本申请要求2015年9月4日提交的题为“vlp稳定的疫苗组合物”的美国临时申请号62/214,526的优先权，其全部内容经此引用并入本文。
背景
1.发明领域
本发明涉及用于稳定生物材料，并特别是疫苗的组合物和方法。具体而言，本发明涉及囊封在vlp中的疫苗，所述vlp含有免疫原性或活性组分和稳定剂。优选的稳定剂包括糖醇山梨糖醇和降解明胶。本发明进一步涉及用于治疗或预防由细菌、病毒、寄生虫造成的感染或其它感染的经稳定的疫苗以及此类疫苗的生产。
2.背景描述
hpv，或人乳头瘤病毒，是病毒的乳头瘤病毒家族的人dna病毒。类似于其它乳头瘤病毒，hpv感染皮肤和粘膜的角质形成细胞。通常，hpv感染是亚临床的，并且导致极少至没有身体症状。感染可以变成临床的，并导致良性乳头状瘤的发展，也称为疣或鳞状细胞乳头状瘤。临床感染也可以变为癌性发展为例如喉咙和生殖组织(如子宫颈)的癌症。
绝大多数临床hpv感染在一到两年内恢复至亚临床。在亚临床感染持续存在的患者中(这发生在5至10％的感染女性中)，存在进展为侵袭性癌症的发展性外阴和子宫颈癌前病变的高风险。从亚临床进展为临床感染需要数年，有很多机会检测和治疗癌前病变。
在发达国家，利用宫颈刮片(pap)检查或液基细胞学的子宫颈筛查用于检测可能发展成癌症的异常细胞。如果发现异常细胞，则邀请女性进行阴道镜检查，在此过程中可以进行活检和除去异常区域。去除异常细胞在预防宫颈癌发展方面非常有效。
两种hpv疫苗是可用的——cervarixtm和gardasiltm。各自预防由hpv16型或18型引起的感染。这两种毒株被认为是造成超过70％的宫颈癌的原因。与所有疫苗一样，hpv疫苗在运输和储存过程中必须进行稳定化，并因此含有稳定剂。稳定剂是添加到疫苗制剂中以提高低温储存或冻干后储存期间的疫苗稳定性的化学化合物。
一种此类化学稳定剂被称为spga，其含有218mm的蔗糖、3.76mm的kh2po4、7.1mm的k2hpo4、4.9mm的谷氨酸钾和1％的血清白蛋白。spga的修正包括谷氨酸单钠替代谷氨酸单钾、淀粉水解物如葡萄糖或葡聚糖完全或部分替代蔗糖、和酪蛋白或pvp完全或部分替代白蛋白。另一种公知的化学稳定剂包含大约3.5％的水解明胶、3.5％的山梨糖醇、1.0％的medium199以及极少量的碳酸氢钠和酚红。其它稳定剂包含微量的dpg溶液，其含有包括半胱氨酸、谷胱甘肽、抗坏血酸、维生素a和usp在内的化合物。其它方法和稳定剂在美国专利号3,985,615；3,915,794；4,000,256；4,147,772；4,537,769；4,555,401；4,849,358；4,985,244；5,139,776；7,998,488；8,142,795；8,551,523；8,557,253；8,795,683和国际申请公开号wo1998028000中公开，其各自经此引用并入本文。
尽管如此，所有这些稳定剂都有缺点，无论是不能在较高温度下保持稳定性，还是在少于最佳时间的一段时间后失效。因此，目前需要保持疫苗的免疫原性且不赋予副作用的有效稳定化学制剂和/或方法。
发明概述
通常，本发明涉及稳定疫苗制剂，并且尤其是人乳头瘤病毒(hpv)疫苗的组合物和方法。
本发明的一个实施方案涉及包含囊封免疫原性组分和稳定剂的vlp(病毒样颗粒)的疫苗。该免疫原性组分包含产生免疫应答的疫苗的免疫刺激部分或活性部分。优选的免疫刺激部分包括传染性病毒、细菌或寄生虫的免疫原性部分。优选的vlp包含病毒的结构组分，诸如，例如肝炎病毒或人乳头瘤病毒(hpv)的结构组分，且vlp不包含允许颗粒复制的遗传物质。该稳定剂优选包含一种或多种明胶、一种或多种氨基酸、或一种或多种糖醇，或其任意组合。优选的明胶被化学或机械降解成平均分子量为10千道尔顿或更低、或8千道尔顿或更低的片段。还优选地，本发明的疫苗不需要添加铝化合物，如磷酸铝。本发明的疫苗可以作为液体长时间保持，或作为冻干粉末甚至保持更长时间。优选的疫苗进一步含有可药用载体，诸如，例如醇、丙二醇、脂肪醇、甘油三酯、脂肪酸酯、矿物油、液体矿脂、棕榈酸异丙酯、聚乙烯乙醇(polyethyleneethanol)、聚氧乙烯单月桂酸酯、月桂基硫酸钠、抗氧化剂、润湿剂、粘度稳定剂或调节剂、着色剂或调味剂。
本发明的另一实施方案涉及向患者施用本发明的稳定的疫苗的方法。优选的患者是具有功能性免疫系统的哺乳动物。方法包括确定待施用的疫苗的治疗有效量，并向需要其的患者施用该量的疫苗。该疫苗优选是冻干粉末，并在施用于患者之前重构为水性或非水性液体。还优选的是，该疫苗作为液体施用，并且该施用是肌肉内施用、腹膜内施用或静脉内施用。优选的患者包括但不限于婴儿、幼儿、青少年、成人或老年人。优选地，施用本发明的疫苗不会在患者体内产生全身性炎症反应，或在施用部位产生局部炎症。
本发明的另一实施方案涉及生产包含vlp、免疫原性剂和稳定剂的本发明的稳定的疫苗的方法，包括：产生包含人肝炎病毒的结构组分的vlp；将该组分与免疫原性剂和稳定剂混合；以及形成囊封该免疫原性剂与该稳定剂的vlp。该结构组分、该免疫原性剂与该稳定剂优选以大约等摩尔量混合。还优选地，囊封该免疫原性剂与该稳定剂的vlp在水性混合物中。优选地，生产包括冻干该水性混合物。还优选地，没有向该疫苗组合物中添加含铝化合物。
本发明的其它实施方案和优点在下面的说明书中部分阐述，并且部分可以由该说明书显而易见，或可以从本发明的实践中习得。
发明详述
目前有许多可用的疫苗提供对抗病毒和细菌感染的保护。这些疫苗各自含有不同的非活性组分，其提高稳定性并在一段时间内保持疫苗的有效性。
已经令人惊讶地发现，可以通过将疫苗包含在病毒样颗粒(vlp)中来提高疫苗的稳定性。vlp优选含有该疫苗的免疫原性组分加一种或多种稳定剂和一种或多种可药用载体。优选的稳定剂包括山梨糖醇、氨基酸、降解至平均分子量为10,000mw或更低的明胶，或其组合。提高的稳定性包括提高的热稳定性和提高的经时稳定性。尽管在本文中关于hpv疫苗描述了提高的稳定性，据信对本领域技术人员显而易见的是，所述提高的稳定性等同适用于包含预防或治疗病毒、细菌、寄生虫和/或其它感染的疫苗的大多数任何疫苗组合物。
病毒样颗粒由病毒结构蛋白组成并与病毒类似，但是是无传染性的且不能复制，因为它们不含有病毒遗传物质。该vlp由病毒结构蛋白(诸如，例如包膜蛋白或衣壳蛋白)在体外，诸如，例如在试管中，和/或在体内，诸如，例如在细胞培养中的表达来自组装。本发明的vlp优选源自肝炎病毒(例如乙型肝炎病毒)并由源自小的hbv的表面抗原(hbsag)组成，但是也可以源自细小病毒(例如腺病毒相关病毒)、逆转录病毒(例如hiv)、水泡性口膜炎病毒(例如vsv)、肝炎病毒(例如甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒)、黄病毒属(例如西尼罗河病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、黄热病病毒、寨卡病毒和引起脑炎的几种其它病毒)及其组合的结构组分。vlp可以在多个细胞培养体系中制备，包括哺乳动物细胞系、昆虫细胞系、酵母细胞系和植物细胞系。vlp可以在含有一种或多种螯合剂和/或还原剂的缓冲溶液中形成。
因此，本发明的一个实施方案涉及含有囊封到vlp中的免疫原性剂和稳定剂的疫苗。该vlp的免疫原性剂包含在个体中刺激免疫应答的抗原或其它结构。免疫原性剂包括但不限于肽、蛋白质、脂质、脂肪酸、多糖、脂多糖。通常，免疫原性剂是传染性颗粒的表面抗原。抗原可以对特定传染原或传染原的组合具有特异性，所述传染原诸如，例如病毒传染原(例如肠道病毒、肝炎病毒、人免疫缺陷病毒{hiv}、人乳头瘤病毒{hpv}、流感病毒、百日咳病毒、风疹病毒、破伤风、水痘病毒{vzv}、黄病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、黄热病病毒、寨卡病毒)、细菌传染原(例如衣原体、梭状芽胞杆菌、白喉、脑膜炎球菌、链球菌、葡萄球菌、肺炎球菌)、寄生虫传染原(例如贾第虫、疟疾{疟原虫})和/或造成脓毒症或败血症的传染原。该免疫应答优选足以在一段时间内保护该个体免受随后的感染。优选地，该疫苗是有效的，并保护患者免受感染达六个月或更久、一年或更久、两年或更久、五年或更久、或十年或更久。响应本发明的免疫原性剂产生的免疫应答在个体中产生体液免疫应答、细胞免疫应答，或优选两者均产生。优选的细胞应答包括t细胞应答和/或吞噬应答，并且还优选记忆细胞应答。
包含在本发明的vlp中的优选稳定剂包括但不限于以下的一种或多种：碳水化合物如葡萄糖和/或果糖，糖醇如甘油、赤藓醇、苏糖醇、avabitol、木糖醇、核糖醇、甘露醇、半乳糖醇、岩藻糖醇、艾杜糖醇、肌醇、庚七醇、异麦芽酮糖醇、lacitol、山梨糖醇、麦芽三糖醇、麦芽四糖醇、polyglyitol或糊精，脱水糖醇如异山梨醇，氨基酸如精氨酸、脯氨酸和/或赖氨酸，取代氨基酸如羟基-丙氨酸，源自动物的明胶如人胶原蛋白、bsa和/或鱼明胶，和/或源自植物的碳水化合物如果胶和纤维素。优选地，本发明的明胶降解至100千道尔顿(kd)或更低、50kd或更低、20kd或更低、10kd或更低、8kd或更低、或5kd或更低的平均分子量。还优选地，本发明的疫苗不需要添加铝、镁或锰化合物，如磷酸铝或其它形式的铝、镁或锰，或优选任何金属化合物。稳定剂可以以vlp组分干重量的1-10％或vlp组分加免疫原性剂的干重量的1-10％，或优选任一组合物干重量的2-4％添加。还优选地，该稳定剂的浓度为水性混合物的1mm至50mm，优选地，浓度为10-20mm。
优选地，该疫苗保持为液体，但是该液体可以被冻干并以干粉储存直到使用，其中将该粉末在适当的载剂(水性或非水性)中再水合以施用于个体。施用优选通过注射来进行，其可以是腹膜内(i.p.)、肌肉内(i.m.)和/或静脉内(i.v.)注射，或局限于注射部位。
优选地，作为液体或粉末的本发明的疫苗在4℃或更高、15℃或更高、25℃或更高、37℃或更高、40℃或更高、50℃或更高、或100℃或更高时是稳定的。还优选地，作为液体或粉末的本发明的疫苗在15℃或更低、更优选至0℃或更低、更优选至-20℃或更低、和更优选至-50℃或更低时是稳定的。还优选地，该疫苗的稳定性保持六个月或更久、八个月或更久、或十二个月或更久。优选地，本发明的疫苗随时间在变动的温度下是稳定的——其可以包括多次冷冻和解冻。
本发明的另一实施方案涉及将本发明的疫苗施用于需要其的患者以治疗或预防感染的方法。该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的本发明的疫苗，包括确定待施用的疫苗的治疗有效量。该治疗有效量通常根据哺乳动物的体重和患者免疫系统的强弱或应答性来确定，并可以由本领域技术人员确定。向需要其的患者施用该治疗有效量，其可以治疗活跃或疑似感染，或预防感染。该疫苗可以获自冻干粉末并在施用于患者之前重构为水性或非水性的液体。优选地，该疫苗作为液体施用，其可以是肌肉内、腹膜内或静脉内，并且患者可以是婴儿、幼儿、青少年、成人或老年人。令人惊讶地，本发明的疫苗不会在注射部位产生诸如红肿或炎症的副作用，并且不会令患者产生全身发热或炎症或其它不良副作用。优选地，免疫有效的疫苗仅含有完全形成的含有免疫原性剂和稳定剂的vlp，且不含有其它物质，诸如，例如不含添加的离子型或非离子型表面活性剂。
本发明的另一实施方案涉及生产本发明的疫苗的方法。通过本领域技术人员公知的方法获得病毒的结构组分，并且不包含允许该组分和所得颗粒复制的任何核酸材料。优选在室温或更低的温度下，将预先确定的摩尔量的该结构组分与大约等摩尔量的本发明的一种或多种免疫原性剂和一种或多种稳定剂混合，以使该vlp以大致等量囊封所述一种或多种免疫原性剂和所述一种或多种稳定剂。完全形成的vlp优选通过过滤、离心或本领域技术人员已知的另一方法与未形成的vlp和游离的结构材料和其它材料分离，由此产生含有一种或多种免疫原和一种或多种稳定剂的完全形成的vlp。该完全形成的vlp可以作为水性(例如水或生理盐水)或非水性(例如油、脂肪酸)混合物储存，或冻干并作为粉末储存。优选地，储存至使用不会造成免疫原性活性的显著损失，并且例如可以为一个月或更久、四个月或更久、六个月或更久、或更优选一年或更久，并且在环境温度下，无论作为液体或粉末。储存疫苗而不损失免疫原性活性还可以在低于环境温度下，诸如，例如在20℃或更低、在10℃或更低、在4℃或更低、或在0℃或更低的温度下。
本发明的其它实施方案和用途在考虑本文中公开的本发明的说明书和实施的情况下对本领域技术人员显而易见。本文引用的所有参考文献(包括所有出版物，美国和外国专利和专利申请)均通过引用明确且全文并入。术语“包含”在此前使用时意在包括术语“由……组成”和“基本由……组成”。此外，术语包含、包括和含有并非意在是限制性的。意在认为本说明书和示例仅仅是示例性的，并且本发明的真实范围和精神仅由下列权利要求书来表示。