本发明涉及针对高表达tug1基因的肿瘤的抗肿瘤性药物递送制剂。
具体地，本发明涉及一种含有在肿瘤细胞中有效抑制tug1表达的修饰sirna、修饰反义rna、反义dna等核酸的药物递送制剂。
背景技术：
tug1是taurineupregulatedgene1(牛磺酸上调基因1)的缩写，其是经剪接的多聚腺苷酸化rna，由young等人(非专利文献1)等鉴定为啮齿类的视网膜分化所必需的非编码dna，在视网膜和脑等神经系统的组织中表现出较强的表达。
关于tug1在癌或肿瘤中的作用，例如zhang等人(非专利文献2)记载了如果在非小细胞肺癌(nsclc)中将tug1敲减时，则会促进细胞增殖。与此相反，也有报告称，在特定的癌或肿瘤中tug1过量表达，如果抑制tug1表达，则增殖会受到抑制。例如，xu等人(非专利文献3)记载了tug1的沉默会使食管鳞状上皮细胞癌(escc)细胞的增殖受到抑制，阻止细胞周期的进行。另外，zhang等人(非专利文献4)记载了在骨肉瘤细胞株中tug1过量表达，此外如果抑制tug1表达，则骨肉瘤细胞会发生凋亡。另外，han等人(非专利文献5)记载了在尿路上皮癌中tug1过量表达，与晚期有关，此外如果使tug1沉默，则会发生增殖抑制和凋亡诱导。
在原发性脑肿瘤中恶性程度最高的胶母细胞瘤(glioblastomamultiforme:gbm)是至今仍然极难根治的肿瘤。gbm除了基因组异常以外，还有非翻译rna和组蛋白修饰、dna甲基化等表观基因组异常，提示了这些表观基因组异常会加剧gbm的恶性化。也有报告称，非翻译rna之一的longnon-codingrna(lncrna，长链非编码rna)进行的基因表达控制与细胞的分化和增殖等各种生命现象密切相关，参与到癌的恶性化。基于这种见解，对于gbm等肿瘤的顽固性疾病的疗法的研究开发也正在进行中，但尚未发现创新性技术。
近年来，在实用性方面尤其引人注目的有希望的技术是片冈等人开发的高分子胶束药物递送系统，该技术是例如将药物包含在由包括亲水性嵌段和阳离子性氨基酸嵌段的嵌段共聚物形成的胶束内(专利文献1～6等)。能够利用该技术的疾病中也包括肿瘤，但对于含有何种药物，包括治疗效果在内，在很大程度上要依赖于今后的研究。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本再表2007/099660
专利文献2：日本再表2007/099661
专利文献3：日本再表2009/113645
专利文献4：wo2013/162041
专利文献5：日本再表2010/093036
专利文献6：日本再表2012/005376
非专利文献
非专利文献1：t.l.youngetal.,curr.biol.,2005；15(6):501-512
非专利文献2：e.b.zhangetal.,celldeathdis.may22,2014；5:e1243.doi:10.1038/cddis.2014.201
非专利文献3：y.xuetal.,tumorbiologyoct31,2014,doi:10,1007/s13277.014.2763.6
非专利文献4：q.zhangetal.,asianpacificjcancerprev,2013；14(4):2311-2315
非专利文献5：y.hanetal.,jsurgoncol,2013；107:555-559
发明概述
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供一种能够预防或治疗包括胶质母细胞瘤(gbm)等脑肿瘤在内的高表达tug1的癌或肿瘤的核酸药物。
如上所述，gbm是在原发性脑肿瘤中恶性程度最高，至今仍是极难改善和根治的肿瘤。gbm除了基因组异常以外，还有非翻译rna和组蛋白修饰、dna甲基化等表观基因组异常，提示了这些表观基因组异常会加剧gbm的恶性化。
本发明人首先发现了在包括gbm的一些肿瘤中，lncrna之一的tug1高表达，以其为靶标的核酸可有效使该肿瘤明显萎缩(wo2016/129633a1)，但是，本次还发现了在以脑肿瘤为代表的肿瘤组织内特异性地积聚，且能够抑制tug1的表达而使肿瘤退缩的抗肿瘤性药物递送制剂，从而完成了本发明。
解决课题的手段
因此，本发明包含以下特征。
(1)一种药物递送制剂，其是用于治疗具有与正常组织相比高表达tug1基因的肿瘤的受试对象或者预防肿瘤转移的抗肿瘤性药物递送制剂，其特征在于，含有高分子胶束作为有效成分，所述高分子胶束含有抑制所述tug1基因高表达的核酸；该高分子胶束含有：具有阳离子性聚氨基酸链段和亲水性聚合物链段的嵌段共聚物，以及所述核酸；该核酸与所述阳离子性聚氨基酸链段的阳离子基团结合形成复合体和/或该核酸包载或附着于所述胶束内部；以及该高分子胶束积聚于肿瘤。
(2)根据上述(1)所述的药物递送制剂，其中，所述肿瘤为脑肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、白血病或淋巴瘤。
(3)根据上述(2)所述的药物递送制剂，其中，所述肿瘤为脑肿瘤或胰腺癌。
(4)根据上述(1)～(3)中任一项所述的药物递送制剂，其中，所述核酸为针对tug1基因转录物rna的sirna、其前体rna、反义rna，或者其修饰rna或反义dna。
(5)根据上述(1)～(4)中任一项所述的药物递送制剂，其中，所述核酸以分别在tug1基因转录物rna的seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3的核苷酸序列中在核苷酸第1044～1062位、第1044～1062位或第1044～1062位的区域，和/或在苷酸第2997～5181位、第2941～5111位或第2941～5125位的区域作为靶标。
(6)根据上述(1)～(5)中任一项所述的药物递送制剂，其中，所述核酸为sirna、其前体rna或其修饰rna中任一种或两种以上的组合，所述sirna含有由seqidno:4～seqidno:11的核苷酸序列组成的有义链和由与该有义链分别互补的seqidno:12～seqidno:19的核苷酸序列组成的反义链。
(7)根据上述(4)～(6)中任一项所述的药物递送制剂，其中，所述修饰rna含有一个或两个以上的修饰核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
(8)根据上述(4)～(7)中任一项所述的药物递送制剂，其中，所述修饰rna为sirna或反义rna/dna嵌合体，所述sirna含有由seqidno:20～seqidno:27的核苷酸序列组成的有义链和由含有与该有义链分别互补的序列的seqidno:28～seqidno:35的核苷酸序列组成的反义链，所述反义rna/dna嵌合体由seqidno:28～seqidno:35的核苷酸序列组成。
(9)根据上述(4)～(8)中任一项所述的药物递送制剂，其中，所述修饰rna为lna修饰反义rna，所述lna修饰反义rna在各末端侧含有具有2’-o,4’-c-亚甲基桥而被锁定的至少两个lan修饰核苷酸。
(10)根据上述(4)～(5)、(7)～(9)中任一项所述的药物递送制剂，其中，所述修饰rna为由seqidno:36～seqidno:38、seqidno:51～seqidno:53中任一个核苷酸序列组成的lna修饰反义rna。
(11)根据上述(1)～(7)中任一项所述的药物递送制剂，其中，所述核酸为含有dna或反义dna的载体，所述dna或反义dna编码针对tug1基因转录物rna的sirna或其前体rna或者反义rna。
(12)根据上述(1)～(11)中任一项所述的药物递送制剂，其中，所述亲水性聚合物链段由多个支链状的聚合物链组成。
(13)根据上述(1)～(12)中任一项所述的药物递送制剂，其中，所述阳离子性聚氨基酸链段含有聚赖氨酸。
(14)根据上述(1)～(13)中任一项所述的药物递送制剂，其中，所述亲水性聚合物链段含有聚乙二醇或末端修饰聚乙二醇。
(15)根据上述(1)～(14)中任一项所述的药物递送制剂，其中，所述嵌段共聚物在所述阳离子性聚氨基酸链段和所述亲水性聚合物链段之间具有连接基团。
(16)根据上述(1)～(14)中任一项所述的药物递送制剂，其中，所述亲水性聚合物链段含有环状肽，所述环状肽含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列或天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸序列。
(17)根据上述(1)～(16)中任一项所述的药物递送制剂，其中，所述嵌段共聚物所具有大于1的n/p比，所述n/p定义为[嵌段共聚物中阳离子基团的总数(n)]/[核酸中磷酸基团的总数(p)]。
(18)根据上述(17)所述的药物递送制剂，其中，所述n/p比为2以上、3以上、4以上或5以上。
(19)一种在受试对象中治疗或预防肿瘤的方法，其包括：向具有与正常组织相比高表达tug1基因的肿瘤的所述受试对象给予上述(1)～(18)中任一项所述的药物递送制剂。
(20)根据上述(19)所述的方法，其中，所述肿瘤为脑肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、白血病或淋巴瘤。
本发明的药物递送制剂对于脑肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、白血病、淋巴瘤等与正常组织相比高表达tug1基因的肿瘤，具有能够较强地抑制上述肿瘤增殖的效果。
附图简要说明
图1表示各种肿瘤细胞株中tug1的表达水平。图中，gsc表示胶质瘤干细胞株，t98、u251、sk-mg1和ao2表示胶质瘤细胞株，mcf7、mda231、sk-br3和t47d表示乳腺癌细胞株，lovo、caco-2、rko、sw48、sw480和sw1083表示大肠癌细胞株，pc3、lncap和vcap表示前列腺癌细胞株，hepg2、huh7和a549表示肝癌细胞株，h920和pc9表示肺癌细胞株，jurkat表示白血病细胞株，raji表示伯基特淋巴瘤细胞株，pfeiffer表示淋巴瘤细胞株。表达水平以tug1相对于内标gapdh的相对表达比例来表示。
图2表示针对tug1的sirna靶序列的位置，以及针对胶质瘤干细胞株gsc的增殖抑制效果。图中，si-tug1#1～si-tug1#14(核苷酸序列：参考图3)表示修饰sirna(rna/dna嵌合体；有义链和反义链的3’末端的“dcda”等为dna序列)，并表示tug1序列上的靶标位置。另外，抑制效果以tug1/gapdh(内标)相对于对照组sirna(“nc”；silencerselectnegativecontrol#1sirna(生命科学公司，商品目录编号4390843))的相对表达比例来表示。*表示统计上的显著性(p<0.01)。
图3表示图2中试验的si-tug1#1～si-tug1#14的核苷酸序列(有义链序列和反义链序列)。获得抑制效果的sirna为si-tug1#1～si-tug1#8(图3a)，表示si-tug1#9～si-tug1#14的抑制效果低，或者未获得抑制效果(图3b)。
图4表示si-tug1#1～si-tug1#8(表示为“#1”～“#8”)对胶质瘤干细胞株gsc中的tug1表达抑制效果的评价。各修饰sirna导入3天后的tug1的表达量(tug1/gapdh(内标))，以相对于对照组sirna(“nc”；silencerselectnegativecontrol#1sirna(生命科学公司，商品目录编号4390843))的相对值来表示。*表示统计上的显著性(p<0.01)。
图5表示si-tug1#1～si-tug1#8(表示为“#1”～“#8”)对胶质瘤干细胞株gsc的抗增殖效果的评价。表示gsc的活细胞数相对于各修饰sirna导入3天后的对照组sirna(“nc”)的相对值。*表示统计上的显著性(p<0.01)。
图6表示根据seqidno:13的核苷酸序列制作的lna修饰反义rna，即lna-tug1-1#1(seqidno:36)、lna-tug1-1#2(seqidno:37)和lna-tug1-1#3(seqidno:38)。进行了lna修饰的位点用下划线表示。
图7表示lna-tug1-1#1(seqidno:36)、lna-tug1-1#2(seqidno:37)和lna-tug1-1#3(seqidno:38)这三种lna修饰反义rna，以及si-tug1#2(有义：seqidno:21和反义：seqidno:29)对tug1的表达抑制效果的评价。为进行对比，使用si-tug1#2和对照组sirna(“nc”)。将各sirna和lna修饰反义rna导入到胶质瘤干细胞株gsc中，表示3天、7天、10天后(d3、d7、d10)相对于对照组sirna(“nc”)的相对tug1表达量。表达量为tug1/gapdh(内标)。*表示统计上的显著性(p<0.01)。
图8表示胶质瘤干细胞株gsc(初始细胞数1×105)中表示的各sirna和各lna修饰反义rna(终浓度30nm)的抗肿瘤细胞增殖抑制效果的评价。表示将si-tug1#2(有义：seqidno:21和反义：seqidno:29)和lna修饰反义rna(lna-tug1-1#1(seqidno:36)、lna-tug1-1#2(seqidno:37)和lna-tug1-1#3(seqidno:38))分别导入到gsc中10天后gsc相对于对照组sirna(“nc”)的活细胞数的相对值。*表示统计上的显著性(p<0.01)。
图9表示根据seqidno:17的核苷酸序列制作的lna修饰反义rna，即lna-tug1-2#1(seqidno:51)、lna-tug1-2#2(seqidno:52)和lna-tug1-2#3(seqidno:53)。进行了lna修饰的位点用下划线表示。
图10表示lna-tug1-2#1(seqidno:51)、lna-tug1-2#2(seqidno:52)和lna-tug1-2#3(seqidno:53)这三种lna修饰反义rna，以及si-tug1#6(有义：seqidno:25和反义：seqidno:33)对tug1的表达抑制效果的评价。为进行对比，使用si-tug1#6和对照组sirna(“nc”)。将各sirna和lna修饰反义rna导入到胶质瘤干细胞株gsc中，表示3天、7天、10天后(d3、d7、d10)相对于对照组sirna(“nc”)的相对tug1表达量。表达量为tug1/gapdh(内标)。*表示统计上的显著性(p<0.01)。
图11表示胶质瘤干细胞株gsc(初始细胞数1×105)中表示的各sirna和各lna修饰反义rna(终浓度30nm)的抗肿瘤细胞增殖抑制效果的评价。表示将si-tug1#6(有义：seqidno:25和反义：seqidno:33)和lna修饰反义rna(lna-tug1-2#1(seqidno:51)、lna-tug1-2#2(seqidno:52)和lna-tug1-2#3(seqidno:53))分别导入到gsc中10天后gsc相对于对照组sirna(“nc”)的活细胞数的相对值。*表示统计上的显著性(p<0.01)。
图12表示tug1抑制对前列腺癌细胞株pc3的增殖抑制效果。图12a表示作用于si-tug1#2或对照组sirna(“nc”)时pc3株中的tug1表达水平，图12b表示作用于各个sirna时pc3株的相对细胞增殖率。*表示统计上的显著性(p<0.01)。
图13表示每3天向皮下移植有胶质瘤干细胞株gsc的裸鼠的肿瘤直接给予lna-tug1-1#1(seqidno:36)或对照组sirna(“nc”)实施治疗时肿瘤大小的经时变化。*表示统计上的显著性(p<0.01)。
图14表示后述实施例7记载的，向脑肿瘤原位移植小鼠模型的静脉内给予含tug1-lna寡聚体(lna-tug1-2#1(seqidno:51))的药物递送制剂时，在给药3小时、6小时、9小时、12小时和15小时后，该药物递送制剂特异性地积聚于脑肿瘤组织中。在各时间的图片上，左边为给予alexa-647标记的tug1-lna寡聚体单体的小鼠，右边为给予含有alexa-647标记的tug1-lna寡聚体的药物递送制剂的小鼠的结果。
图15是根据图14的结果表示向脑肿瘤组织给予的药物递送制剂的荧光强度的经时变化的图表。●表示给予含有alexa-647标记的tug1-lna寡聚体的药物递送制剂的小鼠的脑肿瘤组织中的相对荧光强度的经时变化，▲表示给予alexa-647标记的tug1-lna寡聚体单体的小鼠的脑肿瘤组织中的相对荧光强度的经时变化。相对荧光强度是将给药前(0小时)的荧光强度设为1时的值。
图16表示将以每3天一次的频率向脑肿瘤原位移植小鼠模型静脉内给予10次含tug1-lna寡聚体(lna-tug1-2#1(seqidno:51))的药物递送制剂(25μg/小鼠)后，对小鼠脑组织进行苏木素-伊红(he)染色的结果。左边为给予含有针对萤光素酶基因(萤火虫gl3萤光素酶)的sirna(seqidno:54和seqidno:55)的药物递送制剂(对照)的小鼠脑组织，右边则是给予含tug1-lna寡聚体的药物递送制剂(本发明)的小鼠脑组织。
图17表示tug1抑制对胰腺癌细胞株(miapaca2、panc1、bxpc3)的增殖抑制效果。a表示作用于tug1-lna寡聚体(lna修饰反义dna，seqidno:56)或针对萤火虫gl3萤光素酶基因的lna寡聚体(seqidno:57)时胰腺癌细胞株中的tug1表达水平，b表示作用于各个lna寡聚体时胰腺癌细胞株的相对细胞增殖率。*表示统计上的显著性(p<0.01)。
图18表示对于皮下移植有胰腺癌细胞株(bxpc3)的裸鼠，持续向静脉内给予包载tug1-lna寡聚体(seqidno:56)或针对萤火虫gl3萤光素酶基因的lna寡聚体(seqidno:57)的药物递送制剂(胶束型pic药物递送制剂(参考后述的[参考例1]))时肿瘤大小的经时变化。*表示统计上的显著性(p<0.01)。
本说明书包含作为本申请优先权基础的日本专利申请第2015-226895号说明书和/或附图中记载的内容。
发明的具体实施方式
近年来，lncrna的表达异常与癌的关系受到关注。尤其是在癌症诊断领域中发现了许多微rna(mirna)。根据癌或肿瘤的种类，mirna的种类也有不同，同时有与正常细胞相比过量表达的mirna，也混杂有表达量减少的mirna，因此十分复杂。另外，与mirna相比，lncrna的相关报告数较少，但已知在lncrna与癌的关系中过量表达和表达减少的两种情况。
本发明人对肿瘤中最难以治疗的脑肿瘤的治疗剂进行了开发。原发性脑肿瘤中恶性程度最高的胶质母细胞瘤(gbm)是极难改善的肿瘤。gbm除了基因组异常以外，还有非翻译rna和组蛋白修饰、dna甲基化等表观基因组异常，提示了这些表观基因组异常会加剧gbm的恶性化。上述非翻译rna之一的lncrna的基因表达控制与细胞的分化和增殖等各种生命现象密切相关，近年来也有报告称其参与到癌的恶性化(r.a.guptaetal.,nature,464:1071-1076,2010；l.yangetal.,nature,500:598-602,2013；j.h.yuanetal.,cancercell,25:666-681,2014；a.m.khaliletal.,pnas,106:11667-11672,2009)。
首先，本发明人发现，在由人gbm建立的胶质瘤干细胞(gliomastemcell:gsc)中，lncrna之一的tug1与正常组织相比高表达，tug1的表达抑制有助于gsc的增殖抑制；还发现以tug1为靶标的核酸药物对gbm治疗有效；进而，基于上述见解，发现在至今为止未被报道的一些肿瘤中也有tug1高表达，而且在这些肿瘤中也可期待与gsc同样地利用该核酸药物获得抗肿瘤效果(日本专利特愿2015-024713(申请日2015年2月10日)、wo2016/129633a1))。
如上述背景技术所述，在tug1与肿瘤的关系的相关报告非常少的基础上，关于肿瘤的治疗也知道tug1的表达量因肿瘤的种类而有所不同，但对于高表达的特定肿瘤，未充分证明tug1的表达抑制是否对治疗有效。
tug1由p53诱导，具有抑制与细胞周期相关的特定基因的作用，含有tug1的lncrna在p53转录路径中发挥肿瘤增殖抑制功能的可能性也被认为处在假说阶段，尚未明确(a.m.khaliletal.,pnas,106:11667-11672,2009)。
本发明人在这种状况中发现了脑肿瘤等肿瘤可通过tug1的表达抑制来抑制增殖，而本次，本发明人还发现，含有抑制tug1基因高表达的核酸的药物递送制剂在治疗脑肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、白血病、淋巴瘤等与正常组织相比具有统计上的显著性(p<0.01)高表达(以下称为“高表达”)tug1基因的肿瘤的受试对象或预防肿瘤转移上非常有效。此处，关于预防肿瘤转移，tug1基因在癌症干细胞中表达，当该基因的表达被抑制时，肿瘤增殖会被抑制，因此认为癌症干细胞引起的肿瘤转移也会被抑制。
已知癌症干细胞大多对抗癌剂具有耐药性，即使癌细胞在外观上缩小，也会残留并转移或引起复发。因此，如果能开发出以癌症干细胞为靶标的药物，则能够抑制转移并预防复发。tug1基因也会在癌症干细胞中表达，因此本发明的药物递送制剂可以有效攻击表达tug1基因的癌或肿瘤。
本发明的药物递送制剂还含有抑制tug1基因高表达的核酸，并可以将该核酸特异性地递送到癌或肿瘤细胞。已知上文中例举的癌或肿瘤中，尤其以脑肿瘤和胰腺癌最难以治疗，该制剂对于这样的癌或肿瘤也可有效发挥抗癌效果。
下面对本发明进行更加具体的说明。
1.抑制tug1基因高表达的核酸
本发明组合物的有效成分为在肿瘤中抑制tug1基因高表达的核酸。
关于本说明书中的术语“抑制tug1基因高表达”，将高于在正常组织(或正常细胞)中正常表达的tug1的水平(或量)的异常状态称为“高表达”，该术语按照以下含义使用：将tug1基因的高表达抑制在正常水平或正常水平以下的水平，以及抑制tug1基因的转录物即lncrna的功能。此处，lncrna的功能在本发明中是指与癌或肿瘤的增殖、进展或转移相关的功能。根据本发明，例如可以在脑肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、白血病和淋巴瘤等具有高表达tug1的肿瘤的受试对象中抑制tug1的表达，从而抑制该肿瘤的增殖。
受试对象只要是动物就没有限制，优选为哺乳动物，例如人、狗、猫、马、牛，其他哺乳动物，如动物园等饲养的哺乳动物，优选动物为人。这样的动物中有tug1基因高表达的肿瘤的受试对象为本发明的对象动物。
tug1为上述动物的tug1，例如是由以下核苷酸序列组成的天然变体tug1：作为人tug1基因的转录物(lncrna)而已知的nr_110492(seqidno:1)、nr_110493(seqidno:2)或nr_002323(seqidno:3)的核苷酸序列，或者在这些各核苷酸序列中包括1个或数个核苷酸的缺失、取代、添加或插入的核苷酸序列，或者与上述各核苷酸序列具有70％以上、80％以上或90％以上、优选95％以上、进一步优选98％以上或99％以上的序列一致性的核苷酸序列。
本说明书中使用的“数个”，是指2～10的整数，优选为2～5的整数。另外，序列一致性可以使用用于获得核苷酸序列等序列比对的已知算法，例如blast来确定。
本发明中抑制tug1基因高表达的核酸，例如包含具有rna干扰(rnai)作用的sirna或其前体rna或者它们的修饰rna，或者包含含dna的载体，所述dna编码针对tug1基因转录物rna的sirna或其前体rna。上述核酸的其他示例为反义rna或反义dna或者其修饰核酸，或者为含有编码该反义rna的dna或该反义dna的载体。
本发明中的核酸只要能抑制tug1基因高表达且抑制肿瘤增殖，则不特定限制核酸的种类和核酸的序列，但优选为在上述受试对象tug1基因转录物rna的核苷酸序列内的区域，例如以分别作为人tug1基因转录物rna的核苷酸序列的如seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3的核苷酸序列中在核苷酸第1044～1062位、第1044～1062位或第1044～1062位的区域(图2中#1的区域)，和/或在核苷酸第2997～5181位、第2941～5111位或第2941～5125位的区域(图2中包括#5至#4的区域)作为靶标。
关于针对tug1有rnai作用的sirna或其前体rna，sirna为由与tug1基因转录物rna一部分互补的18～25个核苷酸、优选20～24个核苷酸、进一步优选21～23个核苷酸组成，且具有rnai作用，并由有义rna和反义rna组成的双链rna。在有义rna和反义rna的各3’末端，也可以具有2～5个核苷酸，优选具有2个核苷酸的突出末端。有文献指出，突出末端可能与risc相互作用(w.r.strappsetal.,nucleicacidsres.2010aug；38(14):4788-4797)。
rnai作用具有在本领域中通常使用的含义，是短双链rna(sirna)序列特异性地降解靶标转录物rna碱基，抑制其基因表达的现象。
上述前体rna为sirna的prirna、prerna、shrna中的任一种。prirna具有针对tug1基因的转录物rna序列，例如seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3的核苷酸序列。prerna为通过prirna的酶加工所产生的preshrna。shrna是shorthairpinrna(短发夹rna)的缩写,由从preshrna酶性地产生的与sirna序列相同的有义链和反义链的茎区，以及发夹环区组成。shrna的发夹结构通过细胞机制被切割成sirna，并与rna诱导沉默复合体(risc)结合，该复合体与具有与sirna的反义链互补的序列的转录物rna结合，将其切割。
本发明的核酸例如为sirna中任一种或两种以上的组合，所述sirna含有由seqidno:4～seqidno:11的核苷酸序列组成的有义链和由与该有义链分别互补的seqidno:12～seqidno:19的核苷酸序列组成的反义链。
或者，本发明的核酸为含有dna或反义dna的载体，所述dna或反义dna编码针对tug1基因转录物rna的sirna或其前体rna或者反义rna。优选的前体rna为shrna。
上述载体为含有在导入到细胞内时可以表达上述dna的调节序列的病毒载体或非病毒载体中的任一种，例如所述病毒载体为腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、仙台病毒等病毒载体；所述非病毒载体为质粒、人工染色体(例如细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)、人类人工染色体(hac)或小鼠人工染色体(mac))等。从安全性方面来看，优选的载体为质粒、仙台病毒载体、腺相关病毒载体等。优选地，质粒为可在哺乳动物细胞中使用，优选在人细胞中使用且安全性得到验证的质粒。具体地，作为质粒载体，例如可举出但不限于：日本专利特表2014-508515号公报记载的载体，如psilencer4.1-cmv(ambion)、pcdna3、pcdna3.1/hyg、phcmv/zeo、pcr3.1、pef1/his、pind/gs、prc/hcmv2、psv40/zeo2、ptracer-hcmv、pub6/v5-his、pvax1、pzeosv2、pci、psvl、pksv-10、pbpv-1、pml2d、ptdt1等非病毒载体。
上述调节序列包括启动子、转录起始点、终止子等，根据需要可以包括增强子、筛选标记序列等。启动子只要能在特定的宿主细胞内促进上述dna开始转录，就可以使用任意的内源性或外源性启动子，例如为u6或h1启动子，由此导入到细胞内后载体会稳定地表达，此外会遗传给子细胞，基因沉默的效果也会被遗传。
一般而言，由于rna在生物体内，例如在血液中等容易被核糖核酸酶降解，因此非常不稳定。为了解决这一问题，本发明优选进行有义链和反义链的核苷酸的修饰。修饰可以包括至少一个核苷酸的修饰，优选多个核苷酸的修饰，例如碱基的修饰、糖的修饰、磷酸二酯部分的修饰，或者它们的组合，和/或环状结构(由双链茎区和2个环区组成的结构)、含dna的嵌合体结构等。修饰可以非限定性地举出以下内容。
rna和dna一样是由糖、碱基和磷酸二酯键组成的核苷酸链构成的核酸，两种核酸在结构上的区别为：核苷酸中的糖，即rna的糖为核糖，而dna的糖则为2’位的羟基被氢取代而成的2’-脱氧核糖；进一步的区别在于：碱基，即rna的碱基由腺嘌呤(a)、尿嘧啶(u)、鸟嘌呤(g)和胞嘧啶(c)组成，而dna的碱基则由腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、鸟嘌呤(g)和胞嘧啶(c)组成。
作为骨架的磷酸二酯部分的修饰中，作为磷酸二酯键的替代，例如包括通过作为硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基磷酸酯或亚磷酰胺键的修饰而进行的取代。
碱基和糖的修饰可举出：日本专利特表2007-525192号公报所例举的2’-脱氧-2’-卤(例如氟、氯或溴)代核苷酸、2’-脱氧-2’-卤(例如氟、氯或溴)代嘧啶核苷酸、2’-脱氧-2’-卤(例如氟、氯或溴)代胞嘧啶核苷酸、2’-脱氧-2’-卤(例如氟、氯或溴)代尿嘧啶核苷酸、2’-脱氧-2’-卤(例如氟、氯或溴)代鸟嘌呤核苷酸、2’-o-甲基嘌呤核苷酸、2’-脱氧核苷酸、锁核酸(lockednucleicacid(lna)，例如2’-o,4’-c-亚甲基桥(-o-ch2-)修饰核苷酸、2’-o,4’-c-乙烯桥(-o-ch2ch2-)修饰核苷酸等)、2’-甲氧基乙基核苷酸、4’-硫代核苷酸、2’-甲氧基乙氧基(2’-moe)核苷酸、2’-甲氧基(2’-ome)核苷酸、2’-脱氧-2’-氯代核苷酸、2’-叠氮核苷酸等。另外，关于2’-修饰核苷酸，除了上述例举的以外，例如还可以如日本专利特表2010-507579号公报记载的将糖的2’位例如可以被以下基团取代：卤基、烯丙基、氨基、叠氮基、乙酰氧基、烷基、烷氧基、羧基、酰基、羰氧基、苯甲基、苯基、硝基、巯基、硫代烷氧基、芳基、烯基、炔基、氰基、ocn、cf3、ocf3、n(rm)-烷基、o-烯基、s-烯基、n(rm)-烯基、o-炔基、s-炔基、n(rm)-炔基、o-亚烯基-o-烷基、烷基芳基、芳烷基、o-烷基芳基、o-芳烷基、o(ch2)2sch3、o-(ch2)2-o-n(rm)(rn)或o-ch2-c(＝o)-n(rm)(rn)。此处，各rm和rn独立地为h、氨基保护基，或者取代或非取代c1-c10烷基。
本发明的核酸的核苷酸序列的修饰位置只要能抑制肿瘤增殖就没有特别限制，例如为该序列的5’末端的1～4个核苷酸和/或3’末端的1～4个核苷酸，此外在sirna等双链rna的情况下，即使仅修饰反义链也能获得肿瘤增殖效果。
lna修饰核苷酸为今西武(takeshiimanishi)等人开发的人工核酸(m.abdurrahman,sayoriseki,satoshiobika,haruhisayoshikawa,kazuyukimiyashita,takeshiimanishi:“design,synthesisandpropertiesof2’,4’-bna:abridgednucleicacidanalogue”j.am.chem.soc.130.4886-4896(2008)；satoshiobika等，tetrahedronlett.,38(50):8735-8738(1997)；专利4755972(sautarispharma))，向本发明的sirna、反义rna、反义dna等核酸的核苷酸序列中的糖部分导入lna(也称为“bna(bridgednucleicacid，桥接核酸)”)而成的核苷酸明显具有核酸酶耐受性。这样的核酸在各末端侧至少含有2个lan修饰核苷酸，优选在各末端侧含有3～4个lan修饰核苷酸。lna修饰反义rna和lna修饰反义dna的示例为图3a所示的反义链核苷酸序列(seqidno:28～seqidno:35)的修饰rna，但非限定性，例如为由seqidno:36～seqidno:38、seqidno:51～seqidno:53中任一核苷酸序列组成的lna修饰rna、由seqidno:56的核苷酸序列组成的lna修饰dna等。
本发明的核酸还可以具有在sirna的核苷酸序列中的一部分含有脱氧核糖核苷酸序列的rna/dna嵌合体结构。通过含有脱氧核糖核苷酸序列，与单独的核糖核苷酸序列相比，可以更具核酸酶耐受性(例如日本专利3803318号公报)。脱氧核糖核苷酸可以按照sirna的核苷酸序列的反义链或有义链的全核苷酸数的30％以下，优选20％以下的比例含有。脱氧核糖核苷酸既可以同时含有在sirna的反义链和有义链中，也可以只含有在有义链中。另外，sirna的核苷酸序列中的脱氧核糖核苷酸优选存在于3’侧，例如也可以在3’末端作为突出末端以2～4个脱氧核糖核苷酸连续的序列而存在。具体地，rna/dna嵌合体是有义链的核苷酸序列为seqidno:20～seqidno:27的核苷酸序列，且反义链的核苷酸序列分别为seqidno:28～seqidno:35的核苷酸序列的双链rna。
具有上述环状结构(即由双链的茎区和2个环区组成的结构)的核酸是所称的哑铃型单链rna。茎区由sirna的有义链序列和反义链序列互补的序列构成。环区由与茎区的各末端部连接的例如每个环区非互补的约2～约15个核苷酸构成(例如美国专利第5,168,053号说明书、美国专利第5,190,931号说明书、美国专利第5,135,917号说明书、smithandcluseletal.(1993)nucl.acidsres.21:3405-3411以及美国专利第5,087,617号说明书)。
作为上述核酸的其他示例，可以列举：上述反义rna或反义dna，或者其修饰核酸等。
反义rna或反义dna是单链核酸，其以tug1基因的转录产物lncrna为靶标。以该lncrna为靶标的上述sirna会降解lncrna，而反义rna或反义dna会抑制或阻碍上述lncrna的功能。为了提高在生物体内的稳定性，反义rna或反义dna优选为含有rna/dna嵌合体结构和/或1个或多个上述修饰核苷酸的修饰衍生物。修饰核苷酸的具体示例如上所述，进一步优选的示例为硫代磷酸酯修饰与2’-moe核苷酸、2’-ome核苷酸或lna修饰核苷酸的组合。反义rna或反义dna或其修饰衍生物的碱基长通常为12～100个核苷酸，优选为15～50个核苷酸，更优选为20～30个核苷酸。碱基长也可以设为多于100个核苷酸的长度，但由于其在制造成本方面不利，因此上述范围是合适的。关于反义rna或反义dna的序列，可以从tug1基因转录物lncrna或编码它的dna的核苷酸序列，例如seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3的来源于人tug1的序列，或者具有与这些各核苷酸序列70％以上、80％以上或90％以上，优选95％以上，进一步优选98％以上或99％以上的序列一致性的核苷酸序列所组成的天然变体tug1的核苷酸序列中，筛选上述大小连续的核苷酸序列，作为与该序列互补的核苷酸序列或其修饰核苷酸序列。作为靶标，如上所述，优选以分别在人tug1基因转录物rna的核苷酸序列的例如seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3的核苷酸序列中在核苷酸第1044～1062位、第1044～1062位或第1044～1062位的区域(图2中的#1区域)，和/或在核苷酸第2997～5181位、第2941～5111位或第2941～5125位的区域(图2中包括#5至#4的区域)作为靶标。具体地，在各末端侧至少含有2个，优选3～4个lna修饰核苷酸的反义rna的示例，为图3a所示的具有反义链核苷酸序列(seqidno:28～seqidno:35)的反义rna，但非限定性，例如为具有seqidno:36～seqidno:38、seqidno:51～seqidno:53中任一个核苷酸序列的反义rna。另外，在该具体示例中，反义dna具有在上述反义rna的序列中将尿嘧啶(u)转换为胸腺嘧啶(t)而成的核苷酸序列。
2.用于治疗或预防肿瘤的药物递送制剂
本发明的制剂，其特征在于，是抑制上述tug1基因高表达，且含有由此而抑制肿瘤增殖的核酸的药物递送制剂。本发明的制剂具有由嵌段共聚物形成的胶束或胶束样式结构(称为“高分子胶束”)。下面针对嵌段共聚物和制剂进行说明。
<嵌段共聚物>
本发明的制剂的组成成分之一的嵌段共聚物，例如可通过wo2013/162041、wo2012/096399等记载的方法制造。下面对嵌段共聚物及其制法进行说明。
形成高分子胶束的嵌段共聚物含有阳离子性聚氨基酸链段和亲水性聚合物链段。为了提高疏水性，阳离子性聚氨基酸链段可以优选含有疏水性氨基酸链段和/或疏水性侧基。另外，亲水性聚合物链段和阳离子性聚氨基酸链段也可以通过连接基团来结合。胶束具有亲水性聚合物链段向外壳侧取向而阳离子性聚氨基酸链段向内壳侧取向的多分子胶束结构(以下称为“胶束型聚离子复合物(pic)”)，或者具有亲水性聚合物链段包裹或覆盖阳离子性聚氨基酸链段的单分子胶束样式结构(以下称为“单元型pic”)。更具体地，该胶束也可以具有粒子样式结构并包载核酸，或者也可以具有核酸与阳离子性聚氨基酸链段静电结合地形成复合体，该亲水性聚合物链段包裹或覆盖该聚氨基酸链段的结构，都优选具有纳米粒径的胶束或胶束样结构。
在高分子胶束中，优选核酸被阳离子性聚氨基酸链段静电诱导且该核酸包载或附着于该胶束内部，并且所述胶束能够穿透肿瘤内的新生血管壁而积聚在肿瘤中，即具有epr(enhancedpermeabilityandretention，高通透性和滞留效应)效果。
肿瘤的新生血管的周细胞与内皮细胞结合较弱，此外平滑肌细胞极少或消失，基底膜较薄或几乎缺失。因此，已知该结构是连大于通过肿瘤的新生血管内尺寸的物质都容易漏过，且容易穿透的血管结构。能够穿透肿瘤血管壁的物质，例如形成上述高分子胶束的嵌段共聚物的分子量范围优选为约10kda～约100kda，更优选为约15kda～约50kda，或者物质的最大(直径)尺寸优选为约10nm～约100nm，更优选为约20nm～约50nm(s.azzietal.frontoncol.2013；3:211.doi:10.3389/fonc.2013.00211；f.alexisetal.,molpharmaceutics2008；5(4):505-515)。只要是这样大小，则该物质就可以在肿瘤中积聚。另外，为了提高在肿瘤的积聚率，如后文所述，可以将与肿瘤新生血管的内皮细胞特异性地结合的rgd(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)肽或ngr(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸)肽和上述嵌段共聚物结合(r.j.boohaleretal.,currmedchem2012；19(22):3794-3804)。
本说明书中，“静电诱导”是指阳离子性聚氨基酸链段的正电荷与核酸的磷酸离子的负电荷通过静电力相互吸引而使核酸分子与聚合物分子结合或附着。
上述阳离子性聚氨基酸链段具有正电荷，其能抵消上述核酸的负电荷使上述胶束整体或部分地变成电中性，另一方面，该亲水性聚合物链段具有可以包载或包裹(或覆盖)所述核酸的链长。
上述亲水性聚合物链段与上述阳离子性聚氨基酸链段为分子的组成成分，各链段的结构特性和配置将在下文中进一步说明。
亲水性聚合物链段例如可以配置在阳离子性聚氨基酸链段的端部(一端或两端)。另外，作为该端部的替代，或者除了该端部以外，也可以接枝在阳离子性聚氨基酸链段的中间部分(优选为大致中央部分)的侧链，也可以配置在2个相邻的阳离子性聚氨基酸链段之间。当配置在2个相邻的阳离子性聚氨基酸链段之间时，亲水性聚合物链段也可以配置为在与这些阳离子性聚氨基酸链段的序列方向相交的方向上延伸。
上述嵌段共聚物具有一个或多个亲水性聚合物链段。当每一个分子的嵌段共聚物具有多个亲水性聚合物链段时，亲水性聚合物链段也可以由支链状的聚合物链组成。本发明的制剂的组成成分的嵌段共聚物由于可以包载或覆盖核酸，因此可以适当地避免被酶等代谢或降解。其结果为可以获得血液中滞留性优异的胶束粒子。嵌段共聚物中的亲水性聚合物链段的数量例如可以为1～4，优选为1～2。
上述亲水性聚合物链段可以由任意合适的亲水性聚合物构成。作为该亲水性聚合物，例如可列举：聚(乙二醇)、多醣、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酰胺)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(丙烯酸酯)、聚氨基酸、聚(苹果酸)、聚(噁唑啉)或它们的衍生物。作为多糖的具体示例，可列举：淀粉、葡聚糖、果聚糖、半乳聚糖等。聚乙二醇例如也可以为用c1～c6烷基等基团末端修饰的聚乙二醇，此外用于与阳离子性聚氨基酸链段或连接基团(也称为“接头”)结合的例如在末端具有各种官能团的聚乙二醇在市场有售，此外，作为聚乙二醇，各种分子量的聚乙二醇和支链型的聚乙二醇在市场有售，可以容易获得，因此优选使用。
上述亲水性聚合物链段的重均分子量优选每个链段为10,000～80,000，更优选每个链段为10,000～60,000，例如可以每个链段为10,000～40,000。
如果是用于制备单元型pic的嵌段共聚物，则上述亲水性聚合物链段的长度根据高分子胶束中所含核酸的链长来设定成适当的长度，具体地，亲水性聚合物链段设定为可以包裹或覆盖所述核酸的长度。如果高分子胶束中的至少一个亲水性聚合物链段具有该高分子胶束中所含核酸的长度(如果含有多种核酸，则为各核酸长度的合计)以上的惯性半径(rg)，则判断为所述核酸的整体被亲水性聚合物链段包裹或覆盖。例如，重均分子量为21,000或42,000的聚乙二醇的惯性半径(rg)分别为约6.5nm或约9.7nm，因此判断为它们可以单独覆盖sirna(长度：约5.7nm)。另外，关于含有配置为在核酸的一个末端侧具有旋转中心(例如与聚氨基酸链段的连接位点)的亲水性聚合物链段，以及配置为在另一个末端侧具有旋转中心的亲水性聚合物链段的高分子胶束，如果所述核酸的两端的亲水性聚合物链段的惯性半径(rg)合计为该高分子胶束粒子中所含核酸的长度以上，则可判断为所述核酸的整体被亲水性聚合物链段包裹或覆盖。在这样的高分子胶束中，各亲水性聚合物链段优选具有核酸长度一半以上的惯性半径(rg)，更优选具有核酸长度以上的惯性半径(rg)，进一步优选具有核酸长度1.2倍以上的惯性半径(rg)，更进一步优选具有1.3倍以上的惯性半径(rg)。亲水性聚合物链段的长度上限只要不易受到空间位阻等影响，有利于形成高分子胶束，就没有限制，例如，其惯性半径(rg)也可以设为高分子胶束粒子中所含核酸的长度的例如2.5倍以下，优选1.6倍以下的长度。
本发明的制剂所能使用的嵌段共聚物中，亲水性聚合物链段的末端可以结合含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)序列的环状肽(称为“crgd”)，例如由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸序列组成的环状肽(wo2012/096399)。crgd可以作为用于使胶束与癌细胞粘附或结合的配体。同样，如后文所述，ngr肽也可以用作上述配体。
上述嵌段共聚物中，阳离子性聚氨基酸链段和亲水性聚合物链段也可以通过任意适当的连接基团来连接。作为该连接基团，例如可列举：酯键、酰胺键、亚氨基、碳-碳键、醚键等。另外，这些链段也可以通过可在生物体内断裂的连接基团(例如二硫键、腙键、马来酰胺(maleamate)键或缩醛基团)来连接。需要说明的是，在上述嵌段共聚物的阳离子性聚氨基酸侧末端和/或亲水性聚合物链侧末端，只要不对本发明的效果产生不利影响，则也可以进行任意适当的修饰。
作为构成上述阳离子性聚氨基酸链段的氨基酸，可以使用在侧链具有阳离子基团(例如氨基、胍基、咪唑基等)的任意适当的阳离子性氨基酸。例如可列举：赖氨酸、精氨酸、组氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸。或者，为了提高阳离子性聚氨基酸链段的疏水性，也可以含有疏水性氨基酸(例如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等)和阳离子性氨基酸。
阳离子性聚氨基酸链段例如含有聚赖氨酸。
如果是用于制备单元型pic的嵌段共聚物，则由于核酸的负电荷来源于磷酸基团，且核酸每隔大致相等的间隔具有1个负电荷(电荷量＝-1)，因此从与核酸中的各磷酸基团恰当地形成静电结合的观点考虑，可以优选使用在侧链具有1个阳离子基团的氨基酸，更具体地使用在血液中的ph值在侧链具有1个正电荷的氨基酸。
上述阳离子性聚氨基酸链段中，优选从主链到侧链上的阳离子基团的距离短。具体地，阳离子基团优选通过1～6个原子，进一步优选通过1～4个原子与主链结合。
如果是用于制备单元型pic的嵌段共聚物，则阳离子性聚氨基酸链段优选相对于高分子胶束中所含核酸的负电荷，可以具有大致等量、大致一半量、大致1/4量，或者大致1/8量的正电荷。阳离子性聚氨基酸链段具有这样的电荷量，由此可以获得嵌段共聚物含量不同(例如1个、2个、4个或8个)的各种高分子胶束。另外，阳离子性聚氨基酸链段所含有的氨基酸残基数可根据该链段所要求的电荷量适当设定。只要不损害本发明的效果，阳离子性聚氨基酸链段也可以含有非阳离子性氨基酸残基。非阳离子性氨基酸残基的数量可以设为阳离子性聚氨基酸链段所含有的氨基酸残基总数的例如20％以下，优选为10％以下，更优选为5％以下，进一步优选为2％以下。
用于制备单元型pic的嵌段共聚物的示例非限定性地可由以下式(1)或(2)表示。此处，式(1)或(2)中，作为亲水性聚合物链段的聚乙二醇链的数量例举为2个，但也可以为1个。
[化1]
[化2]
各式中，r1a～r1d彼此独立地为氢原子，或未取代或取代的碳原子数为1～12的直链或支链状的烷基，
r2为氢原子、碳原子数为1～12的未取代或取代的直链或支链状的烷基，或者碳原子数为1～24的未取代或取代的直链或支链状的烷基羰基，
r3为羟基、碳原子数为1～12的未取代或取代的直链或支链状的烷氧基，碳原子数为2～12的未取代或取代的直链或支链状的烯氧基、碳原子数为2～12的未取代或取代的直链或支链状的炔氧基，或者碳原子数为1～12的未取代或取代的直链或支链状的烷基取代亚氨基，
r4a和r4b彼此独立地表示亚甲基或亚乙基，
r5a和r5b彼此独立地选自于由下述基团(i)～(iv)组成的组中相同或不同的基团，或者
r5a和r5b彼此独立地为与-o-或nh-结合的氢原子、苯基、苯甲基、-(ch2)4-苯基、未取代或被氨基或羰基取代的c4～c16烷基，或者固醇衍生物的残基，
此处，p1～p4、q1～q6和r1～r2彼此独立地为1～5的整数，
q为-nh2或-nhc(＝nh)nh2，
l为二价连接基团或原子价键，
x1～x4彼此独立，例如为110～2,000的整数，
y、z和v彼此独立，例如为0～60的整数，且满足5≦y+z+v≦60的关系，
w例如为1～6的整数，
l和m彼此独立，例如为0～5的整数，
n例如为0或1。
-nh-(ch2)p1-[nh-(ch2)q1-]r1nh2(i)；
-nh-(ch2)p2-n[-(ch2)q2-nh2]2(ii)；
-nh-(ch2)p3-n{[-(ch2)q3-nh2][-(ch2)q4-nh-]r2h}(iii)；以及
-nh-(ch2)p4-n{-(ch2)q5-n[-(ch2)q6-nh2]2}2(iv)
上述式(1)或(2)中，l为二价连接基团或原子价键。作为二价连接基团，可以采用任意适当的连接基团。例如，式(1)中，l可以为-l1-l2-l3-，式(2)中，l可以为-l4-l5-l6-。其中，l1和l4彼此独立地为-(o-(ch2)a)b-l1a-，其中a例如为1～5的整数，b例如为0～300的整数，当b为2以上时a不必全部相同，l1a为原子价键、-s-s-、-nh-、-o-、-o-ch(ch3)-o-、-oco-、-oconh-、-nhco-、-nhcoo-、-nhconh-、-conh-或-coo-；l2和l5彼此独立地为原子价键或-l2a-l2b-l2c-，其中l2a和l2c为间隔结构，虽没有特别限制，但例如为取代或未取代的碳原子数为1～12的烷基，l2b例如为下述式(3)～(5)所示结构中的任一种；l3为-((ch2)c-o)d-(ch2)e-l3a-，其中c例如为1～5的整数，d例如为0～500的整数，e例如为0～5的整数，当d为2以上时c不必全部相同，l3a为-nh-或-o-；l6为-((ch2)f-o)g-(ch2)h-l6a-(ch2)i-co-，其中f例如为1～5的整数，g例如为0～300的整数，h例如为0～5的整数，i例如为0～5的整数，当g为2以上时f不必全部相同，l6a为-oco-、-nhco-、-oconh-、-nhcoo-、-nhconh-、-conh-或-coo-。
[化3]
作为上述r1a～r1d、r2或r3的基团所定义的，碳原子数为1～12的直链或支链状的烷氧基、烷基取代亚氨基以及烷基的烷基部分，例如可列举：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正己基、癸基以及十一烷基等。碳原子数为2～12的直链或支链状的烯氧基或碳原子数为2～12的直链或支链状的烷氧基中的烯基或炔基部分，可以列举在碳原子数为2以上所例示的烷基中含有双键或三键的基团。
关于这样的基团或部分，作为“取代的”时的取代基，没有限制，可以列举：c1-6烷氧基、芳氧基、芳c1-3氧基、氰基、羧基、氨基、c1-6烷氧基羰基、c2-7酰胺基、三-c1-6烷基甲硅烷氧基、甲硅烷氧基、甲硅烷氨基，或者缩醛化甲酰基、甲酰基、氯或氟等卤原子。
根据r5a和r5b的基团所定义的，选自于由下述(i)～(iv)组成的组中基团优选为相同基团，进一步优选为式(i)的基团。另外，p1～p4和q1～q6优选为分别彼此独立，例如为2或3，更优选为2。另一方面，r1和r2优选为分别彼此独立，例如为1～3的整数。r5a和r5b的基团中所属的全部重复单元可以选为相同的基团，各重复单元也可以选为不同的基团。
-nh-(ch2)p1-[nh-(ch2)q1-]r1nh2(i)；
-nh-(ch2)p2-n[-(ch2)q2-nh2]2(ii)；
-nh-(ch2)p3-n{[-(ch2)q3-nh2][-(ch2)q4-nh-]r2h}(iii)；以及
-nh-(ch2)p4-n{-(ch2)q5-n[-(ch2)q6-nh2]2}2(iv)
q中所属的全部重复单元可以选为相同的基团，各重复单元也可以选为不同的基团。另外，w例如为1、2、3或4。
表示乙二醇重复数的x1～x4是可以根据所期望的高分子胶束中所含核酸的长度而适当设定的值。例如，当形成含有一个21个碱基对的双链rna的高分子胶束粒子时，x1～x4彼此独立，下限并不限定，例如为100～250，上限并不限定，例如为900～1200。
y、z和v分别为可以根据所期望的高分子胶束中所含核酸的负电荷量和嵌段共聚物的数量而适当设定的值。例如，当形成用于制备含有一个21个碱基对的双链rna和两个嵌段共聚物的单元型pic的嵌段共聚物时，y、z和v可以设定成阳离子性聚氨基酸链段中阳离子基团的数量并不限定，优选为18～22的整数，更优选为19～21的整数，进一步优选为19～20的整数。如此，本发明的药物递送制剂由两个嵌段共聚物构成，并且各嵌段共聚物中的阳离子性聚氨基酸链段可以处于例如含有18～22个阳离子性氨基酸残基的状态。
如果是用于制备单元型pic的嵌段共聚物，则n例如为0或1，优选为1。通过具有2个聚乙二醇链的嵌段共聚物，可以得到血液中滞留性明显优异的高分子胶束。
式(1)或式(2)中，构成阳离子性聚氨基酸链段的各重复单元的结合顺序为任意，可以为无规结构，也可以为嵌段结构。
用于制备胶束型pic的嵌段共聚物的示例如下所述(式(6)或式(7))。
[化4]
各式中，r1和r2彼此独立地可以为氢原子或被取代，例如碳原子数为1～12的直链或支链状的烷基，a为亲水性聚合物链，l1和l3为连接基团，b为含阳离子的基团，r3表示任意氨基酸的侧链，z表示例如5～500的整数，x表示例如z的40％以上的整数，y表示整数且为0或1以上，z-x-y表示整数且为0或1以上，而x和y定义为x、y和z-x-y的合计为z，p表示例如1～10的整数，q表示例如1～10的整数，但x、y、z、p和q不限于上述范围。
上述亲水性聚合物链中的亲水性聚合物的重复数没有限制，可以优选为30～2,000的整数，更优选为40～1,500的整数，进一步优选为50～1,000的整数。
由上述说明可知，z表示聚氨基酸链段的重复数。z没有限制，例如为5～500范围内的整数，该范围的下限并不限定，例如可以为10～20，该范围的上限并不限定，例如可以为100～200。
b表示具有含阳离子基团的氨基酸链段的含阳离子基团。该含阳离子基团为含阳离子，或者能够形成阳离子的任意适当的基团，例如可列举氨基或含铵阳离子的基团。通过含有具有含阳离子基团的氨基酸链段，嵌段共聚物可以在生理条件下与用作药物的核酸形成复合体(pic)。作为具体示例，可列举脒基和来源于二亚乙基三胺，并选自于由下述(i)～(iv)组成的组中基团。
-nh-(ch2)p3-〔nh-(ch2)q3-〕r1nh2(i)；
-nh-(ch2)p4-n〔-(ch2)q4-nh2〕2(ii)；
-nh-(ch2)p5-n{〔-(ch2)q5-nh2〕〔-(ch2)q6-nh-〕r2h}(iii)；以及
-nh-(ch2)p6-n{-(ch2)q7-n〔-(ch2)q8-nh2〕2}2(iv)
优选可以使用(i)所示的基团。p3～p6和q3～q8例如优选为分别彼此独立地为2或3，更优选为2。另一方面，r1和r2例如优选为分别彼此独立地为1～3的整数。
上述具有含阳离子基团的氨基酸链段也可以在侧链的末端，即上述含阳离子基团的末端具有巯基(-sh基)。巯基通过相互反应，可以形成由二硫键的交联反应。
具体地，具有靶标结合位点的嵌段共聚物例如由下述式(8)或式(9)表示：
[化5]
式中，a、r2、l1、l3与上述式(6)和式(7)相同，z表示上述式(6)和式(7)中的聚氨基酸链段，l不限定地表示例如1～5的整数，d表示靶标结合位点。
上述嵌段共聚物所具有的靶标结合位点(式(8)和式(9)中的d)，优选分子量不限定，例如为200～20,000da的肽，更优选分子量为300～10,000da的肽，进一步优选分子量为500～3,000da的肽。
另外，优选d不限定，例如为具有2～200个氨基酸残基的肽，更优选为具有1～100个氨基酸残基的肽，进一步优选为具有3～30个氨基酸残基的肽。
作为上述肽，例如可列举能够与参与血管新生和内膜增厚、恶性肿瘤增殖的整合素进行特异性结合的肽，具体例示有rgd肽和ngr肽。此处，rgd肽是指含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)序列的肽；另外，ngr肽是指含有天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(ngr)序列的肽。这些肽能够与肿瘤的新生血管内皮细胞结合，因此本发明中的嵌段共聚物可以特异性地积聚于肿瘤中。rgd肽优选为环状rgd(crgd)肽。作为上述任一式所表示的嵌段共聚物所含有的crgd肽，具体可列举由下述式(10)所示的肽。
[化6]
另外，ngr肽优选为环状肽，例如为含有在ngr序列的n末端侧含有k，在c末端侧含有e，或者在ngr序列的n末端和c末端都含有c的环状化序列的肽(a.h.negussieetal.,jcontrolrelease2010；143(2):265-273；t.r.pearceetal.,adv.mater2012；24:3803-3822)。
上述嵌段共聚物可以通过任意适当的方法来制备。例如，根据需要将导入有保护基团的规定的氨基酸的n-羧酸酐(nca)，以ω末端氨基化的亲水性聚合物(例如聚乙二醇)的末端氨基作为引发剂依次聚合，接着通过脱保护或侧链变换也可以转化为聚阳离子链段，首先根据需要合成导入有保护基团的聚氨基酸，接着使其与亲水性聚合物结合，然后也可以根据需要通过脱保护或侧链变换合成具有聚阳离子链段的嵌段共聚物。作为使聚氨基酸与亲水性聚合物结合的方法，可使用各种方法，而在各个末端导入并偶联反应性的官能团的方法最具代表性。例如可列举：使用缩合剂或通过活性酯化将羧基与氨基结合的方法、通过马来酰亚胺和巯基进行的方法、通过炔基与叠氮基的点击化学的方法等。
<药物递送制剂>
本发明的药物递送制剂，其是抗肿瘤性药物递送制剂，用于治疗具有与正常组织相比高表达tug1基因的肿瘤的受试对象或者预防肿瘤转移，其特征在于，含有高分子胶束作为有效成分，所述高分子胶束具有抑制所述tug1基因高表达的核酸；该高分子胶束粒子含有：具有阳离子性聚氨基酸链段和亲水性聚合物链段的嵌段共聚物，以及所述核酸；该核酸与所述阳离子性聚氨基酸链段的阳离子基团结合形成复合体和/或该核酸包载或静电结合(或附着)于所述胶束内部；以及该高分子胶束积聚于肿瘤。
本发明的药物递送制剂例如可以通过以下方法获得：根据需要在缓冲化的水溶液中以n/p比大于1地将上述嵌段共聚物和上述核酸混合。如果是用于制备单元型pic的嵌段共聚物，则1以上的n/p比不限定，例如优选为1.0～2.5，更优选为1.1～2.0，进一步优选为1.2～1.6，可以按照上述n/p比进行混合而得到用于制备单元型pic的嵌段共聚物。通过设为这样的n/p比，游离的核酸或嵌段共聚物减少，可以得到以高含有率含有嵌段共聚物和核酸的制剂。另外，如果是用于制备单元型pic的嵌段共聚物，则通过大于1的n/p比，例如在含有一定量的未与核酸静电结合的嵌段共聚物(游离的嵌段共聚物)的制剂中，由于可以使游离嵌段共聚物产生的游离核酸的再捕捉作用和来自向目标肿瘤细胞递送的制剂的顺畅的核酸释放达到高度平衡，因此可以更加显著地兼顾核酸的血液中滞留性的提高和抗肿瘤效果。其中，n/p比是指[嵌段共聚物中阳离子基团的总数(n)]/[核酸中磷酸基团的总数(p)]。
在另一实施方式中，本发明的制剂单元型pic可以通过以下方法得到：根据需要在缓冲化的水溶液中例如以n/p比大于2.5，优选为3以上、4以上、5以上，进一步优选为10以上地将上述嵌段共聚物和核酸混合。通过这样增大n/p比，可以大幅提高制剂中所含核酸的血液中稳定性。n/p比的上限并不限定，例如为20～50。
上述缓冲化的水溶液例如可以为hepes缓冲液(ph值7.3～7.4)、tris缓冲液(ph值7.4)等。
本发明的制剂穿透肿瘤内的新生血管而在肿瘤内积聚。这一点通过核酸制剂在图16的胶质瘤(脑肿瘤干细胞)中的积聚得到了证实。如果是胶束型pic，则胶束的粒径不限定，例如优选为约10nm～约100nm的范围内；另外，如果是单元型pic，则不限定，例如优选为约10nm～约30nm的范围内。
本发明的制剂通过将上述嵌段共聚物和上述核酸(药物有效成分)在缓冲化的水溶液中混合，从而形成为具有上述纳米大小的粒子样结构。
本发明的制剂优选具有通过血液中给药而特异性地积聚于肿瘤组织中的性质，因此副作用明显较低。
上述核酸的剂量没有限制，如果用于人，则每次每kg成人体重换算成sirna分子或反义核酸分子例如为约0.0001mg～约1,000mg，而剂量或给药量一般应考虑受试对象的性别、年龄、体重、症状、重症程度、副作用等来进行选择。另外，给药可以按照例如1周、2周、3周或4周的间隔，或者如有需要则以大于1个月的间隔进行。
在制剂化中，除了核酸有效成分外，还可以混合载体或稀释剂以及添加剂作为药物组合物的形式。根据需要，该药物组合物也可以与其他抗癌剂(例如化学治疗剂、抗体药物、免疫检查点抑制剂等)和/或其他治疗相关制剂进行组合。
作为剂型，优选为注射剂、点滴剂等非口服剂。
载体或稀释剂为水性溶剂，例如蒸馏水、灭菌水、林格氏液、生理盐水、缓冲液等。
添加剂为药学上可接受的添加剂，例如增量剂、分散剂、缓冲剂、防腐剂、助溶剂、稳定剂、等渗剂、ph调节剂等。
给药途径如上所述，例如为静脉内给药、动脉内给药、脑内给药等。
本发明的药物递送制剂，在转移到肿瘤组织内之后，从凝聚体分离的有效成分核酸与嵌段共聚物一起通过内吞作用被摄入到细胞质内。
本发明还提供一种用于对受试对象进行治疗的方法，所述受试对象具有脑肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、白血病(尤其是髓性白血病)或淋巴瘤等与正常组织相比高表达tug1基因的肿瘤，所述方法包括：向受试对象给予上述制剂作为抗癌剂。
由后述实施例可以证实，例如通过在脑肿瘤中使用上述核酸，可确认到优异的细胞增殖抑制效果，因此本发明的制剂作为以肿瘤干细胞为靶标的抗癌剂也是优异的。
组合物、受试对象、给药量、给药途径、给药次数等如上所述。
本发明的制剂可以与化学治疗剂、药物抗体、免疫检查点抑制剂等其他抗癌治疗剂的给药相结合向受试对象给药。该制剂的给药可在给予用于治疗癌症的化学治疗剂和药物抗体之前、同时或之后进行。另外，本发明的制剂中除了上述核酸外，还可以含有用于治疗癌症的化学治疗剂和/或药物抗体。
化学治疗剂的示例并不限定，为日本专利特表2014-508515号公报所记载的抗癌剂，例如拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊甙、喜树碱、托泊替康、替尼泊苷、米托蒽醌等)、dna烷基化剂(例如顺式二氯二胺合铂、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、米尔法兰、苯丁酸氮芥、白消安、塞替派、卡莫司汀、洛莫司汀、卡铂、达卡巴嗪、甲基苄肼等)、dna链断裂诱导剂(例如博来霉素、阿霉素、柔红霉素、伊达比星、丝裂霉素c等)、抗微管剂(例如长春新碱、长春碱等)、抗代谢物(例如阿糖胞苷、甲氨蝶呤、羟基脲、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、6-硫鸟嘌呤、6-巯嘌呤、氟达拉滨、喷司他丁、氯脱氧腺苷等)、蒽环类抗生素、长春花生物碱、表鬼臼毒素、替莫唑胺等。
药物抗体的示例并不限定，为曲妥单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、雷莫芦单抗等具有抗癌作用的市售抗体和开发(临床试验)与上市的抗体。
免疫检查点抑制剂是用于通过抑制癌细胞逃避免疫细胞的攻击来恢复免疫细胞对癌细胞本来的攻击能力的药剂，例如包括抗pd-1抗体和抗pd-l1抗体，或者具有与它们同等的功能的药剂。
化学治疗剂、药物抗体、免疫检查点抑制剂等其他抗癌治疗剂的给药量，应考虑受试对象的性别、年龄、体重、症状、重症度、副作用等来进行选择，或者是在临床现场实际使用范围内的剂量。
<治疗或预防方法>
本发明还提供一种在受试对象中治疗或预防肿瘤的方法，其包括：向具有与正常组织相比高表达tug1基因的肿瘤的所述受试对象给予上述药物递送制剂。
关于药物递送制剂、剂量、给药方法、与其他抗癌治疗剂的联合用药、包括人的受试对象、肿瘤或癌症等如上所述。另外，治疗效果为在受试对象中实现肿瘤或癌的增殖抑制或退缩和/或转移的抑制；另一方面，关于预防，可以在接受了外科手术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法等抗癌治疗的受试对象中预防肿瘤或癌的转移，即预防肿瘤或癌的复发。
[实施例]
下面通过下述实施例，对本发明进行更加具体的说明，但本发明的技术范围并不受这些实施例限制。
[实施例1]
<各种肿瘤细胞株中tug1的表达水平>
使用定量rt-pcr测定各种肿瘤细胞株中tug1的表达水平。所使用的肿瘤细胞株为胶质瘤干细胞株(gsc)、胶质瘤细胞株(t98、u251、sk-mg1和ao2)、乳腺癌细胞株(mcf7、mda231、sk-br3和t47d)、大肠癌细胞株(lovo、caco-2、rko、sw48、sw480和sw1083)、前列腺癌细胞株(pc3、lncap和vcap)、肝癌细胞株(hepg2、huh7和a549)、肺癌细胞株(h920和pc9)、白血病细胞株(jurkat)、伯基特淋巴瘤细胞株(raji)和淋巴瘤细胞株(pfeiffer)。
结果以tug1相对于内标gapdh(glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase，3-磷酸甘油醛脱氢酶)的相对表达比例表示并示于图1中。与正常组织中tug1的表达水平(tug1/gapdh＝0.05394(正常脑组织3个病例的平均值))相比可知，tug1基因的表达水平在很多肿瘤细胞株中较高。
[实施例2]
<由sirna的tug1靶序列的位置和抑制效果>
为了设计抑制tug1表达的核酸(sirna)，从tug1lncrna的核苷酸序列(nr_110492(seqidno:1)、nr_110493(seqidno:2)和nr_002323(seqidno:3)的全部中对靶序列区域的候选进行筛选(a.m.khaliletal.,pnas,106:11667-11672,2009)、sidirectversion2.0(http://sidirect2.rnai.jp/))，委托日本北海道系统科学公司(日本札幌)制作针对该区域的sirna(即si-tug1#1～si-tug1#14((注)这些各序列中，在3’末端含有2个脱氧核糖核苷酸序列))(图3)。
使用lipofectamine3000(生命科学公司)，按照附带操作说明，将各种sirna分别导入到胶质瘤干细胞株gsc(1.0×105细胞)中，使终浓度为30nm。对照组sirna(“nc”)使用silencerselectnegativecontrol#1sirna(生命科学公司，商品目录编号4390843)。sirna导入3天后以gapdh基因为内标，通过定量rt-pcr(美国应用生物系统公司)对tug1相对于对照组sirna的表达量进行定量，结果对于8种sirna(si-tug1#1～si-tug1#8)确认到显著的tug1表达抑制效果(图2和图4)。而对于si-tug1#9～si-tug1#14，则未看到足够的tug1表达抑制效果。
另外，根据上述结果，确认作为tug1靶标区域，优选以分别在seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3的核苷酸序列中在核苷酸第1044～1062位、第1044～1062位或第1044～1062位的区域(图2中的#1区域)，和/或，在第2997～5181位、第2941～5111位或第2941～5125位的区域(图2中包括#5至#4的区域)作为靶标。
[实施例3]
<gsc肿瘤增殖抑制>
对于实施例2制作并确认到tug1表达抑制效果的8种sirna(si-tug1#1～si-tug1#8)中的每种sirna，使用脂质体转染法导入到实施例2所述的gsc肿瘤细胞内，在各sirna导入3天后使用台盼蓝染色(生命科学公司)测定存活细胞数，分析相对于对照组sirna(“nc”)的抗增殖效果，结果确认到分析中所使用的8种sirna存在显著的抗增殖效果。
[实施例4]
<lna修饰反义rna的gsc肿瘤增殖抑制>
对实施例2和实施例3中最能有效抑制tug1表达的si-tug1#2的反义链序列((注)与tug1的lncrna序列部分互补的序列)，进行lna(lockednucleicacid，锁核酸；2’-o,4’-c-亚甲基桥(-o-ch2-)核酸核苷酸)修饰，委托株式会社genedesign制作3种lna修饰反义rna(lna-tug1-1#1(seqidno:36)、lna-tug1-1#2(seqidno:37)、lna-tug1-1#3(seqidno:38)；图6)，研究tug1表达抑制效果。通过脂质体转染法，分别将对照组sirna(“nc”)、si-tug1#2以及上述lna修饰反义导入到胶质瘤干细胞株gsc中，在导入后3天、7天、10天后回收rna，连续性地对tug1表达量的变化进行定量。
结果可知，通过使用lna修饰反义rna，与si-tug1#2相比，能够更长时间地保持tug1的表达抑制效果(图7)。
另外，测定各sirna、各lna修饰反义rna导入10天后的gsc的相对存活细胞数，结果确认到只有lna修饰反义rna具有显著的抗增殖效果(图8)。
同样地，对si-tug1#6的反义链序列((注)与tug1的lncrna序列部分互补的序列)，进行lna修饰，委托株式会社genedesign制作3种lna修饰反义rna(lna-tug1-2#1(seqidno:51)、lna-tug1-2#2(seqidno:52)、lna-tug1-2#3(seqidno:53)；图9)，研究tug1表达抑制效果。通过脂质体转染法，分别将对照组sirna(“nc”)、si-tug1#6以及上述lna修饰反义导入到胶质瘤干细胞株gsc中，在导入后3天、7天、10天后回收rna，连续性地对tug1表达量的变化进行定量。
结果可知，通过使用lna修饰反义rna，与si-tug1#6相比，能够更长时间地保持tug1的表达抑制效果(图10)。
另外，测定各sirna、各lna修饰反义rna导入10天后的gsc的相对存活细胞数，结果确认到lna修饰反义rna具有更显著的抗增殖效果，尤其是lna-tug1-2#2(seqidno:52)和lna-tug1-2#3(seqidno:53)具有优异的抗增殖效果(图11)。
[实施例5]
<前列腺癌增殖抑制>
按照与实施例2和实施例3相同的步骤，利用脂质体转染法将si-tug1#2导入到前列腺癌细胞株pc3中。与上述实施例同样地测定导入3天后的前列腺癌细胞株pc3中的tug1表达水平和pc3株的相对细胞增殖率。使用对照组sirna(“nc”)作为阴性对照，此外表达水平同样以tug1相对于内标gapdh的相对表达比例来表示。
结果确认到tug1抑制对前列腺癌细胞株pc3的增殖抑制效果(图12a和图12b)。
[实施例6]
<gsc荷瘤小鼠中的肿瘤增殖抑制>
对于皮下移植有胶质瘤干细胞株gsc的裸鼠，将肿瘤大小约为100mm3的时间作为第0天，从该时间起每3天向各肿瘤直接给予5μg的lna-tug1-1#1(seqidno:36)，直到第35天，测定肿瘤大小。作为对照，同样向小鼠给予对照组sirna(“nc”)。
结果如图13所示，确认到lna-tug1-1#1的gsc增殖抑制效果。
[实施例7]
<体内(invivo)单元型pic药物递送制剂的脑肿瘤增殖抑制>
本实施例中，制作含tug1-lna寡聚体的药物递送制剂，对脑肿瘤原位移植小鼠进行静脉内给药，由此分析tug1-lna寡聚体在肿瘤组织的特异性积聚和个体水平上的抗肿瘤效果。
(1)用于含tug1-lna寡聚体的嵌段共聚物的制作
用于含tug1-lna寡聚体的嵌段共聚物为双臂α-甲氧基聚(乙二醇)-嵌段-聚(l-赖氨酸)((peg)2-plys)，按照wo2013/162041记载的方法如下制作。
在茄形瓶中量取以下用离子交换柱(gehealthcarejapan公司生产，产品名称“cm-sephadexc-50”)纯化的下述式(11)：
用离子交换柱(gehealthcarejapan株式会社制，商品名“cm-sephadexc-50”)精制下述式(11)
[化7]
(式中，x1和x2为约800～1,000)
表示的双链型聚(乙二醇)衍生物(日油株式会社生产，产品名称“sunbrightgl2-800pa”，平均分子量＝74,000da(37,000da×2))2.00g和2.51g硫脲，氩气置换后，添加30ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)。加热该混合物使其溶解，再搅拌2小时。在氩气气氛下，在茄形瓶中量取nε-三氟乙酰基-l-赖氨酸·n-羧酸酐(lys(tfa)-nca)0.20g(相当于28当量)，溶解于3ml的dmf中。用注射器将得到的溶液添加到加入上述双链型(peg)2的茄形瓶中。在氩气气氛下，在25℃的水浴中搅拌并反应2天。利用ir确认nca特有的吸收峰值消失后，添加17ml的甲醇。在搅拌下将得到的溶液倒入500ml的冷乙醚中，使其再沉淀。除去上清液，添加50ml甲醇进行加热，使其再溶解后，再重复两次倒入冷乙醚使其再沉淀的操作。用过滤器过滤沉淀并进行真空干燥，得到1.95g的(peg)2-plys(tfa)的白色粉末。将1.00g的(peg)2-plys(tfa)溶解于100ml甲醇中。在得到的溶液中添加1n的naoh水溶液10ml，在35℃的水浴中搅拌并反应17小时。将反应液加入透析管(mwco＝6,000～8,000)中，将0.01n盐酸作为外部溶液进行6次透析，将纯水作为外部溶液进行4次透析。通过将管内液冷冻干燥，得到0.85g的(peg)2-plys(盐酸盐)的白色粉末。
根据1h-nmr，以(peg)2的分子量74,000为标准，plys的聚合度确定为20。另外，通过gpc，确认到得到单峰性且几乎不含有lys的均聚物的嵌段共聚物(peg)2-plys(peg的聚合度为21×2，plys的聚合度为20)。
合成的(peg)2-plys的结构如下(式(12))。
[化8]
按照与上述相同的方法，可以得到peg种类和/或聚赖氨酸聚合度不同的各种嵌段共聚物。
(2)含tug1-lna寡聚体的单元型pic药物递送制剂的制作
在10mm的hepes缓冲液(ph值7.3)中，以n/p比为20的方式，在室温下缓慢搅拌和混合上述(1)中制作的(peg)2-plys和tug1-lna寡聚体(lna-tug1-2#1(seqidno:51))，由此制作在内壳具有tug1-lna寡聚体的药物递送制剂。此时，该寡聚体静电诱导并附着于嵌段共聚物的plys，形成在外壳侧配置有亲水性的peg的胶束样式结构(粒径：约10nm～25nm)。
(3)单元型pic药物递送制剂的脑肿瘤增殖抑制
作为脑肿瘤原位移植小鼠模型，对免疫缺陷小鼠(nod/shijic-scidjcl；日本clair株式会社)的脑原位移植脑肿瘤干细胞(gsc-222株)，制作移植30天后的脑肿瘤生长的小鼠。
为了在小鼠个体水平上确认tug1-lna寡聚体在脑中的积聚，用荧光物质(alexa-647)标记药物递送制剂中含有的tug1-lna寡聚体。另外，作为对比分析，使用alexa-647标记的tug1-lna寡聚体单体(未进行高分子胶束化)。对脑肿瘤原位移植小鼠(25μg/小鼠)的静脉内给予含tug1-lna寡聚体的高分子胶束(药物递送制剂)和tug1-lna寡聚体单体后，利用活体成像系统(caliperlifesciences)测定荧光强度，结果确认到含tug1-lna寡聚体的药物递送制剂特异性地积聚于脑肿瘤部位中(图14、图15)。另外，由图15可知，至给药后9小时，积聚在脑内的该药物递送制剂在将给药前的荧光强度值设为1时，荧光强度最高值上升至21，之后下降，在给药后15小时荧光强度值为9。
接着，对上述脑肿瘤原位移植小鼠(移植脑肿瘤干细胞30天后的小鼠)，连续静脉内给予含tug1-lna寡聚体的药物递送制剂(每3天给药一次(25μg/小鼠))，评价抗肿瘤效果。另外，作为对比分析，使用给予了含有针对萤火虫gl3萤光素酶基因的sirna(seqidno:54(有义链)和seqidno:55(反义链))的药物递送制剂的小鼠。
在给药开始起30天后(其间合计给药10次)摘除小鼠的脑，通过苏木素-伊红(he)染色对脑组织进行观察，结果确认到给予含tug1-lna寡聚体的药物递送制剂使得肿瘤明显缩小(图16)，显然，含tug1-lna寡聚体的药物递送制剂在体内(invivo)特异性地积聚于脑肿瘤中，表现出较强的抗肿瘤作用。
[实施例8]
<胰腺癌细胞株增殖抑制>
利用脂质体转染法，向胰腺癌细胞株(miapaca2、panc1、bxpc3)导入tug1-lna寡聚体(lna修饰反义dna，seqidno:56)。测定导入3天后的胰腺癌细胞株中的tug1表达水平和胰腺癌细胞株的相对细胞增殖率。使用针对萤火虫gl3萤光素酶基因的lna寡聚体(lna修饰dna，seqidno:57)作为阴性对照，此外表达水平以tug1相对于内标gapdh的相对表达比例来表示。结果确认到tug1抑制对胰腺癌细胞株的增殖抑制效果(图17a和图17b)。
[实施例9]
<负荷有胰腺癌细胞株(bxpc3)小鼠中的肿瘤增殖抑制>
对皮下移植有胰腺癌细胞株(bxpc3)的裸鼠，连续静脉内给药包载tug1-lna寡聚体(seqidno:56)的药物递送制剂(每3天给药一次(25μg/小鼠))，评价抗肿瘤效果。另外，作为对比分析，使用给予了包载针对萤火虫gl3萤光素酶基因的lna寡聚体(seqidno:57)的药物递送制剂的小鼠。将肿瘤大小约为100mm3的时间作为第0天，从该时间起，持续静脉内给予包载各lna寡聚体的药物递送制剂(胶束型pic药物递送制剂(参考后述的[参考例1]))，每3天测定肿瘤大小，直至第30天。结果如图18所示，确认到包载tug1-lna寡聚体的药物递送制剂的肿瘤增殖抑制效果。
[参考例1]
<包载tug1-lna寡聚体的胶束型pic药物递送制剂的制作>
(1)乙缩醛-聚乙二醇-聚(l-赖氨酸)嵌段共聚物(乙缩醛-peg-plys)的合成
将1.20g的平均分子量12,000的乙缩醛-peg-nh2和2.90g硫脲溶解于18ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中。接着，添加将1.34g的nε-三氟乙酰基-l-赖氨酸的n-羧酸酐(lys(tfa)-nca、乙缩醛-peg-nh2的50当量)溶解于20.1ml的dmf中而成的溶液，在20℃下反应2天。将反应溶液滴入到600ml的乙醚-甲醇(15/1)的混合溶剂中，得到白色沉淀。再将沉淀溶解于甲醇中并滴入到乙醚中，重复2次。将得到的白色沉淀过滤并进行真空干燥，得到2.22g乙缩醛-peg-plys(tfa)。
将得到的2.00g乙缩醛-peg-plys(tfa)溶解于200ml甲醇中，添加1n氢氧化钠溶液20ml，在35℃下反应12小时。将反应溶液加入透析管(funakoshi株式会社生产，spectra/por，截留分子量6,000～8,000)中，将含有150mm的nacl的10mm磷酸缓冲溶液(ph值7.4)作为外部溶液进行4次透析，接着将纯水作为外部溶液进行3次透析，回收透析膜内液并进行冷冻干燥，得到1.63g乙缩醛-peg-plys的白色固体。根据1h-nmr确认得到的化合物为目标物。得到的乙缩醛-peg-plys的聚赖氨酸链段的聚合度为45。
(2)crgd-peg-plys的合成
将crgd肽(式(10))26.2mg(相对于乙缩醛-peg-plys为5倍当量)溶解于1ml的10mm磷酸缓冲液(ph值7.4)中。接着，添加二硫苏糖醇(dtt)5mg(相对于crgd肽为1当量)，在25℃下搅拌30分钟，以还原crgd肽。在另一容器中，将合成例1中得到的乙缩醛-peg-plys125mg(1当量)溶解于0.01m的盐酸(ph值2.0)中，在25℃下搅拌2小时。之后，将还原的crgd肽滴入到乙缩醛-peg-plys溶液中，并使用0.05m氢氧化钠溶液将ph值调节至5.0。在4℃搅拌下使反应过夜。将反应溶液移至透析管(funakoshi株式会社生产，spectra/por，截留分子量：6,000～8,000)中，在含有150mm的nacl的10mm磷酸缓冲液(ph值7.4)中透析2天，接着在蒸馏水中透析2天。透析后，用过滤器(日本millipore公司，sterivextmgp0.22μm)处理后，进行冷冻干燥，得到crgd-peg-plys的白色粉末(产量：112mg，收率86％)。与peg-plys结合的crgd肽的量，由根据1h-nmr测定的crgd肽的苯基ch蛋白峰值与peg的ch2主链峰值的积分比来计算。所得的crgd-peg-plys的crgd的导入率为85％。
(3)crgd-peg-plys(dtbp/im)(嵌段共聚物)的合成
将上述(2)中得到的50mg的crgd-peg-plys溶解于0.1m的硼砂缓冲液(ph值9.0)中。在另一容器中，将3,3’-dithiobispropionimid(dtbp)3.6mg(相对于crgd-peg-plys的赖氨酸单元为0.1当量)溶解于冷水中。将dtbp溶液滴入到crgd-peg-plys溶液中，在25℃下搅拌45分钟。之后，以粉末的形式添加2-亚氨基硫烷(2-im)38mg(相对于crgd-pegplys的赖氨酸单元为2.4当量)，在25℃下搅拌30分钟。将反应液加温至35℃，搅拌过夜。将反应溶液移至透析管(funakoshi株式会社生产，spectra/por，截留分子量6,000～8,000)中，在10mm磷酸缓冲液(ph值7.4)中的150mm的nacl溶液中透析1小时。接着，将35mg(相对于crgd-peg-plys的赖氨酸单元为2.0当量)的dtt加入到透析管的内液中，静置30分钟。之后，在150mm的nacl溶液中透析1小时，在蒸馏水中透析1小时。透析后，用过滤器(日本millipore公司，sterivextmgp0.22μm)处理后，进行冷冻干燥，得到crgd-peg-plys(dtbp/im)的白色粉末(产量：56mg)。与peg-plys(dtbp/im)结合的dtbp和im的量，由根据1h-nmr测定的dtbp的ch2峰值、im的ch2和peg的ch2主链峰值的积分比来计算。所得的crgd-peg-plys(dtbp/im)的dtbp、im的导入率分别为16％、80％。
crgd-peg-plys(dtbp/im)的结构如下(式(13))。
[化9]
(4)胶束型pic药物递送制剂的制作
将上述(3)中得到的crgd-peg-plys(dtbp/im)溶解于10mm的hepes缓冲液(ph值7.4)中，使其浓度为5mg/ml。接着，与dtt浓度30.54mg/ml的10mm的hepes缓冲液(ph值7.4)混合，将浓度配制成n/p比为1～8，并在室温下静置30分钟。将上述tug1-lna寡聚体溶解于10mm的hepes缓冲液(ph值7.4)中，配制成15μm的寡聚体溶液。将tug1-lna寡聚体溶液和crgd-peg-plys(dtbp/im)溶液混合成n/p比为1.3(体积比2：1)，并在25℃下静置24小时。将得到的溶液利用slide-a-lyzer透析卡(截留分子量：3.5kda)在含5v/v％dmso的10mm的hepes溶液(ph值7.4)中透析2天，并在10mm的hepes溶液(ph值7.4)中透析2天，得到包载有嵌段共聚物和tug1-lna寡聚体溶液的复合体寡聚体的胶束。
如实施例7和实施例9中所述，对肿瘤移植小鼠进行静脉内给予得到的胶束，用于确认抗肿瘤效果。
工业实用性
本发明人制作在肿瘤细胞中有效抑制tug1表达的修饰sirna和修饰反义rna，在其中发现在抑制tug1表达的同时抑制胶质瘤等肿瘤和肿瘤干细胞的细胞增殖的核酸，尤其是确认到通过使用lna修饰反义rna，能够更长时间地抑制肿瘤内的tug1表达，显著抑制肿瘤增殖(日本专利特愿2015-024713(wo2016/129633a1))。
本申请还制作含有抑制tug1表达的上述核酸的药物递送制剂，通过将其对患有脑肿瘤、胰腺癌等肿瘤或癌症的受试对象进行给药，该药物递送制剂特异性地积聚于肿瘤中，不仅对肿瘤细胞，对肿瘤干细胞也表现出较强的抗肿瘤作用。因此，本发明表明，以tug1为靶标的核酸药物对脑肿瘤(gbm等)、胰腺癌等癌症治疗是有效的。
序列表自由文本
seqidno:4～seqidno:19：针对人tug1的sirna
seqidno:20～seqidno:21、seqidno:28～seqidno:29、seqidno:43、seqidno:49：针对人tug1的sirna，该序列中(1)…(17)为rna。
seqidno:22～seqidno:27、seqidno:30～seqidno:35、seqidno:39～seqidno:42、seqidno:44～seqidno:48、seqidno:50：针对人tug1的sirna，该序列中(1)…(19)为rna。
seqidno:36：lna修饰反义rna，该序列中(1)…(4)和(16)…(19)为锁核酸。
seqidno:37：lna修饰反义rna，该序列中(1)…(3)和(17)…(19)为锁核酸。
(19)为锁核酸。
seqidno:38：lna修饰反义rna，该序列中(1)…(4)和(17)…(19)为锁核酸。
seqidno:51：lna修饰反义rna，该序列中(1)…(4)和(18)…(21)为锁核酸。
seqidno:52：lna修饰反义rna，该序列中(1)…(3)和(19)…(21)为锁核酸。
seqidno:53：lna修饰反义rna，该序列中(1)…(4)和(19)…(21)为锁核酸。
seqidno:54～seqidno:55：针对萤火虫gl3萤光素酶基因的sirna
seqidno:56：lna修饰反义dna，该序列中(1)…(4)和(19)…(21)为锁核酸。
seqidno:57：针对萤火虫gl3萤光素酶基因的lna修饰dna，该序列中(1)…(4)和(19)…(21)为锁核酸。
本说明书中所引用的上述专利、专利申请和刊物所记载的全部公开，通过参考而将其整体编入本说明书。
序列表
<110>公立大学法人名古屋市立大学
国立大学法人东京大学
<120>抗肿瘤性药物递送制剂
<130>ph-6768-pct
<150>jp2015-226895
<151>2015-11-19
<160>57
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>7598
<212>rna
<213>智人(homosapiens)
<400>1
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