本发明涉及用于鼻内施用以预防或治疗缺血性脑血管疾病的组合物，其包含fas靶向肽(fastargetingpeptide，ftp)。
背景技术：
脑血管疾病(常常被称为卒中)与恶性肿瘤和心脏病一起是三种主要的死亡原因之一，并且特别地，随着韩国人口老龄化步伐加快而正成为主要疾病之一。卒中是向脑供血的血管堵塞或爆裂而导致脑局部部分受损的疾病，通常称为“中风(apoplexy)”。症状包括偏瘫、感觉障碍、语言障碍、发音障碍、视觉损伤和视觉障碍、复视、头痛、头晕、无意识、植物状态和痴呆。卒中被分成两种类型：由于脑血管的完全堵塞或严重变窄导致的不向组织供血引起的缺血性卒中(80％至85％)；以及脑细胞的功能因出血而受损的出血性卒中(15％至20％)。卒中在韩国具有第二高的死亡率并且在世界具有第三高的死亡率。约50％或更多的卒中幸存者患有多种障碍，对需要照顾患者的人以及患者造成社会负担。
缺血性卒中以比出血性卒中高得多的比率发生，并且在向脑供血的脑血管中出现多种类型的病理异常，从而在脑的某一区域中引起脑出血病症，导致脑功能退化或者最终导致缺血性梗死。缺血(ischemia)是指流向身体器官、组织或区域的血减少并最终导致为不可逆的损害的细胞和组织坏死(necrosis)的状态。特别地，脑或心脏是对血流不足最敏感的身体器官。例如，当由于卒中或脑损伤而在组织中发生缺血时，称为缺血级联(ischemiccascade)的过程被触发以永久性地损伤脑组织。然而，周围组织具有可以恢复的半影区(penumbrazone)，并且该区域经受医学治疗。
在占卒中总数的大部分的缺血性卒中中，存在许多情况，其中患者在未来的预后根据急性期(7天内)或亚急性期(4周内)的临床过程来确定。在这些缺血性卒中中，进行再打开治疗以再供应血流，使得为急性期治疗的生理目标的缺血半影(ischemicpenumbra)的脑组织再次发挥功能。然而，到目前为止，已知，可以通过在症状发作后4.5小时内使用静脉内施用方法再打开或者在此后6小时内使用动脉内方法再打开来改善患者的预后。然而，在包括韩国在内，世界上及时发现且可以在适当的急诊室中接受再打开治疗的卒中患者的比率极低。由于大多数急性缺血性卒中患者没有得到足够的治疗，因此迫切需要在急性患者中安全且有效的新治疗方法。
同时，已知fas/fasl相互作用的级联(cascade)相对于凋亡信号转导而被触发。在这方面，已经报道了常规环状fas靶向肽作为fas模拟物(mimetics)(hasegawa等，2004.fas-disablingsmallexocyclicpeptidemimeticslimitapoptosisbyanunexpectedmechanism.procnatlacadsciusa101:6599-6604和us2012-0245081，2012.09.27)，并且已经进行了尝试来由此治疗fas相关疾病。
在整个本说明书中，参考了许多论文和专利文献并且示出了其引用。所引用的论文和专利文献的公开内容通过引用整体并入本文，因此将更清楚地解释本发明所属领域的水平和本发明的内容。
技术实现要素：
技术问题
本发明的发明人已经进行了深入研究并进行了努力以开发这样的药物组合物，所述药物组合物能够通过其迅速转移至脑细胞来抑制脑细胞死亡以预防或治疗缺血性脑血管疾病。结果，证实了当通过鼻内施用将fas靶向肽(ftp)递送至脑组织时，可以抑制由于缺血性脑血管疾病引起的脑细胞死亡，并且因此基于该发现完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供用于鼻内施用以预防或治疗缺血性脑血管疾病的组合物。
本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗缺血性脑血管疾病的药盒。
本发明的又一个目的是提供预防或治疗缺血性脑血管疾病的方法。
本发明的其他目的和优点将从以下本发明的详细描述、权利要求和附图中变得更加明显。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了用于鼻内施用以预防或治疗缺血性脑血管疾病的药物组合物，其包含由seqidno:1的氨基酸序列组成的fas靶向肽(ftp)作为活性成分。
本发明还提供了用于预防或治疗缺血性脑血管疾病的药盒，其包括：用于鼻内施用的药物组合物；和用于所述组合物的鼻内施用的注射装置。
本发明还提供了预防或治疗缺血性脑血管疾病的方法，其包括向有此需要的对象鼻内施用所述用于鼻内施用的组合物。
有益效果
本发明的特征和优点概述如下：
(a)本发明提供了用于鼻内施用以预防或治疗缺血性脑血管疾病的药物组合物。
(b)本发明提供了用于预防或治疗缺血性脑血管疾病的药盒。
(c)当使用本发明的药物组合物或药盒时，可以有效地将药物递送至脑组织。
(d)当使用本发明的药物组合物或药盒时，可以有效地预防或治疗对象的缺血性脑血管疾病。
附图说明
图1a示出了缺氧neuro2a细胞中的fas表达，其中代表性直方图示出了在诱导缺氧之后fas的表达(左图)、表示fas表达％的累积数据(中图)和mfi(右图)；填充的直方图示出了经同种型免疫球蛋白g(isoigg)处理的细胞；并且虚线和实线直方图分别示出了常氧和缺氧细胞中的fas表达。
图1b示出了ftp与缺氧neuro2a细胞的结合，其中代表性直方图示出了由scr-ftp或与alexa488缀合的ftp获得的表达fas的neuro2a细胞中的ftp的结合(左图)、表示fas表达％的累积数据(中图)和mfi(右图)；填充的直方图示出了经isoigg处理的缺氧细胞；并且虚线和实线直方图分别示出了scr-ftp和ftp与缺氧细胞的结合。
图1c示出了fas抗体和ftp的竞争测定的结果，其中代表性直方图示出了在用ftp处理之后fas抗体与缺氧细胞的结合；数据表示为三次重复实验的平均值±sd；**p<0.01，***p<0.001；常氧表示保持在正常培养条件下的细胞，缺氧表示在ogd培养基中培养24小时，随后在含血清的dmem培养基中再氧合24小时的细胞；ftp：fas靶向肽，scr-ftp：乱序肽。
图2a示出了ftp与表达fas的缺氧neuro2a细胞特异性地结合并且示出了代表性的共焦显微图像，所述图像示出了hoechst染色的核(蓝色)、fas表达(绿色)、与表达fas的细胞结合的ftp(红色)以及fas和ftp的共定位(黄色)。
图2b示出了neuro2a细胞中凋亡的流式细胞术分析结果、代表性点图(上图)和示出了膜联蛋白v阳性细胞、7-aad阳性细胞以及膜联蛋白v和7-aad二者的双阳性细胞(％)的累积数据(下图)。
图2c图示了示出了切割的胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-3蛋白的代表性western印迹结果(左图)以及示出了使用imagej软件对β-肌动蛋白归一化的相对蛋白质水平(右图)的条形图(右图)，其中数据表示为平均值±sd；**p<0.01，***p<0.001，n.s.-不显著；常氧表示保持在正常培养条件下的细胞，缺氧表示保持在ogd培养基中24小时，随后在含血清的dmem培养基中再氧合24小时的细胞；在所有情况下，累积数据由三次重复实验获得；ftp-a488：alexa488标记的ftp，scrftp：乱序ftp肽，ogd：氧糖剥夺。
图3图示了示出了全长、切割的胱天蛋白酶-8和切割的胱天蛋白酶-3的代表性western印迹图像，其中常氧表示保持在正常培养条件下的细胞，缺氧表示保持在ogd培养基中24小时，随后在含血清的dmem培养基中再氧合24小时的细胞；ftp：fas靶向肽，scr-ftp：乱序肽。
图4a图示了示出了暴露于大脑中动脉闭塞(mcao)手术的脑中的fas表达的图像，其中代表性显微图像示出了在再灌注后指定小时处脑的正常核和缺血核中的fas表达；比例尺在主图和插图中分别表示100x和400x。
图4b示出了在再灌注后的指定小时处由正常大鼠脑和mcao大鼠脑(n＝3)的左半球和右半球制备的单细胞悬液中的fas表达的荧光激活细胞分选(facs)测量结果，其中代表性直方图在上图中示出，并且示出了表示fas表达％的累积数据(左下图)和平均荧光强度(mfi)(右下图)；填充的直方图示出了正常的大鼠脑，而虚线和实线直方图分别示出了经受mcao手术的大鼠的脑的对侧核和同侧核。
图4c示出了mcao模型(3个个体)中鼻内接种的ftp的生物分布，其中在接种后的指定小时处检查脑(顶视图和冠状视图)的alexa488标记的ftp(ftp-a488)的存在；示出了pbs、用alexa488标记的乱序肽(scr-a488)或用alexa488标记的ftp(ftp-a488)；在代表性图像(左图)以及顶视图(右上图)和冠状视图(右下图)中，在来自指定测试群组的各分离的器官的任意像素值±标准误差下测量表示相对荧光强度的累积数据。
图4d示出了脑细胞的流式细胞术分析结果，其中来自各代表组(每组3个)的同侧核的单细胞悬液在接种后的指定小时处制备；示出了来源于mcao大鼠的pbs、scr-a488或ftp-a488；代表性直方图(上图)和同侧区(左下图)示出了表示ftp-alexa488阳性细胞％的累积数据，并且在右下图中示出了mfi，填充的直方图对应于经pbs处理的大鼠，虚线的和开放的直方图分别示出了经scr-ftp处理的大鼠和经ftp处理的大鼠。
图4e示出了在ftp处理之后脑梗死的测量结果，其中代表性的2，3，5-三苯基氯化四氮唑(ttc)染色数据示出了脑梗死(左)和在再灌注后的指定天数下各组(3个个体)中的梗死体积的百分比(％)(右)。
图4f示出了在再灌注后的指定天数下由来自经pbs-scr-ftp或ftp处理的大鼠的正常或经受mcao的脑获得的使用h&e染色和石蜡包埋的切片的脑的代表性苏木精和伊红(h&e)染色。
图4g示出了脑的末端转移酶介导的dutp缺口末端标记(tunel)染色结果，其中在再灌注后的指定天数下测量了由测试大鼠获得的mcao大鼠中的凋亡，其中脑切片的代表性图像(g，上图)示出了用pbs、scr-ftp或ftp接种的mcao诱导的大鼠的正常或同侧核中的tunel阳性细胞(红色)和dapi染色的核(蓝色)，tunel阳性细胞由大鼠组(每组3个个体)示出(下图)，并且值表示为tunel阳性细胞±sd。
图4h示出了在再灌注后的指定天数下的kaplan-meier存活曲线，其中数据从各组(20个个体)组合，并且计算存活％。
图4i示出了测试大鼠的神经学评分，其中通过在指定天数下测量等级来由各测试组(n＝3)计算神经学评分；数据表示为三次独立实验的平均值±sd；*p<0.1，**p<0.01，***p<0.001，n.s表示不显著。
图5示出了正常大鼠(每组3个个体)中鼻内接种alexa488标记的ftp(ftp-a488)的细胞内分布，其中鼻内施用后12小时和48小时检查脑中荧光的存在；并且在指定的时间点处观察pbs、用alexa488标记的乱序肽(scr-a488)和用alexa488标记的ftp(ftp-a488)。
图6示出了由鼻内接种有ftp-a488的大鼠中的左半球获得的单个细胞的流式细胞术分析结果，其中在具有pbs、scr-a488、ftp-a488的mcao大鼠接种后的指定小时处分析来自各代表性组(n＝3)的对侧核的单细胞悬液；并且该图示出了代表性直方图(上图)、表示ftp-alexa488结合细胞％的累积数据(左下图)和mfi(右下图)；填充的直方图对应于经pbs处理的大鼠，虚线的和开放的直方图分别表示scr-ftp结合细胞和ftp结合细胞。
图7示出了在接种后的指定小时处mcao大鼠模型(n＝3)中鼻内接种的alexa488标记的ftp的细胞内分布，其中检查了接种pbs、scr-ftp-alexa488或ftp-alexa488的大鼠的窦、肺、肝、脾和肾；并且该图示出特定器官的代表性图像(上图)和表示在来自指定测试群组的各分离的器官的任意像素值±标准误差(由3只大鼠获得)下测量的平均荧光强度的累积数据(下图)。
最佳实施方式
本发明的一个实施方案提供了用于鼻内施用以预防或治疗缺血性脑血管疾病的药物组合物，其包含由seqidno:1的氨基酸序列组成的fas靶向肽(ftp)作为活性成分。
本发明的发明人已经进行了深入研究并进行了努力以开发这样的药物组合物，所述药物组合物能够通过其迅速转移至脑细胞来抑制脑细胞死亡以预防或治疗缺血性脑血管疾病。结果，证实了当通过鼻内施用将fas靶向肽(ftp)递送至身体时，可以有效地抑制由于缺血性脑血管疾病引起的脑细胞死亡。
如本文中使用的术语“缺血性脑血管疾病”是指在向脑供血的血管中发生多种类型的病理异常，导致对正常大脑血流的障碍的疾病，并且可与术语“缺血性卒中”或“脑梗死”互换使用。
已知fas靶向肽(ftp)(其根据本发明为用于鼻内施用以预防或治疗缺血性脑血管疾病的组合物的活性成分)是用于抑制fas与为其配体的fasl之间的相互作用的肽序列。fas及其特异性配体fasl分别是属于tnf受体超家族(tnfreceptorsuperfamily，tnfrsf)和tnf配体超家族(tnfligandsuperfamily，tnfsf)的蛋白质成员。fas与fasl之间的相互作用触发导致表达fas的靶标凋亡的细胞内事件的级联。fas是在包括脑细胞的多种组织细胞中表达的膜蛋白，而fasl主要在淋巴器官和免疫相关组织中表达。已经报道了在缺血性脑损伤中fas的表达增加(expressionoffasandfasligandafterexperimentaltraumaticbraininjuryintherat，jcerebbloodflowmetab.第20卷，第4期，2000)。
本发明的ftp是抑制fas活性(特别是fas介导的信号转导)的fas肽模拟物。然而，当静脉内或经口施用本发明的组合物时，活性成分不容易穿过血脑屏障(blood-brainbarrier，bbb)，并且递送至脑的效率显著降低。
因此，本发明的发明人证实了，当包含ftp的药物组合物被鼻内施用时，ftp被有效地递送至脑组织而没有穿过bbb的问题，从而预防或治疗由于包括脑梗死的缺血性脑血管疾病引起的脑细胞死亡。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物抑制缺血性脑细胞死亡。本发明的发明人通过具体实例发现，通过鼻内施用本发明的组合物，缺血动物模型中脑缺血部位的面积显著减小。
在本发明的一个实施方案中，本发明的缺血性脑细胞死亡抑制是由于通过与作为ftp受体的fas结合而抑制fas信号转导(signaling)。以上已经描述的fas与fasl之间的相互作用触发导致表达fas的靶标凋亡的细胞内事件的级联，以增加缺血性脑损伤时fas的表达。通过鼻途径施用的本发明的组合物被有效地递送至脑组织，并因此抑制导致由fas(其表达由于脑缺血而增加)引起的细胞死亡的级联触发。本发明的发明人确认，在鼻内施用本发明的组合物后在脑组织中存在药物受体的情况下，药物被递送，并且因此表现出脑细胞死亡抑制效果。可以确认，在正常脑组织的情况下，当药物受体未表达时，药物不能与其结合。总之，可以确认，当本发明的组合物被鼻内施用时，需要受体以将药物递送至脑组织，并且因此，可以确认，药物仅被递送至受损的脑细胞。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物通过鼻途径施用至处于睡眠(sleeping)、麻醉(anestisia)或无意识状态(unconscious)的对象(subject)。本发明的发明人证实，当本发明的组合物被鼻内施用时，即当鼻内注入处于睡眠、麻醉或无意识状态的对象中时，组合物向脑组织中的递送效率显著提高。
如本文中使用的术语“无意识”是指没有感觉和记忆行为且对外部环境刺激没有反应的意识受损的状态。当发生缺血性卒中时，患者处于无意识状态，在这种情况下，本发明的组合物可被鼻内施用一段时间直至外科手术，从而有效抑制缺血性脑细胞死亡。在患者的无意识状态下，不容易经口施用药物组合物，在经口施用或者通过静脉内施用来全身施用的情况下，药物递送至脑组织并不容易，而当使用本发明的用于鼻内施用的组合物时，药物可被有效地递送至对象的脑组织。
本发明的用于鼻内施用的组合物可以不受限制地用于可通过抑制缺血性脑细胞死亡来预防或治疗的疾病。
在本发明的一个实施方案中，本发明的缺血性脑血管疾病包括脑血栓形成、脑栓塞或腔隙脑梗死。本文中使用的术语“脑血栓形成”是指由于某一脑血管部分的动脉硬化引起的动脉管腔狭窄或血栓形成而产生血流阻塞时发生的疾病。本文中使用的“脑栓塞”是指由于心脏中产生的血栓形成而阻塞脑血管时发生的疾病。本文中使用的术语“腔隙脑梗死”是指由于因在小穿透动脉(smallpenetratingartery)中发生的血栓形成引起的血管堵塞而发生的疾病。所有上述脑血管疾病涉及脑组织的缺血。本文中使用的术语“缺血”是指血液的供应被阻断并且不足，从而导致相应组织部位坏死的状况。当使用本发明的组合物时，可使脑缺血部位的损伤康复，并且可治疗上述疾病。
同时，本发明的ftp是由seqidno:1中所示的8个氨基酸组成的短肽序列，不必然需要如常规已知的那样(us13/210，117，于2011年8月15日提交)形成环状形式(cyclicform)，并且可以以线性肽的形式提供。本文中使用的术语“肽”是指通过肽键将氨基酸残基彼此结合而形成的线性分子。肽可使用本领域已知的化学合成方法来制备，例如固相合成技术(merrifield，j.amer.chem.soc.85:2149-54(1963)；stewart，等，solidphasepeptidesynthesis，第二版，piercechem.co.:rockford，111(1984))或液相合成技术(美国专利登记第5，516，891号)。如本文中使用的，术语“肽模拟物(peptidomimetics)”是指模拟肽的活性的分子(例如，肽)，并且肽模拟物可通过设计设计成模拟常规肽、类肽(peptoids)(其中侧链被添加至肽骨架上的氮原子的形式)或诸如β肽的肽的修饰的类似系统来制备。通常，肽模拟物可被设计成通过经修饰的化学结构而具有提高的稳定性或生物活性。
根据本发明，本发明的肽模拟物可以是fas模拟物。本文中使用的术语“fas模拟物”是指来源于fas肽的肽，并且fas模拟物抑制fas活性(特别是fas介导的信号转导)。
在本发明的一个实施方案中，本发明的ftp是线性(linear)肽。线性肽分子的优点在于合成过程比环状结构简单并且不需要特殊的控制。
除了活性成分以外，本发明的药物组合物还包含可药用载体。包含在本发明的药物组合物中的可药用载体(其是制剂中常用的)可以是但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。除了上述组分以外，药物组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂等。合适的可药用载体和试剂详细描述于remington’spharmaceuticalsciences(第19版，1995)中。
本发明的药物组合物可通过鼻内施用递送至脑组织。
本发明的药物组合物的合适剂量可根据许多因素不同地规定，例如患者年龄、体重、性别、病理状况、饮食、施用时间、排泄速度和反应敏感性。同时，本发明的药物组合物的剂量优选为0.01mg/kg(体重)/天至1，000mg/kg(体重)/天。
本发明的药物组合物可使用可药用载体和/或赋形剂通过本发明所属领域普通技术人员可容易地实施的方法来配制，以制备成单位剂量形式或包含在多剂量容器中。在此，制剂可以是油性或水性介质中的溶液、混悬剂、乳剂、提取物、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂，并且还可包含分散剂或稳定剂。
如本文中使用的，术语“药学有效量”是指足以实现上述细胞因子相关肽的效力或活性的量。
本发明的另一个实施方案提供了用于预防或治疗缺血性脑血管疾病的药盒，其包括：(a)上述用于鼻内施用的组合物；和(b)用于所述组合物的鼻内施用的注射装置。
在本发明的一个实施方案中，本发明的注射装置包括容纳用于鼻内施用的组合物的容器。作为能够容纳本发明的组合物的空间的容器的类型或材料没有特别限制。
具体地，例如，本发明的药盒可包括注射器形式的注射装置、喷雾器形式的注射装置、或管形式的注射装置，通过所述注射装置可鼻内注射药物，但本发明不必然限于此。当包括注射器型注射装置时，对应于注射器针的排出部分可被插入到对象的鼻腔中，然后可操作对应于注射器活塞的施加排出压力的部分以将处于液相的本发明的组合物施用至鼻腔。此时，注射装置的形式不限于常规的注射器类型。在喷雾器形式的注射装置的情况下，与使用注射器型注射装置的情况一样，将排出部分放置在为鼻腔的入口的鼻孔或鼻腔中，然后向其施加喷射压力，使得本发明的组合物可以以喷雾形式鼻内施用。当包括管状注射装置时，如上所述，可将排出部分插入到对象的鼻腔中，然后可向管施加压力，以这样的方式，本发明的组合物可以以液相鼻内注射。
上述类型的注射装置仅用于说明目的，并且可使用任何注射装置而没有特别限制，只要其能够鼻内注射本发明的组合物即可。
本发明还提供了预防或治疗缺血性脑血管疾病的方法，其包括向有此需要的对象鼻内施用上述用于鼻内施用的组合物。
用于鼻内施用的组合物可包含在注射装置中，所述注射装置包括能够容纳待施用至鼻腔的组合物的容器。
鼻内施用可在对象处于睡眠、麻醉或无意识状态时进行。
缺血性脑血管疾病可以是脑血栓形成、脑栓塞或腔隙脑梗死。
对象可以是但不限于哺乳动物例如狗、猫、大鼠、小鼠和人。
具体实施方式
下文中，将参照以下实施例更详细地描述本发明。提供这些实施例仅用于进一步说明本发明的目的，并且对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，这些实施例并不旨在限制根据本发明的本质的本发明的范围。
实施例1：通过fas靶向肽的鼻内施用来治疗缺血性脑血管疾病
(实验方法)
1.肽
用于本发明的实施例中的肽在peptron构建。fas靶向肽的序列为ycdehfcy，并且乱序肽的序列为ycnstvcy。
2.体外缺血模型
小鼠神经母细胞瘤(neuro2a，n2a)细胞从atcc获得并且培养在包含10％胎牛血清(fbs)、青霉素(100iu/ml)和链霉素(100μg/ml)的dulbecco改良的eagle培养基(dmem)中。为了在体外复制缺血/再灌注环境，将neuro2a细胞在6孔板中培养并在缺氧条件(94％n2，5％co2和1％o2)下在氧糖剥夺(oxygenglucosedeprivation，ogd)培养基(lifetechnologies)中保持24小时。随后，使细胞在补充有10％fbs(5％co2，20％o2，37℃)的dmem中再氧合24小时。
3.体外fas表达和ftp结合
为了鉴定ftp与fas受体的共定位(co-localization)，将neuro2a细胞接种在盖玻片上并在缺氧条件下在ogd培养基中保持24小时。在孵育24小时之后，将细胞用包含1％bsa和0.05％吐温20的pbs处理，并在37℃下封闭2小时，随后在4℃下用抗fas抗体(abcam)和alexa647缀合的ftp染色2小时。在孵育2小时之后，将细胞用包含0.05％吐温20的pbs洗涤三次，并在黑暗条件下在4℃下用二抗(abcam)染色2小时。将细胞核用hoechst33342复染并用水性封固溶液(abcam)固定。使用tsp-sp5共焦显微镜(leika，德国)获得细胞中的荧光信号。
4.体外fas介导的凋亡的抑制
为了检查ftp的抑制效果，将缺氧诱导的neuro2a细胞用1，000μm的ftp处理。在孵育24小时之后，使用pe膜联蛋白v凋亡检测试剂盒(bdpharmingentm)根据制造商的说明书将细胞染色。
5.实验动物和研究设计
对于实验，从orientbio购买重量为280g至320g的sprague-dawley(sd)大鼠(rat)并将其放置在无致病原实验室(pathogenicfreelaboratory)中。所有实验均按照汉阳大学动物护理与使用委员会(institutionalanimalcareandusecommittee)批准的合规指南和方案进行。在可控的温度和湿度下，在自由获得水和食物的情况下，将动物圈养在12小时光照/黑暗循环下。为了排除对采取脑损伤的任何性别相关的差异，仅使用雄性sd大鼠。在暴露于新环境后2周，将动物分成四组。第一组动物不经受手术并用作对照。对于剩余组的动物，诱导大脑中动脉闭塞(middlearterycerebralocclusion，mcao)。手术后1小时，未诱导缺血的动物和未显示出任何行为差异的动物从实验中排除，并将剩余动物随机分成处理组。每组中至少包括四个个体。
6.大脑中动脉闭塞(mcao)实验模型
为了诱导脑缺血状态，根据常规已知的mcao程序[1]处理动物。简言之，将动物用5％异氟烷麻醉。此后，在手术期间在相同的气体条件下在2％异氟烷(isoflurane)下维持麻醉状态。在手术期间使用加热垫来将体温维持在37±5℃之间。对每只大鼠的颈部切开约2.0cm的中线皮肤切口。暴露颈外动脉(externalcarotidartery，eca)，同时小心保护迷走神经，然后用丝线(silkartery)结扎。对颈总动脉(commoncarotidartery，cca)和颈内动脉(internalcarotidartery，ica)进行同样的处理，但不进行结扎过程。通过将准备好的3.5cm缝线(suture)(4-0尼龙缝线)穿过eca插入到ica中来阻塞大脑中动脉(middlecerebralartery，mca)并将缝合线推入mca中。此后，使用夹子将cca完全阻塞。在阻塞1小时之后，拉动缝线以引起再灌注。
7.ftp的鼻内接种
使用加压嗅觉递送(pressurizedolfactorydelivery，pod)装置(impelneuropharma)来进行肽的鼻内施用。简言之，将大鼠保持在包含5％异氟烷的异氟烷室中3分钟。在将动物深度麻醉之后，将大鼠置于仰卧位(supineposition)以进行药物注射。将pod尖端(impelneuropharma)小心地插入到鼻孔(nostril)中，然后将预填充的25μl导管缓慢地插入鼻孔中约2cm。随后，向其中缓慢地注射肽溶液(pbs)(15μlpbs和500nm肽)。在mcao之后12小时鼻内注射总计700μg的ftp肽。在鼻内施用之后，在使大鼠返回到其指定的笼之前，将大鼠保持在仰卧位5分钟。
8.alex488标记的ftp的生物分布(bio-distribution)
根据制造商的指南(molecularprobes，lifetechnologies)，将总计500μg的ftp与alexa-488缀合。在mcao之后12小时，使用pod装置将alexa488缀合的短肽以25μl的终体积鼻内注射到各鼻孔中。在预定时间段之后，将动物处死并从其中切下组织。用冷pbs洗涤组织并除去表面脑膜(meninges)以避免自体荧光(auto-fluoresce)。使用imagestation(kodak)观察脑以检测荧光信号。为了评估递送率(％)，使用40μm细胞过滤器(cellstrainer)(bdfalcon)由脑切片制备单细胞悬液。通过流式细胞术(flowcytometry)(bdfacscaliburtm)获得ftp-alexa488结合的细胞并使用flowjo软件进行分析。
9.ttc染色和梗死体积的测量
在预定的处理时间段之后，立即取出脑。将脑中的预期损伤区域切成包括脑基质(brainmatrix)的3片(2mm厚)，然后在2％2，3，5-三苯基氯化四氮唑(ttc，sigma)中于37℃下孵育10分钟。然后将脑切片固定在4％多聚甲醛中并在4℃下保持24小时直至成像和拍照。梗死体积使用由美国国立卫生研究院(nationalinstituteofhealth，nih)开发的imagej来测量并如通常已知的进行计算。
10.western印迹
在作为蛋白酶抑制剂的1μm苯甲基磺酰氟(pmsf)的存在下，使用ripa裂解缓冲液裂解neuro2a细胞。将总计50μg的蛋白质加载到12％sds-page凝胶中并转移到硝酸纤维素转移膜(whatman)上。在tbst中于室温下用5％脱脂乳封闭印迹2小时，并在4℃下用一抗(abcam)孵育。在预定的时间段之后，用tbst洗涤印迹并用与hrp偶联的第二多克隆抗体孵育2小时。在用tbst洗涤印迹三次之后，使用eclwestern印迹底物(promega)使印迹显影。
11.组织学和免疫组织化学
将石蜡包埋的脑切片脱石蜡、再水合然并且根据标准方案进行h&e染色。将h&e染色的切片用盖玻片覆盖并使用光学显微镜粗略地分析。
对于免疫组织化学，在95℃下将切片用预热的抗原修复缓冲液(10mm柠檬酸钠、0.05％吐温-20(w/v)，ph6.0)热灭活25分钟并在室温下冷却。接着，将切片用包含1％bsa和10％山羊血清的tbst在37℃下封闭1小时，并用fas一抗(abcam)在4℃下孵育过夜。在指定的时间之后，将切片用tbst洗涤并用hrp缀合的第二多克隆抗体处理2小时。在用tbst洗涤切片五次之后，使用dab底物(gehealthcare)使切片显影。
12.tunel分析
使用原位细胞死亡检测试剂盒(roche，德国)根据制造商的说明书通过tunel分析来分析脱石蜡且再水合的脑切片中的凋亡程度。
13.神经学评估(neurologicalevaluation)
使用通常已知的方法[2]来评估具有或不具有肽处理的各组大鼠的神经缺陷。简言之，将不显示出可见神经缺陷的大鼠分级为0。如果动物显示出前肢弯曲(forelimbflexion)，则它们被给予1级。接着，将动物放置在吸收垫(absorbentpad)上并拉动其尾部以检查它们的抓握力。2级仅被给予显示出弱抓握力的动物。将大鼠放置在足够宽的空间中并允许自由移动。3级被给予大鼠在其尾部被拉动时朝麻痹侧沿环形移动的情况。4级被给予大鼠在自由环境下自发地沿环形移动的情况。
14.存活曲线
使用先前描述的方法[3]来评估各组动物的存活率。
15.统计分析
通过使用graphpadprism5软件，通过用于分析两组的平均值之间的差异的mann-whitney检验和用于分析两个或更多个组的平均值之间的差异的单向anova来对本发明的数据进行统计分析。p<0.05被认为是统计上显著的。
(实验结果)
1.fas的阻断恢复体外低氧诱导的凋亡
为了检查体外缺血模型中fas阻断的效果，将neuro2a细胞在氧糖剥夺(ogd)培养基中在缺氧条件下培养24小时以诱导fas表达。缺氧条件诱导至少50％表达fas的缺氧细胞(参见图1a)。
随后，将缺氧细胞用荧光标记的fas靶向肽(ftp)或作为对照肽的乱序ftp(scrftp)处理。ftp仅与表达fas的缺氧细胞结合并且不与正常细胞结合，对照肽scrftp不与缺氧细胞结合(参见图1b)。共焦显微图像示出了ftp强烈地与表达fas的细胞结合(参见图2a)。作为ftp与α-fas抗体之间的竞争测定的结果，ftp和α-fas抗体与fas分子的不同区域结合(参见图1c)。
在缺氧条件下fas表达的增加导致体外缺血模型中的凋亡增加。因此，与保持在常氧环境中的细胞相比，在缺氧细胞中膜联蛋白v-和7-aad阳性细胞分别显著增加约60％和约30％(参见图2b，上图)。然而，在除去氧之前用ftp处理的缺氧细胞保护neuro2a细胞免受缺氧诱导的细胞死亡。ftp处理显著减少膜联蛋白v阳性细胞和膜联蛋白v/7-add阳性细胞二者约50％(参见图2b，下图)。然而，在ftp处理之后，在7-aad阳性细胞中未观察到任何显著的减少。
由于ftp仅阻断fas介导的外来凋亡途径，因此评估与fas介导的凋亡有关的激活的级联分子。增加的fas触发外部凋亡信号转导分子例如切割的胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-3等。为了检查ftp处理是否可以阻断缺氧细胞中与fas介导的外部凋亡途径有关的胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-3的活化，胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-3的活化根据浓度通过用ftp处理缺氧细胞来评估。经scrftp处理的细胞不减少切割的胱天蛋白酶8，而ftp处理显著降低了胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-3的调节(参见图2c)。ftp处理使切割的胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-3分别减少约50％和40％。激活的切割胱天蛋白酶-8和激活的胱天蛋白酶-3二者的表达以剂量依赖性方式减少而在全长酶水平上没有显著变化(参见图3)。
总体上，这些结果表明，ftp有效地与表达fas的细胞结合并在治疗上挽救细胞免受fas介导的凋亡。
2.fas靶向肽的鼻内施用缓解fas介导的凋亡
在mcao之后数小时，脑缺血增加脑中fas的表达，但在正常条件下fas的表达不显著。在脑右侧诱导缺血的右侧mcao期间在通过脑组织的免疫组织化学再灌注之后48小时达到最大值的右半球(参见图4a)中，或者在脑细胞的单细胞悬液的流式细胞术分析(参见图4b)中，可以确认，fas的表达以时间依赖性方式选择性地增加。在mcao之后12小时、24小时和48小时，分别发现20％、60％和70％的表达fas的细胞，并且平均荧光强度(mfi)在各时间点增加4倍、12倍和18倍。与右半球相比，在除mcao后48小时以外的各时间点处，在左半球中观察到fas表达水平不显著，这表明在左侧mcao之后右半球对凋亡敏感得多(参见图4b，下图)。
为了在体内靶向fas，使用由impelneuropharma[4]开发的pod装置通过鼻途径将ftp直接递送至脑。作为鼻内接种ftp-alexa488的结果，标记肽的定位不仅在mcao诱导的大鼠中出现，而且在于12小时下的正常大鼠中出现(参见图4c和5)。有趣的是，在接种后约48小时，ftp-a488保持在经mcao处理的大鼠的脑中并且还保持在其同侧脑区域中，表明fas表达指示肽对损伤区域的亲和力。由在接种(尽管此后12小时的强定位)后48小时乱序肽(scr-a488)不保持在mcao诱导的大鼠中的事实，ftp-fas相互作用的特异性增强(参见图4c)。此外，作为来自同侧脑区域的单细胞悬液的流式细胞术分析的结果，发现ftp-a488主要在mcao大鼠中接种scr-a488组后12小时、24小时和48小时具有约19％、61％和73％的ftp阳性细胞的右缺血半球的受影响区域或者未损伤的对侧脑区域中与细胞结合(参见图4d和6)。
接着，为了测量ftp脑靶向是否对脑具有特异性或其他非靶向器官是否暴露得更多，检查了用于分布的外周组织。
结果，在接种scr-a488和ftp-a488二者后的最初12小时在肺中发现轻微的荧光信号，然而在其他器官中未发现信号，表明通过气管将有限的肽引导至肺(参见图7)。然而，接种后24小时，在scr-a488组的肝和肾中发现比ftp-a488组多得多的荧光暴露，这表明非靶向肽从脑到外周间隙的全身引导(参见图7)。这些结果表明，ftp保留在mcao大鼠脑的缺血区域中是由于在这些区域中fas表达的组合。
大鼠模型中的急性脑缺血状况通过调节几种凋亡分子而引起显著的脑损伤[1]。大鼠用2，3，5-ttc染色随后每天进行再灌注，然后从分析1天至5天的mcao大鼠中获得1小时mcao脑组织切片。结果，在mcao后12小时(第0天，参见图4e)立即验证有效梗死面积，如由白色ttc阴性区域所证明的。梗死面积在几乎整个右半球中显著增加，直至mcao后24小时(第1天)，表明1小时mcao足以诱导细胞凋亡。如所预期的，来自mcao动物的正常大鼠冠状脑切片和对侧脑区域未显示出梗死的迹象(参见图4e，左图)。
为了评估ftp施用对脑梗死的影响，在再灌注后12小时向个体施用15mmoli.n.。与模拟(pbs)处理或scr-ftp处理相比，早在mcao后第1天，ftp显著减小了梗死面积的大小，并且个体几乎完全从在再灌注后第5天发生的梗死中恢复。在ftp接种组中，在第1天、第2天、第3天和第5天之后，观察到梗死体积分别减小至26％、29％、18％和7％。在盐水处理组中，尽管在再灌注后24小时发现体积为32％的严重脑梗死，但该梗死体积在第2天和第3天增加至37％和35％，并且在第5天为23％。作为免疫组织化学分析的结果，在再灌注后第1天观察到增加的强度，并且在再灌注后12小时立即在脑的右侧缺血区域中观察到显著的结构性脑损伤(参见图4f)。与ttc染色结果相比，在ftp接种组中，间质水肿和固缩核在再灌注后第1天开始减少并且在此后第5天缓解。早在再灌注后12小时，在所有组中tunel阳性细胞的数目为约15％，并且在再灌注后第1天和第5天在pbs接种组中分别增加至54％和32％。在再灌注后第1天和第5天，ftp处理使凋亡细胞的数目分别显著降低至26％和9％(参见图4g)。此外，在mcao脑的对侧区域中不存在tunel阳性细胞表明凋亡仅对缺血脑区域具有特异性(未示出)。
经受mcao程序的动物在手术后的几天内具有高死亡风险。因此，在pbs、scr-ftp和ftp接种组中，观察到动物存活的变化。为了检查ftp从再灌注后第1天直至第5天的存活影响，使用kaplan-meier法计算存活率。在每组的18只大鼠中，盐水处理组中的12只大鼠、scr-ftp处理组中的11只大鼠和ftp处理组中的2只大鼠随时间死亡(参见图4h)。作为评估结果，在再灌注之后，65％、15％和5％的接种pbs的大鼠存活1至5天。与pbs处理组相比，在鼻内递送ftp的情况下，90％、80％和80％的动物存活1至5天。经受mcao程序的动物在再灌注后几小时内在神经功能等级方面表现出异常。在本实施例中，在mcao后12小时内表现出对行为的渐进影响，并且在pbs和scr-ftp接种组二者中在第1天与第5天之间影响恶化。在再灌注后12小时内，所有动物在其尾部被拉动时均朝麻痹侧沿环形移动(3级)，并且在mcao后的第1天与第3天之间自发运动变得严重(4级)(参见图4g)。与盐水处理组相比，在ftp处理组中神经缺陷评分(neurologicaldeficitsscore)提高(参见图4i)。在再灌注后的第1天与第5天之间，ftp处理组中的神经功能被分级为3.3、2.3、2.3和1.3的平均值。此外，这些结果表明，通过ftp阻断凋亡fas信号转导级联不仅减少了凋亡，而且改善了患有脑缺血的动物中的存活和神经缺陷。
(参考文献)
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工业应用性
本发明可用于预防或治疗缺血性脑血管疾病的领域中。
序列表
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hanyanguniversity)
<120>用于通过鼻内递送来治疗脑卒中的组合物
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<151>2015年11月13日
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<212>prt
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