本发明属于生命科学技术领域，具体涉及一种改善听觉功能变异的康复训练系统及其康复训练方法。
背景技术：
由于铅会不可逆地影响发育中大脑的结构和功能，人受到铅暴露感染尤其是儿童时期铅中毒是一个严重而广泛的健康问题。当前，世界卫生组织(WHO)关于防止儿童铅中毒所列的指标中提出，安全的血液铅浓度为10ug/dl(WHO 1995)。最近研究表明，血液中铅浓度低于10ug/dl也会引起儿童认知障碍和学习能力缺陷，包括注意力缺陷性多动障碍、读写困难以及语言缺陷等(Lidsky and Schneider 2003；Braun et al.2006；Surkan et al.2007；Eubig et al.,2010；Zhang et al.2013；Grandjean and Landrigan 2014)。
低水平的铅暴露(低铅暴露)如何对儿童造成这些有害病征在很大程度上还未知。但这些在认知和行为上有病征的儿童在中枢听觉系统的信息处理上也存在缺陷(Wright et al.,1997；Nagarajan et al.,1999；Ahissae et al.,2001；Breier et al.,2003；Paterson et al.,2006)，表明了铅暴露与听觉信息处理、行为表现障碍之间存在着联系(Zhu et al.,2016)。在人类听觉研究中，低水平的铅暴露和听觉脑干反应的诱发以及听觉阈值的改变有关(Holdstein et al.,1986；Rothenberg et al.,2000)。动物研究也证明了低水平铅暴露会损害声音时间信息的编码，改变单胺能相关的表达，以及减少在听觉脑干上的电压依赖的阴离子通道数量(Jones et al.,2008；Fortune and Lurie 2009；Prins et al.,2010)。本发明人发现低水平铅暴露使大鼠听皮层的神经元重复率跟随能力和反应同步性发生退化(Zhu et al.,2016)。声音定位是听觉系统最重要的任务之一。许多行为学和生理学研究证明听皮层在声音空间信息的处理上发挥重要的作用。然而，低水平的铅暴露是否会损伤听皮层对声音空间信息的处理仍然未知。
目前关于铅中毒的治疗处理(如螯合作用治疗)对已经发生的神经发育缺陷没有有效的恢复作用(Murphy and Regan 1999；Rogan et al.2001；Lidsky and Schneider 2003；Bellinger 2008)。有趣的是，一些早期研究表明在成年动物上进行适当的行为学训练可以改变听皮层的反应动力学(Zhou and Merzenich 2007,2009；Zhang et al.,2013；Zhou et al.,2015；Zhu et al.,2016)。例如，对正常饲养的动物进行听觉方位分辨训练可以优化皮层空间代表区，提升皮层神经元的声音方位敏感性(Zhang et al.,2013)。调制噪声暴露造成的听皮层神经元空间调谐能力的逐步退化也可以被训练修复(Pan et al.,2011；Guo et al.,2012)。目前还不清楚的是，相同的行为学介入策略是否也可以恢复由神经毒物(如，铅)和不正常听觉经验所诱导的听皮层信息处理的改变。
现有技术中关于铅中毒的治疗处理(主要为螯合剂治疗)是通过降低血液中铅的浓度，以避免铅暴露的进一部危害。但是对已经诱导发生的神经发育缺陷及其行为异常没有有效的恢复作用(Murphy and Regan 1999；Rogan et al.2001；Lidsky and Schneider 2003；Bellinger 2008)。对于已经诱导发生的神经发育缺陷及其行为异常的修复或康复训练，至目前尚未见有报道。对于已经由于低浓度铅诱导出的神经系统问题，还没有一个很好的解决方法。
技术实现要素：
本发明首次提出了针对已经诱导发生的听觉神经发育缺陷或行为异常等实现有效的功能修复或康复的应用。本发明基于神经系统可塑性，利用听觉空间分辨训练任务诱导神经系统可塑性，通过感觉系统可塑性的提高来带动相关高级认知功能，改善神经系统问题。本发明提出一种使用无创的行为学方法改善低浓度铅引起的神经系统异常问题。
本发明提出了一种改善听觉功能变异的康复训练系统，包括：
康复训练空间，所述康复训练空间由一弧形隔音壁和一面或两面平面隔音壁围成，空间内包括听测原点位置和训练区域；
安装在所述弧形隔音壁上的至少一个声源装置；所述声源装置分布于所述弧形隔音壁的水平和/或垂直位置上；
用于探测被试者反应数据的探测装置，所述探测装置安装在所述康复训练空间内；
训练结果显示装置，其用于显示测试者反应的结果，所述训练结果显示装置安装在所述康复训练空间内；及
控制装置，其分别与所述声源装置、所述探测装置和所述训练结果显示装置通信，所述控制装置用于调控所述声源装置的运作，收集和分析所述探测装置的反应数据，及控制所述训练结果显示装置所显示的结果。
本发明提出的所述康复训系统中，各声源装置与所述听测原点位置之间所成的水平夹角为-90～90度，垂直夹角为0～60度；所述声源装置发出声音的频率范围是0.1-30kHz，强度为60～80dB/SPL，每次间隔为3s～2m。
本发明提出的所述康复训练系统中，所述被试者是大鼠、小鼠、豚鼠、猫、非人灵长类或人。
本发明提出的所述康复训练系统中，所述听觉功能变异的原因包括：低铅暴露导致的听觉功能变异；由噪音或药物引起的听觉功能问题；由自闭症、注意力缺陷性多动障碍、言语障碍引起的听觉功能变异。
本发明提出的所述康复训练系统中，所述听测原点位置处设有出发小室，所述出发小室与所述训练区域之间设有可开启的开关装置。
本发明提出的所述康复训练系统中，所述听测原点位置处设有触发区域，所述触发区域位于所述探测装置的探测范围内。
本发明提出的所述康复训练系统中，所述训练结果显示装置包括水嘴、供水装置和电磁阀，所述水嘴的数量与所述声源装置对应，分别位于每个声源装置的下方；所述供水装置与所述水嘴以管道连通，管道上设有所述电磁阀。
本发明提出的所述康复训练系统中，所述训练区域内设有挡板，所述挡板的数量与声源装置对应，所述挡板分别设置在每个声源装置的下方，所述挡板位于所述探测装置探测范围内。
本发明提出的所述康复训练系统中，所述康复训练空间外设有返回通道，所述挡板从所述训练区域中下降连接所述返回通道，所述返回通道的两端均连通至所述听测原点位置。
本发明提出的所述康复训练系统中，所述探测装置为可输入文字或数字的输入设备，以所述输入设备获得声源装置的位置信息作为反应数据。
本发明提出的所述康复训练系统中，所述探测装置为设置在被试者头部的方位探测仪，以所述方位探测仪获得被试者头部的转动角度和俯仰角度作为反应数据。
本发明还提出了一种改善听觉功能变异的康复训练方法，利用所述康复训练系统，所述康复训练方法包括如下步骤：
步骤一：所述控制装置向水平分布和/或垂直分布于所述弧形隔音壁上一个声源装置发送指令，控制所述声源装置发声；
步骤二：所述探测装置收集所述康复训练空间内的反应数据，并将反应数据发送至所述控制装置；所述反应数据为所述声源装置发声后在预设时间内所述康复训练空间中的声音、影像和/或信号。所述声音、影像和/或信号包括被试者输入的位置信息、被试者头部的转动角度和俯仰角度、被试者在康复训练空间内的位移、被试者位移所耗的时间等等。
步骤三：所述控制装置分析反应数据得到训练结果，将所述训练结果发送至训练结果显示装置；
步骤四：所述训练结果显示装置显示训练结果
本发明提出的所述康复训练方法中，步骤四之后进一步包括：所述控制装置统计所述训练结果的正确率，若正确率低于阈值则重新进行方位训练阶段，直至在预设时间内正确率高于正确率阈值时，终止康复训练。
本发明提出的所述康复训练方法，包括预训练阶段和方位训练阶段。所述预训练阶段是指让被试者熟悉康复训练空间的环境，尝试进行步骤一到步骤四的康复训练方法的流程，使其了解康复训练的流程和各装置的使用方式。方位训练阶中则进行步骤一到步骤四的康复训练流程，对被试者进行改善听觉功能变异的康复训练。
本发明中，所述“低浓度铅引起的听觉功能变异”主要体现在三个水平。第一，听觉方位行为学中，低浓度铅引起的动物听觉方位敏感性变差，在听觉训练任务中表现出不同于正常组动物的学习能力。第二，神经电生理水平，通过对大鼠大脑初级听皮层神经元的方位敏感性记录，可以看出在低浓度铅引起的动物听觉方位敏感曲线中，铅暴露动物的方位选择型神经元数量要显著低于正常动物。此外，本发明人用神经元最大反应50％所对应的方位角范围(AR)来描述所得到的方位选择曲线的宽度。AR值越小，代表方位选择曲线越窄，铅暴露组大鼠的AR分布相对于正常组大鼠发生了显著的右移，表明早期铅暴露导致方位选择曲线的调谐变宽，方位敏感程度降低。同样，在听觉系统电生理指标中，还应包括频率调谐能力的下降，听神经元重复刺激反应跟随能力的下降，这些指标都应在此列。第三，分子生物学水平，听觉相关蛋白的表达水平的异常表现均在此列。
本发明中，所述“低浓度铅引起的听觉功能变异”是指低铅暴露下(血铅浓度不高于10μg/dl)引起的听觉功能变异。临床研究中，对铅中毒有一个明确的定义，血铅浓度高于10μg/dl(WHO 1995)会产生铅中毒反应，造成中毒现象。一般来说，临床治疗中，对于这种症状的治疗首先要做的就是降低血铅浓度，医生会使用相应螯合剂来结合血液中的重金属铅，促进代谢，排除血铅。但是，由于铅引起的相关神经系统问题还没有被解决，比如儿童的认知障碍和学习能力缺陷，包括注意力缺陷性多动障碍，读写困难，以及言语缺陷等。同时，大量的研究发现，这些神经系统问题同样可以被小于10μg/dl的血铅含量所引发。临床中，更多的人认为这是一种亚健康状态，对此造成的后果却很少被关注。世界卫生组织(WHO)发布的有关儿童铅中毒指标显示，血液铅浓度在10ug/dl(WHO 1995)以内均为安全浓度。虽然如此，仍有研究表明低于此浓度也会引起神经系统认知障碍和学习能力缺陷。一方面，本发明的创新之处在于，探究当血铅水平低于公认的安全浓度，即不属于铅中毒范畴时，所可能引起的儿童认知障碍和学习能力缺陷。本发明中提到的造成听觉变异的诱发原因，对此做出解释。有多种多样的因素都会引起听觉系统的异常，比如噪音，药物引起的听觉问题，自闭症，注意力缺陷性多动障碍，言语障碍等等都具有这种类型的听觉变异。
一般认为，高强度噪音会引起正常人类的不良情绪甚至不好的生理反应，长期暴露在高强度噪音下对听觉系统的影响已经在临床中有目共睹。中等强度噪音在生活中比比皆是，中等强度噪音造成的听觉功能变异，主要包括表现在纯音分辨能力的下降，听觉系统序列声音分辨能力的下降，听空间分辨能力的下降，听觉阈值的上升，等等。
本发明提出经过听觉空间分辨训练可以改善由中等强度噪音所造成的听觉功能变异。中等强度噪音造成的听觉功能变异，包括在纯音分辨能力的下降，听觉系统序列声音分辨能力的下降，听空间分辨能力的下降，听觉阈值的上升，等等。
动物在发育过程中暴露在中等强度的连续噪音下，直到动物神经系统发育完成。成年时期，通过听空间分辨行为的测试，发现噪音暴露的动物正确分辨空间方位角所用的时间明显高于年龄匹配的正常饲养动物。尽管如此，通过长时间的空间分辨强化训练，噪音暴露后的成年动物对于空间方位角的分辨能力仍然可以达到正常动物的水平。同时，检测噪音暴露和噪音暴露后修复动物的听皮层相关蛋白的表达，可以看到，早期噪音暴露引起的中枢兴奋性与抑制性信息系统失衡，成年后可以通过听觉空间的强化训练，调节听皮层兴奋性和抑制性受体亚单位的表达，提高突触传递的效率，修复幼年不良的听觉环境造成的听空间分辨能力的变异。
本发明人通过对大鼠听皮层神经元方位敏感性的研究发现早期的低浓度铅暴露会影响听皮层神经元方位调谐能力，而通过听觉方位训练的方法能够使这种影响恢复到正常的水平。本发明人发现铅暴露会显著引起初级听皮层神经元声音方位调谐曲线变宽，调谐能力下降。声音方位分辨训练能够让铅暴露鼠的方位选择曲线更加接近于正常大鼠。这种皮层空间调谐能力的反转同时通过皮层PV中间神经元和某些兴奋与抑制性受体亚基共同作用完成。本发明研究揭示了强化训练可能治疗铅中毒引起的神经性变化，并提示听觉训练可能是治疗儿童铅中毒引起的行为缺陷的新方向。
本发明的有益效果在于：本发明的无创伤性，即使用行为学训练的方法，对动物本身没有任何伤害。经过训练的低浓度铅暴露动物，它的方位分辨能力可以完全恢复到正常动物的水平，甚至达到正常动物强化训练后的水平。本发明是建立在神经可塑性基础上的一种康复性训练系统及方法，不需要昂贵的仪器设备。本发明在诸多神经系统问题中都具有普遍试用性，而不仅是在低浓度铅暴露引起的神经系统问题中可以有很好的效果，其在中等强度噪音引起的听觉神经系统问题中，同样具有很好的效果。本发明方法能够优化听皮层频率代表区，调制低浓度铅暴露和中等强度噪音引起的听觉空间分辨功能退化。
铅暴露会引起初级听皮层神经元声音方位调谐曲线变宽，调谐能力下降，通过使用本发明康复训练系统及训练方法，这些能力可以通过声音方位分辨训练得以修复。分子水平上，通过使用本发明康复训练系统及训练方法，可以调节相关蛋白的表达。由于铅暴露引起的NR2a和NR2b的表达的下调，也可以通过本发明康复训练系统及训练方法而有所恢复。而且，通过使用本发明康复训练系统及训练方法，还会降低GABAAα2的表达的上调，修复铅暴露引起的GABAAβ2/3亚基的降低。
附图说明
图1是本发明康复训练系统的结构示意图。
图2是本发明康复训练方法的流程图。
图3是实施例1中康复训练系统的结构示意图。
图4是实施例2中康复训练系统的结构示意图。
图5是实施例2中康复训练系统的结构示意图。
图6是实施例3中康复训练系统的结构示意图。
图7是实施例3中康复训练系统的结构示意图。
图8是实施例4中弧形隔音壁及声源装置的设置示意图。
图9是声音-方位分辨表现得分。
图10是训练修复退化的皮层方位选择调谐曲线。
图11是皮层A1区PV表达。
图12是不同组别大鼠的皮层中NMDA NR2a和NR2b亚基的表达。
图13是抑制性受体亚基在皮层的表达。
图1-13中，1-康复训练空间，2-声源装置，3-探测装置，4-训练结果显示装置，5-控制装置，11-弧形隔音壁，12-平面隔音壁，13-出发小室，14-训练区域，15-开关装置，16-返回通道，17-挡板，18-触发区域，41-水嘴，42-供水装置，43-电磁阀。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
如图1所示，本发明改善听觉功能变异的康复训练系统包括：康复训练空间1、至少一个声源装置2、探测装置3、训练结果显示装置4和控制装置5。康复训练空间1由一弧形隔音壁11和一面或两面平面隔音壁12围成，空间内包括听测原点位置和训练区域14。声源装置2水平分布和/或垂直分布于弧形隔音壁11上。探测装置3安装在康复训练空间1内，用于探测被试者反应数据的探测装置3，反应数据为声源装置2发声后在预设时间内康复训练空间1中的声音、影像和/或信号。训练结果显示装置4同样安装在康复训练空间1内，用于显示训练结果。控制装置5分别与声源装置2、探测装置3和训练结果显示装置4通信，控制装置5用于调控声源装置2的运作，收集和分析探测装置3的反应数据，及控制训练结果显示装置4所显示的结果。
图2显示的是基于上述康复训练系统的改善听觉功能变异的康复训练方法。康复训练方法使用康复训练系统，按照下述方法改善被试者的听觉功能：
步骤一：控制装置5向水平分布和/或垂直分布于弧形隔音壁11上一个声源装置2发送指令，控制声源装置2发声；
步骤二：探测装置3收集康复训练空间1内的反应数据，并将反应数据发送至控制装置5；反应数据为声源装置2发声后在预设时间内康复训练空间1中的声音、影像和/或信号；
步骤三：控制装置5分析反应数据得到训练结果，将训练结果发送至训练结果显示装置4；
步骤四：训练结果显示装置4显示训练结果。
步骤四之后，控制装置5统计训练结果的正确率，若正确率低于阈值则重新进行方位训练阶段，直至在预设时间内正确率高于正确率阈值时，终止康复训练。
优选地，本发明康复训练方法法包括预训练阶段和方位训练阶段。预训练阶段是指让被试者熟悉康复训练空间的环境，尝试进行步骤一到步骤四的康复训练方法的流程，使其了解康复训练的流程和各装置的使用方式。方位训练阶中则进行步骤一到步骤四的康复训练流程，对被试者进行改善听觉功能变异的康复训练。
实施例1
本实施例1中，如图3所示，康复训练系统包括一康复训练空间1，康复训练空间1形成一隔音的区域。优选地，康复训练空间1为木制康复训练空间、金属制康复训练空间或混凝土制康复训练空间等。康复训练空间1的半径为50～500cm；优选的半径为150cm。康复训练空间1由一弧形隔音壁11两个平面隔音壁12构成，康复训练空间1包括位于圆心处设有的出发小室13和剩余的训练区域14，出发小室13作为听测原点位置，出发小室13的长宽高分别为10～30cm、5～10cm、5～10cm。优选地，出发小室13的长、宽、高分别是20cm、7cm、8cm。出发小室13与训练区域14之间设置可调控的开关装置15，优选地，设置一块透明有机玻璃形成一道可开关的门作为开关装置15。进一步地，康复训练空间1的内壁上贴有黑色隔音海绵，以隔绝来自外部声源的影响。
康复训练空间1的弧形隔音壁11上安装声源装置2，其数量不限，可以为一个或多个。声源装置2均匀分布于同一水平的位置上。声源装置2包括扬声器、蜂鸣器等可发声装置。声源装置2的设置位点与听测原点位置之间所成水平夹角为-40～40度。
康复训练空间1的弧形隔音壁11上安装水嘴41，其数量不限，可以为一个或多个。水嘴41对应地设置在声源装置2的正下方。水嘴41的后方与供水装置42连通，供水装置42包括水壶、水管等。水嘴41为训练结果显示装置4，以从水嘴41中是否得到供应的水作为训练结果。
本实施例中设置9个扬声器作为声源装置2和9个对应的水嘴41，按设置位点与听测原点位置的水平夹角每隔10度安装一个声源装置2以及相应的水嘴3。
水嘴41开关由电磁阀43控制，电磁阀43由控制装置5发出的指令调控。声源装置2的声音信号由控制装置5经放大器处理后发出，强度为70dB/SPL，频率范围是0.1-20kHz，时程为50ms的白噪音，每次间隔450ms，重复8次。控制装置5包括计算机、嵌入式系统、远程控制装置等具有数据读取和处理功能的装置，控制装置5可通过WIFI、蓝牙等无线信号或有线通信手段收集数据和发送信号。
进一步地，康复训练系统包括探测装置3。该探测装置3为悬于隔音空间上方的摄像机。摄像机可以捕捉被试者在隔音空间内的具体位置。优选地，为方便捕捉和判断被试者的位置，在被试者躯体上安装可探测的标记，例如，标记为可被探测到的高亮圆点。
当控制装置5指令其中的一个声源装置2响起时，打开透明有机玻璃使被试者从出发小室13进入训练区域14。被试者趋向该声源装置2及其下方的水嘴41。当且仅当被试者在预设时间内沿直线径向移动到对应水嘴41处，控制装置5调控电磁阀43开启向该水嘴41供水。本实施例1中预设时间为3秒，同时探测装置3按帧提取被试者的位置，被试者位置的连线构成反应数据。控制装置5收集反应数据后，将其与声源装置2和听测原点位置之间的连线对比，若判断被试者沿直线径向移动到对应水嘴41处且耗时小于3秒，则被试者从水嘴41处喝到水；若判断被试者未能沿直线径向移动到对应水嘴41处，或耗时大于等于3秒，控制装置关闭对应的电磁阀43，则被试者无法从水嘴41处喝到水。
利用训练康复装置的过程中，被试者(动物)体重不低于正常体重水平的90％。本实施例中，被试者(动物)是鼠。被试者(动物)还可以是大鼠、小鼠、豚鼠、猫等其他实验动物。
使用康复训练系统的行为学训练过程，包括两个阶段：预训练阶段、方位训练阶段。
预训练阶段，约需进行7天时间。被试者动物由出发小室13出发，可在训练装置中自由活动，适时给予水和声音刺激，使动物能够找到水嘴41的位置，并且学习到通过听到声音来获得饮水。预训练目的是让被试者动物熟悉训练环境，并认清水嘴41的位置。
方位训练阶段，每次训练开始后，动物处于出发小室13中，头朝正前方。然后，由随机方向的某一个扬声器发出声音信号，动物从出发小室13出发起3秒之内辨识该正确的方位并跑到正确的水嘴41位置，方可获得饮水。若动物跑向错误的方向或超过3秒未到达正确的水嘴41位置，则不能获得饮水。当训练正确率达到80％以上，且在此水平保持5天以上，则康复训练完成。训练效果可通过检测正确率和反应时长来作为评价指标。
实施例2
本实施例2中，康复训练系统的基本情况与实施例1中相同，不同之处如下。被试者(动物)是鼠。被试者(动物)还可以是大鼠、小鼠、豚鼠、猫等其他实验动物。
进一步地，在扇形结构1的外围设置一返回通道16，如图4所示。返回通道16的底部低于训练区域14的底部，呈凹陷，被试者动物从该返回通道16回到出发小室13。
进一步地，在每一个声源装置2及对应水嘴41的下方的底部(地板)上设置一个挡板17，打开挡板可以让被试者(动物)通往返回通道16，离开训练区域14。
使用康复训练系统的行为学训练方法包括预训练阶段、方位训练阶段，同实施例1。
在一具体实施方案中，如图4所示，康复训练系统的康复训练空间1为圆心角成90°的扇形结构，每间隔10°设置一个喇叭及对应的水嘴。间隔角度的大小可以任意调整，不受限制。
在一具体实施方案中，如图5所示，康复训练系统的康复训练空间1为圆心角成180°半圆形结构，每间隔10°设置一个喇叭及对应的水嘴。间隔角度的大小可以任意调整，不受限制。
实施例3
康复训练系统的康复训练空间1为一全封闭的扇形空间或半圆形空间，包括由一弧形隔音壁11与一个或两个平面隔音壁12围成。本实施例中的康复训练系统不设置出发小室13，以圆心角处作为听测原点位置。隔音壁可以是内壁上贴有黑色隔音海棉的木制结构。扬声器和水嘴41的设置分布及数量可参照实施例1、2。
本康复训练系统实现全程自动化智能化。水嘴41开关由电磁阀42控制，全部的训练区域14均在探测装置3监控范围内，通过编写的I/O采集卡的相关程序，配合视频轨迹追踪软件，让控制装置5自动控制扬声器给出的声音信号，经放大器放大后发出强度为70dB/SPL，频率范围是0.1-20kHz，时程为50ms的白噪音，每次间隔450ms，重复8次。训练过程中保证动物体重不低于正常水平的90％。软件是带有硬件接口的视频跟踪软件，控制装置5通过视频采集卡监视动物在训练区域14内的活动轨迹。
本康复训练系统中于听测原点位置处设有一个触发区域18，如图6所示，该触发区域(编号)呈同心扇形，其半径为20cm。其形状和尺寸大小可调整，不受限制。该触发区域的设置位点即为实施例1和2中的出发小室的位置。
当被试者动物进入该触发区域之时，由软件给予I/O采集卡脉冲指令，触发任意角度扬声器发出声音，动物听到声音在3s内做出反应，前往发出声音信号的扬声器。在每一个扬声器区域都设置有识别区域(编号)，识别区域的大小可调整，不受限制，优选地，该识别区域的尺寸为10cm*20cm。当动物从触发区域(编号)出发，进入该识别区域(编号)时，触发给水。当在声音信号发出的3s之内，被试动物没有到达该识别区域的，则不给水。
控制装置5的软件程序利用stoelting公司的anymaze软件实现轨迹追踪与区域识别，配合硬件可使用NI(National Instrument)公司生产的I/O采集卡实现数模转换与自动控制，并由labview语言编程实现。
利用本康复训练系统进行的行为学训练，包括预训练阶段和方位训练阶段。
预训练阶段中，被试动物在康复训练空间1中自由活动，随机进入触发区域18，触发任意角度的某一个扬声器给出声音，动物听到声音，辨识该声音的方位，找到该声源装置2正下方的水嘴41的位置。经一段时间适应，被试动物逐渐学习进入触发区域18，听到声音，获得饮水，建立这一系列反射。
方位训练阶段中，每次训练开始后，完成一次反射计为一次试验(trial)，每天可以控制试验次数或训练时间。最后计算动物训练成功率，当训练正确率达到80％以上，并在此水平保持5天以上，则定义为康复训练完成。
进一步地，还可以定义动物从听到声音后到获得饮水的反应时间，记录动物运动轨迹。动物反应时间可以反应其海马相关的空间认知能力，对动物运动轨迹的分析同样可以衡量动物的注意力水平。
在一个具体实施方案中，如图6所示，康复训练系统的箱体为180°扇形封闭结构，每间隔10°设置一个扬声器及对应的水嘴。扬声器及水嘴的间隔角度、分布、数量等均可任意调整。
在一个具体实施方案中，如图7所示，康复训练系统的箱体为45°扇形封闭结构，每间隔10°设置一个扬声器及对应的水嘴。扬声器及水嘴的间隔角度、分布、数量等均可任意调整。
实施例4
本实施例4中，康复训练系统包括一康复训练空间1，康复训练空间1形成一隔音的区域。优选地，康复训练空间1为木制康复训练空间、金属制康复训练空间或混凝土制康复训练空间等。康复训练空间1的半径为80～500cm；优选的半径为250cm。康复训练空间1由一弧形隔音壁11两个平面隔音壁12构成，康复训练空间1包括位于圆心处设有的听测原点位置及训练区域14。进一步地，康复训练空间1的内壁上贴有黑色隔音海绵，以隔绝来自外部声源的影响。
康复训练空间1的弧形隔音壁11上安装声源装置2，其数量不限，可以为一个或多个。声源装置2均匀分布于弧形隔音壁11上不同水平与垂直平面上。声源装置2包括扬声器、蜂鸣器等可发声装置。声源装置2的设置位点与听测原点位置之间所成水平夹角为-90～90度，垂直夹角成0～60度。每个声源装置2旁按分布位置标明如图8所示的序号。
进一步地，康复训练系统包括探测装置3。探测装置3为一种手持设备或操作屏幕，其可输入声源装置2的序号作为反应数据。训练结果显示装置4为集成设置在探测装置3上显示灯，以显示灯的颜色或亮灭表示训练结果。其中，声源装置2、探测装置3和训练结果显示装置4均与控制装置5连接。当控制装置5指令一个声源装置2响起时，被试者在听到声响并对声响声源位置做出判断，在探测装置3中输入对应方位的声源装置2的序号。当被试者在预设时间内输入正确的对应声源装置2的序号，控制装置5发出指令使显示灯亮起。本实施例中预设时间为3秒，若在3秒内无法输入正确的序号，或者3秒内输入了错误的序号，则显示灯亮起红灯或熄灭表示结果错误。
实施例5
本实施例5中，康复训练系统包括一康复训练空间1，康复训练空间1形成一隔音的区域。优选地，康复训练空间1为木制康复训练空间、金属制康复训练空间或混凝土制康复训练空间等。康复训练空间1的半径为80～500cm；优选的半径为250cm。康复训练空间1由一弧形隔音壁11两个平面隔音壁12构成，康复训练空间1包括位于圆心处设有的听测原点位置及训练区域14。进一步地，康复训练空间1的内壁上贴有黑色隔音海绵，以隔绝来自外部声源的影响。
康复训练空间1的弧形隔音壁11上安装声源装置2，其数量不限，可以为一个或多个。声源装置2均匀分布于弧形隔音壁11上不同水平与垂直平面上。声源装置2包括扬声器、蜂鸣器等可发声装置。声源装置2的设置位点与听测原点位置之间所成水平夹角为-90～90度，垂直夹角成0～60度。
进一步地，康复训练系统包括探测装置3。探测装置3为被试者头上背带的方位探测仪，方位探测仪由三轴加速度触感器和陀螺仪传感器构成，用于捕捉被试者头部的转动角度和俯仰角度作为反应数据。训练结果显示装置4为设置在隔音空间内的指示灯，以指示灯的颜色或亮灭表示训练结果。其中，声源装置2、探测装置3和训练结果显示装置4均与控制装置5连接。当控制装置5指令一个声源装置2响起时，被试者在听到声响并对声响声源位置做出判断，将头转向对应声源装置2的方位。当被试者在预设时间内的头部转向正确的对应声源装置2的方向，即控制装置5收集反应数据后确认被试者头部朝向与对应声源装置2的角度相配合，控制装置5发出指令使显示灯亮起。本实施例中预设时间为3秒，若在3秒内转向正确的方向，则指示灯亮起红灯或熄灭表示结果错误。
(行为学的效果实验)
图9中显示的是声音-方位分辨表现得分情况。图9A所示为实验时间轴，其中，铅暴露后训练组大鼠在出生后第1天～第21天之间接受低水平铅暴露；正常动物后训练组大鼠则接受正常环境；铅暴露组和正常动物后训练组大鼠从出生后的第56天(p56)开始，都被训练完成大约30天的声音-方位分辨任务。铅暴露后训练组大鼠在其出生后第9天的平均血铅浓度为7.9±0.1μg/dl，出生后第21天平均血铅浓度为8.2±0.1μg/dl，而在出生后第40天没有检测出血铅。图9B所示为铅暴露后训练组(灰色线条，N＝8)和正常动物后训练组(黑色线条，N＝11)的声音-方位分辨任务的标准得分情况，虚线分别代表最大得分的60％和75％。图9C所示为铅暴露后训练组和正常动物后训练组两组每天的标准得分平均值(mean±SEM)。*,p<0.05-0.00001.图9D所示为铅暴露后训练组和正常动物后训练组第56天(p56)开始训练时的表现得分，每一组的动物被训练时表现得分达到60％(最高)或75％(最低)；柱状图代表不同组的平均值(±SEM)；*,p<0.005。
(被试者在声源方位分辨任务中的表现)
铅暴露后训练组和正常动物后训练组大鼠接受学习训练时，使其依据喇叭发出的声音去辨别对应的声源方位角，然后去舔相对应的水嘴而获得水奖赏。训练在出生后第56天开始(即，铅暴露结束后5周)，两组动物都训练30天的声音-方位分辨任务(图9A)。图9B显示的是两组动物的学习训练曲线，正常动物后训练组的大鼠比铅暴露后训练组的大鼠在接受学习训练任务过程中表现的更加优秀，体现在用时少，准确率高两方面。虽然两组大鼠在声源方位分辨任务中的准确率随着训练的进行均有显著地提升，但是在训练的第10天到第24天之间，铅暴露后训练组大鼠(灰色线条)的平均表现显著低于正常动物后训练组大鼠(黑色线条)(图9C，t-test,p<0.05-0.00001)。由图9D可以看出，铅暴露后训练组大鼠在30天的声音-方位分辨任务中的准确率达到60％和75％分别平均需要15.0±4天和20.9±1.7天，两者都大于正常组大鼠的(9.6±2.8天和11.6±1.9天(t-test,均p<0.004)。上述结果表明，铅暴露后训练组大鼠的声源方位分辨能力低于正常动物后训练组大鼠。
(听皮层神经元电生理特性的变化)
皮层记录均在有双层墙体的声音屏蔽室内进行。对实验动物进行戊巴比妥钠麻醉后暴露颅骨，将一根长约2cm的铁钉用牙科水泥粘于颅骨处。随后利用铁钉将大鼠头部固定在支架上，使其正对于前侧听空间的水平0°和垂直0°。
纯音刺激(升降时间5ms，包络持续时间50ms)由一个距离动物头部34cm的扬声器给出。扬声器可在动物前方水平方位±90°(垂直方位0°)听空间范围内通过微型马达自由移动，并由远处的控制系统控制。采用灌注3mol/l的KCl溶液的玻璃微电极(阻抗在3-10MΩ)在动物初级听皮层(A1)进行记录。听觉刺激首先从位于记录位点对侧30°(简写为c30°)的扬声器给出。利用A1区独特的从头侧到尾侧的拓扑分布，以及对选择性频率的短音具有可靠的神经元反应来确定其区域(Polley et al.,2006,2007；Zhou et al.,2009)。当找到一个稳定放电的神经元后，确定它的特征频率和最低阈值。在记录位点的对侧90°及同侧90°(简写为I90°)的范围内，以10°的梯度分别记录该神经元在特征频率(声强设置在神经元最低阈值以上10dB)下的发放数目。特征频率的声音在每个方位角度给予32次，根据每个方位上神经元对特征频率声音刺激的发放数目(已经过自发电活动的校正)的不同，绘制该神经元的方位敏感性曲线。
记录过程中，用微量注射泵通过腹腔插管连续注射低剂量戊巴比妥纳维持麻醉，通过反馈式电热毯维持动物体温保持在37摄氏度。
(实验结果)
图10显示的是训练修复退化的皮层方位选择调谐曲线。图10A所示为不同组大鼠的实验时间轴。对照组大鼠被动暴露于与铅暴露后训练组大鼠相同的铅暴露环境中，并被动接受训练，但是对照组大鼠不参与分辨任务。图10B所示为正常组大鼠有代表性的方位选择调谐曲线。这些曲线包括方位选择型、多峰型、半峰型和非选择型。方位选择型曲线的尖端向下50％被认为是AR(zimuth range，方位角范围)。水平虚线代表最大值的50％。c或者i代表对侧与同侧的记录位点。图10C所示为ARs累计频率曲线。图10D所示为特征频率范围在低频率(<10kHz)、中频率(10-20kHz)和高频率(>20kHz)的平均ARs；图中数值为平均值±SME.*，p<0.05-0.001。
(皮层神经元的声源方位选择性)
训练结束后，记录阈上10分贝铅暴露后训练组大鼠的皮层方位选择曲线(例如不同方位角度的神经元发放率)，然后分别与对照组、铅暴露组以及正常组同龄大鼠进行比较(图10A)。对皮层的中间细胞层的神经元进行记录，7只铅暴露后训练组大鼠中记录到162个神经元，6只对照组大鼠中记录到163个神经元，7只铅暴露组大鼠中记录到179个神经元以及6只正常组大鼠中记录到173个神经元。除非另有说明，以下所有量化分析都是基于这些数据样本。
记录得到的方位选择曲线可以分为方位选择型、多峰型、半峰型和非选择型(图10B)。表1归纳了4组大鼠的不同类型方位选择曲线的分布，铅暴露组和对照组大鼠的方位选择型神经元百分比分别为56.4％和57.1％，均低于正常组大鼠的63.6％相比。然而，铅暴露后训练组大鼠的方位选择型神经元百分比为75.3％，高于铅暴露组大鼠的56.4％，甚至高于正常组大鼠的63.6％。铅暴露后训练组、铅暴露组和正常组大鼠的非选择型神经元的分布水平持平，对照组大鼠则略高。
本发明人用神经元最大反应50％所对应的方位角范围(AR)来描述所得到的方位选择曲线的宽度(图10B)。AR值越小，代表方位选择曲线越窄。如图10C，铅暴露组大鼠的AR分布相对于正常组大鼠发生了显著的右移(Kruskal-Wallis with post hoc Dunn’s test,p<0.05)，表明早期铅暴露导致大鼠方位选择曲线的调谐变宽。然而，铅暴露后训练组大鼠的AR分布相对于铅暴露组大鼠发生了显著的左移(Kruskal-Wallis with post hoc Dunn’s test,p<0.05)，并且与正常组大鼠没有显著差异(Kruskal-Wallis with post hoc Dunn’s test,p>0.05)。这些数据表明，训练完全恢复了铅暴露后训练组大鼠的方位选择调谐能力。对照组大鼠的AR分布和铅暴露组大鼠的方位选择调谐能力没有显著差异(Kruskal-Wallis with post hoc Dunn’s test,p>0.05)，表明被动的、未引起注意的声音的输入，对于皮层神经元的声源方位调谐能力没有影响。
另外，本发明人将不同组大鼠的AR按照特征频率CF(characteristic frequency，特征频率)的不同范围进行比较，小于10kHz为低频，10-20kHz为中频，大于20kHz为高频(图10D)。铅暴露组大鼠的平均AR在三个频率段都大于正常组大鼠(ANOVA with post hoc Student-Newman-Keuls test，中频和高频p<0.05，但低频p>0.05)。铅暴露后训练组大鼠在中频和高频两个频率段的平均AR显著小于铅暴露组大鼠(ANOVA with post hoc Student-Newman-Keuls test，中频和高频p<0.01，低频p>0.05)，但在低频段，铅暴露后训练组大鼠的平均AR与铅暴露组大鼠无显著差异(ANOVA with post hoc Student-Newman-Keuls test，p>0.05)；在三个频率段，铅暴露后训练组与正常组大鼠近似(ANOVA with post hoc Student-Newman-Keuls test，所有p>0.05)。
四组大鼠的皮层神经元的CF分布没有显著差异(Kruskal-Wallis test,p＝0.64)。每个频率段的神经元的反应阈值也没有显著差异(ANOVA,所有p>0.05)。因此，铅暴露和接下来的训练都没有影响到皮层反应阈值。
(听皮层神经元相关可塑性蛋白的变化)
取样：动物分为LE组(lead exposure，铅暴露组)、EXP组(实验组)、PT组(passive training，被动训练组)和CON组(对照组)，各组动物年龄基本一致。腹腔注射戊巴比妥钠(75mg/kg.BW)麻醉动物，打开胸腔，进行心脏体循环灌流，先用0.9％(质量百分比，下同)生理盐水快速灌流10min，再用4％多聚甲醛灌流30min。断头取脑组织，放入4％多聚甲醛中固定2h。之后放入20％蔗糖-PBS溶液中脱水过夜。待组织块下沉至蔗糖-PBS溶液底部，取出组织块在液氮中速冻，放入-80℃保存。使用莱卡冰冻切片机对脑组织进行冠状切片，切片厚度30μm，放入盛有PBS溶液的24孔板中，4℃保存。
免疫组化：从4℃冰箱中拿出所需切片，PBS漂洗3次，每次5min，置于封闭液(0.3％Triton，5％BSA，PBS配制)中室温封闭2h，加一抗anti-BDNF(anti-brain derived neurotrophic factor，抗脑源性营养因子抗体，是一种特异抗体)(Millipore，1：200，5％BSA-PBS稀释)(Millipore为公司名称，BSA-PBS为牛血清白蛋白，其中PBS为磷酸缓冲液)、anti-Parvalbumin(抗小白蛋白抗体)(Sigma，1:2000，5％BSA-PBS稀释)，4℃孵育24h-48h，之后PBS漂洗3次，每次10min，加荧光二抗AlexaFluor 488(488表示荧光波长，单位nm，是一种荧光二抗)，1:2000，PBS稀释)，室温避光孵育2h，之后PBS漂洗3次，每次10min，将切片贴至载玻片上，滴加DAPI(封片剂)，封片，避光保存。参照大鼠脑定位图谱，在莱卡荧光显微镜下对听皮层进行观察拍照。
蛋白质印迹(Western blot)
蛋白质样品制备：蛋白质样品分别来自LE组、EXP组、PT组和CON组，各组动物年龄基本一致。腹腔注射戊巴比妥钠(75mg/kg)麻醉动物，迅速断头取脑组织，将分离出的听皮层(auditory cortex，AC)放入匀浆液中，利用玻璃匀浆器冰上匀浆，静置30min后离心10min，取上清，加入1％SDS稀释，沸水浴5min，然后置于-80℃冰箱保存。
蛋白质印迹：组装制胶装置，配制7.5％分离胶、5％浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳(Bio-rad电泳仪)，蛋白上样量为每泳道40μg～120μg蛋白，上样体积为每泳道6μL～20μL。浓缩胶电泳需要60V、25min，分离胶电泳需要120V、90min。电泳完成后，凝胶需要在电转缓冲液中浸泡30min才能转移到NC膜(醋酸纤维膜，PALL)上。不同目标蛋白，电泳时间不同。小分子量蛋白(GABAA受体亚基α3、β2/3)电转需要120V、30min，中分子量蛋白(GluR2、GAD67)电转约为100V、60min，大分子量蛋白(NMDA受体亚基2A、2B)电转需要120V、120min至180min。电转完成后，将携带目标蛋白的NC膜浸入封闭液(5％脱脂奶粉，TBST配制)中室温封闭120min，然后加入一抗anti-GAD67(Millipore，1:200，封闭液稀释)、anti-NMDAR2A(Millipore，1:2000，封闭液稀释)、anti-NMDAR2B(Millipore，1:2000，封闭液稀释)、anti-GABAA receptorα3(Millipore，1:200，封闭液稀释)、anti-GABAA receptorβ2/3(Millipore，1:200，封闭液稀释)，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，加入HRP标记的二抗(Millipore，1:2000，封闭液稀释)，室温孵育120min，之后TBST漂洗3次，ECL试剂(Millipore)反应，显影，拍照。
(PV神经元的表达变化)
图11显示的是皮层A1区PV表达。图11A所示为铅暴露后训练组，对照组，铅暴露组和正常组动物的PV阳性神经元免疫荧光图片。标尺范围100μm。图11B所示为不同组别大鼠的A1区域中PV表达的定量统计。(数值为平均值±SEM，和正常组大鼠的标准一致。*,p<0.05-0.001)。
对不同组大鼠的皮层A1区域中PV的表达进行了检测。免疫组化分析表明，与正常组大鼠相比，铅暴露组大鼠的不同皮层之间PV阳性神经元(PV+)的浓度都有显著降低(图11A，铅暴露组和正常组，和图11B；ANOVA with post hoc Student-Newman-Keuls test，所有p<0.01)。训练能够修复这种差异，铅暴露后进行训练的大鼠PV阳性神经元，在不同皮层间的浓度都与正常组大鼠持平(图11A，铅暴露后训练组和正常组，和图11B；ANOVA with post hoc Student-Newman-Keuls test,所有p>0.05)。然而，对照组大鼠PV阳性神经元的浓度和铅暴露组大鼠PV阳性神经元的浓度持平(图11A，对照组和铅暴露组，和B；ANOVA with post hoc Student-Newman-Keuls test,所有p>0.05)，但是比正常组大鼠中PV阳性神经元浓度低(图11A，对照组和正常组，和图11B；ANOVA with post hoc Student-Newman-Keuls test)，从图中可知，对皮层II-III和IV层的统计结果显示P值大于0.05，没有显著差异，但是第V和VI层P值小于0.001，表现出极显著差异。
(兴奋性和抑制性受体亚基在皮层的表达)
图12显示的是不同组别大鼠的皮层中NMDA NR2a(左)和NR2b(右)亚基的表达。上图是Western blots结果。误差条代表SEM.*,p<0.05-0.001。
图13显示的是抑制性受体亚基在皮层的表达。其中，图13A所示为不同组别大鼠的GABAAα2亚基表达。上图是Western blots结果；误差条代表SEM.*,p<0.01-0.001。图13B所示为GABAAβ2/3亚基表达水平。*,p<0.05-0.01。
本发明人首先利用定量免疫印迹计算了NMDA受体亚基NR2a和NR2b在不同组大鼠的皮层中的表达。如图12所示，与正常组大鼠相比，铅暴露大鼠的NR2a和NR2b表达水平都有显著的降低(one-way ANOVA with Student-Newman-Keuls post hoc test,两者p<0.001)。训练能够增加两种亚基的表达，铅暴露后训练组和正常组的情况无显著差异(one-way ANOVA with Student-Newman-Keuls post hoc test,两者p>0.05)。然而，对照组大鼠中NR2a和NR2b表达水平都比在正常组大鼠中要低(one-way ANOVA with Student-Newman-Keuls post hoc test,两者p<0.05)。因此，由于铅暴露引起的NR2a和NR2b的表达的下调都可以通过后续的训练得到恢复。
定量免疫印迹表明，就抑制性受体亚基来说，铅暴露组和对照组大鼠的GABAAα2亚基表达与正常组大鼠相比都有显著升高(图13A；ANOVA with post hoc Student-Newman-Keuls test,两者p<0.001)。训练会降低α2表达的上调，铅暴露后训练组大鼠中α2的表达水平比正常组大鼠的要低(ANOVA with post hoc Student-Newman-Keuls test,p<0.01)。相反，与正常组大鼠相比，铅暴露会降低GABAAβ2/3亚基的表达(图13B；ANOVA with post hoc Student-Newman-Keuls test,p<0.01)。这个结果又一次被行为训练所修复，铅暴露后训练组大鼠中β2/3的表达水平和正常大鼠中的β2/3表达持平(ANOVA with post hoc Student-Newman-Keuls test,p<0.01)。对照组大鼠中α2和β2/3的表达水平与在铅暴露组大鼠中的表达持平(ANOVA with post hoc Student-Newman-Keuls test,两者p>0.05)，但是与正常组大鼠不同(ANOVA with post hoc Student-Newman-Keuls test,α2的p<0.001，但是β2/3的p<0.05)。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。