技术领域
本发明涉及抗肿瘤治疗领域。具体地，其涉及溶瘤病毒抗肿瘤治疗。
背景技术：
PVS-RIPO是溶瘤脊髓灰质炎病毒(PV)重组体。它由含有人鼻病毒2型(HRV2)的异质内部核糖体进入位点(IRES)的活减毒1型(Sabin，萨宾)PV疫苗组成。IRES是一种顺式作用遗传因子，其位于PV基因组的5′非翻译区，介导病毒、m7G-帽独立的翻译。该病毒在人体内表现出令人兴奋的疗效迹象。尽管如此，本领域仍然需要确定和开发更有效且对更多人有效、特别是对于患有脑肿瘤的患者有效的抗癌治疗。
技术实现要素：
根据本发明的一个方面，提供了一种治疗患者肿瘤的方法。向患者施用嵌合脊髓灰质炎病毒构建体。该构建体在所述脊髓灰质炎病毒的四叶草和所述脊髓灰质炎病毒的开放阅读框之间的所述脊髓灰质炎病毒的5′非翻译区中包含具有人鼻病毒2(HRV2)内部核糖体进入位点(IRES)的脊髓灰质炎病毒萨宾I型菌株。免疫检查点抑制剂也可以在同一时间或约30天内向患者施用。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于治疗肿瘤的试剂盒。该试剂盒包含：嵌合脊髓灰质炎病毒构建体，所述构建体在所述脊髓灰质炎病毒的四叶草和所述脊髓灰质炎病毒的开放阅读框之间的所述脊髓灰质炎病毒的5′非翻译区中包含具有人鼻病毒2(HRV2)内部核糖体进入位点(IRES)的脊髓灰质炎病毒萨宾I型菌株；和免疫检查点抑制剂。
根据本发明的另一方面，提供了嵌合脊髓灰质炎病毒构建体和免疫检查点抑制剂的组合用作药物或用于治疗肿瘤，其中，所述嵌合脊髓灰质炎病毒构建体在所述脊髓灰质炎病毒的四叶草和所述脊髓灰质炎病毒的开放阅读框之间的所述脊髓灰质炎病毒的5′非翻译区中包含具有人鼻病毒2(HRV2)内部核糖体进入位点(IRES)的脊髓灰质炎病毒萨宾I型菌株；和免疫检查点抑制剂。
本领域技术人员在阅读说明书后显而易见的这些和其它方面为本领域提供了用于治疗癌症的新治疗方案。
附图说明
图1描绘了实验方式。
图2显示出使用了代表乳腺癌、黑素瘤和前列腺癌的四种不同肿瘤细胞系的结果。将DC接种在培养皿中。将来自癌细胞裂解物的上清液加入到DC培养物中并温育。然后去除上清液并洗涤DC。将DNA酶I处理的外周血单核细胞(PBMC)在37℃下温育。收获非贴壁细胞，并在响应细胞与刺激物DC比率为10∶1和在CTL刺激培养基中存在IL-7的条件下，用装载有脊髓灰质炎病毒诱导的肿瘤裂解物的DC刺激非贴壁细胞。在第12-14天收获T细胞，计数并在铕释放CTL测定中用作效应子T细胞。使用转染有相关和不相关肿瘤抗原编码mRNA的自体DC作为靶标对照。对于DC靶标对照，收获mRNA电穿孔的靶标细胞，洗涤以除去所有培养基的示踪剂并用铕(Eu)标记。可选地，用Eu标记原始靶标细胞(Sum149，MDAMB231，LNCaP或DM6)。将不同E∶T比率的一万个铕标记的靶标(T)和效应子细胞(E)的系列稀释液在96孔V底板中温育。将平板在37℃下离心3分钟并在37℃下温育。收获50μl上清液并加入到96孔平底板的150μl增强溶液中，使用VICTOR3多标记计数器(Perkin-Elmer)通过时间分辨荧光测量铕释放。使用下式确定具体的细胞毒活性：％特异性释放＝[(实验释放-自发释放)/(总释放-自发释放)]×100。靶标细胞的自发释放小于清净剂总释放的25％。通过在不含T细胞的培养基中温育靶标细胞以确定靶标细胞的自发释放。所有测定一式三份进行，条代表平均％裂解，误差条代表SEM。
图3显示了使用各种治疗(包括类似于本发明的组合的脊髓灰质炎病毒和检查点抑制剂治疗)在C57816小鼠中使用CT2A神经胶质瘤的小鼠肿瘤模型的体内测试结果；小鼠和CT2A细胞均表达人脊髓灰质炎病毒受体CD155。结果(随着时间推移的肿瘤体积)以及下列实验处理显示在上图中：组I(蓝色)：DMEM(控制病毒的载体)+IgG(控制抗PD1)；组II(灰色)：单次瘤内注射PVSRIPO+IgG；组III(橙色)：单次瘤内注射DMEM+抗PD1；第IV组(金色)：单次瘤内注射PVSRIPO(“mRIPO”)+抗PD1。通过腹膜内注射分3次(第3，6，9天)给予抗PD1。三个下图显示了治疗组II-IV中的个体小鼠(每个系为不同的小鼠)的肿瘤响应(随着时间的肿瘤体积)。
具体实施方式
本发明人开发了一种组合治疗方案，其中，向人施用病毒构建体和免疫检查点抑制剂。由于脊髓灰质炎病毒是潜在的病原体，因此，必须采取额外的预防措施以确保不会将致病因子引入受试者。使用良好的制造程序和纯化，制备了足够纯的制剂以允许引入人中。
可以使用任何向肿瘤直接施用病毒制剂的技术。直接施用不依靠血脉管系统进入肿瘤。制剂可以涂在肿瘤表面上，注射到肿瘤中，在手术过程中滴入肿瘤位置内或上，通过导管输液到肿瘤中等。可以使用的一种特殊技术是对流增强的递送。
根据本发明可以使用的免疫检查点抑制剂是任何破坏细胞毒性T细胞和肿瘤细胞的抑制性相互作用的抑制剂。这些包括但不限于抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA4抗体、抗LAG-3抗体和/或抗TIM-3抗体。美国批准的检查点抑制剂包括易普米单抗(ipimilumab)、潘利珠单抗(pembrolizumab)和尼伏单抗(nivolumab)。抑制剂不需要是抗体，而可以是小分子或其它聚合物。如果抑制剂是抗体，则它可以是多克隆、单克隆、片段、单链或其它抗体变体构建体。抑制剂可以靶向本领域已知的任何免疫检查点，包括但不限于CTLA-4，PDL1，PDL2，PD1，B7-H3，B7-H4，BTLA，HVEM，TIM3，GAL9，LAG3，VISTA，KIR，2B4，CD160，CGEN-15049，CHK1，CHK2，A2aR和B-7家族的配体。可以使用针对单个靶免疫检查点的抑制剂或针对不同免疫检查点的不同抑制剂的组合。此外，CSF-1R阻断剂可以组合使用或作为免疫检查点抑制剂的替代物，以确保有效消除远处转移和复发性肿瘤的有效性和持续免疫力的产生。CSF-1R特异性抗体或者抑制或阻断CSF-1R的药物可用于此目的，包括但不限于伊马珠单抗(imactuzumab)和AMG820。
免疫检查点抑制剂可以与脊髓灰质炎病毒同时施用、在其之前施用或在其之后施用。通常这两种试剂会在彼此间30天、28天、21天、14天、7天、4天、2天或1天内施用。所述试剂可以连续地重复给用，或者以第一试剂和第二试剂循环地重复给用。在检查点抑制剂之前施用疫苗可能是有利的，但不是必需的。但是也可以使用相反的顺序。通过病毒构建体启动细胞毒性T淋巴细胞应答可能需要约5天至约14天。检验点抑制剂的施用可有利地在启动期期间或之后开始。
免疫检查点抑制剂可以通过本领域已知的用于特定抑制剂的任何适当手段施用。这些包括静脉内、口服、腹膜内、舌下、鞘内、腔内、肌肉内和皮下。任选地，免疫检查点抑制剂可以与脊髓灰质炎病毒试剂组合施用。
可以治疗任何人肿瘤，包括小儿和成人肿瘤。肿瘤可以在任何器官中，例如脑、前列腺、乳房、肺、结肠和直肠。可以治疗各种类型的肿瘤，包括例如胶质母细胞肿瘤，成神经管细胞肿瘤，恶性上皮肿癌，腺癌等。其它肿瘤实例包括肾上腺皮质癌，肛门癌，阑尾癌，I级(间变性)星型细胞肿瘤，II级星型细胞肿瘤，III级星型细胞肿瘤，IV级星型细胞肿瘤，中枢神经系统非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤，基底细胞癌，膀胱癌，乳腺肉瘤，支气管癌，支气管肺泡癌，宫颈癌，颅咽管肿瘤，子宫内膜癌，子宫内膜子宫癌，室管膜母细胞瘤，室管膜瘤，食管癌，成感觉神经细胞瘤，尤文氏肉瘤，颅外生殖细胞肿瘤，外生殖细胞肿瘤，肝外胆管癌，纤维组织细胞肿瘤，胆囊癌，胃癌，胃肠类癌肿瘤，胃肠道间质肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，神经胶质肿瘤，头颈部癌，肝细胞癌，肝门胆管癌，下咽癌，眼内黑色素肿瘤，胰岛细胞肿瘤，卡波西肉瘤，郎格罕细胞组织细胞增生症，大细胞未分化肺癌，喉癌，唇癌，肺腺癌，髓上皮瘤，恶性纤维组织细胞瘤，髓上皮瘤，黑素瘤，默克尔细胞癌，间皮瘤，内分泌瘤，鼻腔癌，鼻咽癌，成神经细胞瘤，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤，卵巢透明细胞癌，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞瘤，胰腺癌，乳头状瘤病，鼻窦癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，咽癌，松果体实质肿瘤，成松果体细胞肿瘤，垂体肿瘤，胸膜肺母细胞肿瘤，肾细胞癌，15号染色体改变的呼吸道癌，视网膜母细胞肿瘤，横纹肌肉肿瘤，唾液腺癌，小细胞肺癌，小肠癌，软组织肉肿瘤，鳞状细胞癌，鳞状非小细胞肺癌，鳞状颈癌，幕上原始神经外胚层肿瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤，睾丸癌，喉癌，胸腺癌，胸腺肿瘤，甲状腺癌，肾盂癌，尿道癌，子宫肉肿瘤，阴道癌，外阴癌和肾母细胞肿瘤。
可选地，患者可以基于NECL5(脊髓灰质炎病毒受体)表达进行分层。例如，这可以在RNA或蛋白质水平上使用探针、引物或抗体进行测定。NECL5表达可以指导治疗或不治疗本发明的嵌合脊髓灰质炎病毒的决定。NECL5表达也可用于指导治疗的积极性，包括治疗的剂量、频率和持续时间。NECL5的抗体(CD155)可商购获得并可使用。NECL5RNA表达也可以被测定。参见Hirota等Oncogene 24：2229-2235(2005)。
除了递送嵌合脊髓灰质炎病毒构建体和免疫检查点抑制剂组合外，治疗方案还可以包括手术切除肿瘤、手术减少肿瘤、化疗、生物治疗、放疗。这些方式是许多疾病状态下的标准护理，并且患者不需要被拒绝接受护理标准。嵌合脊髓灰质炎病毒和免疫检查点抑制剂组合可以在护理标准之前、期间或之后施用。嵌合脊髓灰质炎病毒和免疫检查点抑制剂组合可以在护理标准失败后施用。当指定组合时，可以在单个组合方案中作为两种单独的试剂分开及时施用。可选地，两种(或更多种)试剂可以混合施用。
试剂盒可以在单个分开或未分开的容器中包含嵌合脊髓灰质炎病毒构建体PVSRIPO以及检查点抑制剂。它们两个可以在分开的器皿中或在单个器皿中混合。可以包括施用说明。任选地，用于测试患者中NECL5表达的抗体是该试剂盒的组分。
申请人已经发现嵌合脊髓灰质炎病毒的临床药物制剂具有令人赞赏的遗传稳定性和同质性。这是特别有利的，因为已知脊髓灰质炎病毒在培养物和天然生物储库中都是高度可变的。可以使用任何合适的遗传稳定性和同质性测定。一种稳定性测定涉及在39.5℃下不能生长的测试。另一种测定涉及批量测序。另一种测定涉及灵长类神经毒性的测试。
虽然申请人不希望受到任何特定作用机制的束缚，但相信多种机制可能有助于脊髓灰质炎病毒构建体的功效。这些包括癌细胞的裂解、免疫细胞的募集和对癌细胞的特异性。而且，病毒是神经减毒的。
以上公开内容总体上描述了本发明。本文公开的所有参考文献明确地通过引用并入。通过参考下面的具体实施例可以获得更完整的理解，本文这些实施例仅仅是为了说明的目的而提供的，并不意图限制本发明的范围。
实施例1
动物肿瘤模型。在无胸腺小鼠的HTB-15 GBM异种移植模型中进行了PVS-RIPO的IND导向的功效试验。PVS-RIPO(来自临床批次)是在‘小鼠调整的’、FDA批准的最大起始剂量下施用的[调整FDA批准的最大起始剂量(10e8 TCID)以减少小鼠中的肿瘤大小(至6.7x10e6 TCID)]。递送模拟了预期的临床路径，即缓慢的瘤内输液。在这些情况下，PVS-RIPO在15天后诱导所有动物肿瘤的完全消退。尽管从治疗的肿瘤中回收病毒直到第10天，但最好的水平是适度的，这表明单独的直接病毒肿瘤细胞杀伤不能解释治疗效果。
来自动物肿瘤模型的证据表明，瘤内接种PVS-RIPO引起直接的病毒诱导的肿瘤细胞杀伤，并引发针对感染/杀伤的肿瘤的强有力的宿主免疫应答(3，7，10)。对病毒输液的响应的特征在于强烈的局部炎症响应，导致肿瘤的免疫渗透。最终，对PVS-RIPO输液的缓慢组织响应导致肿瘤块消失并被瘢痕所替代。
实施例2
临床试验。第14,735号IND‘PVSRIPO针对复发性胶质母细胞肿瘤的剂量发现和安全性研究’于2011年6月19日获得FDA批准，并于2011年10月27日获得IRB批准。具有复发性胶质母细胞肿瘤(GBM)(NCT01491893)的患者的I/II期临床试验目前正在招募患者。
迄今为止，依照IRB批准的方案，两名人受试者接受了PVS-RIPO的治疗。实施例3中描述了第一受试者的初步结果。
实施例3
第一人受试者的初步结果。该患者是一名21岁的女性护理学生，被诊断为右额叶GBM(WHO IV级)。她于2011年6月首次被诊断出，在20岁，出现疑似鼻窦感染的严重头痛和治疗失败的病史。脑成像于2011年6月17获得，并显示较大的右额叶质量，测量值约为5x6cm。她在2011年6月22日接受了右额叶肿块的次全切除术，病理证实为GBM(WHO IV级)。考虑到患者的年龄较小、其良好的表现状态和肿瘤次全切除，决定以通过每天口服75mg/m2的替莫唑胺化疗6周的放射治疗和每2周一次施用贝伐珠单抗(抗血管生成剂)的组合来积极治疗她。患者于2011年9月18日完成了六周的治疗。在2011年10月3日，患者开始以每月一次5天的替莫唑胺化疗，以及额外每两周一次的贝伐珠单抗10mg/kg进行辅助治疗。
在2012年4月16日，患者在经历了在其睡眠中发生的其第一次全身性癫痫发作后出现在门诊部。那时，她已经完成了六个月的替莫唑胺和贝伐珠单抗的组合治疗。尽管她被诊断为GBM并正在进行化疗治疗，但她正在完成学士学位以成为一名儿科肿瘤护士，因此她将这次癫痫发作归因于学校压力增加。当天获得的脑部MRI显示肿瘤复发，伴随有沿切除腔内侧面的新结节增强(图12)。
向患者提供了多种治疗选择，但患者选择继续PVS-RIPO临床试验。在第一次全身性癫痫发作之后，她开始开浦兰(Keppra)治疗，但由于这种情况和已知的肿瘤复发，偶尔忘记服用开浦兰，患者在2012年5月6日睡觉时经历了第二次全身性癫痫发作。她回到了她的基线神经系统状态，并准备招募协议。
患者在2012年5月11日通过预期的临床递送方法(对流增强的瘤内输液3mL含有6小时对比Gd-DTPA的病毒悬浮液；参见实施例4)接受FDA批准最大起始剂量(10e8)的PVS-RIPO输液并且没有经历与此相关的神经系统或其它并发症之前，在2012年5月9日获得后续MRI(图13)。
在输液完成后立即获得的MRI显示输液物的分布(图14)。
我们的研究小组以每周为基础对患者进行随访，并在输液后两周内在门诊部内看到她，此时她否认有任何新的神经系统症状、癫痫复发、疲劳、气短或虚弱。她于2012年6月7日再次在门诊部接受了评估，她的身体和神经系统状态保持正常。该次随访时获得的脑MRI显示疾病的稳定性(图15)。
患者于2012年7月9日在门诊部被看到。她再次否认任何新的神经系统症状，包括自PVS-RIPO输液之前的2012年5月6日发现癫痫发作后没有任何癫痫发作复发活动。她还报告说，她的情绪很好，她满足于她在护理学校的进步，感觉自从她输液后她能够在学校更好地集中注意力。她对两位室友的举动以及她能够定期锻炼的事实也很兴奋。当天获得的脑MRI显示质量效应轻微增加，优越线性增强的最小增加，这与疾病进展有关(图16)。
鉴于令人担忧的影像学改变而没有临床恶化，我们决定获得18-FDG PET扫描。18-FDG PET扫描显示了MRI所关注区域的低代谢活性，提示坏死过程(治疗响应效应；图17)。7月9日的PET扫描表明没有活的肿瘤。在与患者和她的母亲讨论后，决定从临床和放射学的角度继续追踪患者。
在8月27日和10月22日的检查中，患者否认了任何新的神经系统症状，包括自2012年5月6日(在PVS-RIPO输液之前)癫痫发作后没有任何癫痫发作活动。患者报告了改善的认知/记忆功能、运动功能(锻炼)。截至10月26日，患者神经系统功能正常。
由于8月27日的X射线表现良好，没有准备PET扫描。患者在10月22日重新扫描，并有可量化的放射学响应。
MRI/PET叠加显示了肿瘤复发的一般区域没有信号。
实施例4
对流输液。使用由术前MRI获得的信息，术前使用BrainLab iPlan Flow系统基于预测分布以计划导管轨迹。
本发明使用1mM的钆作为替代示踪剂以确定脊髓灰质炎病毒的分布。这也可以用于其它药物输液。钆与药物共输液，并使用各种MRI序列以量化分布。
待递送的全部体积的试剂将由研究药剂师预先装载到注射器中并且在开始输液之前在手术室或NICU中的无菌条件下连接至导管。由于安排输液所需的所有组分(手术室时间、药房时间和放射科预约)的复杂性，研究药物输液的研究已经建立了+1天窗口。这意味着输液允许在活检/导管放置后的第二天开始。就方案和后续事件的时间而言，这仍将被视为“第0天”。在病毒注射时，紧急药物(包括肾上腺素和苯海拉明)是可用的，并监测神经系统状态、血氧饱和度和心律。药物输液将发生在神经外科重症监护室(NSCU)，以便所有其它应急设施都是可用的。由导管放置的麻醉诱导开始，患者将接受预防性抗生素治疗，例如萘普西林(第二代头孢菌素或万古霉素)。
根据我们自己的经验，使用类似输液技术(IRB#4774-03-4R0)的以前发表的报告(19)和IRB、FDA批准的试验，患者将以500μL/小时的速率输液。Medfusion 3500输液泵将预先设定为500μL/小时的递送速率。该试剂(在输液系统中，其总体积将为10mL以占3.3723mL的“死腔”)将在20mL注射器中首次起始时装入注射泵中以避免任何中断输液。递送给患者的接种物的总量是3mL。导管本身(30cm长，1mm内径)不能预装病毒悬浮液。因此，最初约250μE的输液将是留置导管“死腔”的无防腐剂盐水。为了解决这个问题，输液泵将被设定为递送3.250mL。输液将使用Medfusion 3500(Medex，Inc.，Duluth，GA)注射器输液泵进行。病毒注射程序将在6.5小时内完成。递送PVSRIPO后，导管将被立即移除。
输液导管(PIC 030)和输液管(PIT 400)由Sophysa公司提供(Crown Point，IN)。输液导管试剂盒是30cm的清晰、开放式导管(1.0mm内径/2.0mm外径)，以1cm为标记至20cm。导管配备有30cm的不锈钢管心针、带盖带刺的母卢尔锁和不锈钢套管针。输液管试剂盒由带空气过滤器的3通活塞连接器、4m带反虹吸阀的微孔管、红色通风帽和白色卢尔锁帽组成。导管产品包装无菌且无热原性，仅用于单次(一次性)使用。使用Medfusion 3500(Medex，Inc.Duluth，GA)注射器输液泵进行输液。
实施例5--结果
免疫检查点抑制剂的机制是从阻断其效应子功能的肿瘤诱发的事件中释放细胞毒性T细胞功能。肿瘤使用自然存在的控制细胞毒性T细胞的“刹车”系统。对于肿瘤，这具有限制免疫系统攻击表达突变蛋白质的肿瘤潜力的优点，并因此代表异质签名。免疫检查点抑制剂逆转这种肿瘤机制并释放免疫功能。
我们已发现PVSRIPO引发依赖于细胞毒性T细胞(CTL)攻击肿瘤的免疫响应。因此，PVSRIPO与检查点抑制剂的组合增强了治疗效果。如下所示，PVSRIPO确实通过诱导CTL响应以治疗肿瘤。
我们用PVSRIPO感染黑素肿瘤、乳腺肿瘤、脑肿瘤、前列腺癌细胞，并从濒死/死亡细胞收集上清液。来自感染的肿瘤细胞的上清液用于暴露来自人受试者的树突细胞(负责与CTL通信并协调其活化的免疫细胞群)。作为结果，树突细胞表现出强烈的促炎激活迹象(即肿瘤细胞的病毒感染产生促进树突细胞的CTL激活功能的可溶性因子)。
然后将活化的树突细胞与来自捐献树突细胞的相同人受试者的T细胞(包括CTL)共培养。然后将共培养的T细胞(包括CTL)与来自用于感染步骤的相同系的未感染的肿瘤细胞共培养。
我们观察到活化的CTL对肿瘤细胞的高度细胞毒性，参见图2。
本实验在体外证明了我们认为在患者身上发生的事情：病毒感染引发一系列最终导致产生针对肿瘤的CTL响应的事件。这一系列事件可以与免疫检查点抑制剂协同增强。
T细胞功能(免疫检查点)自然存在的“刹车”之一是PD1-PD-L1链路。通常诱导肿瘤中的树突细胞以表达PD-L1，然后PD-L1与T细胞上的PD1结合以抑制T细胞的活化。
我们已经证明了暴露于PVSRIPO/PVSRIPO肿瘤裂解物的树突细胞会增加PD-L1表达。PD-1或PD-L1抑制剂是典型的检查点抑制剂，通过PVSRIPO溶瘤防止这种作用并增加CTL活化。
实施例6--方法
在AIMV培养基中用模拟(DMEM)或PVSRIPO(MO10.1)感染10cm培养皿中融合的Sum149，MDAMB231，LNCaP或DM6细胞48小时。收集上清液并通过离心除去细胞碎片。将融化的PBMC解冻，在PBS中洗涤并以2×108个细胞重悬浮于T-150组织培养瓶中的30ml AIM-V培养基中(3)。在37℃下温育细胞1小时。通过摇晃烧瓶从一边到另一边以去除它们而收获非贴壁细胞。用补充有800U/ml人GM-CSF和500U/ml人IL-4的30ml AIM-V补充贴壁细胞，然后在37℃下温育。通过收集所有非贴壁细胞在第6天收获DC，接着用冷PBS洗涤。仍然贴壁的细胞用细胞解离缓冲液解离。在AIMV培养基中洗涤DC，计数并以1x106个细胞/培养皿接种于35mm培养皿中。将来自癌细胞裂解物的上清液加入到DC培养物中并温育24小时。然后除去上清液并在AIMV培养基中洗涤DC。将PBMC解冻并重悬浮于PBS中，并在37℃下用200U/ml的DNA酶I处理20分钟。DNA酶I处理的PBMC在37℃下温育1小时。收获非贴壁细胞，并在响应细胞与刺激物DC比率为10∶1和存在25ng/ml IL-7的条件下，用装载有脊髓灰质炎病毒诱导的肿瘤裂解物的DC刺激非贴壁细胞。所有的刺激物均在具有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、20mM HEPES、1mM丙酮酸钠、0.1mM MEM非必需氨基酸、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和5×10-5Mβ-巯基乙醇(CTL刺激培养基)的RPMI 1640中完成。响应T细胞浓度为2×106个细胞/ml。在第3天以及每4-5天以100U/ml加入IL-2，持续12-14天。T细胞在CTL刺激培养基中维持在1-2×106个细胞/ml。在第12-14天收获T细胞，计数并在铕释放CTL测定中用作效应子T细胞。使用转染有肿瘤抗原编码mRNA的自体DC作为靶标对照。对于DC靶标对照，收获mRNA电穿孔的靶标细胞(如图2所示)，洗涤以除去所有培养基的示踪剂并用铕(Eu)标记。可选地，用Eu标记原始靶标细胞(Sum149，MDAMB231，LNCaP或DM6)。Eu标记缓冲液(1ml/靶标)含有1ml HEPES缓冲液(50mM HEPES，93mM NaCl，5mM KCl，2mM MgCl2，pH 7.4)，10μl Eu(0.01N HCl中10mM EuCl3.6H2O，)，5μl DTPA(HEPES缓冲液中100mM二亚乙基三胺五乙酸酯)和4μl DS(1％硫酸葡聚糖)(4)。5×106靶标细胞非常温和地重悬浮于1ml铕标记缓冲液中并在冰上温育20分钟。然后将30μl CaCl2溶液(100mM)加入到标记的细胞中，混合并将细胞在冰上再温育5分钟。向细胞中加入30ml修复缓冲液(含10mM葡萄糖和2mM CaCl2的HEPES缓冲液)，并将细胞以1000rpm离心10分钟。计数细胞并用修复缓冲液洗涤5×106个细胞4次。最后一次洗涤后，将细胞以105细胞/ml重悬浮于不含青霉素-链霉素的CTL刺激培养基中。将不同E∶T比率的一万个铕标记的靶标(T)和效应子细胞(E)的系列稀释液在96孔V底板中的不含青霉素-链霉素的200μlCTL刺激培养基中温育。将平板以500×g离心3分钟并在37℃下温育4小时。收获50μl上清液并加入到96孔平底板中的150μl增强溶液(Wallac，Perkin-Elmer)中，使用VICTOR3多标记计数器(Perkin-Elmer)通过时间分辨荧光测量铕释放。使用下式确定具体的细胞毒活性：％特异性释放＝[(实验释放-自发释放)/(总释放-自发释放)]×100。靶标细胞的自发释放小于清净剂总释放的25％。通过在不含T细胞的培养基中温育靶标细胞以确定靶标细胞的自发释放。所有测定一式三份进行，条代表平均％裂解，误差条代表SEM。
实施例7
病毒在受感染的肿瘤细胞和受感染的抗原呈递细胞(树突细胞，巨噬细胞，小胶质细胞)中引发强烈免疫原性1型干扰素(IFN)响应的能力可以帮助PVSRIPO抗肿瘤效应。然而，尽管1型IFN响应作为免疫疗法的介质是非常合乎需要的，但它们也涉及已知的免疫检查点，该免疫检查点可抑制由PVSRIPO(例如PD-L1)引发的抗肿瘤免疫响应的免疫检查点。因此，为了使PVSRIPO免疫疗法最大化，可以指出与免疫检查点阻断组合。这在免疫活性的同系神经胶质瘤肿瘤模型(例如CT2A)的分析中是明显的。参见Martinez-Murillo等人，Histol.Histopathol.12：1309-26(2007)。
我们将皮下CT2A神经胶质瘤植入到脊髓灰质炎病毒受体CD155的转基因C57B16小鼠中。先前用CD155转导用于启动肿瘤的CT2A细胞(以使PVSRIPO感染类似于人细胞)。如下处理四组荷瘤动物(n＝10)：组I：DMEM(控制病毒的载体)+IgG(控制抗PD1)；组II：单次瘤内注射PVSRIPO+IgG；组III：单次瘤内注射DMEM+抗PD1；第IV组：单次瘤内注射PVSRIPO+抗PD1。通过腹膜内注射分3次(第3，6，9天)给予抗PD1。结果如图3所示；上图显示组结果，下图显示单个小鼠的结果。
PVSRIPO和抗PD1两者分别具有显著的抗肿瘤效果(上图)。这两种试剂的组合增加了治疗效果，表明协同作用机制(上图)。重要的是，只有组合治疗才能获得持久的肿瘤缓解(通过非常低肿瘤体积的肿瘤响应曲线的平线表示)。
参考文献
所引用的每篇参考文献的公开内容明确地并入本文。
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