一种可用于抑制寨卡病毒感染的小分子药物及其应用的制作方法

本发明属于生物技术、生物医药技术领域，特别是涉及到一种可用于抑制寨卡病毒感染的小分子药物及其应用。

背景技术：

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)属于黄病毒科黄病毒属，具有包膜蛋白的二十面体病毒。其基因组为一条正向单链RNA,共有约10800个核苷酸，编码3个结构蛋白(PrM、Env、Capsid)和七个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。ZIKV是虫媒病毒中的一种，主要由白天活动的伊蚊叮咬传播，但其传播方式还有母婴垂直传播、性传播及输血传播。

第一株ZIKV于1947年在乌干达寨卡森林的恒河猴中被首次分离得到，第二株病毒于1948年在同一地区的白线斑蚊(Aedes.Africanus)分离得到。在2007年前，只偶尔出现人类感染病例。2007年4月，ZIKV在西太平洋密克罗尼西亚的雅浦(Yap)岛上首次爆发，出现49例ZIKV感染确诊病例，59例ZIKV感染疑似病例。2013年-2014年，ZIKV在法国波利尼西亚、复活节群岛、库克群岛、新苏格兰再次暴发流行。2015年4月在巴西的爆发导致目前(2016年5月18日)全球60个国家出现ZIKV的感染。

ZIKV感染导致发烧、疹子、关节疼痛、肌肉疼痛、头痛和结膜炎等症状，但症状多较温和，为自限性疾病，一般2～7天后自行好转。人感染后可获得持久的终生免疫，目前没有感染后再次感染的报道。

但是目前已证实ZIKV感染孕妇后，病毒可穿透胎盘屏障，或可导致婴儿出现小头症或其他比较严重的脑损伤，尤其是在怀孕的前3个月。同时，ZIKV感染可能还与吉兰-巴雷(Guillain-Barre)综合征有关。

然而，目前国际上尚未有效预防和/或治疗ZIKV感染的疫苗或药物，预防ZIKV感染的主要措施是防止蚊虫的叮咬，而对ZIKV感染的治疗是对症治疗，缓解其疾病症状。所以亟需研究针对ZIKV的特效药物，希望能够为感染ZIKV的孕妇提供特异性治疗，以减少小头症婴儿的出生，同时也为了防止预防和/或治疗吉兰-巴雷综合征。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可以抑制寨卡病毒(ZIKV)感染的小分子药物，从而实现对ZIKV感染的预防和/治疗。

在第一方面，本发明提供了一种抑制寨卡病毒感染的方法，包括给予有效量的孟鲁司特钠。

在第二方面，本发明提供了孟鲁司特钠在制备用于抑制寨卡病毒感染的药物中的用途。

在第三方面，本发明提供了孟鲁司特钠在制备用于治疗和/或预防寨卡病毒感染相关病症或疾病的药物中的用途。

通过使用孟鲁司特钠，无论是在细胞水平上还是在动物水平上，ZIKV感染均可以被有效地抑制。同时毒性实验结果也显示，孟鲁司特钠对细胞没有明显毒性。

附图说明

图1示出孟鲁司特钠对ZIKV毒株SZ01感染BHK21细胞和Vero细胞的抑制；从图中可以看出，孟鲁司特钠可以有效抑制SZ01对BHK21细胞和Vero细胞的感染，IC50值分别约为0.33μM和1.21μM。

图2示出孟鲁司特钠对ZIKV毒株FLR感染BHK21细胞和Vero细胞的抑制；从图中可以看出，孟鲁司特钠可以有效抑制FLR对BHK21细胞和Vero细胞的感染，IC50值分别约为2.45μM和2.96μM。

图3示出孟鲁司特钠对ZIKV毒株MR766感染BHK21细胞和Vero细胞的抑制；从图中可以看出，孟鲁司特钠可以有效抑制MR766对BHK21细胞和Vero细胞的感染，IC50值分别约为1.78μM和1.92μM。

图4示出孟鲁司特钠对BHK21细胞的毒性；从图中可以看出，孟鲁司特钠无明显毒性，其半数毒性浓度CC50>20000nM。

图5示出孟鲁司特钠对AG6小鼠感染ZIKV毒株SZ01的抑制；从图中可以看出，与Vehicle(DMSO)相比，孟鲁司特钠明显改善AG6小鼠的生存率。

具体实施方式

下面通过下文的实施例对本发明的具体技术方案作进一步清楚和完整的描述。需要理解的是，下文中具体描述的技术方案仅用于示例目的，无意于以任何方式对本发明的保护范围进行限制。在不背离本发明的精神和宗旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。本发明的保护范围由随附的权利要求书来进行限定。

如上所述，本发明的目的在于提供一种可以抑制寨卡病毒(ZIKV)感染的小分子药物，从而实现对ZIKV感染的预防和/治疗。

为实现上述目的，本发明人以小分子药物库为基础进行了筛选工作，目的是筛选出具有抑制ZIKV病毒活性的小分子，用于对ZIKV感染的预防和/或治疗。经筛选，本发明人意外地发现，孟鲁司特钠表现出良好且特异的抑制ZIKV的活性。

具体地，本发明人首先在细胞水平上研究了孟鲁司特钠对几种ZIKV毒株感染BHK21和Vero细胞的抑制作用，结果发现该药物可以有效抑制ZIKV的活性，其中抑制毒株SZ01对BHK21细胞和Vero细胞感染的半数抑制浓度IC50分别约为0.33μM和1.21μM，抑制毒株FLR对BHK21细胞和Vero细胞感染的IC50分别约为2.45μM和2.96μM，抑制毒株MR766对BHK21细胞和Vero细胞感染的IC50分别约为1.78μM和1.92μM。

其次，本发明人还在动物水平上研究了孟鲁司特钠对ZIKV的抑制作用，结果发现孟鲁司特钠对SZ01毒株感染AG6小鼠也具有抑制作用，能明显改善AG6小鼠的生存率。

另外，本发明人还发现，孟鲁司特钠不具有明显细胞毒性。在本发明中，发明人以BHK21细胞为例对孟鲁司特钠的细胞毒性进行了验证，结果发现其对细胞无明显毒性，半数毒性浓度CC50>20000nM。因此，孟鲁司特钠具有较好的安全性。

基于以上发现，本发明人由此达成了本申请要求保护的发明。

在对本发明进行详细描述之前，首先对孟鲁司特钠作简单介绍。

孟鲁司特钠的英文名为Montelukast sodium，其分子式为C₃₅H₃₅ClNO₃S·Na，化学结构式如下所示：

孟鲁司特钠目前是一种已经FDA批准用于临床治疗哮喘和过敏性鼻炎的药物，为口服的白三烯受体拮抗剂，能特异性抑制气道中的半胱氨酰白三烯(CysLT1)受体，改善气道炎症，有效控制哮喘症状。孟鲁司特钠在FDA制定的药物对妊娠的危险性等级分类中为B类，具有较好的安全性，并且有文献报道其还具有降低神经炎症，提升海马神经发生，改善老年动物学习和记忆的作用。

因此，在第一方面，本发明提供了一种抑制寨卡病毒感染的方法，包括给予有效量的孟鲁司特钠。

所述方法可以直接在动物体或者人体上实施，用于直接抑制寨卡病毒，进而实现对寨卡病毒感染相关病症或疾病的预防和/或治疗。所述方法也可以在组织或者细胞水平上实施，用于例如进行科学研究之目的。换言之，所述方法可以实施用于预防目的和/或治疗目的，也可以实施用于非预防目的和/或非治疗目的。

在此使用的术语“有效量”是指孟鲁司特钠能够有效地抑制寨卡病毒感染的量。本领域技术人员可以根据实验对象、实验目的、给药方式等因素来确定所述有效量。

在第二方面，本发明提供了孟鲁司特钠在制备用于抑制寨卡病毒感染的药物中的用途。

在一个实施方案中，孟鲁司特钠与其它药物联合用于制备所述用于抑制寨卡病毒感染的药物。

所述其它药物可以是，例如，恩利卡生(emricasan)、7-去氮-2’-C-甲基腺苷(7-deaza-2’-C-methyladenosine，7-deaza-2’-CMA)、2’-C-甲基腺苷(2’-C-methyladenosine，2’-CMA)、2’-C-甲基胞苷(2’-C-methylcytidine,2’-CMC)、2’-C-甲基鸟苷(2’-C-methylguanosine,2’-CMG)、2’-C-甲基尿苷(2’-C-methyluridine,2’-CMU)、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechin gallate,EGCG)、氯硝柳胺(Niclosamide)，但不限于此。

在第三方面，本发明提供了孟鲁司特钠在制备用于治疗和/或预防寨卡病毒感染相关病症或疾病的药物中的用途。

在一个实施方案中，所述寨卡病毒感染相关病症或疾病是寨卡病毒感染引起的小头症或吉兰-巴雷综合征。

在本文中，当述及用于治疗和/或预防寨卡病毒感染引起的小头症时，是指将有效量的所述药物直接给予寨卡病毒感染的孕妇，从而间接地治疗该孕妇腹中胎儿所患小头症和/或间接地预防胎儿患上小头症。

小头症是指头部远小于其他同龄和同性婴儿头部的新生儿畸形。若伴有脑发育不良，小头症婴儿可能会有发育障碍。小头症从轻微到严重不等。造成小头症可能有许多原因，其中包括寨卡病毒感染。

吉兰-巴雷综合征是一种很少见但是很严重的疾病，往往发生在病毒或者细菌感染后的几天到几周内，会造成严重的神经损伤，常见症状包括肌肉无力、疼痛、感官障碍，在相当严重的情况下会造成瘫痪。吉兰-巴雷综合征是以周围神经和神经根的脱髓鞘病变及小血管炎性细胞浸润为病理特点的自身免疫性周围神经病，经典型的吉兰-巴雷综合征被称为急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(AIDP)，临床表现为急性对称性弛缓性肢体瘫痪。

在一个实施方案中，孟鲁司特钠与其它药物联合用于制备所述用于抑制寨卡病毒感染的药物。

所述其它药物可以是，例如，恩利卡生、7-去氮-2’-C-甲基腺苷、2’-C-甲基腺苷、2’-C-甲基胞苷、2’-C-甲基鸟苷、2’-C-甲基尿苷、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯或氯硝柳胺，但不限于此。

本申请实验结果表明，无论是在细胞水平上还是在动物水平上，孟鲁司特钠均可以有效地抑制寨卡病毒感染。同时毒性实验结果还表明，孟鲁司特钠对细胞没有明显毒性。因此，可以使用孟鲁司特钠抑制寨卡病毒感染，进而预防和/或治疗寨卡病毒感染相关病症或疾病。

实施例

实施例1.孟鲁司特钠在体外对ZIKV感染的抑制

孟鲁司特钠抑制ZIKV感染的实验操作可以参考文献：Zhiwu Sun,et al.,Intranasal Administration of Maleic Anhydride-Modified Human Serum Albumin for Pre-Exposure Prophylaxis of Respiratory Syncytial Virus Infection；Viruses 2015,7,798-819；doi:10.3390/v7020798，具体如下：

(1)从38岁中国男性患者体内分离ZIKV，并将分离得到的ZIKV通过接种C6/36细胞进行扩增(Sci China Life Sci,doi:10.1007/s11427-016-5043-4)。

(2)使用无血清DMEM在96孔板中梯度稀释孟鲁司特钠，使其浓度分别为10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.156μM、0.078μM，每孔加药体积为50μL，每个浓度设置3个重复。

(3)使用无血清DMEM稀释ZIKV(毒株分别为SZ01、MR766、FLR)，使得ZIKV的终浓度为3TCID50(半数组织培养感染剂量),按照每孔50μL的量将ZIKV加入(2)中的96孔板，同时设置病毒感染的阳性组和无病毒无药物的阴性组。病毒与药物37℃条件下孵育1小时30分钟。

(4)使用EDTA-EGTA消化液消化处理BHK21或Vero细胞，使用含2％FBS的DMEM将该细胞稀释为2*10⁵/mL，并按100μL/孔的量加入(3)中的96孔板。之后在37℃、5％CO₂条件下培养。

(5)至阳性组细胞出现明显CPE(致细胞病变效应)导致细胞全部死亡时，使用CCK8检测孟鲁司特钠对病毒的抑制活性。CCK8检测的具体操作如下：

a)小心吸弃96孔板中的培养基，加入新鲜的含2％FBS的DMEM，继续培养2-4小时。

b)将1mL CCK8溶液加入9mL含2％FBS的DMEM中(一块96孔板的用量)，颠倒混匀，得到CCK8反应液。

c)小心吸弃96孔板中的培养基，将b)中所述的CCK8反应液加入96孔中，每孔100μL。

d)37℃条件下培养1小时，之后在酶标仪上测定各孔的OD₄₅₀吸光度值。

(6)计算孟鲁司特钠的抑制活性，使用的公式为：孟鲁司特钠的抑制活性＝(A_药物孔-A_病毒孔)*100/(A_无药物孔-A_病毒孔)，其中A_药物孔是指含有药物、病毒、细胞和CCK8的孔的吸光度，A_病毒孔是指含有病毒、细胞和CCK8的孔的吸光度，A_无药物孔是指只含有细胞和CCK8的孔(无药物无病毒)的孔的吸光度。

抑制试验结果显示：孟鲁司特钠可以较好地抑制ZIKV的感染，抑制毒株SZ01对BHK21细胞和Vero细胞感染的半数抑制浓度IC50分别约为0.33μM和1.21μM(图1)；抑制毒株FLR对BHK21细胞和Vero细胞感染的IC50分别约为2.45μM和2.96μM(图2)；抑制毒株MR766对BHK21细胞和Vero细胞感染的IC50分别约为1.78μM和1.92μM(图3)。

实施例2 孟鲁司特钠对BHK21细胞的毒性检测

孟鲁司特钠对BHK21细胞的毒性检测操作可以参考文献：Zhiwu Sun,et al.,Intranasal Administration of Maleic Anhydride-Modified Human Serum Albumin for Pre-Exposure Prophylaxis of Respiratory Syncytial Virus Infection.Viruses 2015,7,798-819；doi:10.3390/v7020798)，具体如下：

(1)使用无血清DMEM稀释孟鲁司特钠，使其浓度分别为20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.156μM，每孔加药体积为100μL，每个浓度设置2个重复。

(2)使用EDTA-EGTA消化液消化处理BHK21细胞，使用含2％FBS的DMEM将细胞稀释为4*10⁵/mL，并按100μL/孔的量加入(1)中的96孔板。之后在37℃、5％CO₂条件下培养4天。

(3)小心吸弃96孔板中的培养基，加入新鲜的含2％FBS的DMEM，继续培养2-4小时。

(4)将1mL CCK8溶液加入9mL含2％FBS的DMEM中(一块96孔板的用量)，颠倒混匀，得到CCK8反应液。

(5)小心吸弃96孔板中的培养基，将(4)中所述的CCK8反应液加入96孔中，每孔100μL。

(6)37℃，5％CO₂条件下培养1小时，之后在酶标仪测定各孔的OD₄₅₀吸光度值。

(7)计算细胞的活性，使用的计算方法为：细胞活性＝(A_药物孔-A_无细胞孔)*100/(A_无药物孔-A_无细胞孔)，其中A_药物孔是指含有药物、细胞和CCK8的孔的吸光度，A_无细胞孔是指不含药物和细胞、只含有CCK8的孔的吸光度，A_无药物孔是指不含药物、只含细胞和CCK8的孔的吸光度。

毒性实验结果显示：孟鲁司特钠对BHK21细胞无明显毒性，其半数毒性浓度CC50>20000nM(图4)。

实施例3.孟鲁司特钠在小鼠模型中对ZIKV感染的抑制

孟鲁司特钠在小鼠模型中对ZIKV感染的抑制实验如下进行：

(1)将20只AG6小鼠分成两组(药物组和对照组)，每组10只，药物组以45mg/kg腹腔注射给药，对照组腹腔注射DMSO。

(2)8小时后，每只AG6小鼠腹腔注射1000PFU(空斑形成单位)的SZ01病毒。病毒注射完毕后，药物组以45mg/kg腹腔注射给药，对照组腹腔注射DMSO。

(3)药物组连续7天以相同方式给药，对照组连续7天以相同方式注射DMSO，并每天观测小鼠生存率。

小鼠模型抑制试验结果显示：孟鲁司特钠可以较好地抑制ZIKV毒株SZ01对AG6小鼠的感染，从图5中可以看出，与Vehicle(DMSO)相比，孟鲁司特钠明显改善AG6小鼠的生存率。

对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明并不限于上述示例的细节，在不背离本发明的精神和宗旨的情况下，本领域技术人员能够想到本文所描述技术方案的变化方案，并且该变化方案也在本发明的保护范围内。本发明的保护范围由随附权利要求所限定。

另外，应当理解，虽然本说明书通过实施方式来对本发明进行了描述，但是并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案。本说明书的这种叙述方案仅为清楚起见，本领域技术人员应当将本说明书当作一个整体，各个实施方式中的技术方案可以适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。