急性髓性白血病(aml)又称急性髓细胞性白血病或急性非淋巴细胞性白血病(anll)，是一种血细胞髓样系的癌症，其特征在于异常白细胞的快速生长，其在骨髓中积累并干扰正常血细胞生成。aml是影响成人的最常见的急性白血病，并且其发病率随着年龄增加而增加。虽然aml是一种相对罕见的疾病(约占美国癌症死亡的1.2％)，但其发病率预计会随着人口老龄化而增加。
aml的症状是由白血病细胞替代正常骨髓引起的，这导致红细胞，血小板和正常白细胞的减少。这些症状包括疲劳，气短，易瘀伤和出血，以及感染风险增加。已经确定了几种危险因素和染色体异常，但目前尚不清楚aml的具体原因。作为一种急性白血病，aml进展迅速，如果不予治疗，在数周或数月内通常会致命。
aml有几种亚型，不同亚型的治疗和预后有所不同。五年存活率仅为25％，复发率为33-78％不等，具体取决于亚型。aml首先用旨在诱导缓解的化学疗法治疗，并且患者可继续接受额外的化疗或造血干细胞移植。
标准护理化疗是阿糖胞苷与蒽环类抗生素的组合，其在过去40年中保持不变。鉴于上述25％的存活率，这清楚地表明需要新的疗法。
对于10％诊断患有急性早幼粒细胞性白血病(apl)的患者子集，一种方法在aml中取得有限的成功，包括用小分子如全反式视黄酸(atra)和三氧化二砷治疗受试者，所述小分子触发白血病aml细胞的分化。atra和三氧化二砷克服视黄酸受体α(rarα)融合癌蛋白施加的分化停滞，并且治疗的白血病早幼粒细胞终末分化为成熟的嗜中性粒细胞。与传统的细胞毒性化疗相比，患者对这些小分子的耐受性非常好。此外，将atra纳入治疗方案本身，将急性早幼粒细胞性白血病(apl)患者的总体存活率从20％提高到75％。不幸的是，对于更大部分的非apl急性髓性白血病，分化疗法并不存在，其中标准的护理导致仅25％的总体存活率。
哺乳动物同源盒转录因子有助于谱系特异性造血分化，并且在正常造血过程中它们的表达受到严格调控。更具体地说，hoxa9在正常血细胞生成和白血病发生中具有重要作用。尽管对早期造血作用至关重要，但随着细胞成熟，hoxa基因簇的表达通常下调。hoxa基因簇成员的持续表达和不恰当表达发生在大多数急性髓性白血病中。hoxa9作为融合蛋白nup98-hoxa9的一个伴侣直接参与人类白血病。在人类aml分析中，hoxa9表达水平与不良预后核型相关并与生存负相关。此外，在cml患者中，相对较高水平的hoxa9表达与从慢性期转变为加速期和爆发期相关。hoxa9对表达与混合谱系白血病(mll)基因有关的融合癌蛋白的淋巴和骨髓白血病的小亚群至关重要。携带mll重排的白血病是aml特别不良预后亚组，并依赖于hoxa9用于增殖和存活。总体而言，这表明通过与nup98融合和/或hoxa9表达的不适当维持，hoxa9失调是在髓样白血病分化停滞中的常见机制。
在现有技术中需要鉴别化合物，该化合物可用于治疗或者预防在需要的受试者中的血液癌症，例如但不限于急性髓性白血病(aml)、急性早幼粒细胞性白血病(apl)、骨髓增生异常综合征(mds)、混合性白血病(mll)和/或慢性髓性白血病(cml)。本发明满足了这种需要。
技术实现要素：
如下所述，本发明总体上提供了化合物，其可用于治疗或者预防在需要的受试者中的一些类型的血液癌症。在一些实施方案中，本发明化合物克服罹患血液癌症的受试者中的分化停滞。
本发明提供了治疗或者预防在需要的受试者中的血液癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的布喹那，或其盐或者溶剂合物，其中布喹那以每48小时一次的频率或更高频率(afrequencyequaltoorlessthanonceevery48hours)给药于所述受试者。
本发明还提供了在需要的受试者中消耗或者促进白血病起始细胞的分化的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的布喹那，或其盐或者溶剂合物，其中布喹那以每48小时一次的频率或更高频率给药。
在一些实施方案中，布喹那以每72小时一次的频率或更高频率(afrequencyequaltoorlessthanonceevery72hours)给药于所述受试者。
在一些实施方案中，布喹那以每72小时一次的频率给药于所述受试者。
在一些实施方案中，所述血液癌症的特征在于分化停滞。在其它实施方案中，所述受试者已经治疗或者正在治疗特征在于分化停滞的血液癌症。
在一些实施方案中，所述血液癌症包括急性髓性白血病(aml)、急性早幼粒细胞性白血病(apl)、混合性白血病(mll)、骨髓增生异常综合征(mds)，和/或慢性髓性白血病(cml)。
在一些实施方案中，所述血液癌症包括aml。
在一些实施方案中，布喹那通过至少一种选自以下的途径给药于所述受试者：口服、直肠、粘膜、透粘膜、局部、静脉内、真皮内、肌内、皮下、皮内、子宫内、硬膜外和脑室内注射。
在一些实施方案中，还向所述受试者给药用于治疗或者预防血液癌症的至少一种另外的药剂。
在一些实施方案中，所述药剂包括atra或者三氧化二砷。
在一些实施方案中，所述化合物和所述药剂共同配制。
在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物。在其它实施方案中，所述哺乳动物是人类。
在一些实施方案中，所述受试者对一种或者多种抗癌剂不应答。
在一个方面，本发明提供了二氢乳清酸抑制剂在治疗或者预防在需要的受试者中的血液癌症的方法中的用途。所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)抑制剂，或其盐或者溶剂合物，其中选自6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸)(布喹那)；5-甲基-n-[4-(三氟甲基)苯基]-异噁唑-4-甲酰胺)；(2z)-2-氰基-3-羟基-n-[4-(三氟甲基)苯基]丁-2-烯酰胺)或其任何组合或其盐或者溶剂合物的二氢乳清酸抑制剂以每72小时一次的频率或更高频率给药于所述受试者。
在具体实施方案中，6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸)或其盐或者溶剂合物以每72小时一次的频率或更高频率或者以每48小时一次的频率或更高频率给药于所述受试者。
在本文中描述的任何方面的各种实施方案中，所述血液癌症包括急性髓性白血病(aml)、急性早幼粒细胞性白血病(apl)、混合性白血病(mll)、骨髓增生异常综合征(mds)，和/或慢性髓性白血病(cml)。在一些实施方案中，所述血液癌症包括aml。
在本文中描述的任何方面的各种实施方案中，所述受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物为人类。在本文中描述的任何方面的各种实施方案中，所述受试者已经治疗或者正在治疗特征在于分化停滞的血液癌症。在各种实施方案中，所述受试者对一种或者多种抗癌剂不应答。
在本文中描述的任何方面的各种实施方案中，6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸通过至少一种选自以下的途径给药于所述受试者：口服、直肠、粘膜、透粘膜、局部、静脉内、真皮内、肌内、皮下、皮内、子宫内、硬膜外和脑室内注射。
在本文中描述的任何方面的各种实施方案中，还将用于治疗或者预防血液癌症的至少一种另外的药剂(例如，三氧化二砷和/或atra)给药于所述受试者。
在本文中描述的任何方面的各种实施方案中，所述方法包括向所述受试者以足以在得自所述受试者的生物样品中提高二氢乳清酸水平和/或降低尿苷水平的量和持续时间给药包含二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)抑制剂(例如，6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸(布喹那)或其盐或者溶剂合物)的组合物，由此治疗所述血液癌症。
在本文中描述的任何方面的各种实施方案中，所述方法包括向所述受试者给药第一剂量的dhodh抑制剂(例如，6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸(布喹那)或其盐或者溶剂合物)；检测在得自所述受试者的生物样品中的二氢乳清酸和/或尿苷；和给药第二剂量的dhodh抑制剂(例如，6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸(布喹那)或其盐或者溶剂合物)，其中所述给药的量和/或时机基于检测的二氢乳清酸(dho)和/或尿苷的量而修饰，由此治疗所述受试者中的血液恶性肿瘤。
在本文中描述的任何方面的各种实施方案中，dhodh抑制剂给药的量和/或时机足以增加二氢乳清酸水平至少约100-500倍。
在本文中描述的任何方面的各种实施方案中，第二剂量的dhodh抑制剂(例如，6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸(布喹那)或其盐或者溶剂合物)在dho的量返回至基线之后给药。在一些实施方案中，所述第二剂量在尿苷的量比在给药所述第一剂量之后12小时存在的尿苷水平高10-25％时给药。
本发明提供了具有抗癌活性的化合物，包含其的组合物，以及治疗或预防一些类型的血液癌症如aml的方法。结合下面提供的例子，将由本发明限定的组合物和物品分离或另外制造。根据详细描述和权利要求，本发明的其他特征和优点将显而易见。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：singleton等人，dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology(2nded.1994)；thecambridgedictionaryofscienceandtechnology(walkered.，1988)；theglossaryofgenetics，5thed.，r.rieger等人(eds.)，springerverlag(1991)；和hale&marham，theharpercollinsdictionaryofbiology(1991)。一般而言，本文使用的命名和医学、有机化学和聚合物化学中的实验室操作是本领域众所周知和常用的。
如本文所用，冠词“一”和“一个”是指冠词的语法对象中的一个或多于一个(即至少一个)。举例来说，“一个元素”是指一个元素或多于一个元素。
如本文所用，术语“约”将被本领域普通技术人员理解，并且将在某种程度上根据其使用的上下文而变化。如本文所用，当提及诸如量、持续时间等的可测量值时，术语“约”意味着包括从指定值±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选地±1％，还更优选±0.1％的变化，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。
如本文所用，术语“给药”意指通过任何合适的方法将本发明的组合物提供给受试者。
如本文所用，除非另有说明，否则单独使用或与其它术语组合使用的术语“烯基”是指具有所述数目碳原子的稳定的单不饱和或二不饱和直链或支链烃基。实例包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、2-丁烯基(巴豆基)、异戊烯基、丁二烯基、1，3-戊二烯基、1，4-戊二烯基以及更高级的同系物和异构体。代表烯烃的官能团由-ch2-ch＝ch2表示。
如本文所用，除非另有说明，单独使用或与其它术语组合使用的术语“烷氧基”是指通过氧原子与分子的其余部分连接的如上所定义的具有指定数目的碳原子的烷基，例如甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基(异丙氧基)和更高级的同系物和异构体。优选为(c1-c3)烷氧基，例如但不限于乙氧基和甲氧基。
如本文所用，除非另有说明，术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分是指具有指定数目的碳原子的直链或者支链的烃(即，c1-c10是指1-10个碳原子)，并且包括直链、支链，或者环状取代基基团。实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基，和环丙基甲基。最优选(c1-c6)烷基，例如但不限于乙基、甲基、异丙基、异丁基、正戊基、正己基和环丙基甲基。
如本文所用，除非另有说明，单独使用或与其它术语组合使用的术语“炔基”意指具有碳-碳叁键的稳定的直链或支链烃基，其具有所述数目的碳原子。非限制性实例包括乙炔基和丙炔基，和更高级的同系物和异构体。所述术语“炔丙基”是指由-ch2-c≡ch示例的基团。所述术语“高炔丙基”是指由-ch2ch2-c≡ch示例的基团。所述术语“取代的炔丙基”是指由-cr2-c≡cr示例的基团，其中r在每次出现时独立地为h、烷基、取代的烷基、烯基或者取代的烯基，条件是至少一个r基团不为氢。所述术语“取代的高炔丙基”是指由-cr2cr2-c≡cr示例的基团，其中r在每次出现时独立地为h、烷基、取代的烷基、烯基或者取代的烯基，条件是至少一个r基团不为氢。
如本文所用，所述术语“aml”是指急性髓性白血病。
如本文所用，所述术语“apl”是指急性早幼粒细胞性白血病，其也被称为pml或者早幼粒细胞性白血病。
如本文所用，术语“芳族”是指具有一个或多个多不饱和环并具有芳族特征的碳环或杂环，即具有(4n+2)离域π(pi)电子，其中n是整数。
如本文所用，除非另有说明，单独使用或与其它术语组合使用的术语“芳基”或“芳烃”是指含有一个或多个环(通常为一个，两个或三个环)的碳环芳族体系，其中这样的环可以是以悬挂的方式连接在一起，如联苯，或者可以是稠合的，如萘。实例包括苯基、蒽基，和萘基(包括1-和2-萘基)。优选为苯基和萘基，最优选为苯基。
如本文所用，所述术语“芳基-(c1-c3)烷基”是指官能团，其中1-3个碳的亚烷基链连接至芳基，例如，-ch2ch2-苯基或者-ch2-苯基(苄基)。优选为芳基-ch2-和芳基-ch(ch3)-。所述术语“取代的芳基-(c1-c3)烷基”是指芳基-(c1-c3)烷基官能团，其中所述芳基是取代的。优选为取代的芳基(ch2)-，其中所述取代基选自卤素、c1-c3-烷基、c1-c3-烷氧基、氰基、氨基。相似地，所述术语“杂芳基-(c1-c3)烷基”是指官能团，其中1-3个碳的亚烷基链连接至杂芳基，例如，-ch2ch2-吡啶基。优选为杂芳基-(ch2)-。所述术语“取代的杂芳基-(c1-c3)烷基”是指杂芳基-(c1-c3)烷基官能团，其中所述杂芳基为取代的。优选为取代的杂芳基-(ch2)-，其中所述取代基选自卤素、c1-c3-烷基、c1-c3-烷氧基、氰基、氨基。
如本文所用，所述术语“atra”是指全反式视黄酸，或其盐或者溶剂合物。
如本文所用，所述术语“布喹那”是指6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸，或其盐或者溶剂合物。
在一个方面，涉及受试者的术语“共同给药的”和“共同给药”是指向受试者给药本发明的组合物或其盐和还可治疗本发明涵盖的任何疾病的组合物。在一个实施方案中，将所述共同给药的组合物分别给药，或者以任何种类的组合作为单一治疗方法的一部分给药。可将所述共同给药的组合物以任何种类的组合配制为在多种固体、凝胶，和液体制剂下的固体和液体的混合物，和配制为溶液。
如本文所用，所述术语“cml”是指慢性髓性白血病。
如本文所用，术语“组合物”或“药物组合物”是指可用于本发明的至少一种化合物与药学上可接受的载体的混合物。该药物组合物有助于将化合物给药于受试者。
如本文所用，除非另有说明，术语“环烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指具有指定碳原子数的环状链烃(即，c3-c6是指包含由3-6个碳原子组成的环基团的环状基团)，并且包括直链、支链或环状取代基。实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基，和环辛基。最优选为(c3-c6)环烷基，例如但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
如本文所用，所述术语“δ”是指delta(ppm)。
如本文所用，所述术语“dhodh”是指二氢乳清酸脱氢酶。
“dhodh抑制剂”是指可检测地降低二氢乳清酸脱氢酶的活性的药剂。在一些实施方案中，所述dhodh活性降低至少约10％、20％、30％、40％、50％或者更多。在一个实施方案中，dhodh活性是通过检测二氢乳清酸(dho)向乳清酸的转化测得的。在一个实施方案中，dhodh抑制是通过检测二氢乳清酸(dho)测得的。在另一实施方案中，dhodh活性是通过检测尿苷消耗测得的。
“疾病”或“障碍”是指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何状况。在一些实施方案中，所述疾病包括血液癌症，例如急性髓性白血病(aml)、急性早幼粒细胞性白血病(apl)、混合性白血病(mll)、急性淋巴细胞性白血病(all)、骨髓增生异常综合征(mds)、慢性髓性白血病(cml)，和/或粒单核细胞性白血病(mml)。
如本文所用，所述术语“dmso”是指二甲基亚砜。
“有效量”是指相对于未治疗患者化合物改善疾病症状所需的量。用于实施本发明用于治疗疾病的活性化合物的有效量取决于给药方式，受试者的年龄，体重和一般健康状况而变化。最终，主治医师或兽医将决定适当的剂量和剂量方案。该量被称为“有效”量。在癌症的情况下，足以治疗疾病的有效量降低或稳定肿瘤细胞增殖，减少肿瘤细胞存活或增加肿瘤细胞死亡。
如本文所用，所述术语“etoac”是指乙酸乙酯。
如本文所用，除非另有说明，单独或作为另一取代基的一部分使用的术语“卤代”或“卤素”是指氟，氯，溴或碘原子，优选氟，氯或溴，更优选地，氟或氯。
如本文所用，除非另有说明，术语“杂烷基”本身或与其他术语结合是指由所述数目的碳原子和一个或两个选自o、n和s的杂原子组成的稳定的直链或支链烷基，并且其中氮和硫原子可以任选被氧化并且氮杂原子可以任选被季铵化。杂原子可以位于杂烷基的任何位置，包括在杂烷基的剩余部分和它所连接的片段之间，以及连接至杂烷基中最远端的碳原子。实例包括：-o-ch2-ch2-ch3、-ch2-ch2-ch2-oh、-ch2-ch2-nh-ch3、-ch2-s-ch2-ch3，和-ch2ch2-s(＝o)-ch3。多达两个杂原子可以是连续的，例如-ch2-nh-och3，或者-ch2-ch2-s-s-ch3。
如本文所用，除非另有说明，术语“杂环”或“杂环基”或“杂环的”本身或作为另一个取代基的一部分意指由碳原子和至少一个选自n、o和s的杂原子组成的未取代或取代的稳定的单环或多环杂环体系，并且其中所述氮和硫杂原子可以任选被氧化，并且所述氮原子可以任选被季铵化。除非另有说明，杂环体系可以连接在提供稳定结构的任何杂原子或碳原子上。杂环在性质上可以是芳族的或非芳族的。在一个实施方案中，杂环是杂芳基。
如本文所用，术语“杂芳基”或“杂芳族”是指具有芳族特征的杂环。多环杂芳基可以包括一个或多个部分饱和的环。实例包括四氢喹啉和2，3-二氢苯并呋喃基。
非芳族杂环的实例包括单环基团，例如氮杂环丙烷、氧杂环丙烷、硫杂环丙烷、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、吡咯烷、吡咯啉、咪唑啉、吡唑烷、二氧戊环、环丁砜、2，3-二氢呋喃、2，5-二氢呋喃、四氢呋喃、噻吩烷、哌啶、1，2，3，6-四氢吡啶、1，4-二氢吡啶、哌嗪、吗啉、硫吗啉、吡喃、2，3-二氢吡喃、四氢吡喃、1，4-二噁烷、1，3-二噁烷、高哌嗪、高哌啶、1，3-二氧杂环庚烷、4，7-二氢-1，3-二氧杂环庚三烯和环氧己烷(hexamethyleneoxide)。
杂芳基的实例包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基(例如但不限于2-和4-嘧啶基)、哒嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基、异噻唑基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、1，3，4-三唑基、四唑基、1，2，3-噻二唑基、1，2，3-噁二唑基、1，3，4-噻二唑基和1，3，4-噁二唑基。
杂芳族或者至少部分非芳族杂环的多环杂环的实例包括吲哚基(例如但不限于3-、4-、5-、6-和7-吲哚基)、吲哚啉基、喹啉基、四氢喹啉基、异喹啉基(例如但不限于1-和5-异喹啉基)、1，2，3，4-四氢异喹啉基、噌啉基、喹喔啉基(例如但不限于2-和5-喹喔啉基)、喹唑啉基、酞嗪基、1，8-二氮萘基、1，4-苯并二噁烷基、香豆素、二氢香豆素、1，5-二氮萘基、苯并呋喃基(例如但不限于3-、4-、5-、6-和7-苯并呋喃基)、2，3-二氢苯并呋喃基、1，2-苯并异噁唑基、苯并噻吩基(例如但不限于3-、4-、5-、6-，和7-苯并噻吩基)、苯并噁唑基、苯并噻唑基(例如但不限于2-苯并噻唑基和5-苯并噻唑基)、嘌呤基、苯并咪唑基、苯并三唑基、硫代黄嘌呤基、咔唑基、咔啉基、吖啶基、吡咯双烷基，和喹嗪双烷基。
上述的杂环基和杂芳基部分的列举意图是代表性的而不是限制性的。
如本文所用，术语“说明材料”包括可用于传达本发明组合物和方法的用途的出版物、记录、图表或任何其他表达介质。在一些情况下，说明材料可以是用于治疗受试者的血液癌症的试剂盒的一部分。试剂盒的说明材料可以例如固定在含有本发明组合物的容器上，或与装有组合物的容器一起运输。或者，说明材料可以与容器分开运输，意图是接受者合作使用说明材料和组合物。例如，说明材料用于试剂盒；组合物的使用说明；或使用组合物制剂的说明。
如本文所用，所述术语“来氟米特”是指5-甲基-n-[4-(三氟甲基)苯基]-异噁唑-4-甲酰胺，或其盐或者溶剂合物。
如本文所用，所述术语“mds”是指骨髓增生异常综合征(mds)。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不消除用于本发明的化合物的生物学活性或性质且相对无毒的材料，例如载体或稀释剂，即该材料可给药于受试者而不引起不希望的生物效应或以有害的方式与其中所含的组合物的任何组分相互作用。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒酸和碱制备的给药的化合物的盐，包括其无机酸、无机碱、有机酸、无机碱、溶剂合物、水合物和包合物。
如本文所用，术语“预防”或“防止”是指避免或延迟与开始给药药剂或化合物时尚未出现这种症状的受试者中的疾病或病症相关的症状的发作。疾病、病症和障碍在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“反应条件”是指促进反应所需或任选需要的物理处理、化学试剂或其组合。反应条件的非限制性实例是电磁辐射、热、催化剂、化学试剂(例如但不限于酸、碱、亲电试剂或亲核试剂)和缓冲剂。
如本文所用，术语“盐”是指本发明所涵盖的化合物的盐，包括其无机酸，有机酸，无机碱，有机碱，溶剂合物，水合物或包合物。如本文所用，术语“盐”包括可用于本发明的化合物的游离酸或游离碱的加成盐。合适的酸加成盐可以由无机酸或有机酸制备。无机酸的实例包括盐酸，氢溴酸，氢碘酸，硝酸，碳酸，硫酸，磷酸，高氯酸和四氟硼酸。合适的有机酸可以选自脂族，脂环族，芳族，芳脂族，杂环，羧酸和磺酸类的有机酸，其实例包括甲酸，乙酸，丙酸，琥珀酸，乙醇酸，葡糖酸，乳酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，抗坏血酸，葡萄糖醛酸，马来酸，富马酸，丙酮酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯甲酸，邻氨基苯甲酸，4-羟基苯甲酸，苯乙酸，扁桃酸，扑酸(双羟萘酸)，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，泛酸，三氟甲磺酸，2-羟基乙磺酸，对甲苯磺酸，磺胺酸，环己基氨基磺酸，硬脂酸，海藻酸，β-羟基丁酸，水杨酸，半乳糖二酸和半乳糖醛酸。可用于本发明的化合物的合适碱加成盐包括例如金属盐，包括碱金属盐，碱土金属盐和过渡金属盐，例如锂盐，钙盐，镁盐，钾盐，铵盐，钠盐和锌盐。可接受的碱加成盐还包括由碱性胺例如n，n′-二苄基乙二胺，氯普鲁卡因，胆碱，二乙醇胺，乙二胺，葡甲胺(n-甲基葡糖胺)和普鲁卡因制成的有机盐。所有这些盐可以通过常规方法由相应的游离碱化合物通过例如使适当的酸或碱与相应的游离碱反应来制备。
如本文所用，术语“受试者”，“患者”或“个体”可以是人类或非人类哺乳动物或鸟类。非人哺乳动物包括例如家畜和宠物，如绵羊，牛，马，猪，犬科动物，猫科动物和鼠类哺乳动物。优选地，受试者是人。
如本文所用，术语“取代的”意指原子或原子团已经取代氢作为连接至另一基团的取代基。除非另有说明，本发明中列举的任何基团均可被取代。
对于芳基、芳基(c1-c3)烷基和杂环基，应用于这些基团的环的术语“取代的”是指任何取代水平，即单取代、二取代、三取代、四取代或五取代，在这种替代被允许的情况下。取代基是独立选择的，并且取代可以在任何化学可进行的位置。在一个实施方案中，取代基的数量在1和4之间变化。在另一个实施方案中，取代基的数量在1和3之间变化。在又一个实施方案中，取代基的数量在1和2之间变化。在又一实施方案中，所述取代基独立地选自c1-c6烷基、-oh、c1-c6烷氧基、卤素、氨基、乙酰氨基和硝基。如本文所用，当取代基是烷基或烷氧基时，碳链可以是支链、直链或环状的，其中直链是优选的。
如本文所用，术语“特立氟胺”是指(z)-2-氰基-3-羟基-n-(4-(三氟甲基)苯基)丁-2-烯酰胺，或者其立体异构体、盐或溶剂合物。
如本文所用，术语“治疗”是指通过向受试者给药药剂或化合物来降低受试者经历疾病或病症的症状的频率或严重程度。
贯穿本公开，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应该被认为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值，和在适当的情况下，在范围内的数值的部分整数。例如，诸如从1到6的范围的描述应该被认为具有具体公开的子范围，例如从1到3、1到4、1到5、2到4、2到6，从3到6等等，以及在该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这都适用。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方案的以下详细描述。为了说明本发明，在附图中示出了目前优选的实施方案。然而，应该理解的是，本发明不限于附图中所示的实施方案的精确布置和手段。
图1a-1f显示er-hoxa9细胞真实地代表了条件性髓样分化的模型。
图1a提供了facs分析。用mscvneo-er-hoxa9转导的原代鼠类骨髓细胞在β-雌二醇存在下生长为谱系阴性细胞((+)e2；左图)。如流式细胞术所证明的，e2的去除(从左到右：(-)24小时，(-)48小时，(-)72小时和(-)96小时)和er-hoxa9的失活导致髓样分化标记cd11b(mac1)和gr-1的同步上调。
图1b提供了显示流式细胞术碘化丙啶分析的图，其显示er-hoxa9细胞的终末分化伴随着从细胞周期中退出(从左到右：(+)e2；(-)24小时，(-)48小时，(-)72小时和(-)96小时)。
图1c提供了显微照片，其显示通过存在(+)e2和不存在e2(-96小时)的细胞的wright-giemsa染色来证实伴随髓样分化的形态学变化。
图1d提供显微照片，其显示终末分化的细胞(而非未分化的细胞)能够吞噬荧光标记的大肠杆菌(左：在β-雌二醇存在下，(+)e2；右：在除去e2后96小时，(-)96小时)。
图1e提供了一系列分析指定基因表达的变化的图(从左到右，从上到下：csfra2、ccl4、elane、cd34、lyz1、cd33、mpo、sox4、mmp9、ltf、myb、flt3、egfp、itgam、pim1、cebpa)。lys-gfp-er-hoxa9细胞显示了在5天时程的髓样分化后基因表达的预期变化。他们的逐步基因表达与未操纵的鼠类骨髓髓样细胞(图1f)以及原代人类骨髓细胞的纯化群体(图1g)的基因表达模式相平行。
图1f是显示未处理的鼠类骨髓髓样细胞中的比较时程的示意图。该分析说明全局基因表达时间线，其类似于骨髓衍生的嗜中性粒细胞中的正常基因表达。
图1g是显示原代人骨髓细胞中的比较时程的示意图。
图1h是显示野生型hoxa9和包含g400v突变的hoxa9er融合蛋白的示意图。
图1i显示用er-hoxa9构建体转导的原代鼠类骨髓细胞的细胞表面标记谱(顶部，从左到右：ssc-avs.fsc-a；fsc-wvs.fsc-a；ssc-wvs.ssc-a；7aadvs.fsc-a；底部，从左到右：kitvs.lin；kitvs.sca；cd16/32vs.cd34；正常骨髓：cd16/32vs.cd34)。
图1j是显示在用er-hoxa9构建体转导的未分化鼠类骨髓细胞(具有方形的图)中和在未分化对照细胞(具有点的图)中的超氧化物生成的图。
图1k是显示在hoxa9-er[小时]骨髓衍生的嗜中性粒细胞[d]与对照细胞的β-雌二醇(e2)诱导的分化过程中的基因表达模式的热图。
图1l提供两幅图，显示在hoxa9-er骨髓衍生的嗜中性粒细胞与对照细胞的β-雌二醇(e2)诱导的分化过程中基因表达模式的基因集富集分析(gsea)(顶部：上调的基因；底部：下调的基因)。
图2a-2h显示高通量筛选和药物化学鉴定小分子ml390作为髓样分化的诱导剂。
图2a包括显示gfp表达分析的两个图(左：存在β-雌二醇，(+)e2；右：除去e2，(-)e2)。在去除雌二醇后进行分化后，lys-gfp-er-hoxa9gmp上调gfp荧光。
图2b包括两个图，显示了图2a中描述的细胞中细胞表面标记cd11b(mac1)和gr-1的表达分析(左：在β-雌二醇(+)e2存在下；右：去除e2(-)e2)。
图2c是显示建立高通量流式细胞术表型筛选以鉴定可通过上调gfp和cd11b监测可触发lys-gfp-er-hoxa9细胞分化的化合物的示意图。
图2d显示了图2c中描述的筛选中鉴定的十二种生物活性化合物中的两种，包括化合物3(c03)和化合物7(c07)。
图2e显示最有效的小分子是(r)-c07的衍生物，命名为ml390。
图2f是显示对比log[m]的c03(具有方形的图)和(r)-c07触发髓样分化[％](具有三角形的图)，而(s)-c07(具有菱形的图)完全失去活性的图。
图2g是显示ml390能够在鼠(具有点的er-hoxa9图)和人急性髓性白血病(aml)模型(具有方形的u937图和具有三角形的thp1图)中引起髓样分化[％]的图。
图2h显示成像流式细胞术，其证明在不存在β-雌二醇(-e2)的情况下的分化或者用ml390处理所导致的分化期间，在lys-gfp-er-hoxa9细胞中gfp和cd1lb表达的上调以及kit表达的下调(顶部：在β-雌二醇的存在下，(+)e2；中部：除去e2，(-)e2；底部：在β-雌二醇和ml390的存在下，(+)e2+ml390)。
图2i显示了在96小时在未分化和分化的lys-gfp-er-hoxa9细胞中gfp、kit、cd11b和dapi的成像流式细胞术分析(顶部：在β-雌二醇存在下未分化，(+)e2；底部：分化，在去除e2后96小时，(-)e296小时)。
图2j是图，其显示在存在(+)e2的情况下(具有点的图)/在不存在β-雌二醇(-e2)的情况下(具有方形的图)在lys-gfp-er-hoxa9细胞中细胞增殖的分析。
图3a-3g显示抗性细胞系将dhodh鉴定为ml390的靶标。
图3a是图，其显示随时间[天]推移的抗性细胞系生长[log细胞计数]。对c03和(r)-c07耐受的er-hoxa9和u937细胞系通过以下方法产生：在缓慢增加浓度的化合物中连续培养，方形图10μmol、25μmol、50μmol、点线dmso。
图3b是示出在dmso对照和化合物抗性细胞之间的基因表达的比较的图，其证明在四种抗性细胞系中共享仅8个过表达的基因。
图3c是图，其显示8个基因始终显示超过8倍的上调，并且是染色体16(人)和染色体8(小鼠)上的基因邻居，如图“倍数变化[log2]”对比“在u937细胞中的dmsovsc07”所示。
图3d是图，其显示全外显子组测序数据的分析揭示在16号染色体的狭窄区域上的覆盖率增加，这与作为基因表达增加的机制的染色体扩增一致，该图显示了“拷贝数比率”与16号染色体位置的关系。
图3e是显示用指定化合物抑制dhodh酶的图。通过使用体外酶抑制测定，dhodh被确认为c03(具有向下指向的三角形的图)、c07(具有点的(r)-c07图；具有方形的(s)-c07图)和ml390(具有向上指向的三角形的图)的靶标。
图3f是显示通过在细胞培养基中补充尿苷可以消除c03和ml390的分化作用的图。该图显示“从分化拯救％”vs“log[m]尿苷”。
图3g提供了用ml390处理的lys-gfp-er-hoxa9细胞中基因表达的基因集富集分析(gsea)。通过基因集富集分析，“富集评分”vs“基因列表中的排序”，细胞显示与髓样分化一致的基因表达变化(顶部：上调的基因；底部：下调的基因)。
图3h提供了ven图，其显示了在小鼠和人抗性细胞系中过表达的基因的重叠。
图3i是图，其显示了在用布喹那(具有菱形的图)(brq)、ml390(具有三角形的图)、(s)-c07(具有方形的图)，和特立氟胺(具有点的图)处理的细胞中的dhodh酶抑制。
图3j是图，其显示了在用布喹那(brq)(具有黑点的图)、ml390(具有较浅的点的图)、(s)-c07(向上指向的三角形的图)、(r)-c07(具有方形的图)，和来氟米特(lef)/特立氟胺(teri)(具有向下指向的三角形的图)处理的细胞中的分化％。
图3k是图，其显示了在er-hoxa9细胞(具有点的图)、u937(具有方形的图)和thp1人类白血病细胞系(具有三角形的图)中的分化％。
图3l提供了ven图，其显示了在嗜中性粒细胞vs.er-hoxa9细胞在不存在β-雌二醇(-e2)vs.用ml390处理的er-hoxa9细胞的情况下过表达的基因中的重叠。
图3m是热图，其显示了在不存在β-雌二醇(-e2)vs.用ml390处理的er-hoxa9细胞的情况下的er-hoxa9细胞。
图4a-4d显示布喹那在急性髓性白血病(aml)的体内异种移植模型中引起分化并显示出抗肿瘤活性。
图4a是显示用布喹那治疗期间肿瘤大小的图。将thp1细胞皮下植入scid小鼠的胁腹，并在10天的过程中用媒介物(具有点的图)或布喹那ip(5mg/kg，每天一次(qd)(具有方形的图)，15mg/kg，每三天一次(q3d)(具有三角形的图))处理小鼠。该图显示“肿瘤面积(mm2)”对比“天数”。
图4b显示thp1细胞中cd11b表达的流式细胞术分析结果(顶部：媒介物；中部：布喹那(brq)，5mg/kg，每天一次(qd)；底部：布喹那，15mg/kg，每三天一次(q3d))。在治疗10天结束时外植肿瘤并通过流式细胞术分析分化标记cd11b。
图4c是显示相对于对照细胞用指定剂量的布喹那(brq)处理的细胞中的cd11b表达的图。比较每组3只小鼠，左侧媒介物，中间5mg/kgqdbrq，右侧15mg/kgq3dbrq的外植肿瘤的cd11b-apc表达的几何平均荧光强度。
图4d显示了从外植肿瘤提取到甲醇中的代谢物水平以及通过质谱法测量的细胞内尿苷水平。(a)和(c)中的数据表示为平均值±sd。z，媒介物左方点，brq5mg/kgqd右方正方形。
图4e显示单次ip剂量后布喹那血浆浓度的分析(左图：血浆浓度图；右图：药代动力学数据图)。从上到下：实线：顶部图，50mg/kgi.p.sd，下面，25mg/kgi.p.sd，和底部图，点线：ic50_u(thp-1)和底线ic50_u(ubiochem)，“未结合浓度[μg/l]”。
图4f提供了在discoverx激酶测定中对布喹那激酶抑制活性的分析。
图4g是显示在存在或不存在布喹那的情况下培养的肿瘤细胞的羧基荧光素(cfse)测定中的增殖，具有点的对照图和具有方形的brq图，“apc荧光”对比“天数”。
图5a-5e显示dhodh的抑制导致上游代谢物的积累和下游代谢物的消耗。
图5a是显示涉及从头嘧啶合成的酶促步骤的模型的示意图。dhodh位于线粒体内膜中并将电子传递给泛醌。
图5b是显示二氢乳清酸倍数变化的图。用ml390处理er-hoxa9细胞导致二氢乳清酸积累。
图5c提供显示下游代谢物消耗的图，从左至右包括ump、尿苷、udp、udp-glcnac和udp-葡萄糖，对照矩形，ml390点矩形。
图5d提供了显示用吡唑呋喃菌素处理的er-hoxa9细胞中的分化百分比的图。用吡喃呋喃菌素(一种omp脱羧酶抑制剂)处理er-hoxa9细胞导致可以通过尿苷补充培养基来拯救的分化，(-)具有点的尿苷图，(+)具有正方形的尿苷图，“分化％”对比“log[m]吡唑呋喃菌素”。
图5e是免疫印迹。用ml390或布喹那处理细胞，然后进行免疫印迹，证明蛋白n-乙酰糖基化(glcnac)程度的总体降低，从左到右(-)e24天、(+)e2对照、布喹那、ml390。
图6a-e显示布喹那在急性髓性白血病(aml)的体内同系模型中引起分化并显示出抗白血病活性。
图6a是显示治疗方案的示意图。采用hoxa9和meis1驱动的急性髓性白血病的同系模型来确定布喹那的体内活性。
图6b显示了来自用布喹那处理的小鼠的骨髓白血病细胞的流式细胞术分析的结果表明分化标记物cd11b和gr-1的表达增加，(左侧：媒介物；右侧：布喹那(brq)，25mg/kg)，“gr-1”对比“mac1(cd11b)”。
图6c提供了显示分析布喹那治疗的一系列图表。与媒介物治疗的小鼠相比，每隔一天给予25mg/kg布喹那(总共4次剂量)治疗的小鼠显示骨髓中白血病负荷降低(上，左)，脾重量正常化(上，中)，外周血白血病减少(上，右)，白血病细胞减少(底部，左)和增加的分化标记mac1(底部，中部)和gr1(底部，右)。
图6d提供了显示分析布喹那治疗的一系列图表。与媒介物治疗的小鼠相比，在7天时间表的第1天和第4天给予25mg/kg布喹那(总共6个剂量)治疗的小鼠显示白血病负担(骨髓中的白血病负担)的更急剧减少(顶部，左侧)，脾重量正常化(顶部，中心)，外周血白血病(顶部，右侧)，白血病细胞(底部，左侧)和分化标记mac1(底部，中)和gr1(底部，右侧)。
图6e提供了显示分析布喹那治疗的一系列图表(从左到右：小鼠体重，血细胞比容(hct)，白细胞计数(wbc和血小板计数(plt))。小鼠接受治疗3周(从第14天到第33天)，每隔一天给予5mg/kg或10mg/kg布喹那(左图)，或在7天时间表的第1天和第4天给予25mg/kg布喹那。布喹那处理的小鼠在所有三组中均比媒介物处理的小鼠存活得更久。
图6f提供了一系列图表，其显示了布喹那治疗小鼠体重的分析(从左到右：小鼠体重，血细胞比容(hct)，白细胞计数(wbc)和血小板计数(plt))。
图7a-7b显示布喹那触发体内分化的形态学证据并导致白血病起始细胞活性的消耗。
图7a提供了两张显微照片(左：媒介物；右：布喹那)。用媒介物或布喹那处理的小鼠的白血病细胞通过facs纯化。用wright-giemsa染色的cytospin制剂在布喹那处理的小鼠中分离的白血病细胞中显示出粒细胞成熟的迹象，包括细胞核凝集和细胞质透明。
图7b提供了显示用布喹那或对照处理的小鼠的存活时间过程的两幅图(左图：每隔一天(q2d)以25mg/kg接受布喹那(brq)4次剂量的小鼠的研究；右图：在7天周期的第1天(d1)和第4天(d4)以25mg/kg接受布喹那(brq)6次剂量的小鼠的研究)。作为白血病起始细胞活性的功能测定，将来自用媒介物或布喹那处理的小鼠的相同数量的纯化的活的白血病细胞的引入受者小鼠。
图8是显示单次25mg/kg剂量的布喹那(brq)后血浆尿苷水平的图。将布喹那给药于急性髓性白血病(aml)的同系鼠模型(时间0，具有点的图)。之后分析尿苷的血浆水平(具有三角形的图)，“布喹那[um]”和“尿苷[z.yx106]”对比“小时”。
图9是显示在单次25mg/kg剂量的布喹那后二氢乳清酸(dho)的水平的图。在布喹那给药后72小时内dho水平下降到检测不到的水平，dho[ug/l)具有方形的图，brq[um]具有点的图，“brq[um]”和dho[um/l]对比小时。
图10包括显示在单次25mg/kg剂量的布喹那之后的dho水平的两幅图(顶部)和显示给药dhodh抑制剂ml390(右侧)或对照(左侧)之后的dho的倍数变化的第三图(底部)。
图11是显示无论布喹那给药[um]是通过腹膜内(ip，具有点的图)还是通过嘴(po，具有向上指向的三角形的图)，dho水平的变化是相似的的图，点图dho[ng/ul](ip，具有方形的图)，(po，具有向下指向的三角形的图)。
图12是显示dho水平在25、50或100mg/kg发生类似变化的图。示出布喹那：25(具有浅点的图)、50(具有方形的图)，或者100mg/kg(具有向上指向的三角形的图)，对于dho：点图，25(具有向下指向的三角形的图)、50(具有菱形的图)和100mg/kg(具有黑点的图)、“brq”和“dho”对比“小时”。
图13是显示在腹膜内给药(ip)的3个不同剂量的布喹那下观察到高于阈值的类似时间的图。
具体实施方式
本发明总体上提供可用于在需要的受试者中治疗或者预防一些类型的血液癌症的化合物和将这些化合物给药于患有血液癌症的受试者的方法。在一些实施方案中，本发明化合物克服了在罹患血液癌症的受试者中的分化停滞。
本发明至少部分基于抑制二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)能够促进髓样分化的发现以及给药这些化合物以增强其功效的方法的发现。在体内急性髓性白血病(aml)模型中，dhodh抑制剂降低白血病细胞负荷，降低白血病起始细胞的水平并提高存活率。dhodh抑制可为克服aml患者的分化阻滞提供新的代谢靶标。
在具体的实施方案中，本发明提供dhodh抑制剂布喹那用于治疗aml的用途。先前对dhodh抑制剂的研究已经以基于体重的方式给药该抑制剂。在那些研究中，给药dhodh抑制剂导致毒性并缺乏有效性。当dhodh抑制剂每日给药于小鼠时观察到类似的结果。这种剂量导致严重的贫血，严重的血小板减少症和约10天的治疗后死亡。出乎意料的是，当每3天给药一次dhodh抑制剂布喹那时，它有效对抗aml并且耐受性良好。
在一些实施方案中，本发明所涵盖的癌症的特征在于分化停滞。在其他实施方案中，将本发明化合物给药于受本发明所涵盖的癌症影响的受试者克服了癌症中的分化停滞。本发明还包括包含一种或多种本发明化合物的组合物，以及使用本发明化合物治疗或预防一些类型的血液癌症的方法。
急性髓性白血病
急性髓性白血病(aml)是一种临床上具有破坏性的疾病。即使在诊断和支持治疗方面有所改善，成人aml的5年生存率也仅为30％，65岁以上患者的预后更差。尽管这些令人失望的结果，并强调了对新的治疗的需求，但阿糖胞苷与蒽环类抗生素组合的化疗标准护理仍然保持40多年不变。
aml的一个标记是髓样白血病母细胞在分化的早期阶段被阻滞。在发展精细核型分析和遗传分析之前，将未成熟的形态学标记用于组织学分类病人的疾病(例如，1976年fab分类方案)。认识到白血病母细胞在分化的不成熟阶段似乎被冻结，表明新的疗法可针对促进分化而不是简单地杀死白血病细胞。
在一小部分(10％)急性早幼粒细胞性白血病(apl，fabm3)患者中，复发性染色体易位导致涉及视黄酸受体的融合癌蛋白。通过用全反式视黄酸(atra)和三氧化二砷治疗患者来探索这种依赖性，将细胞从分化停滞释放，使得白血病母细胞恢复其正常成熟过程，终末分化为嗜中性粒细胞。这种分化疗法的巨大成功和临床影响已经颠覆了apl患者的生存曲线。apl曾经是aml的最严重的预后亚群之一，现在治愈率最高，总生存率超过85％。尚未得到满足的挑战是为剩余的90％非apl急性髓性白血病患者确定相似的分化疗法。
为确定新的治疗靶标以克服髓样分化阻滞而进行的大量努力大都不成功。在最近类似于apl的发展中，突变异柠檬酸脱氢酶2(idh2)的小分子抑制剂可能能够诱导具有idh2突变的那部分患者(9％)中的细胞分化。然而，其余的aml病例涉及染色体改变和基因突变的复杂和异质组合。突变特异性治疗药物的开发是一项艰巨的挑战，即使是合理设计的强效靶标(如突变型flt3)的抑制剂在临床上也令人失望。
另一种策略是基于推理，即影响分化或自我更新的各种致突变事件可通过共同的分子途径汇集。该策略试图确定和靶向可能在aml基因亚型范围内共享的分化途径。有趣的是，同源框转录因子hoxa9的表达在70％的aml患者中上调，可能反映了白血病母细胞在分化停滞的一个常见阶段停止。hoxa9对于正常的骨髓生成是至关重要的，其表达必须下调以允许正常分化。此外，hoxa9对mll易位如mll/af9所致白血病的维持很重要，hoxa9在慢性髓性白血病患者转变为急变期疾病期间上调，而hoxa9表达本身是患有白血病的儿童的独立危险因素。因此，不希望受理论束缚，虽然未发现突变，但hoxa9的持续表达可能代表aml中常见的失调节点，适合作为跨一系列不同亚型的治疗靶向。
由于没有已知的hoxa9小分子抑制剂，开发了可用于无偏的表型筛选的hoxa9强化的髓样分化停滞的细胞模型。由于hoxa9的持续表达导致髓样分化停滞，使用雌激素受体-hoxa9(er-hoxa9)融合蛋白来有条件地永生化原代鼠类骨髓的培养物。从gfp敲入溶菌酶基因座的小鼠的骨髓中产生er-hoxa9细胞。由于溶菌酶是仅在终末分化的细胞中表达的髓样颗粒蛋白，因此该细胞系系统允许大规模的小分子表型筛选来鉴定在活性hoxa9存在下能够触发分化的那些。
二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)被确定为最具活性的化合物的靶标。dhodh是负责从头嘧啶生物合成的第四和限速步骤的酶，并且其调节先前未显示诱导aml分化。在这项研究中，dhodh抑制剂在体内和体外都在aml的鼠和人模型二者中表现出有效的分化活性。不受理论束缚，dhodh抑制剂的抗白血病活性指向尿苷生物合成与细胞命运决定之间的新的联系，并且可能为治疗aml患者提供急需的新治疗选择。
化合物
在一个方面，本发明提供抗癌化合物。在一些实施方案中，所述化合物包括哺乳动物dhodh(二氢乳清酸脱氢酶)的抑制剂，或其盐或者溶剂合物。在其它实施方案中，所述哺乳动物dhodh包括人dhodh。
在一些实施方案中，本发明包括至少一种选自以下的化合物，或其盐或者溶剂合物：
布喹那(也被称为6-氟-2-(2′-氟-[1，1′-联苯]-4-基)-3-甲基-喹啉-4-甲酸)
来氟米特(也被称为5-甲基-n-[4-(三氟甲基)苯基]-异噁唑-4-甲酰胺)
特立氟胺(也被称为(2z)-2-氰基-3-羟基-n-[4-(三氟甲基)苯基]丁-2-烯酰胺)
或其任何组合。
本发明的化合物可以具有一个或多个立构中心，并且每个立构中心可以以(r)或(s)构型独立存在。在一个实施方案中，本文描述的化合物以光学活性或外消旋形式存在。本文所述的化合物涵盖具有本文所述的治疗有用性质的外消旋，旋光，区域异构和立体异构形式或其组合。旋光形式的制备以任何合适的方式进行，包括作为非限制性实例，通过用重结晶技术拆分外消旋形式，由光学活性原料合成，手性合成或使用手性固定相的色谱分离。在一个实施方案中，一种或多种异构体的混合物用作本文所述的治疗化合物。在另一个实施方案中，本文所述的化合物含有一个或多个手性中心。这些化合物通过任何方式制备，包括立体选择性合成，对映体选择性合成和/或对映异构体和/或非对映异构体混合物的分离。化合物和异构体的拆分通过任何方式来实现，包括(作为非限制性实例)化学方法，酶促方法，分步结晶，蒸馏和色谱法。
本文所述的方法和制剂包括使用具有本发明任何化合物的结构的化合物的n-氧化物(如果合适的话)，结晶形式(也称为多晶型物)，溶剂合物，无定形相和/或药学上可接受的盐，以及具有相同类型活性的这些化合物的代谢物和活性代谢物。溶剂合物包括水，醚(例如四氢呋喃或甲基叔丁基醚)或醇(例如乙醇)溶剂合物，乙酸酯等。在一个实施方案中，本文所述的化合物以与药学上可接受的溶剂例如水和乙醇的溶剂化形式存在。在另一个实施方案中，本文所述的化合物以非溶剂化形式存在。
在一个实施方案中，本发明的化合物可以作为互变异构体存在。所有互变异构体均包括在本文所述化合物的范围内。
在一个实施方案中，本文所述的化合物被制备为前药。“前药”是在体内转化为母体药物的药剂。在一个实施方案中，在体内给药时，前药被化学转化为化合物的生物学，药学或治疗活性形式。在另一个实施方案中，前药通过一个或多个步骤或过程酶促代谢为该化合物的生物学，药学或治疗活性形式。
在一个实施方案中，例如本发明化合物的芳环部分上的位点易受各种代谢反应的影响。在芳环结构上引入合适的取代基可以减少，最小化或消除这种代谢途径。在一个实施方案中，用于降低或消除芳环对代谢反应的敏感性的合适取代基为(仅示例性的)氘、卤素或烷基。
本文所述的化合物还包括同位素标记的化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数的原子替代。适合包含在本文所述化合物中的同位素的实例包括但不限于2h、3h、11c、13c、14c、36cl、18f、123i、125i、13n、15n、15o、17o、18o、32p，和35s。在一个实施方案中，同位素标记的化合物可用于药物和/或底物组织分布研究。在另一个实施方案中，用较重的同位素例如氘取代提供了更高的代谢稳定性(例如增加的体内半衰期或减少的剂量需求)。在又一个实施方案中，用正电子发射同位素如11c、18f、15o和13n取代可用于正电子发射形貌(pet)研究以检查底物受体占有率。同位素标记的化合物通过任何合适的方法或通过使用合适的同位素标记的药剂代替其他未使用的未标记的药剂的方法来制备。
在一个实施方案中，本文所述的化合物通过其他手段标记，包括但不限于使用发色团或荧光部分，生物发光标记或化学发光标记。
本发明还包括药物组合物，其包含本发明化合物和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，药物组合物还包含至少一种用于治疗本文所考虑的疾病或障碍的其他药剂。在一些实施方案中，本发明的化合物和另外的药剂共同配制在组合物中。
盐
本文所述的化合物可以与酸形成盐，并且这些盐包括在本发明中。在一个实施方案中，盐是药学上可接受的盐。术语“盐”包括在本发明的方法中有用的游离酸的加成盐。术语“药学上可接受的盐”是指具有在提供药物应用中的效用的范围内的毒性特征的盐。药学上不可接受的盐仍可具有例如高结晶度的性质，其在本发明的实践中具有实用性，例如在本发明方法中有用的化合物的合成、纯化或配制过程中的实用性。
合适的药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸或有机酸制备。无机酸的实例包括盐酸，氢溴酸，氢碘酸，硝酸，碳酸，硫酸(包括硫酸盐和硫酸氢盐)和磷酸(包括磷酸氢盐和磷酸二氢盐)。合适的有机酸可以选自脂族，脂环族，芳族，芳脂族，杂环，羧酸和磺酸类的有机酸，其实例包括甲酸，乙酸，丙酸，琥珀酸，乙醇酸，葡糖酸，乳酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，抗坏血酸，葡萄糖醛酸，马来酸，丙二酸、糖精、富马酸，丙酮酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯甲酸，邻氨基苯甲酸，4-羟基苯甲酸，苯乙酸，扁桃酸，扑酸(双羟萘酸)，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，泛酸，三氟甲磺酸，2-羟基乙磺酸，对甲苯磺酸，磺胺酸，环己基氨基磺酸，硬脂酸，海藻酸，β-羟基丁酸，水杨酸，半乳糖二酸和半乳糖醛酸。
本发明化合物的合适的药学上可接受的碱加成盐包括例如金属盐，包括碱金属盐，碱土金属盐和过渡金属盐，例如钙盐，镁盐，钾盐，钠盐和锌盐。药学上可接受的碱加成盐还包括由碱性胺如n，n′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(n-甲基葡糖胺)和普鲁卡因制成的有机盐。所有这些盐可以由相应的化合物，通过该化合物与例如合适的酸或碱反应来制备。
组合疗法
在一些实施方案中，本发明的化合物可与至少一种用于治疗或预防本发明所涵盖的疾病或障碍的其他药剂组合用于本发明的方法。该另外的药剂可包含本文鉴定的化合物或已知用于治疗、预防或减轻血液癌症的症状的化合物，例如市售化合物，所述血液癌症例如但不限于急性髓性白血病(aml)、急性早幼粒细胞性白血病(apl)、混合性白血病(mll)、急性淋巴细胞性白血病(all)、骨髓增生异常综合征(mds)、慢性髓性白血病(cml)，和/或粒单核细胞性白血病(mml)。
在一些实施方案中，所述至少一种另外的药剂为抗癌剂。
所述抗癌剂可选自131i-chtnt、阿巴瑞克、阿比特龙、阿柔比星、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumabemtansine)、阿法替尼、阿柏西普、阿地白介素、阿雷替尼、阿仑单抗、阿仑膦酸、阿利维a酸、六甲蜜胺、氨磷汀、氨鲁米特、氨基酮戊酸己酯(hexylaminolevulinate)、氨柔比星、安吖啶、阿那曲唑、安西司亭、茴三硫(anetholedithiolethione)、anetumabravtansine、血管紧张素ii、抗凝血酶iii、阿瑞吡坦、阿西莫单抗、小白菊内酯(arglabin)、三氧化二砷，门冬酰胺酶、阿昔替尼、阿扎胞苷、巴利昔单抗、贝洛替康、苯达莫司汀、贝索单抗、贝林司他、贝伐单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、比生群、博来霉素、兰妥莫单抗、硼替佐米、布舍瑞林、博舒替尼、本妥昔单抗(brentuximabvedotin)、白消安、卡巴他赛、卡博替尼、降钙素、亚叶酸钙(calciumfolinate)、左亚叶酸钙、卡培他滨、卡罗单抗、卡铂、卡巴醌、卡非佐米、卡莫氟、卡莫司汀、卡妥索单抗、塞来考昔、西莫白介素、色瑞替尼、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、氯地孕酮、氮芥、西多福韦、西那卡塞、顺铂、克拉屈滨、氯甲双磷酸、氯法拉滨、cobimetinib、库潘尼西(copanlisib)、克立他酶(crisantaspase)、克唑替尼、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、达雷木单抗、达贝泊汀α、达拉菲尼(dabrafenib)、达沙替尼、正定霉素、地西他滨、地加瑞克、地尼白介素2(denileukindiftitox)、地舒单抗(denosumab)、地普奥肽、地洛瑞林、环氧乳醇、右雷佐生、二溴螺氯铵、二去水卫矛醇、双氯芬酸(diclofenac)、dinutuximab、多西他赛、多拉司琼、去氧氟尿苷、多柔比星、多柔比星+雌激素酮、屈大麻酚、依库珠单抗(eculizumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依利醋铵、依洛珠单抗、艾曲泊帕、内皮他丁、依诺他滨、恩扎鲁胺、表柔比星、环硫雄醇、红细胞生成素α、红细胞生成素β、红细胞生成素ζ(epoetinzeta)、依他铂、艾立布林(eribulin)、厄洛替尼、艾美拉唑、雌二醇、雌莫司汀、炔雌醇、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、法倔唑、芬太尼、非格司亭、氟甲睾酮、氟尿苷、氟达拉滨、氟脲嘧啶、氟他胺、亚叶酸、福美司坦、福沙吡坦、福莫司汀、氟维司群、钆布醇、加多利道、钆特酸葡甲胺(gadotericacidmeglumine)、钆维胺、钆塞酸、硝酸镓、加尼瑞克、吉非替尼、吉西他滨、吉姆单抗、羧肽酶、谷胱甘肽、gm-csf、戈舍瑞林、格雷西隆、粒细胞集落刺激因子、二盐酸组胺、组氨瑞林、羟基尿素、i-125粒子、兰索拉唑、伊班膦酸、替伊莫单抗、依鲁替尼、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、咪喹莫特、英丙舒凡、吲地司琼、英卡膦酸、丁烯英酯(ingenolmebutate)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、碘比醇、碘苄胍(123i)、碘美普尔、伊匹单抗、依立替康、伊曲康唑、伊沙匹隆、ixazomib、兰瑞肽、兰索拉唑、拉帕替尼、lasocholine、雷利度胺、lenvatinib、雷诺格拉斯蒂姆、香菇多糖、来曲唑、亮丙瑞林、左旋咪唑、左炔诺孕酮、左甲状腺素钠、麦角乙脲、洛铂、洛莫司汀、氯尼达明、马索丙考、甲孕酮、甲地孕酮、美拉胂醇、美法仑、去氢甲睾酮、巯嘌呤、美司钠、美沙酮、甲氨蝶呤、甲氧沙林、氨基酮戊酸甲基酯(methylaminolevulinate)、甲泼尼龙、甲基睾丸素、美替罗星、米伐木肽、米替福新、米铂、二溴甘露醇、米托胍腙、二溴卫矛醇、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、mogamulizumab、莫拉司亭、莫哌达醇、盐酸吗啡、硫酸吗啡、大麻隆、nabiximols、那法瑞林、纳洛酮+戊唑辛、纳曲酮、那托司亭、奈昔木单抗、奈达铂、奈拉滨、奈立膦酸、奈妥匹坦/帕洛诺司琼、纳武单抗-喷曲肽、尼洛替尼、尼鲁米特、尼莫唑、尼妥珠单抗、尼莫司汀、nintedanib、硝氨丙吖啶、纳武单抗、奥妥珠单抗、奥曲肽、奥法木单抗、奥拉帕利、高三尖杉酯碱、奥美拉唑、奥坦西隆、奥普瑞白介素、奥古蛋白、orilotimod、奥西替尼(osimertinib)、奥沙利铂、氧可酮、羟甲烯龙、奥佐米星(ozogamicine)、p53基因治疗、紫杉醇、帕博西林(palbociclib)、帕利夫明、钯-103粒子、帕洛诺司琼、帕米膦酸、帕尼单抗、帕比司他、泮托拉唑、帕唑帕、天门冬酰胺酶、peg-依泊汀β(甲氧基peg-依泊汀β)、帕母单抗、培非格司亭、聚乙二醇干扰素α-2b、培美曲塞、喷他佐辛、喷司他丁、培洛霉素、全氟丁烷、过磷酰胺、帕妥珠单抗、溶链菌、匹鲁卡品、吡柔比星、匹克生琼、普乐沙福、光辉霉素、聚氨葡糖、聚磷酸雌二醇、聚乙烯吡咯烷酮+玻璃酸钠、云芝多糖-k、泊马度胺、帕纳替尼、卟菲尔钠、普拉曲沙、泼尼氮芥、泼尼松、甲基苄肼、丙考达唑、普萘洛尔、喹高利特、雷贝拉唑、雷妥莫单抗、镭-223氯化物、拉多替尼、雷洛昔芬、雷替曲塞、雷莫司琼、雷莫芦单抗、雷莫司汀、拉布立酶、雷唑巴占、refametinib、瑞戈非尼、利塞膦酸、铼-186、依替膦酸、利妥昔单抗、罗拉匹坦、罗米地辛、罗米司亭、罗莫肽、roniciclib、来昔屈南钐(153sm)、沙莫司亭、沙妥莫单抗、分泌素、司妥昔单抗、普罗文奇(sipuleucel-t)、西佐喃、索布佐生、甘氨双唑钠、sonidegib、索拉非尼、吡唑甲氢龙、链佐星、舒尼替尼、他拉泊芬、talimogenelaherparepvec、他米巴罗汀、他莫昔芬、他喷他多、他索纳明、替西白介素、锝(99mtc)巯诺莫单抗、99mtc-hynic-[tyr3]-奥曲肽、替加氟、替加氟+吉美嘧啶+奥替拉西、替莫卟吩、替莫唑胺、西罗莫司、替尼泊苷、睾酮、替曲膦、沙利度胺、噻替派、胸腺法新、促甲状腺素α、硫鸟嘌呤、托珠单抗、托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲贝替定、曲美替尼(trametinib)、曲马多、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(trastuzumabemtansine)、曲奥舒凡、维a酸、曲氟尿苷+胸苷磷酸化酶抑制剂(trifluridine+tipiracil)、曲洛司坦、曲普瑞林、曲美替尼、曲磷胺、促血小板生成素、色氨酸、乌苯美司、瓦他拉尼、戊柔比星、凡德他尼、伐普肽、维罗非尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春氟宁、长春瑞滨、维莫德吉、伏立诺他、伏氯唑、钇-90玻璃微球、净司他丁、净司他丁斯酯、唑来膦酸、佐柔比星，但是不限于此。
在其它实施方案中，所述至少一种另外的药剂为抗癌剂，尤其为阿糖胞苷和/或蒽环类抗生素。
在其它实施方案中，所述至少一种另外的药剂包括atra或者三氧化二砷。
协同效应可例如使用适合的方法计算，例如，sigmoid-emax方程(holford&scheiner，19981，clin.pharmacokinet.6：429-453)、loewe加和性方程(loewe&muischnek，1926，arch.exp.patholpharmacol.114：313-326)和中值效应方程(chou&talalay，1984，adv.enzymeregul.22：27-55)。可将上面提到的每一方程应用于实验数据以产生相应的图形，以帮助评价药物组合的效果。与上面提到的方程相关联的相应的图形分别为浓度-效应曲线、等效线图曲线和组合指数曲线。
方法和用途
在一个方面，本发明包括治疗或者预防受试者中的血液癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的至少一种本发明化合物。在其它实施方案中，所述至少一种本发明化合物配制在药物组合物中。
在一些实施方案中，所述血液癌症的特征在于分化停滞。在其它实施方案中，所述血液癌症包括急性髓性白血病(aml)、急性早幼粒细胞性白血病(apl)、混合性白血病(mll)、骨髓增生异常综合征(mds)，和/或慢性髓性白血病(cml)。在其它实施方案中，所述血液癌症包括aml。
在一些实施方案中，本发明化合物包括至少一种选自以下的化合物，或其盐或者溶剂合物：布喹那(也被称为6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸)；来氟米特(也被称为5-甲基-n-[4-(三氟甲基)苯基]-异噁唑-4-甲酰胺)；特立氟胺(也被称为(2z)-2-氰基-3-羟基-n-[4-(三氟甲基)苯基]丁-2-烯酰胺)；或其任何组合。
在一些实施方案中，本发明化合物包括布喹那(也被称为6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸)或其盐或者溶剂合物。
在一些实施方案中，所述化合物或者组合物通过至少一种选自以下的途径给药于所述受试者：口服、直肠、粘膜(例如，通过口服或者经鼻吸入)、透粘膜、局部(经皮)，和静脉内、真皮内、肌内、皮下、皮内、子宫内、硬膜外和脑室内注射。在其它实施方案中，将所述受试者进一步给药用于治疗或者预防血液癌症的至少一种另外的药剂。在其它实施方案中，所述受试者为哺乳动物。在其它实施方案中，哺乳动物为人类。在其它实施方案中，所述受试者不应答于一种或者多种可商购的和/可用的抗癌剂。
在一些实施方案中，本发明包括用于治疗或者预防血液癌症的化合物，更尤其为二氢乳清酸脱氢酶抑制剂(dhodh抑制剂)，更尤其为布喹那(也被称为6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸)；来氟米特(也被称为5-甲基-n-[4-(三氟甲基)苯基]-异噁唑-4-甲酰胺)；特立氟胺(也被称为(2z)-2-氰基-3-羟基-n-[4-(三氟甲基)苯基]丁-2-烯酰胺)；或其任何组合或其盐或者溶剂合物。
在一些实施方案中，本发明包括用于治疗或者预防血液癌症的化合物，更尤其为二氢乳清酸脱氢酶抑制剂(dhodh抑制剂)，更尤其为布喹那(也被称为6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸)或其盐或者溶剂合物。
在一些实施方案中，本发明包括用于治疗或者预防血液癌症的化合物，其中所述血液癌症为急性髓性白血病(aml)、急性早幼粒细胞性白血病(apl)、混合性白血病(mll)、骨髓增生异常综合征(mds)，和/或慢性髓性白血病(cml)。
在一些其它实施方案中，本发明包括用于治疗或者预防血液癌症的化合物，其中所述血液癌症为急性髓性白血病(aml)。
在一些其它实施方案中，本发明包括用于治疗或者预防血液癌症的二氢乳清酸脱氢酶抑制剂(dhodh抑制剂)，所述血液癌症更尤其为急性髓性白血病(aml)、急性早幼粒细胞性白血病(apl)、混合性白血病(mll)、骨髓增生异常综合征(mds)，和/或慢性髓性白血病(cml)，更尤其为急性髓性白血病(aml)。
在一些其它实施方案中，本发明包括选自以下的化合物：布喹那(也被称为6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸)；来氟米特(也被称为5-甲基-n-[4-(三氟甲基)苯基]-异噁唑-4-甲酰胺)；特立氟胺(也被称为(2z)-2-氰基-3-羟基-n-[4-(三氟甲基)苯基]丁-2-烯酰胺)；或其任何组合或其盐或者溶剂合物，其用于治疗或者预防血液癌症，更尤其为急性髓性白血病(aml)、急性早幼粒细胞性白血病(apl)、混合性白血病(mll)、骨髓增生异常综合征(mds)，和/或慢性髓性白血病(cml)，更尤其为急性髓性白血病(aml)。
在其它实施方案中，本发明包括选自布喹那(也被称为6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸)；来氟米特(也被称为5-甲基-n-[4-(三氟甲基)苯基]-异噁唑-4-甲酰胺)；特立氟胺(也被称为(2z)-2-氰基-3-羟基-n-[4-(三氟甲基)苯基]丁-2-烯酰胺)；或其任何组合或其盐或者溶剂合物的化合物用于制造药物的用途，所述药物用于预防或者治疗血液癌症，更尤其为急性髓性白血病(aml)、急性早幼粒细胞性白血病(apl)、混合性白血病(mll)、骨髓增生异常综合征(mds)，和/或慢性髓性白血病(cml)，更尤其为急性髓性白血病(aml)。
制剂/给药
本发明组合物可含有药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂，以及可通过适合的方法给药于受试者。
因此，在一些其他实施方案中，本发明包括组合物，其包含选自以下的化合物：布喹那(也被称为6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸)；来氟米特(也被称为5-甲基-n-[4-(三氟甲基)苯基]-异噁唑-4-甲酰胺)；特立氟胺(也被称为(2z)-2-氰基-3-羟基-n-[4-(三氟甲基)苯基]丁-2-烯酰胺)；或其任何组合或其盐或者溶剂合物，用于预防或者治疗，更尤其是用于治疗血液癌症，更尤其是急性髓性白血病(aml)、急性早幼粒细胞性白血病(apl)、混合性白血病(mll)、骨髓增生异常综合征(mds)，和/或慢性髓性白血病(cml)，更尤其是急性髓性白血病(aml)。
在一些其它实施方案中，本发明包括组合物，其包含选自以下的化合物：布喹那(也被称为6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸)；来氟米特(也被称为5-甲基-n-[4-(三氟甲基)苯基]-异噁唑-4-甲酰胺)；特立氟胺(也被称为(2z)-2-氰基-3-羟基-n-[4-(三氟甲基)苯基]丁-2-烯酰胺)；或其任何组合或其盐或者溶剂合物，以及药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂，用于预防或者治疗，更尤其是用于治疗血液癌症，更尤其是急性髓性白血病(aml)、急性早幼粒细胞性白血病(apl)、混合性白血病(mll)、骨髓增生异常综合征(mds)，和/或慢性髓性白血病(cml)，更尤其是急性髓性白血病(aml)。
根据本领域已知的任何常规方法，本发明的组合物可以以各种形式配制，包括口服剂型或无菌注射溶液。在其他实施方案中，组合物也可以用作吸入型药物递送系统。在其他实施方案中，本发明的组合物可以配制用于可注射溶液。
组合物可以配制成散剂，颗粒剂，片剂，胶囊剂，混悬剂，乳剂，糖浆剂，气雾剂，外用制剂，栓剂和无菌注射溶液。本领域已知的合适制剂公开于例如remington′spharmaceuticalscience(mackpublishingcompany，eastonpa)中。可包含在本发明组合物中的载体、赋形剂和稀释剂包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、羟基苯甲酸丙基酯、滑石、硬脂酸镁或者矿物油。
片剂还可含有标准成分，例如粘合和粒化剂如聚乙烯基吡咯烷酮、崩解剂(例如，可溶胀交联聚合物如交联羧甲基纤维素)、润滑剂(例如，硬脂酸盐)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸酯)、抗氧化剂(例如，bht)、缓冲剂(例如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)，和泡腾剂如柠檬酸盐/碳酸氢盐混合物。这种赋形剂是众所周知的，不需要在这里详细讨论。胶囊制剂可以是硬明胶或软明胶种类，并且可以含有固体、半固体或液体形式的活性组分。明胶胶囊可以由动物明胶或其合成的或植物来源的等价物形成。固体剂型(例如片剂，胶囊等)可以被涂覆或未被涂覆，但是通常具有涂层，例如保护膜涂层(例如蜡或清漆)或控释涂层。涂层(例如eudragit.tm.型聚合物)可以设计成在胃肠道内的期望位置释放活性成分。因此，可以选择涂层以便在胃肠道内的某些ph条件下降解，从而选择性地在胃中或回肠或十二指肠中释放化合物。可替代地或另外地，该包衣可以用作掩味剂来掩盖令人不愉快的味道，例如苦味药物。涂层可能含有糖或其他助剂掩盖不愉快的味道。代替包衣或除包衣外，抗生素可存在于包含释放控制剂(例如释放延迟剂)的固体基质中，所述释放控制剂可适于在胃肠道中的不同的酸性或碱性条件下选择性释放化合物。或者，基质材料或释放阻滞涂层可以采取易受侵蚀聚合物(例如，马来酸酐聚合物)的形式，其在剂型通过胃肠道时基本上不断被侵蚀。作为另一种选择，活性化合物可以配制在提供化合物释放的渗透控制的递送系统中。可以根据本领域技术人员公知的方法制备渗透释放和其他延迟释放或持续释放制剂。药物制剂可以以包含整个疗程的“患者包装”呈现给患者，包装在单个包装中，通常为泡罩包装。患者包比传统处方有优势，其中药剂师将患者的药物供应从大量供应中分离出来，因为患者始终可以访问包含在患者包中的包装插页，其通常在患者处方中缺失。已经显示包含包装说明书可以改善患者对医生说明书的依从性。每个片剂，胶囊，囊片，丸剂等可以是单一剂量，例如如本文所讨论的剂量，或剂量可以是两片或更多片剂，胶囊，囊片，丸剂等等；例如，如果片剂，胶囊等是125mg并且剂量是250mg，则患者可以在每个给药间隔时服用两个片、胶囊等。
本发明的组合物可以与常用的稀释剂或赋形剂如填充剂，增量剂，粘合剂，润湿剂，崩解剂或表面活性剂一起配制。用于口服给药的固体制剂包括片剂，丸剂，粉剂，颗粒剂或胶囊剂，并且除了组合物外，此类固体制剂还包含至少一种赋形剂，例如淀粉，碳酸钙，蔗糖，乳糖或明胶。除了简单的赋形剂外，还可以使用润滑剂如硬脂酸镁或滑石粉。用于口服给药的液体制剂包括悬浮液，溶液，乳剂和糖浆，并且除了水和液体石蜡之外，其还可以含有各种赋形剂，例如润湿剂，调味剂，芳香剂和防腐剂，它们是常用的简单稀释剂。
用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液，非水溶液，悬浮液，乳剂，冷冻干燥制剂和栓剂。作为非水溶剂或悬浮剂，可以使用丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，或可注射酯如油酸乙酯。作为栓剂的基质，可以使用witepsol，聚乙二醇，吐温61，可可脂，月桂脂肪或甘油明胶。
本发明药物组合物的优选剂量根据患者的病情和体重，疾病严重程度，药物类型，给药途径和给药时间而变化，并且可以由本领域技术人员适当选择。为了优选的效果，本发明的药物组合物可以以0.01-100mg/kg/天的剂量给药。给药可以是每天1至4次，例如每天一次，两次，三次或四次。在24小时内给药的最大量可以高达1500mg。给药可以持续2至30天，例如3至21天，例如7、10或14天。技术人员可以根据受试者的体重和总体健康状况以及给药抗生素的目的来调整剂量。根据获得的反应，可能会重复进行治疗。
在一些实施方案中，本发明包括二氢乳清酸抑制剂(dhodh抑制剂)，更尤其为布喹那(也被称为6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸)；来氟米特(也被称为5-甲基-n-[4-(三氟甲基)苯基]-异噁唑-4-甲酰胺)；特立氟胺(也被称为(2z)-2-氰基-3-羟基-n-[4-(三氟甲基)苯基]丁-2-烯酰胺)；或其任何组合或其盐或者溶剂合物，其用于预防或者治疗血液癌症的方法中，更尤其为急性髓性白血病(aml)、急性早幼粒细胞性白血病(apl)、混合性白血病(mll)、骨髓增生异常综合征(mds)，和/或慢性髓性白血病(cml)，更尤其为急性髓性白血病(aml)，所述方法包括将所述化合物以每48小时一次的频率或更高频率给药于需要的受试者。
在一些其它实施方案中，本发明包括二氢乳清酸抑制剂(dhodh抑制剂)，更尤其为布喹那(也被称为6-氟-2-(2’-氟-[1，1’-联苯]-4-基)-3-甲基喹啉-4-甲酸)；来氟米特(也被称为5-甲基-n-[4-(三氟甲基)苯基]-异噁唑-4-甲酰胺)；特立氟胺(也被称为(2z)-2-氰基-3-羟基-n-[4-(三氟甲基)苯基]丁-2-烯酰胺)；或其任何组合或其盐或者溶剂合物，其用于预防或者治疗血液癌症的方法中，更尤其为急性髓性白血病(aml)、急性早幼粒细胞性白血病(apl)、混合性白血病(mll)、骨髓增生异常综合征(mds)，和/或慢性髓性白血病(cml)，更尤其为急性髓性白血病(aml)，所述方法包括将所述化合物以每72小时一次的频率或更高频率给药于需要的受试者。
本发明组合物可通过各种途径给药于受试者。涵盖所有给药模式，例如，口服、直肠、粘膜(例如，通过口服或者经鼻吸入)、透粘膜、局部(经皮)或者通过静脉内、真皮内、肌内、皮下、皮内、子宫内、硬膜外或者脑室内注射。
除非另外指明，否则说明书和权利要求中使用的表示成分的量，性质(例如分子量，反应条件等)的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非有相反指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中提出的数值参数是近似值，其可以根据本发明试图获得的期望性质而变化。至少，而不是试图限制权利要求范围的等同原则的应用，每个数字参数至少应该根据所报告的有效数字的数目和通过应用普通舍入技术来解释。
尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和参数是近似值，但具体实施例中列出的数值尽可能精确地报道。但是，任何数值固有地包含必然由其各自测试测量中发现的标准偏差导致的某些误差。
应该理解的是，无论在何处提供数值和范围，这些值和范围所涵盖的所有值和范围都意图被包括在本发明的范围内。此外，落入这些范围内的所有值以及值范围的上限或下限也是本申请所预期的。
本领域技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文描述的特定程序，实施例，权利要求和示例的许多等同物。这样的等同物被认为是在本发明的范围内，并且由所附的权利要求覆盖。例如，应理解的是，使用本领域认可的代表并且使用不超过常规实验的反应条件(包括但不限于反应时间、反应尺寸/体积)，和实验试剂(例如溶剂、催化剂)、压力、气氛条件如氮气气氛和还原剂/氧化剂的修饰也在本申请的范围内。
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制造和使用本发明的测定，筛选和治疗方法的完整公开和描述，并且不意图限制发明人所认为的发明的范围。
实施例
现在参考以下实施例描述本发明。提供这些实施例仅仅是为了说明的目的，并且本发明不限于这些实施例，而且包括由于本文提供的教导而显而易见的所有变化。
除非另有说明，否则本文所述的用于合成的起始原料是从商业来源或已知的合成操作获得的并且不经进一步纯化而使用。
生物实施例
实施例1：er-hoxa9融合物建立了条件性髓样分化停滞的模型
高通量髓样分化测定是具有挑战性的，因为髓样分化的特异性测量是麻烦的，历史上依赖于形态学或酶促测定，最近依赖于基因表达的变化。此外，通常在aml细胞系中评估髓样分化，其中分化停滞的机制未定义。
使用雌激素受体-hoxa9(er-hoxa9)融合蛋白有条件地永生化原代鼠类骨髓的培养物。野生型hoxa9蛋白的持续表达足以在鼠类骨髓培养物中强制髓样分化停滞，并且将这些细胞注射入受者小鼠导致急性髓性白血病(aml)，尽管具有长潜伏期(kroon等人，theembojournal17，3714-3725，1998)。人类雌激素受体(er)的激素结合结构域与hoxa9的n末端融合产生一种蛋白，其在不存在β-雌二醇(e2)的情况下在细胞质中组成性翻译并以无活性形式隐蔽。在结合其β-雌二醇配体后，er-hoxa9蛋白转位至细胞核，在那里它保留了其作为转录因子的野生型活性。使用人类er的g400v变体。该变体使其对生理浓度的雌激素或在胎牛血清中发现的微量雌激素不敏感(图1h)。
用er-hoxa9构建体转导的原代鼠类骨髓细胞增殖为干细胞因子依赖性成髓细胞系，其细胞表面受体谱与粒细胞-巨噬细胞祖细胞(gmp)的一致(图1i)。在存在β-雌二醇和活性er-hoxa9蛋白的情况下，这些细胞无限增殖为未成熟成髓细胞，而在停用β-雌二醇时，细胞在4-5天的过程中经历同步和终末嗜中性粒细胞分化，从而表明细胞表面cd11b和gr-1表达的预期的变化(图1a)。通过测定细胞周期(图1b)和形态学(图1c)的变化以及通过功能性嗜中性粒细胞效应器功能(包括吞噬作用(图1d)和超氧化物生成(图1j))的测定来证实这种正常和终末生成粒细胞的分化。
实施例2：溶菌酶-gfp-er-hoxa9细胞建立了aml分化的表型筛选模型
为了促进小分子分化筛选，从溶菌酶-gfp(绿色荧光蛋白)敲入小鼠的骨髓衍生出er-hoxa9gmp细胞系，其中gfp的表达限于成熟的髓样细胞。对β-雌二醇中培养的未分化细胞以及去除β-雌二醇后的9个时间点进行rna测序(rna-seq)的时程基因表达分析，长达120小时。关键嗜中性粒细胞基因(elane，mpo)以及hoxa9靶基因(cd34，flt3)的表达模式表明转录因子、初级颗粒蛋白和次级颗粒蛋白的预期的逐步模式(图1e)。将基因表达与允许7天体外分化(图1f、1k、1l)的原代鼠成髓细胞的未操作培养物以及新鲜分选的人类髓样细胞亚群(图1g)的基因表达进行比较。er-hoxa9细胞分化过程中基因表达的逐步模式显示与鼠和人原代成髓细胞的显著相似。
在lys-gfp-er-hoxa9细胞系中，gfp表达伴随着髓样分化的正常过程(图1e，2a)并且与髓样标记cd11b和gr-1的表达平行(图2b)。成像流式细胞术显示与分化有关的单细胞形态学改变伴随细胞表面cd11b染色增加，细胞表面cd117(ckit)染色减少和细胞质gfp表达增加(图2i)。实施例20提供筛选可促进髓样分化的化合物的方法。
与野生型er-hoxa9gmp类似，lys-gfp-er-hoxa9细胞是scf依赖性的，具有大约12小时的倍增时间，并且在无β-雌二醇培养时在5天期间进行4-5次倍增后终末分化(图2j)。
实施例3：高通量筛选鉴定了12个小分子作为髓样分化的调节剂
使用lys-gfp-er-hoxa9gmp，进行高通量小分子表型筛选以鉴定在存在活性hoxa9的情况下可以触发髓样分化的化合物。(关于测定细节见实施例20)。在四天的化合物处理后，基于正向和侧向散射特性，通过高通量流式细胞术评估细胞的生存力以及通过gfp的内源表达和cd11b的细胞表面表达测定细胞的分化(apc荧光，图2c)。该测定实现了0.9的z因子，表明出色的信噪比。在大约25个筛选日内评估了nih分子图书馆计划的分子库小分子库(nihmolecularlibraryprogram’smolecularlibrarysmall-moleculerepository，mlsmr)中超过330,000个小分子的分化潜力。
在浓度响应实验中通过流式细胞术重新筛选活性化合物以消除有毒化合物(＜10％活细胞)，自发荧光(绿色和/或远红光荧光)化合物和雌激素拮抗剂。在er-hoxa9和野生型hoxa9鼠gmp细胞系的多个克隆中，12个化合物显示出可重现的髓样分化。在aml的四个人类细胞系模型(hl60、nb4、thp1和u937)中筛选了12个活性化合物的跨物种分化活性。称为3和7(c03和c07，图2d)的化合物在u937和thp1人白血病细胞系中促进分化(如通过cd11b表达的上调测定的)并且被选择作为化合物优化的起点。
实施例4：ml390是c07的有效衍生物
根据在鼠和人aml模型中的跨物种活性，选择具有不同化学骨架的两种化合物(c03和c07)用于进一步研究。化合物c03在结构上与已知的非甾体抗炎化合物(nsaid)以及已知的醛-酮还原酶3(akr3)的抑制剂类似。然而，用各种确定的nsaid或akr3抑制剂处理lys-gfp-er-hoxa9细胞并不导致髓样分化，表明这不是作用机制。在我们的分化测定中，几种c03的结构类似物不比母体化合物更有效(参见实施例20)。
分别合成c07的对映异构体并且生物活性是(r)-对映异构体特异的。(图2f)。有关合成细节，请参见实施例12。改变(r)-c07卤化物基团以提高效力，得到命名为ml390的先导化合物(图2e)。在鼠和人aml细胞系中ml390具有约2μm的ed50(触发其最大分化活性的50％的有效浓度)活性(图2g)。由与ml390孵育引发的分化类似于伴随er-hoxa9失活的正常分化，如通过用成像流式细胞术，同时比较细胞形态、细胞内gfp荧光和细胞表面染色所测量(图2h)。
实施例5：抗性细胞系的分析鉴定二氢乳清酸脱氢酶为ml390的靶标
对大量未注释的库的表型筛选之后，12个活性小分子的蛋白靶标仍是未知的。通过产生化合物抗性细胞系的靶标鉴定是我们实验室以前已经成功的方法。为了产生抗性细胞系，将鼠lys-gfp-er-hoxa9和人u937白血病细胞在缓慢升高(5μm至50μm)浓度的dmso、c03或(r)-c07中培养。最初，处理的细胞生长非常缓慢并且出现比亲本细胞更多的分化(基于形态学和cd11b染色)。
经过六个月的时间，每3-4天传代一次，出现以相同速率增殖且与dmso媒介物中培养的细胞无法区分的抗性未分化细胞(图3a，3b)。抗性细胞系在相似的时间框出现在(r)-c07和c03处理的培养物以及鼠和人细胞系中。尽管它们看起来化学结构不相关，但对(r)-c07具有抗性的细胞表现出对c03的交叉抗性，反之亦然，表明了类似的抗性机制。此外，在停止任一化合物治疗后，细胞保留其抗性持续超过六周，表明作为抗性机制的稳定遗传改变。
通过rna-seq分析我们的四种抗性细胞系的基因表达，并比较抗c03和(r)-c07的细胞之间的表达变化的重叠以及鼠和人细胞之间的重叠(图3h)。分析显示，在lys-gfp-er-hoxa9和u937两种细胞系中，仅有8个共有基因在c03-抗性和(r)-c07-抗性群体中高度(＞4倍)上调(图3i，3j)。有趣的是，这8个转录物是染色体16(人)或染色体8(小鼠)的长臂的相同100kb区域内的基因邻居，表明染色体扩增是抗性机制。全外显子组测序(wes)数据的分析证实了这一假设，表明该区域内的覆盖度更高(图3c，3d)。wes没有发现任何一致的点突变。
一个扩增基因编码酶二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)，它是细胞内从头合成嘧啶的关键酶。该酶在人和小鼠之间高度保守(90％氨基酸同源性)，这与c03和(r)-c07在鼠和人两种aml模型中触发分化的能力一致。
如在体外酶抑制测定中使用重组人dhodh蛋白所证明的，c03和(r)-c07是dhodh的抑制剂。酶抑制活性(ic50)与生物分化效应(ed50)紧密平行(图3e)。同样，已知的dhodh抑制剂包括来氟米特，其活性代谢产物特立氟胺和布喹那钠在我们的酶抑制和细胞分化测定二者中都具有活性(图3i，3j)。
尽管细胞依赖于dhodh来进行胞内尿苷合成，但它们也可以通过核苷转运蛋白由细胞外尿苷拯救。具有增加浓度的尿苷的补充培养基消除了lys-gfp-er-hoxa9、u937和thp1细胞系中c03和(r)-c07的分化作用(图3f显示了lys-gfp-er-hoxa9细胞)。这种“尿苷拯救”表明，髓样分化效应完全是由于干扰尿苷单磷酸(ump)合成(图5a)，并且不涉及与抑制dhodh无关的其它替代机制。
实施例6：dhodh抑制触发与髓样分化一致的基因表达模式
用ml390处理12、36和72小时的lys-gfp-er-hoxa9细胞中的基因表达变化类似于伴随原代嗜中性粒细胞分化的变化(图3g)。然而，与er-hoxa9失活后的模式相比，这些模式不太明显(图1f，1i，3m)。ml390处理后的基因表达变化在正常分化过程中未观察到(图3l)可能与降低嘧啶可用性和全面抑制rna和dna合成有关。
实施例7：布喹那钠是一种有效的选择性dhodh抑制剂，适用于体内研究
由于ml390的低溶解度和生物利用度限制了其作为体内工具化合物的潜力，因此评估了其他dhodh抑制剂在体内研究中的适用性。布喹那钠是杜邦制药公司最初作为抗增殖剂开发的dhodh的有效抑制剂(dup785；nsc368390)。布喹那在体外以＜10nm的ic50抑制dhodh活性(图3i)并在er-hoxa9、u937，和thp1细胞中以＜1μm的ed50触发分化(图3k)。布喹那的效力取决于细胞外尿苷的浓度；在50％fbs中培养(以更好地接近体内尿苷的细胞外血浆浓度)的细胞显示其ed50增加约2倍。
布喹那在体内的半衰期约为12小时(图4e)，并且与蛋白高度结合(98-99％)，符合已发表的文献(cramer，1995)。为了帮助排除布喹那除dhodh之外还抑制激酶的可能性，我们针对＞400多种已知激酶组测试了布喹那(discoverxkinomescan)。布喹那显示在100nm和1μm浓度下几乎完全不存在激酶抑制活性(图4f)。
在野生型c57b1/6小鼠中评估布喹那的最大耐受剂量(mtd)(参见实施例21)。当每日给药时，布喹那在剂量高达15mg/kg时是可耐受的。接受剂量高于15mg/kg的小鼠在每日给药6天后表现出体重减轻和血小板减少症。这种毒性是可逆的，并且在停止治疗后小鼠完全恢复。在15mg/kg或25mg/kg的单次腹膜内(ip)剂量后血浆布喹那浓度的测量表明，间歇给药时间表也能够维持浓度高于约1μm的体外细胞eds0(图3k，4e)。此外，这种间歇性时间表的耐受性更好，被给予每三天一次(q3d)高达50mg/kg的剂量的小鼠显示没有体重减轻或血小板减少症。
实施例8：布喹那在aml的thp-1异种移植模型中在体内表现出抗白血病活性和分化
将thp1细胞皮下植入scid小鼠的胁腹，并历时10天以嫁接至约40mm2的肿瘤尺寸。小鼠用通过ip注射给予的媒介物对照或布喹那，以每天5mg/kg或每三天(q3d)15mg/kg的剂量治疗。布喹那在15mg/kgq3d剂量下减缓肿瘤生长并以5mg/kg日剂量阻止肿瘤生长(图4a，4g)。将thp1肿瘤移植用于分化分析；用布喹那处理的小鼠的thp1细胞表现出明显的分化，如通过它们的cd11b表达的增加(图4b中图示的和图4c中的几何平均荧光强度所示)所证明的。
实施例9：dhodh抑制导致体外和体内尿苷和udp-代谢物的消耗
在尿苷单磷酸的内源性合成中，dhodh催化二氢乳清酸(dho)转化为乳清酸(ump，图5a)。在体外，用ml390处理lys-gfp-er-hoxa9细胞48小时抑制dhodh活性，导致上游代谢物二氢乳清酸的剧烈(＞500倍)积累(图5b)和尿苷和其他下游代谢物的消耗(图5c)。
尽管dhodh催化尿苷生物合成的第四步，但酶omp脱羧酶(ompd)催化第六步(图5a)。吡唑呋喃菌素是一种有效的小分子ompd抑制剂(dix等人，1979)，并且用吡唑呋喃菌素处理lys-gfp-er-hoxa9细胞表现dhodh抑制的分化效应(图5d)。
细胞培养基的尿苷补充消除了ml390或吡唑呋喃菌素的分化作用(图3g，5d)。尿苷补充也逆转了下游代谢物的消耗，但并未逆转dho的积累。总之，这些发现表明在通路的两个点抑制ump合成，但不是二氢乳清酸的积累导致了髓样分化。因此，尽管二氢乳清酸是酶抑制的标记，但它不是像idh突变型白血病患者中的2-羟基戊二酸(2hg)那样的肿瘤代谢产物(ward等，2010)。
为了确认体内dhodh抑制，进行皮下thp1细胞以及hoxa9-meis1骨髓白血病细胞的细胞代谢物分析。与经媒介物处理的对照相比，从brq处理的小鼠分离的thp1细胞显示细胞尿苷水平显著(90％auc)降低(图4d)。以类似的方式，从brq处理的小鼠的骨髓中分离的hoxa9-meis1白血病细胞除udp和udp-糖缀合物(例如udp-glcnac，udp-galnac)外还显示细胞尿苷显著减少。
dhodh和ompd抑制剂导致模型系统中的尿苷消耗和髓样分化。然而，dna和rna生物合成的下游抑制剂(甲氨蝶呤，羟基脲)或dna损伤剂(阿糖胞苷，柔红霉素)导致细胞毒性而不分化。(参见，实施例24)。不受理论束缚，部分分化作用可能是由于udp-glcnac消耗导致蛋白的o-连接n-乙酰基糖基化(glcnac)翻译后修饰降低。用ml390或brq抑制dhodh导致蛋白o-glcnac修饰的总体减少(图5e)。
实施例10：布喹那在aml的同系hoxa9模型中在体内表现出抗白血病活性和分化
为了解决体内dhodh抑制的抗白血病和分化效应，我们选择了aml的同系逆转录病毒转导模型。在该模型中，用表达hoxa9和meis1癌蛋白二者的基于mscv的逆转录病毒转导骨髓细胞，并将其静脉内导入已用亚致死剂量辐射预处理的受者小鼠中。处死发展为急性髓性白血病的小鼠，并在补充有scf和il-3的培养基中体外扩增骨髓细胞。为了容易在体内追踪，用表达venus荧光蛋白的慢病毒转导白血病细胞，并通过荧光激活细胞分选(facs)进行双重分选至纯度。将这些表达venus的培养的白血病细胞重新移植到预处理的二次受者小鼠中，并将这些二次受者用于所有描述的实验中。在14天后，当骨髓中的白血病母细胞的负荷大约为5％时，开始用布喹那或媒介物进行ip治疗(图6a)。小鼠以六种剂量治疗：(1)媒介物q2d，(2)brq5mg/kgq2d，(3)brq10mg/kgq2d，(4)brq25mg/kgq2d，(5)媒介物，7天时间表的第1天+第4天，或者(6)brq25mg/kg，7天时间表的第1天+第4天。预定的暂定安乐死和白血病分析在两个计划的时间点进行(图6a)。
第一次分析和二次移植是在brq25mg/kgq2d给予四次剂量后进行的。鉴于该方案的强度，这些小鼠表现出体重减轻、贫血和血小板减少症的副作用(图6a)。与brq体外分化作用类似，白血病细胞更为成熟，如分化标记cd11b(mac-1)和gr-1(ly6c/g)的上调所证明的(图6b)。用brq治疗的小鼠显示其骨髓、脾脏和外周血的白血病受累显着减少(图6c)。
第二次分析和二次移植在媒介物对照小鼠表现出终末白血病迹象(例如皮毛起皱，活动减少，体重减轻)时进行。该组在7天计划表的第1天和第4天接受brq25mg/kg，共6剂。值得注意的是，在这个延长的时间表上治疗的小鼠没有显示在每隔一天计划表上治疗的小鼠的副作用(图6e，6f)。此外，用布喹那治疗的小鼠显示其骨髓、脾脏和外周血的白血病受累更显着减少(图6d)。
每隔一天用brq5mg/kg或10mg/kg处理小鼠导致存活的延长(图6e，左图)。这种治疗耐受良好，无血液学毒性或体重减轻。用7天计划表的第1天和第4天给予brq25mg/kg治疗小鼠导致存活的更显着的延长，同样没有毒性(图6e，右图)(参见实施例24)。在该治疗组中，决定在14次剂量的brq(第59天)后停止治疗。在停止治疗约4周后，小鼠最终复发白血病。
实施例11：dhodh抑制剂引起体内白血病起始细胞活性的分化和消耗
从brq处理的小鼠中分离的白血病细胞基于其cd11b和gr-1细胞表面表达更多地分化(图6c，6d)。为了评估它们的形态以及它们作为白血病起始细胞的功能潜力，通过荧光激活细胞分选(facs)从媒介物或brq处理的小鼠新鲜分离活venus阳性白血病细胞。白血病细胞的wright-giemsa染色的细胞离心涂片器制剂表明，在聚集体中，从brq处理的小鼠中分离出来的细胞呈现形态学的粒细胞分化，并有核凝聚迹象(图7a)。
将来自媒介物或brq处理的小鼠的facs纯化的白血病细胞重新引入亚致死剂量照射的第三受者小鼠中。实验进行两次：每隔一天接受brq25mg/kg4次剂量的小鼠(图7b，左图)，和在7天周期的第1天和第4天接受brq总共6次剂量的小鼠(图7b，右图)。在两种情况下，从brq治疗的初次供体接受相同数量的活白血病细胞的小鼠花费更长时间来发展白血病症状，这与白血病起始细胞潜能的降低一致。
当dhodh抑制剂每日给予小鼠时，小鼠变得严重贫血，表现出严重的血小板减少症，并在治疗约10天后死亡。相比之下，布喹那在急性髓性白血病的小鼠模型中每3天给药一次时，布喹那耐受性良好且有效。为了探索这一观察，分析了布喹那，二氢乳清酸(dho)和尿苷的血浆水平。dhodh催化尿苷单磷酸内源合成中二氢乳清酸(dho)转化成乳清酸。抑制dhodh活性导致二氢乳清酸积累和尿苷消耗。
将单剂量布喹那(25mg/kg)给药于急性髓性白血病(aml)的同系小鼠模型。在此后的不同时间分析血浆尿苷水平(图8)。血浆尿苷最初下降，约48小时后反弹。dho水平在0时刻检测不到(图9)。dho迅速积累，但在布喹那给药的72小时内，dho水平再次检测不到(图9，图10)。这些结果表明，单独的或与尿苷组合的dho的血浆水平可以用作dhodh活性的标记。应安排dhodh抑制剂的给药时间，以使dho在给药另一剂量的dhodh抑制剂之前回到基线。这将最大限度地提高疗效并将不良副作用(包括死亡风险)降至最低，。根据患者的代谢情况调整dhodh抑制剂的剂量可以完成患者特异性给药。这将涉及基于血浆dho的测量来调整剂量。这将最大限度地提高疗效并使毒性最小化。
本文报道了使用雌激素依赖形式的同源框蛋白hoxa9的新颖的条件性髓样分化模型系统。当在来自溶菌酶-gfp敲入小鼠的原代小鼠类骨髓单核细胞中表达时，er-hoxa9产生因子依赖性粒细胞-单核细胞祖(gmp)细胞系，其在er-hoxa9失活时经历正常、同步和末端嗜中性粒细胞分化。这些细胞为研究正常的髓细胞生成提供了无限的髓样祖细胞来源，以及无限地提供模型白血病粒细胞-单核细胞祖细胞(gmp)来鉴定克服分化停滞的小分子。使用这些细胞进行可触发髓样分化的化合物的无偏小分子表型筛选。
这是第一次使用条件性髓样分化的雌激素依赖性hoxa9系统作为髓样分化停滞的模型。最有效的生物活性化合物被鉴定为酶二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)的抑制剂。实际上，来自超过330,000种化合物的库的12个命中的11个是dhodh的抑制剂，突出显示了嘧啶生物合成途径用作髓样分化调节剂的意外发现。这项研究强调了与基于靶标的筛选相比，表型筛选在识别肿瘤学中的新的和相关蛋白靶标中的重要性，并表明它们可以揭示关于该疾病的新的生物学。表型筛查中的困难往往是靶标识别。使用对小分子分化作用具有获得抗性的细胞系来确定作用机制。
dhodh催化嘧啶合成的第四步，将二氢乳清酸转化成乳清酸。该酶位于线粒体内膜中，通过还原其泛醌(辅酶q10)辅因子在二氢乳清酸和电子传递链的络合物3之间转移电子。其在电子传递中的作用不被认为与体外髓样分化作用有关，因为抑制下游酶ompd(其不参与电子传递)表型模拟dhodh抑制的分化作用。
dhodh在发育过程中很重要，完全缺乏酶活性不能延续生命(鼠类或人类)。miller综合征是一种罕见的常染色体隐性障碍，其中患者在dhodh的两个等位基因中具有遗传的次形态突变，导致多器官功能障碍。尽管广泛地表达，但在恶性肿瘤情形下尚未报道dhodh的突变。其次感兴趣的是，由于能够设计小分子特异性结合并抑制恶性疟原虫dhodh而不抑制人类酶，因此dhodh也被公认为抗疟疾药物靶标。
人类dhodh的两种抑制剂已被批准用于人类的临床应用。来氟米特是一种在治疗类风湿性关节炎患者中作为疾病缓解剂和抗炎剂有效的前药。其活性形式特立氟胺也被批准用于治疗多发性硬化症患者。来氟米特和特立氟胺是dhodh的弱抑制剂(ic50约5μm)，易于生物利用，半衰期长，且耐受性良好。
用来氟米特治疗白血病(hoxa9和meis1表达)小鼠。在最高剂量时，来氟米特(25mg/kg每日)治疗导致分化标记cd11b表达的非常轻微的增加，但不导致白血病负荷的减少。此外，在该剂量下耐受性差，造成受者小鼠体重减轻和嗜睡。
布喹那是由杜邦制药公司开发的一种强效(ic50约20nm)和特异性dhodh抑制剂(dup785，nsc368390)。布喹那没有在患有白血病或其他血液恶性肿瘤的患者中进行研究。在本文描述的模型系统中，对于其体外髓样分化效应需要持续暴露于布喹那；持续少于48小时的布喹那脉冲几乎没有效果。不受理论束缚，可能需要长时间抑制尿苷的产生来杀死癌细胞或体内诱导aml分化。
布喹那作为免疫抑制剂单独评估，并与环孢素和fk506联合评估。布喹那对于预防临床前移植模型中的器官排斥是有效的，这与活化的t细胞具有其嘌呤(atp，gtp)库的2倍扩增和其嘧啶(utp，udp-葡萄糖，ctp)库的8倍扩增的假设一致，指向活化淋巴细胞对内源性嘧啶合成抑制剂的潜在的敏感性(fairbanks等人，1995)。
本文报道的结果显示布喹那和其他dhodh抑制剂在体外和体内引发了髓样分化，并导致体内功能性白血病起始细胞的消耗。携带同系白血病的野生型小鼠和植入人异种移植物(thp1)的免疫受损小鼠耐受延长剂量的布喹那。不受理论束缚，很可能在体内正常和恶性细胞之间对dhodh抑制具有不同的敏感性。这一观察结果指向了治疗急性髓性白血病患者的治疗窗口。
在正常细胞和恶性细胞中普遍表达的酶的背景下，什么可能是治疗窗口的生物学基础？dhodh抑制导致嘧啶前体消耗并因此抑制核酸合成。与导致累积dna损伤的传统抗代谢物嘌呤和嘧啶类似物化学疗法不同，dhodh抑制导致核苷酸消耗期，从而驱动对于补救途径或自噬的依赖。从扩展脉冲(q2d或q3d)布喹那暴露观察模型系统中的功效。不希望受理论束缚，这可能归因于恶性细胞相对于正常细胞对核苷酸“饥饿”的间歇期的不同敏感性。这与剂量计划表在小鼠模型中的重要性是一致的，其中每三天给予高剂量表现出有效的抗白血病作用，而没有每天给药时观察到的体重减轻和血小板减少症。
不希望受理论束缚，观察到分化作用可以被ompd抑制剂吡唑呋喃菌素(而不是阿糖胞苷、羟基脲或甲氨蝶呤)表型模拟，这表明尿苷/ump/udp的上游消耗在分化效应中具有特殊重要性。一个有趣的潜在分化机制是改变o-连接n-乙酰糖基化，这是一种常见的蛋白翻译后修饰。酶o-glcnac转移酶(ogt)是一种将glcnac从udp-glcnac转移至丝氨酸和苏氨酸残基的普遍存在的酶，并且该修饰可以与包括磷酸化在内的其他修饰竞争蛋白功能的调节。经历glcnac翻译后修饰的特别感兴趣的蛋白包括akt、tet蛋白家族和c-myc(综述于(hanover等人，2012；
分化疗法治疗白血病的疗效已被小分子全反式视黄酸(atra)和三氧化二砷(as2o3)在pml/rar-α易位和急性早幼粒细胞性白血病患者中的巨大益处所证实。其他形式的非aplaml缺乏分化疗法已经被不完善的模型系统所阻碍。本文报道了一种新的表型筛选系统，其导致出人意料地将dhodh鉴定为aml中潜在的治疗靶标，并鉴定dhodh抑制在体外和同系和异种移植aml的动物模型中的功效。
这项工作强调了表型筛选在鉴定与正常和恶性细胞生物学相关的先前未识别的分子途径中的重要性。
化学实施例
所有反应均在氮气(n2)气氛下进行。所有的试剂和溶剂都是从商业供应商处购买的，并按原样使用。nmr波谱在bruker300(300mhz1h，75mhz13c，282mhz19f)波谱仪上记录。质子和碳化学位移以参考nmr溶剂的ppm(δ)报告。数据报道如下：化学位移，多重性(br＝宽，s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰；偶合常数(hz))。在teledyneiscocombiflashrf上使用40-60μm硅胶(
实施例12：化合物c03的合成
按照文献方法(j.org.chem.2006，71，3270)合成化合物c03：向4ml的正丁醇中加入1.0g的2-氯烟酸(6.4mmol)，1.6g的4-氯苯胺(13mmol)，1.3g的k2co3(9.5mmol)和40mg的铜粉(640mmol)并将该混合物在130℃加热过夜。冷却后，加入20ml水并过滤混合物，滤液用浓盐酸酸化。滤出黄褐色沉淀并从etoh中重结晶，得到380mg黄褐色固体(24％)，其通过lc/ms分析确认与购买的材料相同。1hnmr(300mhz，dmso)δ13.60(s，1h)，10.51(s，1h)，8.41(dd，j＝1.9，4.7，1h)，8.27(dd，j＝1.9，7.7，1h)，7.78(d，j＝8.9，2h)，7.36(d，j＝8.8，2h)，6.91(dd，j＝4.8，7.7，1h)。13cnmr(75mhz，dmso)δ168.91，155.22，152.51，140.52，138.65，128.45，125.49，121.32，114.22，107.88.ms247(m-1)。
实施例13：化合物c07对映异构体和ml390的合成
向在20mldmf中的2.00g(r)-1-氨基-1，2，3，4-四氢萘(13.6mmol)添加2.58gn-tboc-β-丙氨酸(13.6mmol)、14mlet3n(140mmol)、1.84ghobt(13.6mmol)和3.90gedachcl(10.2mmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。将水和ch2cl2添加并分离，将水用ch2cl2洗涤数次，将合并的ch2cl2层用盐水洗涤数次，然后干燥(mgso4)，过滤，并浓缩，用甲苯驱逐残余dmf。用25-50％etoac/己烷实施色谱法，得到3.58g产物，其为白色固体(83％)。1hnmr(300mhz，cdcl3)δ7.20-7.25(m，1h)，7.17(t，j＝3.5，2h)，7.08-7.12(m，1h)，5.91(d，j＝6.5，1h)，5.19(t，j＝6.8，2h)，3.43(q，j＝6.1，2h)，2.89-2.67(m，2h)，2.42(t，j＝5.9，2h)，2.10-1.97(m，1h)，1.90-1.77(m，3h)，1.42(s，9h)。13cnmr(75mhz，cdcl3)δ170.54，156.04，137.50，136.56，129.14，128.55，127.27，126.25，79.25，47.42，36.93，36.45，30.17，29.18，28.38，19.97。
将该物质溶于150mlch2cl2并在冰浴中冷却，然后加入40mltfa并除去冰浴。搅拌2小时后，将反应浓缩成油状物，加入乙醚生成白色固体，过滤并用乙醚冲洗，3.70g(99％)。1hnmr(300mhz，dmso-d6)δ8.48(d，j＝8.5，1h)，7.24-7.02(m，4h)，4.99(dd，j＝5.9，13.7，1h)，3.05(s，2h)，2.73(d，j＝5.9，2h)，1.95-1.79(m，2h)，1.79-1.60(m，2h)。
ml390：向在10mlch2cl2中搅拌的304mgtfa盐(0.916mmol)中加入280mget3n(2.79mmol)，溶解固体，然后加入226mg(1.01mmol)4-三氟甲氧基苯甲酰氯并搅拌反应物过夜。将含水nahco3和ch2cl2添加并分离，将ch2cl2干燥，浓缩并用20-70％etoac/己烷色谱纯化，然后从ch2cl2和己烷重结晶，得到292mg产物(78％)。1hnmr(300mhz，dmso-d6)δ8.70(t，j＝5.4，1h)，8.30(d，j＝8.7，1h)，7.97(d，j＝8.7，2h)，7.47(d，j＝8.2，2h)，7.15-7.01(m，3h)，7.01-6.91(m，1h)，4.99(dd，j＝5.8，12.7，1h)，3.52(dd，j＝6.5，12.6，2h)，2.79-2.61(m，2h)，2.40(ddd，j＝6.9，14.2，27.5，2h)，1.94-1.75(m，2h)，1.75-1.54(m，2h)。19fnmr(282mhz，cdcl3)δ-57.71。13cnmr(75mhz，dmso-d6)δ169.76，164.92，150.16，137.50，136.96，133.58，129.42，128.58，128.12，126.51，125.62，120.50，119.96(q，jc-f＝5.4)46.20，36.36，35.35，29.85，28.72，19.92。hrms：c21h21f3n2o3的计算值407.1577(m+h)；实测值，407.1578。
(r)-c07使用相同的操作，但是使用4-氯苯甲酰氯制备，并以73％分离为白色固体：1hnmr(300mhz，dmso)δ8.67(t，j＝5.4，1h)，8.31(d，j＝8.7，1h)，7.87(d，j＝8.6，2h)，7.54(d，j＝8.5，2h)，7.12(t，j＝7.9，2h)，7.08-6.95(m，2h)，5.00(t，j＝7.1，1h)，3.52(dd，j＝6.6，12.7，2h)，2.70(d，j＝4.9，2h)，2.48-2.41(m，1h)，2.37(dd，j＝6.8，14.2，1h)，1.85(dd，j＝3.7，9.4，2h)，1.77-1.57(m，2h)。13cnmr(75mhz，dmso)δ169.68，165.03，137.49，136.91，135.82，133.20，129.00，128.53，128.20，128.09，126.49，125.61，46.14，36.29，35.32，29.81，28.69，19.89.ms357(m+1)。
实施例14：布喹那的合成
简而言之，按照美国专利4,680,299中所述制备布喹那钠。利用pfitzinger反应，5-氟靛红与4-(2-氟苯基)苯丙酮在koh存在下缩合，得到作为游离酸的布喹那，将其用dmf重结晶。随后使用氢氧化钠形成盐，历经2步以47％得到布喹那钠。lc和定量1hnmr波谱研究发现盐的纯度＞95％
布喹那
在室温向5-氟靛红(18.1g，110mmol，1.00eq.)和4-(2-氟苯基)苯丙酮(25.0g，110mmol，1.00eq.)在无水乙醇(183ml，0.60m)中的搅拌的溶液滴加9.0m氢氧化钾水溶液(81.0ml，729mmol，6.66eq.)。将所得混合物在100℃加热24小时，冷却至室温并在减压下浓缩。将水(500ml)添加至残留物并用et2o(500ml)萃取。然后将水层冷却至0℃并用冰乙酸酸化，得到浑浊溶液。将析出物过滤并先后用水(100ml)和et2o(100ml)洗涤，得到粗产物。将固体从热dmf/水中重结晶，得到布喹那，为白色结晶固体(19.9g，53.0mmol，48％)。m.p.314°-316°。1hnmr(300mhz，dmso-d6)14.4(1h，s，cooh)，8.15(1h，dd，j＝9.0，5.6hz，arh)，7.77-7.67(5h，m，arh)，7.64(1h，t，j＝7.9hz，arh)，7.53-7.43(2h，m，arh)，7.40-7.30(2h，m，arh)，2.47(3h，s，cch3)；lrmsm/z(esi)376([m+h]+，100)；lrmsm/z(esi-)374([m-h]-，100)，749([2m-h]-，20)。
布喹那钠
在室温向布喹那(18.1g，48.2mmol，1.00eq.)在无水乙醇(482ml，0.10m)中的搅拌的溶液添加1.0m氢氧化钠水溶液(48.2ml，48.2mmol，1.00eq.)。将所得混合物在50℃加热4小时(直到澄清)，过滤并在减压下浓缩。将残留物从水冻干，得到布喹那钠，其为白色粉末状物(18.8g，47.3mmol，98％)。1hnmr(300mhz，dmso-d6)7.94(1h，dd，j＝9.0，5.7hz，arh)，7.69-7.66(4h，m，arh)，7.63(1h，t，j＝8.4hz，arh)，7.60-7.49(2h，m，arh)，7.49-7.41(1h，m，arh)，7.40-7.30(2h，m，arh)，2.36(3h，s，cch3)。lrmsm/z(esi)376([m+h]+，100)；lrmsm/z(esi-)374([m-h]-，100)，749([2m-h]-，15)。
实施例15：溶解度测定
在含有1％dmso的磷酸盐缓冲盐水(pbs)ph7.4中测定溶解度。在100％dmso和含有1％dmso的pbs中以100μm一式两份制备每种化合物。使化合物在室温下以250rpm轨道摇动平衡24小时。平衡后，通过uplc-ms(waters，milford，ma)分析样品，在单四极杆质谱仪上通过sir检测检测化合物。dmso样品用于产生两点校准曲线，依其拟合在pbs中的反应。
实施例16：pbs稳定性
在具有0.1％dmso的pbsph7.4存在下测定稳定性。每个化合物在六个独立的板上一式两份制备，并使其在室温下以250rpm轨道摇动平衡48小时。在每个时间点(0、2、4、8、24和48小时)取出一块板。从每个孔中取出等分试样并通过uplc-ms(waters，milford，ma)分析，在单四极杆质谱仪上通过sir检测检测化合物。此外，在每个时间点的剩余材料中，加入乙腈以迫使化合物溶解(以测试化合物的回收)。也通过uplc-ms分析其等分试样。
实施例17：gsh稳定性
在含0.1％dmso的ph7.4μmpbs和50μm谷胱甘肽存在下测定稳定性。每个化合物在六个独立的板上一式两份制备，并使其在室温下以250rpm轨道摇动平衡48小时。在每个时间点(0、2、4、8、24和48小时)取出一块板。从每个孔中取出等分试样并通过uplc-ms(waters，milford，ma)分析，在单四极杆质谱仪上通过sir检测检测化合物。此外，在每个时间点的剩余材料中，加入乙腈以迫使化合物溶解(以测试化合物的回收)。也通过uplc-ms分析其等分试样。
实施例18：血浆蛋白结合
对于人和小鼠血浆，使用快速平衡透析(red)装置(piercebiotechnology，rockford，il)通过平衡透析确定血浆蛋白结合。每种化合物在血浆(0.95％乙腈，0.05％dmso)中以5μm一式两份制备，并添加至膜的一侧(200μl)，将pbsph7.4添加至另一侧(350μl)。将化合物在37℃以250rpm轨道摇动孵育5小时。在孵育后，通过uplc-ms(waters，milford，ma)分析样品，在单四极杆质谱仪上通过sir检测检测化合物。
实施例19：血浆稳定性
在人和小鼠血浆中在37℃在5小时测定血浆稳定性。每一化合物在用pbsph7.4(0.95％乙腈，0.05％dmso)以50/50(v/v)稀释的血浆中以5μm一式两份地制备。将化合物以250rpm轨道摇动在37℃孵育5小时，取样时间点为0和5小时。样品通过uplc-ms(waters，milford，ma)分析，在单四极杆质谱仪上通过sir检测检测化合物。
实施例20：初级筛选以鉴定促进髓样分化的化合物
所使用的细胞系是erhoxa9成髓细胞系。hoxa9的有条件形式通过将其与雌激素受体的激素结合域融合产生，使得hoxa9仅在雌激素存在下才有活性。当通过逆转录病毒转导导入原代鼠类骨髓单核细胞并在干细胞因子(scf)和β-雌二醇存在下培养时，erhoxa9蛋白阻止髓样分化，导致成髓细胞系的生长。这些细胞系在β-雌二醇和scf存在下无限增殖。从培养基中去除β-雌二醇使erhoxa9失活，细胞从hoxa9分化停滞中释放并进行正常的髓样分化。该系统通过以下方法进一步改进：使用从转基因小鼠收获的骨髓产生细胞系，其中绿色荧光蛋白(gfp)插入内源性溶菌酶启动子的下游。溶菌酶是次级颗粒蛋白，仅在分化的髓样细胞中表达。因此，源自溶菌酶gfp转基因小鼠的骨髓的erhoxa9成髓细胞系在β-雌二醇存在下为gfp阴性，但在除去β-雌二醇和erhoxa9失活后变为明亮的gfp阳性。
细胞在补充有10％胎牛血清(serumsourceint’1)、青霉素/链霉素、l-谷氨酰胺(omegascientific)、5％含干细胞因子(scf)的条件培养基和0.5μmβ-雌二醇(sigma)的rpmi(cellgro)中培养。在第1天，将25μl补充有0.04％pluronicf-68(gibco)的完全培养基加入到无菌384孔培养板(greiner)中，随后加入0.2μl在dmso(sigma)中的测试化合物。作为分化的阳性对照的孔含有补充有pluronicf-68和5μm雌激素受体拮抗剂氟维司群的完全培养基。加入完全培养基中的25μl细胞(1.2x105/ml)，并将板孵育(37℃/5％co2)4天。组分的最终浓度为3,000个细胞/孔，4μm测试化合物和0.4％dmso。
在第5天，如下收获板：将5μl由1：100稀释的apc缀合的抗小鼠cd11b(ebioscience，clonem1/70)和1/500稀释的聚苯乙烯珠(spherotech)组成的抗体/珠溶液加入到孔中，并将板孵育20分钟，然后使用
实施例20的详细测定方案：
繁殖培养基
450mlrpmi(cellgro，vwr目录号45000-412)，50ml胎牛血清(serumsourceinternational，目录号fb02-500hi)，5ml青霉素/链霉素/l-谷氨酰胺(omegascientific，目录号pg-30)，25ml包含干细胞因子(scf)的条件培养基和0.05μmβ-雌二醇(sigma，目录号p5556)。
筛选培养基
繁殖培养基+0.04％pluronicf-68(gibco，lifetechnologies目录号24040-032)。
条件培养基
由中国仓鼠卵巢(cho)细胞系产生，其组成性表达并分泌scf至上清液中。
细胞繁殖
将erhoxa9成髓细胞系解冻并置于含有100ml繁殖培养基的t175烧瓶中；在37℃，5％co2下孵育。对于传代：将细胞转移至50ml锥形管并以1500rpm旋转5分钟；将旧培养基丢弃；细胞用繁殖培养基洗涤；并加入足够的繁殖培养基进行1∶10稀释。
细胞筛选
将细胞计数并转移至50ml锥形管中。细胞以1,500rpm离心5分钟；将旧培养基丢弃。将沉淀重悬于筛选培养基中至浓度为1.2x105个细胞/ml。
384孔板制备：将25μl筛选培养基添加至无菌384孔培养板(greiner，目录号781182)的第1列和第3-24列中；使用针工具将0.2μl在dmso(sigma，目录号d2650)中的测试化合物加入到第3-23列中；化合物的最终浓度为4μm，含有0.4％dmso；将含有5μm氟维司群(sigma，目录号i4409)的25μl筛选培养基加入第2列的孔(阳性对照孔)中。
将如上所述制备的25μl细胞(1.2x105/ml)加入第2-23列(最终细胞浓度为3,000个细胞/孔)。将板在37℃和5％co2孵育4天。在第5天，将5μl由1∶100稀释的apc缀合的抗小鼠cd11b(ebioscience，clonem1/70)和1∶500稀释的聚苯乙烯珠(5微米；spherotech，目录号cpx-50-10)组成的抗体/珠溶液添加至第2-23列的孔中。将板孵育20分钟。
样品在
实施例21：初级剂量应答
细胞在补充有10％胎牛血清(serumsourceint’l)、青霉素/链霉素、l-谷氨酰胺(omegascientific)、5％含干细胞因子(scf)的条件培养基和0.5μmβ-雌二醇(sigma，e2758)的rpmi(cellgro)中培养。在第1天，将25μl补充有0.04％pluronicf-68(gibco)的完全培养基添加到无菌384孔培养板(greiner)中，接着添加0.2μl在dmso中的化合物稀释阵列。充当分化的阳性对照的一些孔含有补充有pluronicf-68和5μm雌激素受体拮抗剂氟维司群的完全培养基。加入完全培养基中的25μl细胞(1.2x105/ml)，并将板孵育(37℃/5％co2)4天。组分的最终浓度为3,000个细胞/孔和0.4％dmso。将测试化合物从40μm开始以1∶3连续稀释六次，导致浓度范围为40μm至6nm。使用非线性最小二乘回归方法，在具有可变斜率的s形剂量-响应模型(也被称为4参数逻辑方程)中用
在第5天，如下收获板：加入5μl由1∶100稀释的apc缀合的抗小鼠cd11b(ebioscience，clonem1/70)和1/500稀释的聚苯乙烯珠(spherotech)组成的抗体/珠溶液，并将板孵育20分钟，然后使用
实施例21的详细测定方案：
繁殖培养基
450mlrpmi(cellgro，vwr目录号45000-412)，50ml胎牛血清(serumsourceinternational，目录号fb02-500hi)，5ml青霉素/链霉素/l-谷氨酰胺(omegascientific，目录号pg-30)。
筛选培养基
繁殖培养基+0.04％pluronicf-68(gibco，lifetechnologies目录号24040-032)。
细胞繁殖
将细胞解冻并置于含有100ml繁殖培养基的t175烧瓶中，并在37℃，5％co2下孵育。对于传代：将细胞转移到50ml锥形管中，并以1500rpm旋转5分钟；将旧培养基丢弃；将细胞用繁殖培养基洗涤；并加入足够的繁殖培养基进行1∶10稀释。
细胞筛选
将细胞计数并转移至50ml锥形管中；在1500rpm下旋转5分钟。丢弃旧培养基，并将沉淀重新悬浮在筛选培养基中至1.2×105个细胞/ml的浓度。
96孔板制备：将100μl筛选培养基添加至无菌96孔培养板(greiner，目录号655161)的第1列和第3-24列；使用针工具将0.8μl在dmso(sigma，目录号d2650)中的测试化合物添加到第3-23列中；化合物的终浓度为4μm，含0.4％dmso。将100μl含有5μm氟维司群(sigma，目录号i4409)的筛选培养基加入第2列(阳性对照孔)的孔中。
将如上制备的100μl细胞(1.2×105/ml)加入到第2-23列中。细胞的最终浓度为12,000个细胞/孔。将板在37℃和5％co2下培养4天。在第5天，将20μl由1∶100稀释的apc缀合的抗小鼠cd11b(ebioscience，clonem1/70)和1∶500稀释的聚苯乙烯珠(5微米；spherotech，目录号cpx-50-10)组成的抗体/珠溶液加入第2-23列的孔中。将板孵育20分钟。
样品在
实施例22：反筛测定
运行反筛测定以消除不作用于感兴趣的靶标的化合物。荧光化合物通过分析绿色或红色荧光鉴定并丢弃。使用补充有10％胎牛血清(serumsourceint’1)、青霉素/链霉素、l-谷氨酰胺(omegascientific)的rpmi(cellgro)，以与上述初级筛选中对于细胞所述相同的方式培养hoxa9/meis1永生化并缺乏gfp-报道分子的鼠细胞。在第1天，将25μl补充有0.04％pluronicf-68(gibco)的完全培养基添加到无菌384孔培养板(greiner)中，然后加入0.2μl在dmso中的测试化合物。加入完全培养基中的25μl细胞(1.2x105/ml)并将板孵育(37℃/5％co2)24小时。组分的最终浓度为3,000个细胞/孔、4μm测试化合物和0.4％dmso。在孵育24小时后，使用
实施例23：分化确认筛选
mac1表达数据从初级筛选数据集中提取。
实施例24：细胞毒性反筛
使用promegacelltiter-glo(r)测定法测量成纤维细胞细胞系nih3t3中的atp(作为生存力的代表)作为细胞生存力的量度。制备不透明壁多孔板，其具有在培养基中的哺乳动物细胞，100μl/孔(96孔板)或者25ml/孔(384孔板)。在获得背景发光后，加入测试化合物并根据培养方案培养。在30分钟后，celltiter-glo(r)试剂的体积等于存在于每一孔中的细胞培养基的体积，将内容物在定轨摇床上混合2分钟，孵育10分钟，然后记录发光200毫秒。
实施例25：雌激素受体伪影反筛
除了使用野生型hoxa9(即，缺乏雌激素受体融合的组成型活性hoxa9蛋白)细胞系之外，野生型hoxa9成髓细胞系在与初级分析相同的操作内使用，并且在第4天添加mac1-apc抗体。
实施例26：hoxa9细胞毒性组
hoxa9：人类白血病细胞
除了使用人白血病细胞系外，thp-1和u937人白血病细胞系在与初级分析相同的操作内使用。这些是因子非依赖性细胞系和不依赖雌激素的细胞系，使得细胞仅在补充有10％胎牛血清的rpmi中生长。
细胞毒性测定使用从atcc获得的hek293t、hepg2和a549细胞以一定浓度范围(0.05-26μm)测试细胞毒性。将化合物加入到细胞中并孵育72小时。使用发光试剂celltiter-glo(promega)测量细胞atp水平作为细胞生存力的代表。
hek293的详细分析方案：
第0天：将hek293细胞(hek293t，atcc)在三颈烧瓶(nunc)中生长至约95％汇合(不含tryple苯酚红)，并重悬，以50,000个细胞/ml的dmem、10％fbs/pen/strep/l-谷氨酰胺(compactselect)分配。
第1天：使用corning8867bc384孔板将每孔2000个细胞铺板于40μl培养基(dmem/10％fbs/pen/strep/l-谷氨酰胺)中；并在标准tc条件(5％co2；95％湿度，37℃)中孵育24小时(compactselect)。
第2天：使用针工具(cybiwell)将每孔100nl化合物剂量加入40μl测定体积。将100nl细胞毒性化合物米托蒽醌(cid4212)固定至阳性对照孔，终浓度为10μm(100nl4mmdmso储备液)。系统在37℃在liconic培养箱，95％湿度5％co2中孵育72小时。
第4天：将板从培养箱中取出冷却15分钟至室温；用thermocombi加入20μl50％promegacelltiterglo(用ph7.4pbs以1∶1稀释)。系统在室温孵育5分钟。
用perkin-elmerenvision以uslum设定得到读数，每孔0.1秒。
hepg2的详细分析方案：
第0天：使hepg2细胞(atcc)在三颈瓶(nunc)中生长至约95％汇合(不含tryple苯酚红)并重新悬浮，以50,000个细胞/ml的dmem、10％fbs/pen/strep/l-谷氨酰胺分配(使用tapcompactselect自动化细胞培养系统)。
第1天：使用corning8867bc384孔板将每孔2000个细胞铺板于40μl培养基(dmem/10％fbs/pen/strep/l-谷氨酰胺)中；并在标准tc条件(5％co2；95％湿度，37℃)中孵育24小时(compactselect)。
第2天：使用针工具(cybiwell)将每孔100nl化合物剂量加入40μl测定体积中。将100nl细胞毒性化合物米托蒽醌固定在阳性对照孔中至最终浓度为10μm(100nl4mmdmso储备液)。系统在37℃在liconic培养箱，95％湿度5％co2中孵育72小时。
第4天：将板从培养箱中取出，冷却15分钟至室温；用thermocombi添加20μl50％promegacelltiter-glo(用ph7.4pbs以1∶1稀释)。系统在室温孵育5分钟。
在perkin-elmerenvision读板器上以标准发光设定读板，每孔0.1秒。
a549的详细分析方案：
第0天：将a549细胞(atcc)在三颈烧瓶(nunc)中生长至约95％汇合(不含tryple酚红)，并重悬，以25,000个细胞/ml的dmem、10％fbs/pen/strep/l-谷氨酰胺进行分配(使用tapcompactselect自动细胞培养系统)。
第1天：使用corning8867bc384孔板将每孔1000个细胞涂板于40ul培养基(dmem/10％fbs/pen/strep/l-谷氨酰胺)中；系统在标准tc条件(5％co2；95％湿度，37℃)中孵育24小时(compactselect)。
第2天：使用针工具(cybiwell)将每孔100nl化合物剂量加入到40μl测定体积中。将100nl细胞毒性化合物米托蒽醌(cid4212)固定至阳性对照孔至终浓度为10um(100nl4mmdmso储备液)。系统在37℃在liconic培养箱，95％湿度5％co2中孵育72小时。
第4天：将板从培养箱中取出，冷却15分钟至室温；用thermocombi加入20μl50％promegacelltiterglo(用ph7.4pbs以1∶1稀释)。系统在室温孵育5分钟。
在perkin-elmerenvision读板器上以标准发光设定读板，每孔0.1秒。
实施例27：hoxa9：cd34+反筛
除了使用原代cd34+细胞外，在与初级分析相同的操作内使用cd34+人原代细胞。从来自正常人骨髓供体的废弃骨髓过滤器使用磁珠阳性选择(stemcelltechnologies)分离细胞。在这种情况下，将细胞在补充有10％胎牛血清、50μmβ-巯基乙醇以及10ng/ml干细胞因子、白细胞介素-3、白细胞介素-6、血小板生成素和flt-3-配体的rpmi中培养。
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虽然已经参考具体实施例公开了本发明，但显而易见的是，本领域的其他技术人员可以设计出本发明的其他实施例和变型，而不脱离本发明的真实精神和范围。所附权利要求旨在被解释为包括所有这些实施例和等同变型。