本发明涉及以溶血磷脂酸受体(lpa1)拮抗物质、例如具有特定结构的α位卤素取代噻吩化合物或其药理上可允许的盐作为有效成分的医药组合物。本发明的lpa1拮抗物质、例如具有特定结构的α位卤素取代噻吩化合物具有lpa1拮抗作用，因此，对于治疗和/或预防由lpa引起的非酒精性脂肪性肝炎(nash)是有用的。
背景技术：
中性脂肪蓄积在肝脏中的疾病被称为脂肪肝，因除了酒精的过量摄取之外的原因而产生的脂肪肝被称为非酒精性脂肪肝疾病(nafld)。进而，nafld在病理学上被分类为观察不到肝细胞损伤的单纯性脂肪肝(nafl)和伴有肝细胞损伤且显示出炎症征象的非酒精性脂肪性肝炎(nash)。nash的病况类似于酒精性肝损伤，若病况加剧则经由肝硬化而转变为肝细胞癌(非专利文献1)。
nash的治疗药使用抗氧化剂、胰岛素抵抗力改善药等，但尚未发现会显示出充分治疗效果的药物(非专利文献2)。
溶血磷脂酸(lpa)是显示各种生理作用的脂质介质。lpa与g蛋白共轭受体(lpa1、lpa2、lpa3、lpa4、lpa5、lpa6)结合而向细胞内传导信号，从而调节细胞的增殖、分化、存活、迁移、粘接、浸润、形态形成。此外，已知lpa会干预各种疾病(非专利文献3)。
lpa还干预在肝脏中发病的各种疾病。有报告称lpa会促进在肝纤维化的过程中显示重要作用的星状细胞的增殖或者肌成纤维细胞的迁移(参照非专利文献4、5)。此外有报告称：c型慢性肝炎患者的血浆中的lpa浓度增加，lpa浓度与肝脏的纤维化程度存在相关关系(非专利文献6)。进而有报告称：作为lpa合成酶的autotaxin(atx)在nafld患者的血清中有所增加，atx与肝脏的脂肪变性有关，并启示了因atx而产生的lpa有助于脂肪变性(非专利文献7)。
截止至今，作为具有lpa1拮抗作用的化合物，专利文献1～29、非专利文献8～11公开了([1,1’-联苯]-4-基)乙酸衍生物。此外，专利文献1～3、10～13、15和19、非专利文献8～10中，作为药理试验，记载了视网膜病、肺纤维病、硬皮病、骨髄损伤等病态模型动物的药效数据。然而，根据使用了病态模型动物的药效数据，关于具有lpa1拮抗作用的化合物与nash的治疗或预防有关的效果没有任何记载，也没有启示。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：wo2010/077882号公报
专利文献2：wo2010/077883号公报
专利文献3：wo2010/141761号公报
专利文献4：wo2010/141768号公报
专利文献5：wo2011/017350号公报
专利文献6：wo2011/041461号公报
专利文献7：wo2011/041462号公报
专利文献8：wo2011/041694号公报
专利文献9：wo2011/041729号公报
专利文献10：wo2011/091167号公报
专利文献11：wo2011/159632号公报
专利文献12：wo2011/159633号公报
专利文献13：wo2011/159635号公报
专利文献14：wo2012/078593号公报
专利文献15：wo2012/078805号公报
专利文献16：wo2012/138648号公报
专利文献17：wo2012/138797号公报
专利文献18：wo2013/025733号公报
专利文献19：wo2013/070879号公报
专利文献20：wo2013/085824号公报
专利文献21：wo2013/189862号公报
专利文献22：wo2013/189864号公报
专利文献23：wo2013/189865号公报
专利文献24：wo2014/104372号公报
专利文献25：wo2014/113485号公报
专利文献26：wo2014/145873号公报
专利文献27：us20140200215号公报
专利文献28：wo2015/066456号公报
专利文献29：cn104418820号公报
非专利文献
非专利文献1：hepatology,44(2006)865-873
非专利文献2：journalofhepatology,62(2015)s65-s75
非专利文献3：experimentalcellresearch333,(2015)171-177
非专利文献4：biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,248(1998)436-440
非专利文献5：journalofbiomedicalscience,10(2003)352-358
非专利文献6：journalofclinicalgastroenterology,41(2007)616-623
非专利文献7：obesity,23(2015)965-972
非专利文献8：thejournalofpharmacologyandexperimentaltherapeutics,336(2011)693-700
非专利文献9：britishjournalofpharmacology,160(2010)1699-1713
非专利文献10：arthritis&rheumatism,63(2011)1405-1415
非专利文献11：journalofmedicinalchemistry,55(2012)7920-7939
技术实现要素：
发明要解决的问题
本发明人等为了开发出nash的优异治疗药或预防药而进行了研究。其结果发现：具有优异的lpa1拮抗作用且具有特定结构的α位卤素取代噻吩化合物作为nash的治疗药和/或预防药是有用的，从而完成了本发明。
本发明提供一种作为nash的治疗药和/或预防药(优选为治疗药)的lpa1拮抗物质、例如具有特定结构的α位卤素取代噻吩化合物或其药理上可允许的盐的医药用途。
用于解决问题的方案
本发明提供下述方案。
(1)一种用于治疗和/或预防nash的医药组合物，其以lpa1拮抗物质作为有效成分。
(2)根据(1)所述的用于治疗和/或预防nash的医药组合物，其中，lpa1拮抗物质为通式(i)所示的α位卤素取代噻吩化合物或其药理上可允许的盐。
(式中，
r1表示氢原子或甲氧基；
r2表示氢原子或c1-c6烷基；
x表示卤素原子；
a选自由下述基团组成的组。)
(3)一种用于治疗和/或预防nash的医药组合物，其以(2)所述的α位卤素取代噻吩化合物或其药理上可允许的盐作为有效成分，其中，通式(i)中，x为氟原子或氯原子。
(4)一种用于治疗和/或预防nash的医药组合物，其以(3)所述的α位卤素取代噻吩化合物或其药理上可允许的盐作为有效成分，其中，通式(i)中，r1为氢原子。
(5)一种用于治疗和/或预防nash的医药组合物，其以(3)所述的α位卤素取代噻吩化合物或其药理上可允许的盐作为有效成分，通式(i)中，r1为甲氧基。
(6)一种用于治疗和/或预防nash的医药组合物，其以(r)-1-[4’-(5-氯-3-{[(1-苯基乙氧基)羰基]氨基}噻吩-2-基)-2’-甲氧基-[1,1’-联苯]-4-基]环丙烷羧酸或其药理上可允许的盐作为有效成分。
(7)一种用于治疗和/或预防nash的医药组合物，其以(r)-1-{4’-[5-氯-3-({[1-(2,5-二氟苯基)乙氧基]羰基}氨基)噻吩-2-基]-2’-甲氧基-[1,1’-联苯]-4-基}环丙烷羧酸或其药理上可允许的盐作为有效成分。
(8)一种用于治疗和/或预防nash的医药组合物，其以(r)-1-{4’-[3-({[1-(2-氯苯基)乙氧基]羰基}氨基)-5-氟噻吩-2-基]-2’-甲氧基-[1,1’-联苯]-4-基}环丙烷羧酸或其药理上可允许的盐作为有效成分。
(9)一种用于治疗和/或预防nash的医药组合物，其以(r)-1-{4’-[5-氯-3-({[1-(噻吩-3-基)乙氧基]羰基}氨基)噻吩-2-基]-[1,1’-联苯]-4-基}环丙烷羧酸或其药理上可允许的盐作为有效成分。
(10)一种用于治疗和/或预防nash的医药组合物，其以(r)-1-{4’-[5-氟-3-({[1-(4-甲基噻吩-3-基)乙氧基]羰基}氨基)噻吩-2-基]-[1,1’-联苯]-4-基}环丙烷羧酸或其药理上可允许的盐作为有效成分。
(11)一种用于治疗和/或预防nash的方法，其包括：将有效量的lpa1拮抗物质、例如(2)～(10)中任一项所述的通式(i)所示的α位卤素取代噻吩化合物或其药理上可允许的盐对需要其的对象进行给药。
(12)用于治疗和/或预防nash的lpa1拮抗物质、例如(2)～(10)中任一项所述的通式(i)所示的α位卤素取代噻吩化合物或其药理上可允许的盐。
(13)lpa1拮抗物质、例如(2)～(10)中任一项所述的通式(i)所示的α位卤素取代噻吩化合物或其药理上可允许的盐的用于治疗和/或预防nash的用途。
(14)lpa1拮抗物质、例如(2)～(10)中任一项所述的通式(i)所示的α位卤素取代噻吩化合物或其药理上可允许的盐的用于制造nash治疗用和/或预防用医药的用途。
本发明的lpa1拮抗物质只要对lpa1具有拮抗作用，就没有特别限定，可列举出例如本发明的通式(i)所示的化合物。lpa1拮抗物质具有强力的lpa1拮抗作用，并起到良好的治疗和/或预防nash的效果，从这一点出发，其相对于lpa1拮抗作用的ic50值优选为0.001nm～500nm，更优选为0.001nm～100nm。
此外，本发明还涉及用于筛选nash的治疗用和/或预防用化合物的方法，其包括评价候补化合物对lpa1的拮抗作用。例如，可以测定候补化合物相对于lpa1拮抗作用的ic50值，筛选出该值为0.001nm～1000nm、优选为0.001nm～500nm、更优选为0.001nm～100nm的化合物来作为nash的治疗用和/或预防用化合物。
需要说明的是，上述相对于lpa1拮抗作用的ic50值利用本申请的试验例1中记载的方法进行测定。
作为本发明的通式(i)所示化合物的具体例，可列举出例如下述表1所示那样的化合物。需要说明的是，下述表1中，a基表示下述式a1～a5所示的基团，me表示甲基，et表示乙基，n-pr表示正丙基，iso-pr表示异丙基，f表示氟原子，cl表示氯原子，br表示溴原子，ome表示甲氧基，“外消旋”和“(r)-”表示下述通式(i)中的标有“*”的碳原子的构型：
[表1]
发明的效果
本发明的lpa1拮抗物质、例如通式(i)所示的α位卤素取代噻吩化合物或其药理上可允许的盐具有强力的lpa1拮抗作用，因而，作为nash的治疗药和/或预防药是有用的。
具体实施方式
前述通式(i)所示的化合物中，各取代基的优选形态如下所示。
x所示的“卤素原子”例如是氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
作为x所示的“卤素原子”，优选为氟原子、氯原子或溴原子，更优选为氟原子或氯原子。
r2所示的“c1-c6烷基”可列举出例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、或者1,2,2-三甲基丙基等直链状或支链状的c1-c6烷基。
作为r2所示的“c1-c6烷基”，优选为c1-c3烷基、更优选为乙基。
r2优选为氢原子或乙基，更优选为氢原子。
本发明的通式(i)所示的化合物存在光学异构体、几何异构体或旋转异构体时，这些异构体也包括在本发明的范围内，此外，存在质子互变异构时，这些互变异构体也包括在本发明的范围内。
通式(i)中，基团：
优选为下述基团：
本发明的通式(i)所示的化合物在r2为氢原子的情况下，可以用碱进行处理而制成药理上可允许的碱性盐。作为这样的盐，可列举出例如钠盐、钾盐、钙盐或镁盐等金属盐；铵盐等无机盐；或者三乙胺盐或胍盐等有机胺盐等。
本发明的通式(i)所示的化合物或其药理上可允许的盐可以形成水合物或者溶剂合物，它们各自或者它们的混合物包括在本发明中。
本发明的式(i)所示的盐中，构成原子中的一种或多种有时也包括非天然比率的原子同位素。作为原子同位素，可列举出例如氘(2h)、氚(3h)、碳-14(14c)、氟-18(18f)、硫-35(35s)或碘-125(125i)等。这些化合物作为治疗剂或预防剂、研究试剂、例如化验试剂和诊断剂、例如体内图像诊断剂是有用的。本发明的式(i)所示的盐的所有同位素变种无论是否为放射性均包括在本发明中。
作为本发明的通式(i)所示的化合物或其药理上可允许的盐，从具有强力的lpa1拮抗作用并起到良好的治疗和/或预防nash的效果的方面出发，优选为化合物编号i-56、i-60、i-116、i-120、i-146、i-150、i-170、i-206、和i-210的化合物或其药理上可允许的盐，特别优选为化合物编号i-60、i-120、i-150、i-170和i-210的化合物或其药理上可允许的盐，尤其优选为化合物编号i-150和i-170的化合物或其药理上可允许的盐。
本发明的通式(i)所示的化合物或其药理上可允许的盐可通过公知的制造方法、例如专利文献24(wo2014/104372号公报)中记载的方法或者基于其的方法来制造。
本发明的医药组合物中，除了本发明的lpa1拮抗物质、例如通式(i)所示的化合物和其药理上可允许的盐之外，还可以包含其它医药活性成分、例如用于治疗和/或预防nash的物质等。
此外，本发明的医药组合物中，在不损害本发明效果的范围内，可以包含赋形剂、润滑剂、结合剂、崩解剂、乳化剂、稳定剂、调味剂或稀释剂等药理上可允许的添加剂，可以利用片剂、胶囊、粉剂、糖浆、颗粒剂、细粒剂、丸剂、悬浊剂、乳剂、经皮吸收剂、栓剂、软膏剂、洗剂、吸入剂或注射剂等的形态，通过经口或非经口(静脉内给药、肌肉内给药、腹腔内给药、经皮给药、经气管给药、皮内给药或皮下给药等)来给药。
将本发明的lpa1拮抗物质、例如通式(i)所示的化合物或其药理上可允许的盐用作nash的治疗用和/或预防用医药的情况下，可以将其自身(保持原料粉末的状态)进行给药，或者，可以利用在不损害本发明效果的范围内与赋形剂、润滑剂、结合剂、崩解剂、乳化剂、稳定剂、调味剂或稀释剂等药理上可允许的添加剂混合而制造的片剂、胶囊、粉剂、糖浆、颗粒剂、细粒剂、丸剂、悬浊剂、乳剂、经皮吸收剂、栓剂、软膏剂、洗剂、吸入剂或注射剂等的形态，通过经口或非经口(静脉内给药、肌肉内给药、腹腔内给药、经皮给药、经气管给药、皮内给药或皮下给药等)来给药。
这些制剂使用赋形剂、润滑剂、结合剂、崩解剂、乳化剂、稳定剂、调味剂或稀释剂等药理上可允许的添加剂，通过公知的方法来制造。
赋形剂可列举出例如有机系赋形剂或无机系赋形剂。有机系赋形剂可列举出例如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇或山梨醇等糖衍生物；玉米淀粉、马铃薯淀粉、α-淀粉或糊精等淀粉衍生物；结晶纤维素等纤维素衍生物；阿拉伯胶；葡聚糖；或者支链淀粉等。无机系赋形剂可列举出例如轻质硅酸酐；或者硫酸钙等硫酸盐等。
润滑剂可列举出例如硬脂酸；硬脂酸钙或硬脂酸镁等硬脂酸金属盐；滑石；胶体二氧化硅；蜜蜡或鲸蜡等蜡类；硼酸；己二酸；硫酸钠等硫酸盐；二醇；富马酸；苯甲酸钠；d,l-亮氨酸；月桂基硫酸钠；硅酸酐或硅酸水合物等硅酸类；或者上述赋形剂中的淀粉衍生物等。
结合剂可列举出例如羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、或者上述赋形剂所示的化合物等。
崩解剂可列举出例如低取代度羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙或内部交联羧甲基纤维素钙等纤维素衍生物；交联聚乙烯基吡咯烷酮；或者羧甲基淀粉或羧甲基淀粉钠等经化学修饰的淀粉或纤维素衍生物。
乳化剂可列举出例如膨润土或veegum等胶体性粘土；月桂基硫酸钠等阴离子表面活性剂；苯扎氯铵等阳离子表面活性剂；或者聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯或蔗糖脂肪酸酯等非离子表面活性剂等。
稳定剂可列举出例如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯等对羟基苯甲酸酯类；氯丁醇、苄醇或苯基乙醇等醇类；苯扎氯铵；苯酚或甲酚等酚类；硫柳汞；乙酸酐；或者山梨酸。
调味剂可列举出例如糖精钠或阿斯巴甜等甜味料；柠檬酸、苹果酸或酒石酸等酸味料；或者薄荷脑、柠檬提取物或柑橘提取物等香料等。
稀释剂是通常用作稀释剂的化合物，可列举出例如乳糖、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、硫酸钙、羟丙基纤维素、微晶性纤维素、水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油、淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮、或者它们的混合物等。
本发明中，为了治疗和/或预防nash，将有效量的本发明的医药组合物或lpa1拮抗物质、例如通式(i)所示的化合物或其药理上可允许的盐对需要其的对象进行给药。作为上述对象，可列举出例如动物、例如人等哺乳类，典型而言，可列举出nash患者。
此外，本发明的lpa1拮抗物质、例如通式(i)所示的化合物或其药理上可允许的盐的有效量可根据前述对象的症状、年龄、体重等条件而变化，对于成人而言，在经口给药的情况下，可以分别以每次下限0.001mg/kg(优选为0.01mg/kg)、上限20mg/kg(优选为10mg/kg)的方式，在非经口给药的情况下，可以分别以每次下限0.0001mg/kg(优选为0.0005mg/kg)、上限10mg/kg(优选为5mg/kg)的方式，根据症状每天给药1次～6次。
实施例
以下示出制造例(制造例1～9)、试验例(试验例1～5)和制剂例(制剂例1～3)，更详细地说明本发明，但这些例示用于更良好地理解本发明，并不对本发明的范围作出限定。
此外，在没有特别说明的情况下，化学结构式中的me表示甲基，et表示乙基。
[制造例]
(制造例1)
(r)-1-{4’-[5-氯-3-({[1-(噻吩-3-基)乙氧基]羰基}氨基)噻吩-2-基]-[1,1’-联苯]-4-基}环丙烷羧酸乙酯(化合物编号i-56)
按照专利文献24(wo2014/104372号公报)的实施例111中记载的方法进行制造。
质谱(duis-,m/z)：550[m-1]-。
1h-nmr光谱(400mhz,cdcl3)δ：7.69-7.63(2h,m),7.63-7.51(3h,m),7.48-7.40(4h,m),7.31(1h,dd,j＝5.0,2.9hz),7.28-7.26(1h,m),7.11(1h,dd,j＝5.0,1.3hz),6.72(1h,s),5.99(1h,q,j＝6.6hz),4.13(2h,q,j＝7.1hz),1.64(2h,dd,j＝7.0,4.0hz),1.62(3h,d,j＝6.5hz),1.23(2h,dd,j＝7.0,4.0hz),1.19(3h,t,j＝7.1hz)。
(制造例2)
(r)-1-[4’-(5-氯-3-{[(1-苯基乙氧基)羰基]氨基}噻吩-2-基)-2’-甲氧基-[1,1’-联苯]-4-基]环丙烷羧酸乙酯(化合物编号i-146)
按照专利文献24(wo2014/104372号公报)的实施例51中记载的方法进行制造。
质谱(ci,m/z)：575[m]+。
1h-nmr光谱(400mhz,dmso-d6)δ：9.39(1h,brs),7.40-7.26(10h,m),7.23-7.16(2h,m),7.10(1h,dd,j＝7.8,1.6hz),5.75(1h,q,j＝6.4hz),4.06(2h,q,j＝7.1hz),3.73(3h,s),1.56-1.41(5h,m),1.23(2h,dd,j＝7.0,4.0hz),1.13(3h,t,j＝7.0hz)。
(制造例3)
(r)-1-{4’-[5-氟-3-({[1-(4-甲基噻吩-3-基)乙氧基]羰基}氨基)噻吩-2-基]-[1,1’-联苯]-4-基}环丙烷羧酸乙酯(化合物编号i-116)
按照专利文献24(wo2014/104372号公报)的实施例137中记载的方法进行制造。
质谱(duis-,m/z)：548[m-1]-。
1h-nmr光谱(400mhz,dmso-d6)δ：9.31(1h,brs),7.74-7.68(2h,m),7.66-7.61(2h,m),7.57-7.40(5h,m),7.17-7.13(1h,m),6.83(1h,brs),5.74(1h,q,j＝6.5hz),4.05(2h,q,j＝7.2hz),2.17(3h,brs),1.60-1.43(3h,m),1.51(2h,dd,j＝6.8,4.0hz),1.23(2h,dd,j＝7.1,4.1hz),1.11(3h,t,j＝7.1hz)。
(制造例4)
(r)-1-{4’-[3-({[1-(2-氯苯基)乙氧基]羰基}氨基)-5-氟噻吩-2-基]-2’-甲氧基-[1,1’-联苯]-4-基}环丙烷羧酸乙酯(化合物编号i-206)
按照专利文献24(wo2014/104372号公报)的实施例92中记载的方法进行制造。
质谱(ei,m/z)：593[m]+。
1h-nmr光谱(400mhz,cdcl3)δ：7.52-7.48(2h,m),7.43-7.17(9h,m),7.06(1h,dd,j＝7.8,1.6hz),6.97(1h,d,j＝1.6hz),6.23(1h,q,j＝6.7hz),4.13(2h,q,j＝7.1hz),3.82(3h,s),1.63(2h,dd,j＝6.9,3.9hz),1.57(3h,d,j＝6.7hz),1.24(2h,dd,j＝7.0,4.0hz),1.20(3h,t,j＝7.2hz)。
(制造例5)
(r)-1-{4’-[5-氯-3-({[1-(噻吩-3-基)乙氧基]羰基}氨基)噻吩-2-基]-[1,1’-联苯]-4-基}环丙烷羧酸(化合物编号i-60)
按照专利文献24(wo2014/104372号公报)的实施例112中记载的方法进行制造。
质谱(duis-,m/z)：522[m-1]-。
1h-nmr光谱(400mhz,dmso-d6)δ：12.37(1h,brs),9.33(1h,brs),7.74-7.68(2h,m),7.65-7.60(2h,m),7.58-7.50(3h,m),7.48-7.37(3h,m),7.25-7.07(2h,m),5.82(1h,q,j＝6.4hz),1.56-1.44(3h,m),1.48(2h,dd,j＝6.7,3.8hz),1.19-1.16(2h,m)。
(制造例6)
(r)-1-[4’-(5-氯-3-{[(1-苯基乙氧基)羰基]氨基}噻吩-2-基)-2’-甲氧基-[1,1’-联苯]-4-基]环丙烷羧酸(化合物编号i-150)
按照专利文献24(wo2014/104372号公报)的实施例52中记载的方法进行制造。
质谱(duis-,m/z)：546[m-1]-。
1h-nmr光谱(400mhz,dmso-d6)δ：12.34(1h,brs),9.40(1h,brs),7.45-7.25(10h,m),7.21-7.16(2h,m),7.09(1h,dd,j＝7.9,1.6hz),5.75(1h,q,j＝6.4hz),3.73(3h,s),1.54-1.41(5h,m),1.18-1.12(2h,m)。
(制造例7)
(r)-1-{4’-[5-氟-3-({[1-(4-甲基噻吩-3-基)乙氧基]羰基}氨基)噻吩-2-基]-[1,1’-联苯]-4-基}环丙烷羧酸(化合物编号i-120)
按照专利文献24(wo2014/104372号公报)的实施例138中记载的方法进行制造。
质谱(duis-,m/z)：520[m-1]-。
1h-nmr光谱(400mhz,dmso-d6)δ：12.38(1h,brs),9.33(1h,brs),7.73-7.67(2h,m),7.65-7.59(2h,m),7.57-7.50(2h,m),7.49-7.38(3h,m),7.19-7.12(1h,m),6.83(1h,brs),5.74(1h,q,j＝6.4hz),2.17(3h,brs),1.59-1.44(3h,m),1.48(2h,dd,j＝6.7,3.8hz),1.18(2h,dd,j＝6.9,3.9hz)。
(制造例8)
(r)-1-{4’-[3-({[1-(2-氯苯基)乙氧基]羰基}氨基)-5-氟噻吩-2-基]-2’-甲氧基-[1,1’-联苯]-4-基}环丙烷羧酸(化合物编号i-210)
按照专利文献24(wo2014/104372号公报)的实施例93中记载的方法进行制造。
质谱(duis-,m/z)：564[m-1]-。
1h-nmr光谱(400mhz,dmso-d6)δ：12.35(1h,brs),9.55(1h,brs),7.60-7.28(9h,m),7.18(1h,d,j＝1.5hz),7.09(1h,dd,j＝7.8,1.4hz),6.84(1h,d,j＝2.5hz),6.00(1h,q,j＝6.1hz),3.77(3h,s),1.55-1.39(5h,m),1.21-1.10(2h,m)。
(制造例9)
(r)-1-{4’-[5-氯-3-({[1-(2,5-二氟苯基)乙氧基]羰基}氨基)噻吩-2-基]-2’-甲氧基-[1,1’-联苯]-4-基}环丙烷羧酸(化合物编号i-170)
按照专利文献24(wo2014/104372号公报)的实施例68中记载的方法进行制造。
质谱(duis-,m/z)：582[m-1]-。
1h-nmr光谱(400mhz,dmso-d6)δ：12.35(1h,brs),9.54(1h,brs),7.44-7.39(2h,m),7.39-7.19(7h,m),7.18(1h,d,j＝1.6hz),7.10(1h,dd,j＝7.9,1.6hz),5.91(1h,q,j＝6.5hz),3.76(3h,s),1.56-1.43(3h,m),1.47(2h,dd,j＝6.7,3.7hz),1.18(2h,dd,j＝6.8,4.0hz)。
[试验例1]
lpa1拮抗作用试验
使表达出人lpa1的rh7777细胞的膜级分(a324、chantest公司制)5μg悬浮于反应缓冲液(20mmhepes、100mmnacl、10mmmgcl2、10μmgdp、5μg皂角甙、0.2％bsa、0.1nm[35s]gtpγs(neg030x、perkinelmer公司制)、ph7.4)后，分别添加变更浓度并溶解于dmso的试验化合物。以30℃进行15分钟的预孵化后，添加lpa(l7260、sigma公司制、最终浓度100nm)，以30℃进行30分钟的孵化。使用细胞收集器(m30、brandel公司制)，将膜级分回收至玻璃纤维滤纸(gf/b、whatman公司制)，用10mm磷酸缓冲液(ph7.4)进行清洗。使用液体闪烁分析器(2900tr、packard公司制)测定膜级分的放射活性，通过使用了exsas(armsystex公司制)的非线性回归分析求出对lpa1与[35s]gtpγs的结合造成50％抑制的试验化合物浓度(ic50)。
本试验中，本发明的化合物显示出优异的活性，制造例6、7和8的化合物的ic50值为100nm以下。
[试验例2]
细胞迁移试验
细胞迁移试验使用了chemo-tx(注册商标)(116-8、neuroprobe公司制)。将a2058人黑素瘤细胞(由europeancollectionofcellculture获取)用无血清emem培养基培养约24小时后，再次悬浮至包含0.1％bsa的dmem培养基中，制成细胞悬浮液。将变更浓度并溶解于dmso的试验化合物分别添加至细胞悬浮液中，以37℃培养15分钟(最终dmso浓度为0.5％)。将在包含0.1％bsa和0.5％dmso的dmem培养基中溶解的lpa(最终浓度为100nm)添加至chemo-tx96孔板中，将用0.001％纤连蛋白(fibronection)涂覆了两面的chemo-tx过滤器放在板上。将所培养的细胞悬浮液(细胞数量为50000个)添加至过滤器上表面，进一步以37℃培养3小时后，去除过滤器上表面的细胞。取出过滤器并使其干燥后，使用diffquik染色液(16920、sysmex公司制)，将迁移至过滤器下表面的细胞染色。测定过滤器的吸光度(570nm)，通过使用了exsas(armsystex公司制)的非线性回归分析来求出对lpa的细胞迁移活性造成50％抑制的试验化合物浓度(ic50)。
本试验中，本发明的化合物显示出优异的活性，制造例5～9的化合物的ic50值为200nm以下。
[试验例3]
人肝星状细胞α-smamrna表达试验
将人原代肝星状细胞(由sciencellresearchlaboratories获取)悬浮至包含2％fbs和1％星状细胞增殖添加物的星状细胞培养基(sciencellresearchlaboratories公司制)，并播种于24孔板。培养14小时后，去除培养基并添加星状细胞培养基，进一步培养3小时。去除培养基并添加包含0.1％bsa的星状细胞培养基，添加变更浓度并溶解于包含0.1％bsa的星状细胞培养基的试验化合物和溶解于包含0.1％bsa的pbs的lpa(最终浓度为10μm)。培养24小时后，去除培养基，添加包含1m二硫苏糖醇的溶解缓冲液(macherey-nagel公司制)，将星状细胞溶解。
使用nucleospin(注册商标)rna(macherey-nagel公司制)，从星状细胞溶解液进行rna的提取和提纯后，使用primescript(注册商标)rtreagentkitwithgdnaeraser(takarabio公司制)和takarapcrthermalcyclerdice(注册商标)gradient(takarabio公司制)来合成cdna，并使用sybr(注册商标)premixextaqii(takarabio公司制)和thermalcyclerdice(注册商标)realtimesystemii(takarabio公司制)来进行定量pcr，测定星状细胞中的α-smamrna和ribosomalprotein,large,p0mrna的表达量。
利用ribosomalprotein,large,p0的表达量校正α-sma的表达量，求出试验化合物对由lpa的诱发导致的α-smamrna表达亢进作用造成的抑制率(％)。
本试验中，本发明的化合物表现出优异的活性，在100nm的浓度下，制造例5～9的化合物的抑制率为50％以上。
[试验例4]
小鼠lpa诱发组胺游离试验
小鼠lpa诱发组胺游离试验按照swaney等人的方法(thejournalofpharmacologyandexperimentaltherapeutics,336(2011)693-700页)来进行。试验化合物悬浮于0.5％甲基纤维素溶液(133-14255、和光纯药工业公司制)，对雄性cd1小鼠(体重30～40g、日本charlesriver公司供给)以10ml/kg的用量进行经口给药。在给药4小时后，从尾静脉给药(每只小鼠为300μg)溶解于包含0.1％bsa的pbs的lpa(857130p、avanti公司制)。立即使用异氟烷对小鼠进行麻醉，自lpa给药起2分钟后从静脉采血。血液转移至包含edta的试管中，以4℃、2000×g离心分离10分钟，得到血浆。
血浆中的组胺浓度用eia试剂盒(62htmpeb、cisbiobioassays公司制)进行测定。
由给药了试验化合物的小鼠的血浆中组胺浓度算出每个个体的相对于0.5％甲基纤维素溶液给药组的抑制率(％)，将显示抑制率80％以上的个体的比例示作有效率(％)。
本试验中，本发明的化合物显示出优异的活性，在10mg/kg的给药下，制造例5～9的化合物的有效率为50％以上。
[试验例5]
小鼠非酒精性脂肪性肝炎(nash)模型
作为nash模型，使用了stam(注册商标)小鼠(株式会社stellic再生医科学研究所制)。stam(注册商标)小鼠如下制作：对2日龄的雄性小鼠在背部皮下给药1次链脲佐菌素(sigmaaldrich公司制)200μg，自出生后4周龄起用高脂肪饵料(highfatdiet32、cleajapan,inc.制)进行饲育，从而制作(medicalmolecularmorphology,46(2013)141-152页)。
试验化合物自5周龄或6周龄起每日经口给药。9周龄或10周龄时在麻醉下采取血液和肝脏，对血液实施生化学检查。肝脏在测定湿重量后，从一部分中提取rna，利用定量pcr法来测定炎症和纤维化的标记基因的表达。进一步测定肝组织中的羟基脯氨酸量或胶原量。由肝脏的一部分制作石蜡切片或冷冻切片，实施病理组织学检查，测定nafldactivityscore、fibrosisarea或者inflammationarea。结果使用exsus(cacexicare公司制)或者prism4(graphpadsoftware公司制)进行统计学分析。
上述试验中，将自6周龄起至9周龄为止的3星期以30mg/kg、1日2次给药试验化合物时的结果示于表2。
[表2]
本试验中，例如本发明的制造例6和制造例9的化合物显示出优异的活性，使nafldactivityscore显著(p<0.05)减少。
根据前述试验例1～5的结果，本发明的α位卤素取代噻吩化合物具有lpa1拮抗作用，作为nash的治疗药和/或预防药(优选为治疗药)是有用的。
本次在实验上确认了具有lpa1拮抗作用的化合物对于nash的治疗和/或预防是有用的，因此，可推测lpa1拮抗物质对于nash的治疗和/或预防同样是有用的。
[制剂例1]硬胶囊剂
向标准二分式硬明胶胶囊中填充粉末状的制造例的化合物的盐(100mg)、乳糖(150mg)、纤维素(50mg)和硬脂酸镁(6mg)，制造硬胶囊，清洗后进行干燥。
[制剂例2]软胶囊剂
将大豆油、橄榄油之类的消化性油状物与制造例的化合物的盐的混合物以含有100mg活性成分的方式注入至明胶中，制造软胶囊，清洗后进行干燥。
[制剂例3]片剂
使用制造例的化合物的盐(100mg)、胶体性二氧化硅(0.2mg)、硬脂酸镁(0.2mg)、微晶性纤维素(0.2mg)、淀粉(0.2mg)和乳糖(98.8mg)，按照制剂学领域中公知的方法来制造片剂。所得片剂可根据需要实施涂布。
产业上的可利用性
本发明的lpa1拮抗物质、例如通式(i)所示的α位卤素取代噻吩化合物或其药理上可允许的盐在强力的lpa1拮抗作用、药效持续性等方面具有优异的性质，作为nash的治疗药和/或预防药是有用的。