile Thr Ile
130 135 140
Asp Phe Ala Pro Val Val Asp Val Thr Asp Ala Pro Asp Asp Thr Val
145 150 155 160
Ile Gly Asp Arg Ser Phe Gly Ser Asp Pro Ala Thr Val Thr Ala Tyr
165 170 175
Ala Gly Ala Tyr Ala Gln Gly Leu Arg Asp Ala Gly Val Leu Pro Val
180 185 190
Leu Lys His Phe Pro Gly His Gly Arg Gly Ser Gly Asp Ser His Asn
195 200 205
Gly Gly Val Thr Thr Pro Pro Leu Asp Asp Leu Val Gly Asp Asp Leu
210 215 220
Val Pro Tyr Arg Thr Leu Val Thr Gln Ala Pro Val Gly Val Met Val
225 230 235 240
Gly His Leu Gln Val Pro Gly Leu Thr Gly Ser Glu Pro Ala Ser Leu
245 250 255
Ser Lys Ala Ala Val Asn Leu Leu Arg Thr Gly Thr Gly Tyr Gly Ala
260 265 270
Pro Pro Phe Asp Gly Pro Val Phe Ser Asp Asp Leu Ser Gly Met Ala
275 280 285
Ala Ile Ser Asp Arg Phe Gly Val Ser Glu Ala Val Leu Arg Thr Leu
290 295 300
Gln Ala Gly Ala Asp Ile Ala Leu Trp Val Thr Thr Lys Glu Val Pro
305 310 315 320
Ala Val Leu Asp Arg Leu Glu Gln Ala Leu Arg Ala Gly Glu Leu Pro
325 330 335
Met Ser Ala Val Asp Arg Ser Val Val Arg Val Ala Thr Met Lys Gly
340 345 350
Pro Asn Pro Gly Cys Gly Arg
355
<210> 2
<211> 185
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 2
Thr Ala Leu Phe Asp Ser Ile Ala Arg Lys Leu Ser Ser Leu Met Thr
1 5 10 15
Gly Asp Ser Asp Asp Asp Gly Gly Arg Arg Ser Ala Gln Arg Pro Ala
20 25 30
Arg Thr Arg Ser Arg His Ala Arg Pro Pro Ser Glu Asp Asn Arg Glu
35 40 45
Pro Ile Ala Glu Arg Arg Ser Arg Arg Arg Pro Arg Pro Gln Asn Asp
50 55 60
Pro His Pro Arg Arg Asn Ala His Glu Arg Pro Ala Pro Arg Ser Ser
65 70 75 80
Arg Phe Asp Ser Tyr Arg Ser Tyr Gln Pro Ser Glu Pro Ser Gly Pro
85 90 95
Ala Glu Pro Val Asn Arg Tyr Glu Arg Arg Gly Ala Arg Tyr Gln Pro
100 105 110
Tyr Ala Arg Tyr Glu Pro Thr Tyr Glu Pro Gln Arg Arg Arg Ala Arg
115 120 125
Pro Ser Glu Pro Thr Asn Pro Thr His His Pro Ile Ser Gln Val Arg
130 135 140
Tyr Arg Gly Ser Ala Thr Arg Asp Ala Arg Arg Asp Asn Tyr Arg Glu
145 150 155 160
Glu Gln Arg Phe Asp Arg Arg Asp Arg Ser Arg Ala Pro Arg Arg Pro
165 170 175
Pro Ala Glu Ser Trp Glu Tyr Asp Val
180 185
<210> 3
<211> 1080
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 3
tcgacgacct ccggcgcgtc gcccgcaact ccggtagccg ttcccgtgcc ccggagctgc 60
gccgagccgg cggggatccc ggcgctgctg tccccccgtg acaagctggc ccagctgctg 120
gtggtcggcg tgcgagatgc tgcggacgcc caagccgtgg tcaccaacta ccacgtcggc 180
ggcatcctca tcggcagcga caccgacctg acgatttttg acggcgcgct ggccgagatc 240
gttgccggcg ggggtccgct gccgctggcg gtgagtgtcg acgaggaagg cgggcgggtg 300
tcccggttga ggtcgctgat cggcggtacg gggccgtcgg cccgcgaact ggcacaaacc 360
cgaaccgtcc agcaggtgcg cgacttggct cgagaccgcg gccggcagat gagaaagctg 420
ggtatcacca tcgacttcgc cccggtggtc gacgtcaccg acgccccgga tgacacggtg 480
atcggggacc ggtcgttcgg ctcggatccg gctacggtca ccgcgtatgc cggggcgtac 540
gcgcagggtc tgcgcgatgc cggggtgctg ccggtgctca agcatttccc cggtcacggg 600
cgtggctcgg gtgattcgca caacgggggt gtcacgacac caccgcttga tgacctggtg 660
ggcgatgacc tggtgcccta ccgaacgctg gtgacccagg cgccggtcgg tgtgatggtg 720
ggtcatctgc aggttcctgg gttgaccggc tccgagccgg ccagtctgag caaggccgcg 780
gtgaacctgc tgcgcaccgg cacgggatac ggcgcaccgc cgttcgatgg tccagtgttc 840
agcgacgacc tctctggtat ggccgcgatc tcagaccggt ttggcgtcag cgaggcggtg 900
ttgcgcacct tgcaagccgg tgccgatatc gcactgtggg ttaccaccaa agaggtgccc 960
gcggtgctgg accgcctgga acaggcgctg cgcgccggtg aattgccgat gtcggcggtc 1020
gaccggtcgg tggtgcgggt ggcgaccatg aaggggccca acccggggtg tggccgttag 1080
<210> 4
<211> 555
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 4
acggctctgt tcgacagcat cgccaggaag ctcagctcgc tgatgaccgg cgattcggac 60
gacgacggcg gccggcggtc ggcccagcgg cctgcccgta ctcgttcccg acacgcccga 120
cccccgtcgg aggacaaccg cgaacccata gccgagcgtc gatcgcgccg ccgccctagg 180
ccgcagaatg atccgcaccc gcgccgcaat gcccacgaac ggccggcacc gcgcagcagc 240
cgcttcgatt cttaccgcag ctaccagccg tccgaaccct ccgggcctgc cgagcccgtc 300
aaccggtacg aacgtcgggg tgctcgatac cagccctatg cgcgctacga gcccacctac 360
gagccccaac gccgacgcgc ccgtcccagc gagccaacca acccgacaca ccatccgatc 420
tcgcaggtcc gctaccgcgg gtcagctact cgcgacgcgc ggcgggacaa ctaccgcgag 480
gagcagcggt tcgatcggcg ggatcgttcg cgggcaccgc gcagaccacc ggctgaatcc 540
tgggaatacg acgtc 555