本申请根据35u.s.c.§119(e)要求在2015年10月28日提交的美国临时专利申请号62/247,410的优先权，其通过引用以其全部并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是使用政府支持在由国立卫生研究院授予的基金gm112182下进行的。政府享有本发明中的某些权利。
背景技术：
癌症是全世界的主要健康问题。每年，世界各地有数千万人被诊断为癌症，并且超过一半的患者最终死于癌症。在美国大约一半的所有男性和所有女性的三分之一将在其一生中的某一时间被诊断为癌症，并且四分之一的死亡是由癌症引起的(jemal等,cacancerj.clin.,2002,52:23-47；howlader等,seercancerstatisticsreview,1975-2010,nationalcancerinstitute)。最常鉴定的人癌症包括由器官和实体组织产生的癌症，例如，结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和子宫内膜癌。结肠癌影响西半球二十分之一的人(henderson,naturecellbiology,2000,2(9):p.653-60)。在全球，每年有100万新患者被诊断为结肠癌，并且其一半死于此疾病(liu等,cell,2002,108(6):p.837-47)。
在过去几十年中，癌症治疗和诊断方面取得了显著进步。癌症的治疗选择包括手术、化学疗法、放射疗法和免疫疗法。最近的免疫疗法治疗，旨在刺激免疫系统，特别引起了大量的研究。尽管免疫疗法可以是高度有效的，但是仅患者的子集，而不管肿瘤起源器官，通常对治疗有反应。这一领域的新发现显然需要提高免疫疗法的疗效和特异性。
wnt信号传导控制多种细胞过程，包括细胞命运决定、分化、极性、增殖和迁移。分泌蛋白的wnt家族结合几类受体，例如低密度脂蛋白受体相关(lrp)蛋白5和6(lrp5/6)，从而导致几种不同的细胞内信号传导级联的活化，包括wnt/β-联蛋白、wnt/钙和wnt/jnk途径。wnt与lrp5/6的结合通过阻断多蛋白复合物的功能特异性激活wnt/β-联蛋白途径，所述多蛋白复合物引发β-联蛋白的降解，导致β-联蛋白在细胞质和细胞核中的积累。核β-联蛋白与lef/tcf家族转录因子的成员复合并激活基因表达。
可能由干细胞功能改变引起的病理状态，例如退行性疾病和癌症，通常与wnt/β-联蛋白途径活性的变化相关。事实上，wnt/β-联蛋白途径的过度活化被认为诱导干细胞的过早衰老和年龄相关的干细胞功能丧失(brack等,science,2007,vol.317no.5839pp.807-810；liu等,science,2007,vol.317no.5839pp.803-806)。在癌症中，wnt/β-联蛋白途径的过度活化，其通常与其他细胞生长调节基因的突变结合，可导致异常细胞生长(reya和clevers,nature,2005,434(7035):843-50)。因此，许多正在进行的研究集中在wnt/β-联蛋白途径作为癌症中的潜在治疗靶标(breuhahn等,oncogene,2006,25:3787-3800；greten等,brjcancer,2009,100:19-23)。特别地，包括癌症基因组测序项目的几个研究揭示，超过80％的结肠癌具有突变或甚至丧失腺瘤性结肠息肉病(adenomatosispolyposiscoli)(apc)基因，所述基因是wnt/β-联蛋白途径的主要抑制剂(kinzler和vogelstein,cell.1996,oct18；87(2):159-70.review；sjoblom等,science,2006,oct13；314(5797):268-74；mann等,procnatlacadsciusa,1999.96(4):p.1603-8)。apc和蛋白质如gsk3β和axin形成标记β-联蛋白降解的复合物。apc中的突变破坏这种复合物，并导致细胞质β-联蛋白水平增加及其核易位。由于β-联蛋白是wnt信号传导的最重要的衔接子，它促进致癌因子响应于wnt配体的表达。
wnt信号传导也受许多分泌的多肽拮抗剂调节。这些包括四种分泌的dickkopf(dkk)蛋白(monaghan等,mechdev,1999.87:45-56；krupnik等,gene,1999.238:301-13)。在这四种dkk蛋白中，已经证明dkk1、2和4是经典wnt信号传导的有效拮抗剂(mao等,nature,2001.411:321-5；semenov等,currbiol,2001.11:951-61；bafico等,natcellbiol,2001.3:683-6；niehrs,nature,2006.25:7469-81)，通过以高亲和力直接结合至wnt共同受体lrp5/6(mao等,nature,2001.411:321-5；semenov等,currbiol,2001.11:951-61；bafico等,natcellbiol,2001.3:683-6)。虽然dkk1据报道在脊椎动物发育中的头和心形成中起关键作用(niida等,oncogene2004,nov.4；23(52):8520-6)，但是dkk2似乎不在脊椎动物发育中发挥关键作用。缺乏dkk2的小鼠具有较低的血糖(li等,procnatlacadsciusa,2012.109:11402-7)、降低的骨骼质量(li等,natgenet,2005.37:945-52)和缺陷性眼表上皮(gage等,devbiol,2008.317:310-24；mukhopadhyay等,development,2006.133:2149-54)。鉴于dkk蛋白是wnt拮抗剂，常规的认识是dkk的失活将增加wnt活性并因此加速癌症形成。然而，他们在癌症形成中的作用还没有直接研究。
dkk分子含有两个保守的富含半胱氨酸的结构域(niehrs,nature,2006.25:7469-81)。以前，显示dkk1和dkk2的第二个富含cys的结构域在抑制经典wnt信号传导中起更重要的作用(li等,jbiolchem,jbiolchem,2002.277:5977-81；brott和sokol,mol.cell.biol.,2002.22:6100-10)。最近，解构了dkk2的第二个富含cys结构域的结构，并描绘了dkk与lrp5/6和kremen的相互作用所需的结构域上的氨基酸残基(chen等,jbiolchem,2008.283:23364-70；wang等,jbiolchem,2008.283:23371-5)。dkk与lrp5/6的相互作用是dkk介导的wnt抑制的主要机制的基础。尽管dkk与kremen(也是跨膜蛋白)的相互作用显示促进wnt信号传导的dkk拮抗作用，但是这种相互作用可能具有其他未解构的功能。ala扫描诱变鉴定了lrp5的第三个ywtd重复结构域上的氨基酸残基对结合dkk1和dkk2是重要的(zhang等,mol.cell.biol.,2004.24:4677-84)。这些结果已经通过dkk1/lrp6的第三个和第四个ywtd重复结构域复合物的结构研究证实(cheng等,natstructmolbiol,2011.18:1204-10；chen等,devcell,2011.21:848-61；ahn等,devcell,2011.21:862-73.；bourhis等,structure,2011.19:1433-42)。结构研究之一还揭示了dkk的n末端与lrp的第一个ywtd重复结构域之间的第二个dkk-lrp相互作用位点(bourhis等,structure,2011.19:1433-42)。
虽然wnt信号传导由于其在早期胚胎发育中的作用和其促进肿瘤发生最初被发现，但是最近的研究已经揭示其在广泛的生物过程中起重要作用。本发明源自wnt拮抗剂与常规观点相反对肿瘤促进作用的意外发现。这种wnt抑制剂的中和，其将导致wnt信号传导的改变，可能通过调节肿瘤免疫微环境抑制肿瘤形成。
显然，需要新的方法来减少癌细胞增殖，触发癌细胞死亡并治疗癌症。本发明满足了这种需要。此外，本发明满足改善抗癌免疫疗法和癌症诊断的需要。
技术实现要素：
本发明涉及治疗需要其的对象中的癌症的组合物和方法。
在一方面，治疗癌症的方法包括给对象施用有效量的在药学上可接受的运载体中的人源化的抗dickkopf2(抗dkk2)抗体或其片段。
在另一方面，本发明包括用于治疗对象中的癌症的药物组合物。本发明的药物组合物包括人源化的抗dickkopf2(抗dkk2)抗体或其片段和药学上可接受的运载体。
在另一方面，本发明包括用于在对象中提供抗肿瘤免疫性的方法。在又另一方面，本方法包括用于针对对象中的细胞群或组织刺激t细胞介导的免疫应答的方法。本发明的方法包括给对象施用有效量的人源化的抗dickkopf2(抗dkk2)抗体或其片段与药学上可接受的运载体。在一些实施方式中，t细胞介导的免疫应答是cd8+细胞毒性t淋巴细胞(ctl)应答。
本发明还提供了诊断对象中癌症的方法和诊断对象中发展癌症的倾向的方法。这些方法包括测定来自该对象的生物学样品中dkk2基因的表达水平，其中与来自没有癌症的对象的对照生物学样品的dkk2表达水平相比，来自该对象的生物学样品中dkk2表达水平的增加是对象具有癌症或发展癌症的倾向的指示，并且其中当在对象中检测到癌症或发展癌症的倾向时，为该对象推荐人源化的抗dkk2抗体治疗。
本发明进一步提供了用于测定人源化的抗dkk2抗体治疗对需要其的对象中的癌症的功效的方法。方法包括测定来自该对象的生物学样品中dickkopf2(dkk2)基因的表达水平，其中与来自不具有癌症的对象的对照生物学样品中dkk2表达水平相比，来自该对象的生物学样品中dkk2表达水平的增加是人源化的抗dkk2抗体治疗有效的指示，并且其中当人源化的抗dkk2抗体治疗被确定为有效时，为对象推荐另外的治疗。
在进一步的方面，本发明包括包含靶向dkk2表位的人源化的抗dickkopf2(抗dkk2)抗体的组合物，该dkk2表位包括氨基酸序列seqidno:5。
在又进一步的方面，本发明包括用于诊断对象中癌症或发展癌症或转移的倾向的试剂盒。本发明的试剂盒包括靶向dkk2表位的人源化的抗dkk2抗体，该dkk2表位包括氨基酸序列seqidno:5。
在一些实施方式中，癌症包括包含表达腺瘤性结肠息肉病(apc)突变的细胞的肿瘤。在一些实施方式中，人源化的抗dkk2抗体具备中和活性。在其它实施方式中，人源化的抗dkk2抗体靶向ddk2中和表位，该ddk2中和表位包括氨基酸序列seqidno:5。在又其它实施方式中，人源化的抗dkk2抗体包括选自seqidno:1、2和3的氨基酸序列中的至少一种。
在一些实施方式中，癌症选自结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肠癌、胰腺癌和食管癌。在一些实施方式中，癌症是转移性的。
在一些实施方式中，本发明的组合物和方法进一步包括给对象施用另外的药剂，其选自化学治疗剂、抗细胞增殖剂、免疫治疗剂和其任意组合。在一些实施方式中，另外的药剂是程序性细胞死亡1(pd-1)抗体。在其它实施方式中，人源化的抗dkk2抗体和另外的药剂被共同施用至对象。在又其它实施方式中，人源化的抗dkk2抗体和另外的药剂是共同配制的并且被共同施用至对象。
在一些实施方式中，施用途径选自吸入、口服、直肠、阴道、胃肠外、外部、经皮、肺部、鼻内、含服、眼部、鞘内和其任意组合。
在一些实施方式中，来自对象的生物学样品中dkk2的表达水平比正常对照水平大至少10％。在一些实施方式中，使用选自如下的方法测定来自对象或正常对照的生物学样品中dkk2的表达水平：检测基因的mrna、检测由基因编码的蛋白质、和检测由基因编码的蛋白质的生物学活性。在一些实施方式中，另外的治疗包括选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法和癌症疫苗疗法的至少一种。
在一些实施方式中，对象是哺乳动物。在其它实施方式中，哺乳动物是人。
附图说明
出于说明本发明的目的，在附图中描绘了本发明的某些实施方式。然而，本发明并不限于在附图中描绘的实施方式的精确安排和机构。
图1a-1d是基于公共领域中微阵列数据的分析描绘人gi肿瘤中dkk2基因表达的上调的一系列箱线图(boxplot)。
图2a-2b是通过使用5f8抗dkk2单克隆抗体(mab)的免疫组织染色描绘多种组织起源的肿瘤的组织学切片中dkk2蛋白的检测的一系列图像。
图3是显示dkk2的遗传失活抑制小鼠结肠癌模型apc(min)(又称为，apcmin/+)小鼠中的肿瘤进展的一系列直方图。n>10，*，p<0.01。
图4是图解apcko(apcmin/+dkk2-/-)小鼠中减小的肿瘤负荷的一系列图像。这些图像显示apcko肿瘤倾向于比apc小鼠的那些更小和更不频繁。
图5是描绘mab5f8和1a10抗体与dkk2蛋白的结合以及mab5f8和1a10在hek293细胞中经由wnt活性试验逆转dkk2蛋白对wnt活性的抑制的能力的一系列图表。
图6是展现在apc(min)小鼠中在存在mab5f8抗体的情况下息肉体积的减小的直方图。从10周龄开始，每周两次使用150μgmab5f8处理apc(min)小鼠持续六周。
图7是描绘与抗pd-1比较mab5f8对同种异体移植llc肿瘤生长的抑制作用的图表。免疫活性c57bl小鼠移植有肿瘤细胞并且从第3天开始mab处理(n＝5)。
图8是描绘与抗pd-1比较mab5f8对移植有llc肿瘤细胞的小鼠的寿命延长的作用的图表。如图7中类似地完成实验。大于1.5cm3的小鼠肿瘤体积被认为是死亡的和处死的。
图9是描绘与抗pd-1比较mab5f8对同种异体移植mc38肿瘤生长的抑制作用的图表。免疫活性c57bl小鼠移植有肿瘤细胞并且从第6天开始mab处理，(n＝5)。标绘出肿瘤体积的增加。
图10是显示mab5f8中和在同种异体移植肿瘤模型中减小肿瘤负荷伴随粒酶b-阳性细胞和肿瘤细胞死亡的增加的一系列直方图和图像。小鼠结肠癌细胞(mc38)被皮下移植至免疫活性c57bl小鼠并且从植入后6天开始使用抗dkk2mab(5f8，也称为yal-008-1-5f8)进行处理。显示了肿瘤生长曲线以及凋亡细胞和粒酶b阳性细胞的肿瘤切片免疫染色。n＝5。
图11是描绘中和抗dkk2抗体增加粒酶b-阳性nk和cd8细胞的一系列直方图。同种异体移植肿瘤中细胞的流式细胞分析揭示dkk2中和不影响cd45造血细胞、nk或cd8+细胞的数目，但是增加肿瘤中粒酶b阳性造血细胞、nk和cd8+细胞的百分数。n＝5。
图12是描绘人源化的抗dkk2抗体对同种异体移植模型中肿瘤进展的作用的一系列图表和直方图。mc38细胞被接种至c57bl小鼠(8周龄)并且使用抗体在第6、9和12天进行处理(200μg/处理)。抗体显示了肿瘤生长的显著抑制。*，p<0.05与对照igg(n＝5，学生t检验)。通过流式细胞术分析肿瘤。
图13是描绘人源化的抗dkk2抗体5f8-hxt1-v2对nk和cd8细胞活化的作用的一系列直方图。5f5-hxt1-v2处理增加粒酶b-阳性免疫细胞，包括cd8阳性淋巴细胞和nk1.1阳性自然杀伤细胞。*，p<0.05与对照igg(n＝5，学生t检验)。
图14是显示小鼠抗dkk2抗体y008-1-5f8或其人源化抗体5f8-hxt1-v2对移植的mc38肿瘤进展的抑制作用依赖于宿主免疫性的一系列图表和直方图。这些抗体未能显示对购自jax的移植mc38-移植免疫缺陷nsg小鼠的肿瘤进展的显著抑制作用。
图15是展现人源化的抗dkk2抗体与人dkk2蛋白的结合的图表。人dkk2蛋白被涂覆在elisa板上并且然后使用抗dkk2抗体接着hrp缀合的二次抗体进行培育。在减去抗体与板的背景结合后，使用化学发光试验测定结合。
图16a-16b是人源化的抗dkk2抗体的氨基酸序列表。抗体人源化基于小鼠抗dkk25f8单克隆抗体(5f8mab)。图16a：包括重链1(hc1，igg1；seqidno:1)和轻链1(lc1，κ；seqidno:2)的人源化的抗dkk2抗体的一个译本5f8-hxt1-v1的氨基酸序列表。图16b：包括重链2(hc2，igg1；seqidno:3)和轻链1(lc1，κ；seqidno:2)的人源化的抗dkk2抗体的第二个译本5f8-hxt1-v2的氨基酸序列表。以红色突出的残基表示5f8-hxt1-v1和5f8-hxt1-v2之间不同的那些。粗体的残基指的是互补决定区(cdr)。
图17是展现dkk2直接抑制人nk细胞系(nk92)中的粒酶b表达连同wnt5a的图表。重组体wnt5a和dkk2(200ng/ml)被添加至nk-92mi细胞持续24小时并且通过流式细胞术分析粒酶b含量。
图18是抗原的氨基酸序列(seqidno:4)和人源化的抗dkk2抗体的衍生的表位的氨基酸序列(seqidno:5)的列表。
具体实施方式
本发明涉及意想不到的发现，即抑制dickkopf2(dkk2)导致抑制肿瘤形成，伴随包括自然杀伤(nk)细胞和cd8+细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的免疫效应细胞的增加的细胞毒性活性，以及增加的肿瘤细胞凋亡。因此，在本文所述的各种实施方式中，本发明的方法涉及通过给患者施用有效量的人源化的抗dkk2抗体来治疗癌症的方法，在对象中提供抗肿瘤免疫性的方法，在对象中刺激对细胞群或组织的免疫效应细胞介导的免疫应答的方法。另外，本发明包括诊断癌症或发展癌症的倾向的方法，以及确定使用免疫疗法治疗来治疗癌症的方法。此外，本发明包括用于治疗癌症的药物组合物以及用于实施上述方法的试剂盒。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述相似或等同的任何方法和材料可以用于本发明的测试的实践中，但是本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不意在限制。
如本文所使用的，冠词“一种”和“一个”用于指该冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。作为实例，“一个要素”是指一个要素或多于一个要素。
如本文所用，当提及可测量的值例如量、时间持续等时，术语“约”意在涵盖从规定值的±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，并且还更优选地±0.1％的变化，因为这样的变化适于执行所披露的方法。
如本文所用，“高10％”指的是表达水平为比对照高至少10％或更多，例如高20％、30％、40％、或50％、60％、70％、80％、90％或更多，和/或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2.0倍或更多，以及其间的任何和所有全部或部分增量。
如本文所用，术语“对照”或“参考”可互换使用，并且是指用作比较标准的值(例如，健康对象中dkk2表达水平)。
如本文中使用的“对象”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如家畜和宠物，例如羊、牛、猪、犬、猫和鼠哺乳动物。优选地，对象是人。
如在本文使用的“突变”是dna序列的变化，导致从其天然状态的改变。突变可以包括至少一个脱氧核糖核酸碱基例如嘌呤(腺嘌呤和/或胸腺嘧啶)和/或嘧啶(鸟嘌呤和/或胞嘧啶)的缺失和/或插入和/或重复和/置换。
突变可能或可能不产生在生物体(对象)的可观察特征(表型)中可辨别的变化。
本文所用的术语“免疫原性”是特定物质例如抗原或表位在哺乳动物体内引起免疫应答的能力。这种免疫应答可以是体液和/或细胞介导的。
本文所用的术语“活化”是指细胞在足够的细胞表面部分连接以诱导显著的生物化学或形态变化之后的状态。在t细胞的上下文中，这种活化是指已经被充分刺激以诱导细胞增殖的t细胞的状态。t细胞的活化还可以诱导细胞因子产生及调节性能或细胞溶解效应物功能。在其它细胞的上下文中，此术语推断特定物理化学过程的上调或下调。术语“活化的t细胞”表示目前正在进行细胞分裂、细胞因子产生、调节性能或细胞溶解效应物功能的，和/或最近经历了“活化”的过程的t细胞。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且没有限制可包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链(其在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚体)以及较长链(其在本领域中通常称为蛋白质，其存在很多类型)二者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
在本发明的上下文中，使用通常出现的核酸碱基的以下缩写。“a”是指腺苷，“c”是指胞嘧啶，“g”是指鸟苷，“t”是指胸苷，并且“u”是指尿苷。
本文所用的术语“rna”定义为核糖核酸。
本文所用的术语“免疫治疗剂”意在包括调节患者免疫系统的任何药剂。“免疫疗法”是指改变患者免疫系统的治疗。
本文所用的术语“治疗的”是指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态获得治疗效果。
在本发明的上下文中使用的术语“治疗”意在包括用于疾病或病症的治疗性治疗以及预防性或抑制性措施。因此，例如，术语治疗包括在疾病或病症发作之前或之后施用药剂，从而预防或消除疾病或病症的所有征兆。作为另一个实例，在疾病的临床表现后施用药剂以对抗疾病的症状包括疾病的“治疗”。这包括预防癌症。
术语“生物学样品”是指从生物体或从生物体的组分(例如，细胞)获得的样品。样品可以是任何生物组织或流体。通常，样品将是“临床样品”，其是源自患者的样品。这样的样品包括但不限于骨髓、心脏组织、痰、血液、淋巴液、血细胞(例如，白细胞)、组织或细针活检样品、尿、腹膜液和胸膜液或来自它们的细胞。生物学样品也可包括组织切片例如用于组织学目的的冷冻切片。
“dkk蛋白”是指含有一个或多个富含半胱氨酸的结构域的dkk蛋白家族的蛋白质。dkk蛋白家族包括dkk1、dkk2、dkk3和dkk4，以及在序列水平、结构或功能上与这些蛋白质中的一种或多种充分相关的任何其它蛋白质。这种蛋白家族描述于例如krupnik等(1999)gene238:301中。此定义也包括dkk蛋白的等位基因变体和突变体，例如本文所述的那些。
当用于提及核苷酸序列时，术语“等同的”应理解为是指编码在功能上等同的多肽的核苷酸序列。等同的核苷酸序列将包括通过一个或多个核苷酸置换、添加或缺失而不同的序列，例如等位基因变体；并且因此将包括由于遗传密码的简并性而与本文所述的核酸的核苷酸序列不同的序列。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或片段(例如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(cdr)的残基被来自具有期望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的cdr的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架区(fr)残基被相应的非人残基替换。另外，人源化抗体可以包括在受体抗体或在输入的cdr或框架序列中均未发现的残基。完成这些修饰以进一步改善和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包括基本上所有至少一个并且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有cdr区对应于非人免疫球蛋白的那些并且所有或基本上所有fr区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体最佳地还将包括至少部分免疫球蛋白恒定区(fc)，通常人免疫球蛋白的那个。对于进一步的细节，参见jones等,nature,321:522-525,1986；reichmann等,nature,332:323-329,1988；presta,curr.op.struct.biol.,2:593-596,1992。
“杂交”是指核酸链通过碱基配对与互补链结合的任何过程。两个单链核酸在形成双链双链体时“杂交”。双链性(double-strandedness)区域可以包括单链核酸中的一个或两个的全长，或者一个单链核酸的全部和另一个单链核酸的子序列，或双链性区域可以包括每个核酸的子序列。杂交还包括形成含有某些错配的双链体，条件是两条链仍然形成双链螺旋。“严格杂交条件”是指导致基本上特异性杂交的杂交条件。术语探针与模板核酸的靶位点的“特异性杂交”是指探针主要与靶标的杂交，使得可以清楚地解释杂交信号。如本文进一步描述的，导致特异性杂交的这些条件根据同源性区域的长度、区域的gc含量、杂化物的解链温度“tm”而变化。因此杂交条件将在杂交溶液的盐含量、酸度和温度以及洗涤中变化。
本文所用的关于核酸例如dna或rna的术语“分离的”是指分别与存在于天然来源的大分子中的其它dna或rna分离的分子。本文使用的术语“分离的”还指当通过重组dna技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品的核酸或肽。此外，“分离的核酸”意在包括不是作为片段天然存在的并且不会在天然状态中发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用于指从其它细胞蛋白分离的多肽并且意在包括纯化的和重组的多肽二者。“分离的细胞”或“分离的细胞群”是不存在于其天然环境中的细胞或细胞群。
如本文所用，术语“核酸”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(dna)，和在适当时，核糖核酸(rna)。该术语还应当理解为包括作为等同物的由核苷酸类似物制备的rna或dna的类似物，和如适用于所述的实施方式的单链(有义或反义)和双链多核苷酸。est、染色体、cdna、mrna和rrna是可以称为核酸的分子的代表性实例。
“干细胞”是指能够分化成所需细胞类型的细胞。干细胞包括胚胎干(es)细胞；成人干细胞；和体干细胞，例如来自未定型中胚层的sp细胞。“全能”干细胞能够分化成所有组织类型，包括中胚层、内胚层和外胚层的细胞。“多能(multipotent/pluripotent)”干细胞是能够分化成几种命运中的至少两种的细胞。
当在多核苷酸序列的上下文中使用时，术语“变体”可以包括与基因或其编码序列的多核苷酸序列相关的多核苷酸序列。此定义还可以包括例如“等位基因”、“剪接”、“物种”或“多态”变体。多肽通常将相对于彼此具有显著的氨基酸同一性。多态性变体是给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变异。多态性变体可包括其中多核苷酸序列变化一个碱基的“单核苷酸多态性”(snp)。snp的存在可以指示例如某种群体、疾病状态或疾病状态的倾向。
术语“wnt拮抗剂”或“wnt抑制剂”是指下调(例如，遏制或抑制)通过wnt途径的信号转导的分子或组合物。下调可以直接发生，例如通过抑制wnt信传导途径中的蛋白质的生物活性，或间接发生，例如通过抑制wnt信号传导的下游介体(例如tcf3)或通过降低β-联蛋白的稳定性等。wnt拮抗剂的实例包括但不限于dkk多肽(glinka等,nature,1998,391:357-62；niehrs,trendsgenet,1999,15(8):314-9)、crescent多肽(marvin等,genes&dev.,2001,15:316-327)、cerberus多肽(美国专利号6,133,232)、wise/sclerostin(li等,jbiolchem,2005.280:19883-7)、轴蛋白多肽(zeng等,cell,1997,90(1):181-92；itoh等,currbiol,1998,8(10):591-4；willert等,development,1999,126(18):4165-73)、frzb多肽(cadigan等,cell,1998,93(5):767-77；美国专利号6,133,232；美国专利号6,485,972)、糖原合酶激酶(gsk)多肽(he等,nature,1995)374(6523):617-22)、t细胞因子(tcf)多肽(molenaar等,cell,1996,86(3):391-9)、显性失活散乱蛋白(dishevelled)多肽(wallingford等,nature,2000,405(6782):81-5)、显性失活n钙黏着蛋白多肽(美国专利号6,485,972)、显性失活β-联蛋白多肽(美国专利号6,485,972)、下游转录因子(例如tcf等)的显性失活突变体(dominantnegative)、wnt多肽的显性失活突变体、破坏lrp-卷曲蛋白(frizzled)-wnt复合物的药剂和螯合wnt的药剂(例如，crescent和wnt的抗体)。wnt拮抗剂多肽可以是哺乳动物来源的，例如人、小鼠、大鼠、犬、猫、牛或羊，或非哺乳动物来源，例如来自非洲蟾蜍、斑马鱼、果蝇、鸡或鹌鹑。wnt拮抗剂还包括各种多肽的片段、同系物、衍生物、等位基因变体和肽模拟物，包括但不限于dkk、crescent、cerberus、轴蛋白、frzb、gsk、tcf、显性失活散乱蛋白、显性失活n-钙黏着蛋白、和显性失活β-联蛋白多肽。在其它实施方式中，wnt拮抗剂还包括抗体(例如，wnt特异性抗体)、多核苷酸和小分子。
本文所用的术语“癌症”包括任何恶性肿瘤，包括但不限于癌、肉瘤。癌症起因于细胞的不受控制和/或异常分裂，然后侵入并破坏周围组织。如本文所用，“增殖(proliferating和proliferation)”是指经历有丝分裂的细胞。如本文所用，“转移”是指恶性肿瘤从其原始见到位置的远处扩散。癌细胞可通过血流、通过淋巴系统、穿过体腔或其任何组合转移。
术语“癌”是指由上皮细胞组成的趋向于浸润周围组织并产生转移的恶性新生长。
术语“癌症疫苗”是指刺激免疫系统以抵抗癌症或抵抗有助于癌症发展的药剂的疫苗。存在两种广泛类型的癌症疫苗：预防性癌症疫苗，其旨在预防健康对象中的癌症发展；以及治疗性癌症疫苗，其旨在通过增强身体对抗癌症的天然防御来治疗现有癌症(lollini等,naturereviewscancer,2006；6(3):204-216)。如本文所用，术语“癌症疫苗”应解释为包括预防性和治疗性癌症疫苗二者。
术语“转移”是指癌症从一个器官或部分到另一个不相邻的器官或部分的扩散。
术语“改善”或“治疗”意指与癌症或黑素瘤相关的临床征兆和/或症状由于所进行的动作而减轻。待监测的征兆或症状将是特定癌症或黑素瘤的特征，并且对于临床医师来说是熟知的，如监测征兆和病症的方法。例如，熟练的临床医生将知道可以使用通常用于特定肿瘤的诊断成像方法(例如，使用超声或磁共振图像(mri)监测肿瘤)来监测肿瘤生长的大小或生长速率。
如本文所用，术语“药物组合物”是指在本发明中有用的至少一种化合物与其它化学组分例如运载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。药物组合物有助于将该化合物施用至生物体。本领域中存在施用化合物的多种技术，包括但不限于：静脉内、口服、气雾剂、肠胃外、眼部、肺部和外部施用。
术语“药学上可接受的运载体”包括药学上可接受的盐、药学上可接受的材料、组合物或运载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料，其涉及在对象内携带或输送本发明的化合物(一种或多种)或携带或输送本发明的化合物(一种或多种)至对象，使得其可以执行其预期功能。通常，这种化合物从身体的一个器官或部分携带或输送至身体的另一器官或部分。每种盐或运载体在与制剂的其它成分相容的意义上必须是“可接受的”，并且不对对象有害。可以用作药学上可接受的运载体的材料的一些实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡类；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；稀释剂；造粒剂；润滑剂；粘合剂；崩解剂；润湿剂；乳化剂；着色剂；脱模剂；涂层剂；甜味剂；调味剂；加香剂；防腐剂；抗氧化剂；增塑剂；胶凝剂；增稠剂；硬化剂；固化剂；悬浮剂；表面活性剂；保湿剂；运载体；稳定剂；和在药物制剂中使用的其它无毒的相容性物质，或其任何组合。如本文所用，“药学上可接受的运载体”还包括与化合物的活性相容并且对于对象是生理上可接受的任何和所有的包衣、抗菌剂和抗真菌剂，以及吸收延迟剂等。补充性活性化合物也可以掺入组合物中。
如本文所用的术语“抗体”或“ab”是指衍生自特异性结合到抗原上的特异性表位的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是源自天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。用于本发明的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、细胞内抗体(“胞内抗体”)、fv、fab和f(ab)2，以及单链抗体(scfv)和人源化抗体(harlow等,1998,usingantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,ny；harlow等,1989,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharbor,newyork；houston等,1988,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；bird等,1988,science242:423-426)。抗体可以源自天然来源或源自重组来源。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。
本文所用的术语“合成抗体”是指使用重组dna技术产生的抗体，例如本文所述的由噬菌体表达的抗体。该术语还应解释为是指通过合成编码抗体的dna分子产生的抗体，并且该dna分子表达抗体蛋白或规定抗体的氨基酸序列，其中使用以下合成dna或氨基酸序列技术获得dna或氨基酸序列，所述技术是本领域可获得的和熟知的。
术语“抗体片段”是指完整抗体或其重组变体的至少一部分，并且是指完整抗体的抗原结合结构域，例如完整抗体的抗原决定可变区，其足以赋予抗体片段对靶标例如抗原的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、fv片段、scfv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体例如sdab(vl或vh)、vhh结构域、和由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“scfv”是指包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区通过短的柔性多肽连接体连续连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scfv保留其来源的完整抗体的特异性。除非特别说明，如本文所使用的scfv可以具有任何顺序的vl和vh可变区，例如相对于多肽的n末端和c末端，scfv可以包含vl-连接体-vh或可以包含vh-连接体-vl。
本文所用的“抗体重链”是指存在于其天然存在的构象中的抗体分子中的两种类型多肽链中的较大者，并且其通常决定抗体所属的类别。
本文所用的“抗体轻链”是指存在于其天然存在的构象中的抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
本文所用的术语“重组抗体”是指使用重组dna技术产生的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语也应解释为是指通过合成编码抗体的dna分子产生的抗体，所述dna分子表达抗体蛋白或规定抗体的氨基酸序列，其中dna或氨基酸序列使用本领域可获得和熟知的重组dna或氨基酸序列技术获得。
本文使用的术语“抗原”或“ag”定义为引发免疫应答的分子。这种免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或二者。技术人员将理解，任何大分子，包括实际上所有的蛋白质或肽，可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组dna。技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna因此编码如本文所使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发所需的免疫应答。此外，技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以是合成的或可以源自生物学样品。这样的生物学样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
术语“施用器”，如本文所用的术语，是指用于施用本发明的化合物和组合物的任何装置，包括但不限于皮下注射器、移液管等。
如本文所用，“适配体”是指可以与另一个分子特异性结合的小分子。适配体通常是基于多核苷酸或肽的分子。多核苷酸适配体是通常包含几条核酸链的dna或rna分子，其采用高度特异性的三维构象，所述构象被设计为对特异性靶分子(例如肽、蛋白质、药物、维生素，以及其它有机和无机分子)具有合适的结合亲和力和特异性。这样的多核苷酸适配体可以通过使用通过指数富集的配体的系统演化而从大量随机序列中选择。肽适配体通常是连接到结合特异性配体的蛋白质支架的约10至约20个氨基酸的环。可以使用例如酵母双杂交系统的方法从组合文库鉴定和分离肽适配体。
本文所用的术语“抗肿瘤效应”是指可以通过多种手段表现的生物效应，包括但不限于，例如，肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数目的减少、转移的数目减少、预期寿命的增加、肿瘤细胞增殖的减少、肿瘤细胞存活的减少、或与癌性病症相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤效应”也可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来证明。
本文所用的术语“异种移植物”是指取自一个物种的供体并移植到另一个物种的受体中的组织的移植物。
本文所用的术语“同种异体移植物”是指取自一个物种的供体并移植到同一物种的受体中的组织的移植物。
范围：贯穿本公开内容，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，在范围格式的描述仅为了方便和简明，并且不应当解释为是对本发明的范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为是具有确切披露的所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，诸如从1至6的范围的描述应当被认为已经确切披露子范围，例如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3到6等，以及在所述范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度，此均适用。
描述
免疫系统在激活和抑制之间平衡。逃避免疫监视是肿瘤形成的先决条件之一。肿瘤逃避免疫监视的方法之一是产生升高量的免疫抑制分子。多年来已经确定了越来越多的免疫抑制分子和机理。已经表明这些免疫抑制分子的中和在治疗各种恶性肿瘤中是有效的。
本发明涉及抑制自然杀伤(nk)细胞和cd8+细胞毒性t淋巴细胞(ctl)活性的分泌型肿瘤形成增强剂dkk2的发现。dkk2是一种分泌蛋白，其可以抑制β-联蛋白介导的wnt信号传导，改变非β-联蛋白介导的wnt活性，并且还可以具有wnt非依赖性功能。dkk2在许多组织中表达，并在人结肠直肠癌、胃肠癌、肝癌、肾癌和胰腺癌中上调。下面描述的实验证据表明dkk2抑制剂和中和抗体是用于治疗其中表达dkk2的癌症的关键免疫调节剂。因此dkk2是治疗这些癌症的有希望的靶标。
本发明的方法
本发明涉及治疗需要其的对象中的癌症的方法，方法包括给对象施用有效量的在药学上可接受的运载体中的人源化的抗dkk2抗体或其片段。本发明的人源化的抗dkk2抗体在细胞、组织或体液中抑制或减少dkk2表达和/或抑制或降低dkk2活性。
抗体
本发明包括含有人源化的抗dkk2抗体的组合物。在一个实施方式中，人源化的抗dkk2抗体包括选自seqidno:1、2和3的氨基酸序列中的至少一种(图16a-16b)。
产生抗体的方法是本领域已知的。本文描述了用于生产根据本发明使用的抗体的示例性技术。本领域技术人员应当理解，抗体包括能够特异性结合存在于靶分子上的表位的任何免疫球蛋白分子，无论是源自天然来源还是源自重组来源。在一个实施方式中，靶分子包括
当用于本发明的组合物和方法中的靶分子的抗体是多克隆抗体(igg)时，抗体通过用包含全长靶蛋白或其片段、上游调节子、或其片段的肽接种适当的动物而产生。这些多肽或其片段可以通过本领域已知的任何方法获得，包括化学合成和生物合成。
然后从获得自动物的流体中分离在接种的动物中产生的特异性结合靶分子或其片段的抗体。可以以这种方式在几种非人哺乳动物例如但不限于山羊、绵羊、马、骆驼、兔和驴中产生抗体。用于产生多克隆抗体的方法是本领域熟知的，并且描述于例如harlow等,1998,in:antibodies,alaboratorymanual,coldspringharbor,ny中。
针对全长靶分子或其片段的单克隆抗体可以使用任何公知的单克隆抗体制备方法制备，例如在harlow等(1998,in:antibodies,alaboratorymanual,coldspringharbor,ny)和tuszynski等(1988,blood,72:109-115)中描述的那些。人单克隆抗体可以通过美国专利公开号2003/0224490中描述的方法制备。针对抗原的单克隆抗体从使用本文提及的标准程序用抗原免疫的小鼠产生。可以使用本领域可获得的技术克隆和测序编码使用本文所述的程序获得的单克隆抗体的核酸，并且描述于例如wright等,1992,criticalrev.immunol.12(3,4):125-168，及其中引用的参考文献中。
当用于本发明方法的抗体是对应于全长靶分子或其片段的抗体的生物活性抗体片段或合成抗体时，抗体如下制备：将编码所需抗体或片段的核酸克隆到合适的载体中。将载体转染到适于产生大量抗体或其片段的细胞中。然后在细胞中表达编码所需抗体的dna，从而产生抗体。编码所需肽的核酸可以使用本领域可获得的技术克隆和测序，并描述于例如wright等,1992,criticalrev.inimmunol.12(3,4):125-168及其中引用的参考文献中。可选地，所需抗体或其片段的量也可以使用化学合成技术合成。如果抗体的氨基酸序列是已知的，则可以使用本领域已知的方法化学合成所需的抗体。
在一个实施方式中，本发明包括使用与存在于靶分子上的表位特异性反应的人源化抗体。这些抗体能够结合靶分子。可用于本发明的人源化抗体具有人架构并具有来自与靶细胞表面分子特异性反应的抗体(通常为小鼠抗体)的一个或多个互补决定区(cdr)。
在一些实施方式中，非人抗体可以是人源化的，其中修饰抗体的特定序列或区域以增加与在人中天然产生的抗体的相似性。例如，在本发明中，抗体或其片段可以包括非人哺乳动物scfv。在一个实施方式中，抗原结合结构域部分是人源化的。
可以使用本领域已知的各种技术生产人源化抗体，包括但不限于cdr-移植(参见，例如，欧洲专利号ep239,400；国际公布号wo91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，其每个通过引用以其全部并入本文)、覆盖(veneering)或表面重建(resurfacing)(参见，例如，欧洲专利号592,106和ep519,596；padlan,1991,molecularimmunology,28(4/5):489-498；studnicka等,1994,proteinengineering,7(6):805-814；以及roguska等,1994,pnas,91:969-973，其每个通过引用以其全部并入本文)、链替换(chainshuffling)(参见，例如，美国专利号5,565,332，其通过引用以其全部并入本文)、和在如下中公开的技术，例如，美国专利申请公布号us2005/0042664、美国专利申请公布号us2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公布号wo9317105、tan等,j.immunol.,169:1119-25(2002),caldas等,proteineng.,13(5):353-60(2000),morea等,methods,20(3):267-79(2000),baca等,j.biol.chem.,272(16):10678-84(1997),roguska等,proteineng.,9(10):895-904(1996),couto等,cancerres.,55(23supp):5973s-5977s(1995),couto等,cancerres.,55(8):1717-22(1995),sandhujs,gene,150(2):409-10(1994)，以及pedersen等,j.mol.biol.,235(3):959-73(1994)，其每个通过引用以其全部并入本文。通常，框架区中的框架残基将被置换为来自cdr供体抗体的相应的残基以变更、优选地改进抗原结合。通过本领域熟知的方法鉴定这些框架置换，例如，通过对cdr和框架残基的相互作用进行建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基以及序列比较以鉴定在特定位置处不寻常的框架残基。(参见，例如，queen等，美国专利号5,585,089；和riechmann等,1988,nature,332:323，其通过引用以其全部并入本文)。
人源化抗体具有从非人来源引入其的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。因此，人源化抗体包括来自非人免疫球蛋白分子的一个或多个cdr和来自人的框架区。抗体的人源化是本领域熟知的，并且可以基本上遵循winter与合作者的方法进行(jones等,nature,321:522-525(1986)；riechmann等,nature,332:323-327(1988)；verhoeyen等,science,239:1534-1536(1988))，这通过将啮齿动物cdr或cdr序列置换为相应的人抗体序列，即cdr-移植(ep239,400；pct公布号wo91/09967；和美国专利号4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，其内容通过引用以其全部并入本文)。在这样的人源化嵌合抗体中，基本上小于完整人可变结构域已经被置换为来自非人物种的相应的序列。实际上，人源化抗体通常是其中一些cdr残基和可能的一些框架(fr)残基被置换为来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基的人抗体。抗体的人源化也可以通过覆盖或表面重建(ep592,106；ep519,596；padlan,1991,molecularimmunology,28(4/5):489-498；studnicka等,proteinengineering,7(6):805-814(1994)；以及roguska等,pnas,91:969-973(1994))或链替换(美国专利号5,565,332)实现，其内容通过引用以其全部并入本文。
用于制造人源化抗体的人可变结构域——轻和重二者——的选择是为了降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”方法，啮齿动物抗体的可变结构域的序列针对已知的人可变结构域序列的整个文库进行筛选。最接近于啮齿动物的人序列然后被接受为用于人源化抗体的人框架(fr)(sims等,j.immunol.,151:2296(1993)；chothia等,j.mol.biol.,196:901(1987)，其内容通过引用以其全部并入本文)。另一种方法使用源自特定的轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于数种不同的人源化抗体(carter等,proc.natl.acad.sci.usa,89:4285(1992)；presta等,j.immunol.,151:2623(1993)，其内容通过引用以其全部并入本文)。
抗体可以被人源化，其中保留对靶抗原的高亲和力以及其它有利的生物学性质。根据本发明的一个方面，人源化抗体通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念性人源化产物的方法来制备。三维免疫球蛋白模型是一般可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。图解和展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些展示允许对残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用的分析，即，对影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基的分析。以此方式，fr残基可以从受体和输入序列选择和组合，使得实现期望的抗体特性，比如对靶抗原的增加的亲和力。一般而言，cdr残基直接地和最实质性地参与影响抗原结合。
人源化抗体保留与原始抗体相似的抗原特异性。然而，使用人源化的某些方法，可以使用“定向进化”的方法增加抗体对靶抗原的结合亲和力和/或特异性，如由wu等,j.mol.biol.,294:151(1999)描述的，其内容通过引用以其全部并入本文。
在一些实施方式中，表达控制dna序列可以与人源化免疫球蛋白编码序列可操作地连接，包括天然相关或异源启动子区。表达控制序列可以是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统，或者表达控制序列可以是能够转化或转染原核宿主细胞的载体中的原核启动子系统。一旦载体被掺入合适的宿主中，将宿主保持在适合于高水平表达引入的核苷酸序列的条件下，并且根据需要收集和纯化人源化轻链、重链、轻链/重链二聚体或完整的抗体、结合片段或其它免疫球蛋白形式(beychok,cellsofimmunoglobulinsynthesis,academicpress,newyork,1979，其通过引用并入本文)。
可以根据本领域熟知的方法分离人抗体的dna序列，特别是互补决定区(cdr)。优选地，如国际专利申请公开号wo1987/02671中所述，从永生化的b细胞分离人cdrdna序列。可用于产生本发明的抗体的cdr可以类似地源自编码能够结合靶分子的单克隆抗体的dna。这样的人源化抗体可以使用熟知的方法在能够产生抗体的任何方便的哺乳动物来源中产生，包括但不限于小鼠、大鼠、骆驼、骆马、兔或其它脊椎动物。用于恒定区和框架dna序列的合适细胞和其中表达和分泌抗体的宿主细胞可以从许多来源获得，例如维吉尼亚州马纳萨斯美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection,manassas,va)。
产生对dkk2有反应性的特异性抗体或抗体片段的另一种方法包括筛选编码在具有dkk2蛋白或肽的细菌中表达的免疫球蛋白基因或其部分的表达文库。例如，可以使用噬菌体表达文库在细菌中表达完整的fab片段、vh区和fv区。参见例如ward等,nature,1989,341:544-546；huse等,science,1989,246:1275-1281；以及mccafferty等,nature,1990,348:552-554。用例如dkk2肽筛选这样的文库可以鉴定与dkk2反应的免疫球蛋白片段。可选地，scid-hu小鼠(可获自genpharm)可用于产生抗体或其片段。
在进一步的实施方式中，可以从使用在mccafferty等,nature,1990,348:552-554中描述的技术产生的抗体噬菌体文库分离抗体或抗体片段。clackson等,nature,1991,352:624-628和marks等,1991,222:581-597描述了使用噬菌体文库分别分离鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组(marks等,biotechnology,1992,10:779-783)，以及组合感染和体内重组作为构建非常大噬菌体文库(waterhouse等,nuc.acids.res.,1993,21:2265-2266)产生高亲和力(nm范围)的人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代物。
还可以修饰dna，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利号4,816,567；morrison等,proc.natl.acad.sci.usa,1984,81:6851)，或通过使免疫球蛋白编码序列共价连接非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分。通常，这种非免疫球蛋白多肽置换抗体的恒定结构域，或者它们置换抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体，所述嵌合二价抗体具有对第一抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一抗原结合位点。
已经开发了用于产生功能性抗体片段的各种技术。抗体片段可以包括抗体的可变区或抗原结合区。传统上，通过完整抗体的蛋白水解消化得到这些片段(参见例如morimoto等,journalofbiochemicalandbiophysicalmethods,1992,24:107-117和brennan等,science,1985,229:81)。然而，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可以从上述抗体噬菌体文库中分离抗体片段。可选地，可以从大肠杆菌直接回收fab'-sh片段并化学偶联以形成f(ab′)2片段(carter等,bio/technology,1992,10:163-167)。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离f(ab′)2片段。用于产生抗体片段的其它技术对于本领域技术人员是显而易见的。在其它实施方式中，选择的抗体是单链fv片段(scfv)。参见wo93/16185；美国专利号5,571,894；美国专利号5,587,458。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如，例如，美国专利号5,641,870中描述的。这样的线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
抗体模拟物或“非抗体结合蛋白”通过使用非免疫球蛋白支架作为抗体可变区的替代蛋白框架，使用非免疫球蛋白支架，包括adnectins、高亲和性多聚体(avimers)、单链多肽结合分子和抗体样结合肽模拟物(美国专利号5,260,203；5,770,380；6,818,418和7,115,396)。已经开发了以类似于抗体的方式靶向和结合靶标的其它化合物。这些“抗体模拟物”中的某些使用非免疫球蛋白支架作为抗体可变区的替代蛋白框架。可以使用称为“抗体样结合肽模拟物”(abip)的用于将抗体减小为较小肽模拟物的方法，用于将抗体减小为较小肽模拟物的方法也可用作抗体的替代方案(murali等cellmolbiol.,2003,49(2):209-216)。
融合蛋白是单链多肽，包括称为“高亲和性多聚体”的多个结构域，通过体外外显子改组和噬菌体展示从人细胞外受体结构域开发，并且是一类在各种靶分子的亲和力和特异性方面与抗体有些相似的结合蛋白(silverman等natbiotechnol,2005,23:1556-1561)。得到的多结构域蛋白可以包括多个独立的结合结构域，其与单表位结合蛋白相比可以表现出改善的亲和力(在一些情况下亚纳摩尔)和特异性。关于高亲和性多聚体的构建和使用的方法的其它细节公开于例如美国专利申请公开号20040175756、20050048512、20050053973、20050089932和20050221384中。
除了非免疫球蛋白框架外，还在包括但不限于rna分子和非天然寡聚体(例如，蛋白酶抑制剂、苯并二氮杂类、嘌呤衍生物和β-转角模拟物)的化合物中模拟抗体性质，所有这些都合适用于本发明。这些的目的是通过开发用于设计定制特异性的抗体的完全体外技术来规避在动物中开发抗体的限制。
如本领域已知的，适配体是由与特定分子靶标紧密结合的核酸组成的大分子。tuerk和gold(science,1990,249:505-510)披露了用于选择适配体的selex(指数富集的配体系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment))方法。在selex方法中，产生和/或用靶分子筛选核酸分子的大文库(例如，1015个不同分子)。然后可以进一步精制分离的适配体，以消除对靶标结合和/或适配体结构无贡献的任何核苷酸(即，截短到其核心结合结构域的适配体)。参见，例如jayasena,1999,clin.chem.45:1628-1650对于适配体技术的综述。
关于本发明的抗dkk2抗体的术语“中和”或短语“中和dkk2活性的抗体”意指与dkk2结合或与dkk2接触的抗体导致抑制细胞增殖活性、癌症转移、癌细胞侵入或癌细胞迁移，抑制wnt信号传导、促进dkk2诱导的微环境的肿瘤形成的建立。因为dkk2分泌到细胞外并且作为癌细胞的增殖、迁移、侵入和转移的必要因子起作用，一些抗dkk2抗体可以中和这些活性。本发明中的中和抗体特别适用于治疗应用：以预防或治疗顽固性疾病癌症和癌症转移。本发明中的中和抗体可以施用至患者或与细胞接触以抑制特征在于dkk2过表达的癌症的转移。
本发明的抗体可以通过本领域已知的任何方法评估免疫特异性结合。可使用的免疫测定包括但不限于使用以下的技术的竞争性和非竞争性测定系统：例如，蛋白质印迹、放射免疫测定、elisa(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白a免疫测定，仅举几个例子。这种测定是常规的并且是本领域熟知的(参见，例如，currentprotocolsinmolecularbiology,(ausubel等,eds.),greenepublishingassociatesandwiley-interscience,newyork,2002)。
联合疗法
当与用于治疗癌症的至少一种另外的化合物组合时，本文所述方法中鉴定的化合物也可用于本发明的方法中。另外的化合物可以包含本文鉴定的化合物或已知用于治疗、预防或减少癌症的症状和/或转移的化合物，例如市售化合物。
在一个方面，本发明考虑本发明中有用的药剂可以与治疗剂组合使用，所述治疗剂例如抗肿瘤剂，包括但不限于化学治疗剂、免疫治疗剂、抗细胞增殖剂或其任何组合。例如，以下非限制性示例性类别的任何常规化学治疗剂包括在本发明中：烷化剂；亚硝基脲；抗代谢物；抗肿瘤抗生素；植物生物碱；紫杉烷；激素药；和混合式(miscellaneous)药剂。
烷化剂是这样命名的，因为它们能够在细胞中存在的条件下向许多电负性基团添加烷基，从而干扰dna复制以阻止癌细胞繁殖。大多数烷化剂是细胞周期非特异性的。在具体方面，它们通过交联dna双螺旋链中的鸟嘌呤碱基来停止肿瘤生长。非限制性实例包括白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、异环磷酰胺、盐酸氮芥、盐酸美沙拉秦、丙卡巴肼、塞替派和尿嘧啶芥。
抗代谢物阻止在细胞周期的合成(s)期期间将碱基并入dna，从而禁止正常发育和分裂。抗代谢物的非限制性实例包括例如5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、甲氨蝶呤和硫鸟嘌呤的药物。
抗肿瘤抗生素通常通过干扰细胞分裂所需的酶或通过改变细胞周围的膜来阻止细胞分裂。此类中包括蒽环类，例如多柔比星，其通过破坏dna的结构并终止其功能来阻止细胞分裂。这些药剂是细胞周期非特异性的。抗肿瘤抗生素的非限制性实例包括阿克拉霉素、放线菌素、安定霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素、松节霉素、加利车霉素、卡霉素、卡莫西霉素、卡西林素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地柔红霉素、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、阿霉素、伊达比星、马赛洛霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星。
植物生物碱抑制或停止有丝分裂或抑制阻止细胞产生细胞生长所需的蛋白质的酶。常用的植物生物碱包括长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。然而，本发明不应被解释为仅限于这些植物生物碱。
紫杉烷影响在细胞功能中是重要的称为微管的细胞结构。在正常的细胞生长中，当细胞开始分裂时形成微管，但是一旦细胞停止分裂，则微管被分解或破坏。紫杉烷禁止微管分解，使得癌细胞变得如此被微管堵塞，以致它们不能生长和分裂。非限制性的示例性紫杉烷包括紫杉醇和多西紫杉醇。
激素剂和类激素药物用于某些类型的癌症，包括例如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。它们常常与其它类型的化学疗法药物一起使用以增强其有效性。性激素用于改变雌性或雄性激素的作用或产生，并用于减缓乳腺癌、前列腺癌和子宫内膜癌的生长。抑制这些激素的产生(芳香酶抑制剂)或作用(他莫昔芬)通常可用作治疗的辅助。一些其它肿瘤也是激素依赖性的。他莫昔芬是激素剂的非限制性实例，其干扰促进乳腺癌细胞生长的雌激素的活性。
混合式药剂包括化学治疗剂，例如博莱霉素、羟基脲、l-天冬酰胺酶和丙卡巴肼。
化学治疗剂的其它实例包括但不限于以下及其药学上可接受的盐、酸和衍生物：氮芥例如苯丁酸氮芥、氯氮平、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氮芥氧化物、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲洛磷胺、尿嘧啶芥子；亚硝基脲例如卡莫司汀、氯卓卡星、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；嘌呤类似物例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫柳宁、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如阿扎他滨、阿扎胞苷、6-氮尿嘧啶、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-fu；雄激素例如卡鲁斯特、丙酸色丙酸托烷酯、表薄甾烷醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝伐单抗；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌；依洛尼塞；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫匹达莫；硝唑兰；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；psk@雷佐生；西佐呋喃；锗螺胺；丝裂酸；三唑酮；2,2′,2″-三氯三乙胺；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“ara-c”)；环磷酰胺；塞替哌；紫杉烷，例如太平洋紫杉醇(taxolo,bristol-myerssquibboncology，princeton,n.j.)和多西他赛(taxotere,rhone-poulencrorer,antony,france)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物例如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素c；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺安托；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；塞罗达；伊班膦酸盐；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；视黄酸；埃斯波霉素；和卡培他滨。
抗细胞增殖剂可以进一步定义为凋亡诱导剂或细胞毒性剂。凋亡诱导剂可以是粒酶、bcl-2家族成员、细胞色素c、半胱天冬酶或其组合。示例性粒酶包括粒酶a、粒酶b、粒酶c、粒酶d、粒酶e、粒酶f、粒酶g、粒酶h、粒酶i、粒酶j、粒酶k、粒酶l、粒酶m、粒酶n或其组合。在其它具体方面，bcl-2家族成员是例如bax、bak、bcl-xs、bad、bid、bik、hrk、bok或其组合。
在另外的方面，半胱天冬酶为半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12、半胱天冬酶-13、半胱天冬酶-14或其组合。在具体方面，细胞毒性剂是tnf-α、白树毒素、促红细胞生成素、核糖体抑制蛋白(rip)、假单胞菌外毒素、艰难梭菌毒素b、幽门螺杆菌vaca、小肠结肠炎耶尔森氏菌yopt、维生素e、二亚乙基三胺五乙酸、伊洛福芬(irofulven)、白喉毒素、米托洁林(mitogillin)、蓖麻毒素、肉毒杆菌毒素、霍乱毒素、皂草素6或其组合。
免疫治疗剂可以是但不限于白细胞介素-2或其它细胞因子，程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)信号传导的抑制剂，例如结合pd-1的单克隆抗体，易普利姆玛。免疫治疗剂还可以阻断细胞毒性t淋巴细胞相关抗原a-4(ctla-4)信号传导，并且其还可以涉及癌症疫苗和基于树突状细胞的治疗。
免疫治疗剂还可以是通过细胞因子治疗或通过过继细胞疗法和/或通过造血干细胞移植转移外源细胞而被活化和扩增的nk细胞。适合于过继细胞疗法的nk细胞可以源自不同来源，包括自体nk细胞的离体扩增，来自外周血的未刺激或扩增的同种异体nk细胞，来自外周血和脐带血的cd34+造血祖细胞，和nk细胞系。表达嵌合抗原受体或细胞因子的遗传修饰的nk细胞也包括在本发明中。用于本发明的另一种免疫治疗剂是基于过继t细胞疗法(act)的药剂，其中给患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(til)。施用的t细胞可以被遗传工程化以表达肿瘤特异性抗原受体，例如以非主要组织相容性(mhc)限制的方式识别细胞表面抗原的嵌合抗原受体(car)或者它们可以是传统的αβtcr，其识别由mhc分子呈递的细胞内抗原的表位。
药物组合物和制剂
本发明设想了包含人源化的抗dkk2抗体的药物组合物用于本发明方法的用途。
这样的药物组合物是处于适于施用至对象的形式，或者药物组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的运载体、一种或多种另外的成分或这些的一些组合。药物组合物的各种组分可以以生理学上可接受的盐的形式存在，例如与生理上可接受的阳离子或阴离子组合，如本领域所熟知的。
在一个实施方式中，可以施用可用于实施本发明的方法的药物组合物以递送1ng/kg/天和100mg/kg/天之间的剂量。在另一个实施方式中，可以施用可用于实施本发明的药物组合物以递送1ng/kg/天和500mg/kg/天之间的剂量。
本发明的药物组合物中活性成分、药学上可接受的运载体和任何另外的成分的相对量将根据所治疗的对象的身份、大小和状况而变化，并且还取决于施用组合物的途径而变化。举例来说，组合物可以包含在0.1％与100％(w/w)之间的活性成分。
可用于本发明方法的药物组合物可适当地开发用于吸入、口服、直肠、阴道、肠胃外、外部、经皮、肺部、鼻内、含服、眼部、鞘内、静脉内或其它施用途径。其它考虑的制剂包括投射的纳米颗粒(projectednanoparticle)、脂质体制剂、含有活性成分的再密封的红细胞，和基于免疫的制剂。施用途径(一种或多种)对于本领域技术人员是显而易见的，并且取决于许多因素，包括所治疗的疾病的类型和严重性、所治疗的兽医或人患者的类型和年龄等。
本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域已知的或以后开发的任何方法制备。通常，这种制备方法包括使活性成分与运载体或一种或多种其它辅助成分缔合的步骤，然后如果必要或需要，将产品成形或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用至对象的活性成分的剂量或这种剂量的合宜分数，例如这样剂量的一半或三分之一。单位剂型可以是单日剂量或多日剂量之一(例如，每天约1至4次或更多次)。当使用多日剂量时，对于每个剂量，单位剂型可以相同或不同。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合于对人进行伦理给药的药物组合物，但是本领域技术人员应当理解，这样的组合物通常适于施用至各种动物。对适于施用至人的药物组合物修饰以使该组合物适于施用至各种动物是众所周知的，且普通技术的兽医药理学家可以仅使用普通(如果有的话)实验设计和进行这种修饰。考虑施用本发明的药物组合物的对象包括但不限于人和其它灵长类动物、哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫和狗。
在一个实施方式中，使用一种或多种药学上可接受的赋形剂或运载体配制组合物。在一个实施方式中，药物组合物包含治疗有效量的人源化的抗dkk2抗体和药学上可接受的运载体。可用的药学上可接受的运载体包括但不限于甘油、水、盐水、乙醇和其它药学上可接受的盐溶液，例如磷酸盐和有机酸盐。这些和其它药学上可接受的运载体的实例描述于remington’spharmaceuticalsciences,1991,mackpublicationco.,newjersey中。
运载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们适当的混合物以及植物油。恰当的流动性可以被维持，例如通过应用包衣例如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂。阻止微生物的作用可以通过不同的抗菌剂以及抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等来实现。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠或多元醇例如甘露醇和山梨醇。可注射的组合物的延长吸收可以通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝或明胶包括在组合物中而造成。
制剂可以与常规赋形剂，即适合于口服、胃肠外、鼻部、静脉内、皮下、肠内或本领域已知的任何其它合适的给药方式的药学上可接受的有机或无机载体物质的混合物一起使用。可以将药物制剂灭菌，并且如果希望的话，与助剂混合，所述助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。它们也可以根据需要与其它活性剂例如其它止痛剂组合。
本发明的组合物可包含占组合物总重量约0.005％至2.0％的防腐剂。防腐剂用于阻止在暴露于环境中的污染物的情况下的腐败。根据本发明有用的防腐剂的实例包括但不限于选自苄醇、山梨酸、对羟基苯甲酸酯、亚胺脲及其组合的那些。特别优选的防腐剂是约0.5％至2.0％的苄醇和0.05％至0.5％的山梨酸的组合。
组合物优选包含抑制化合物降解的抗氧化剂和螯合剂。对于一些化合物，优选的抗氧化剂是bht、bha、α-生育酚和抗坏血酸，其优选范围为组合物总重量的约0.01％至0.3％，更优选bht范围为0.03％至0.1％。优选地，螯合剂以组合物总重量的0.01％至0.5％的量存在。特别优选的螯合剂包括按组合物总重量计约0.01-0.20％，更优选0.02-0.10％重量范围的依地酸盐(例如依地酸二钠)和柠檬酸。螯合剂可用于螯合组合物中可能对制剂的保存期限有害的金属离子。虽然bht和乙二胺四乙酸二钠是分别对于一些化合物特别优选的抗氧化剂和螯合剂，但是如本领域技术人员已知的，其它合适和等效的抗氧化剂和螯合剂因此可能被置换。
施用/给药
施用方案可影响有效量的组成。例如，治疗制剂可在与癌症相关的外科手术之前或之后，或在患者被诊断患有癌症之后不久施用至患者。此外，可以每天施用或者顺序地施用若干分次剂量以及交错剂量，或者剂量可以连续地输注、或者可以是单次快速静脉注射。此外，治疗制剂的剂量可按比例地增加或减少，如治疗或预防情况的紧急情况所指示的。
给患者，优选哺乳动物，更优选人施用本发明的组合物可以使用已知的程序，以有效治疗患者癌症的剂量和时间进行。实现治疗效果所需的治疗化合物的有效量可以根据以下因素而变化：例如所使用的具体化合物的活性；给药时间；化合物的排泄速率；治疗的持续时间；其它药物，与化合物组合使用的化合物或材料；所治疗患者的疾病或病症的状态、年龄、性别、体重、状况、一般健康和在先病史，以及医学领域中熟知的类似因素。可对剂量方案加以调节，以提供最优治疗应答。例如，可每日施用数个分开的剂量或可按治疗情形紧迫程度所指示的成比例减少剂量。本发明的治疗化合物的有效剂量范围的非限制性实例为约0.01至50mg/kg体重/每天。本领域普通技术人员将能够研究相关因素并且在不进行过度实验的情况下确定治疗化合物的有效量。
化合物可以以每天几次的频率施用至动物，或者可以更低频率地施用，例如每天一次，每周一次，每两周一次，每月一次或甚至更低频率，例如每几个月一次或甚至每年一次或更少。应当理解，在非限制性实例中，可以每天，每隔一天，每2天，每3天，每4天或每5天施用每天剂量化合物的量。例如，对于每隔一天的给药，可以在周一开始5mg/天的剂量，在周三施用第一后续的5mg/天剂量，在周五施用第二后续5mg/天剂量，等等。剂量的频率对于本领域技术人员是显而易见的，并且取决于许多因素，例如但不限于所治疗的疾病的类型和严重性，以及动物的类型和年龄。在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变以此获得用于具体患者、组合物，以及施用模式的有效达到所希望的治疗应答的活性成分的量，不对患者具有毒性。具有本领域普通技术的医生，例如医师或兽医，可以容易地确定和开出所需的药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以以水平低于为了实现所需疗效需要的剂量开始在药物组合物中采用的本发明的化合物的剂量，且逐步增加剂量直至实现所需效果。
在具体实施方式中，特别有利的是以容易施用和剂量均匀性的剂量单位形式配制化合物。如本文所用的剂量单位形式指适宜作为待治疗患者的单一剂量的物理上分离的单位；每个单位含有经计算产生与所需药用载体相关的所需治疗效应的药物化合物的预先确定的量。本发明的剂量单位形式由以下因素决定并直接取决于以下因素：(a)治疗化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果，以及(b)混配/配制这样的用于治疗患者的癌症的治疗化合物领域固有的限制。
施用途径
本领域技术人员将认识到，尽管可以使用多于一种途径用于施用，但是特定途径可以提供比另一种途径更直接和更有效的反应。
本发明的任何组合物的施用途径包括吸入、口服、鼻部、直肠、肠胃外、舌下、经皮、经粘膜(例如，舌下、舌部、(经)颊部、(经)尿道、阴道(例如，经阴道和阴道内)、(经)鼻部和(经)直肠)、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌肉内、皮肤内、动脉内、静脉内、支气管内、吸入和外部给药。合适的组合物和剂型包括例如片剂、胶囊、囊剂、丸剂、软胶囊(gelcap)、含片、分散体、悬浮液、溶液、糖浆、颗粒、珠粒、经皮贴剂、凝胶、粉末、弹丸剂、浆剂、锭剂、乳霜、糊剂、膏剂、洗剂、盘剂、栓剂、用于鼻或口服给药的液体喷雾剂、用于吸入的干粉或气雾化制剂、用于膀胱内给药的组合物和制剂等。应当理解，可用于本发明的制剂和组合物不限于本文所述的具体制剂和组合物。
控释制剂和药物递送系统
本发明的药物组合物的控释或缓释制剂可以使用常规技术制备。在一些情况下，待使用的剂型可以作为一种或多种活性成分的缓释或控释而提供，其中使用例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、可渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体或微球体或其组合，以提供不同比例的所需释放曲线。本领域普通技术人员已知的合适的控释制剂，包括本文所述的那些，可以容易地选择用于本发明的药物组合物。因此，适合于口服给药的单一单位剂型，例如适于控释的片剂、胶囊、软胶囊和囊剂，包括在本发明中。
大多数控释药品都具有相对其非控释相应物改进药物治疗的共同目标。理想的是，在医学治疗中所设计的最佳的控释制剂的用途其特征为采用最小量的药物物质在最少量的时间内治愈或控制病况。控释制剂的优点包括延长药物活性、减少给药频率和增加患者顺应性。此外，控释制剂可用于影响作用开始的时间或其它特征，例如药物的血液水平，因此可影响副作用的发生。
免疫应答刺激
在一个实施方式中，本发明包括通过给对象施用有效量的人源化的抗dkk2抗体或其片段与药学上可接受的运载体来提供抗肿瘤免疫性和刺激t细胞介导的免疫应答的方法。
活化t淋巴细胞(t细胞)及其在免疫疗法中用于治疗癌症和感染性疾病的用途是本领域众所周知的(melief等,immunol.rev.,1995,145:167-177；riddell等,annu.rev.immunol.,1995,13:545-586)。如本发明中所披露的，dkk2的消除导致cd8+细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的活化和肿瘤的抑制。
用于ctl活化的标记物可以是但不限于细胞毒素例如穿孔素、粒酶和颗粒溶素、细胞因子、il-2、il-4、cd25、cd54、cd69、cd38、cd45ro、cd49d、cd40l、cd137、cd134。如本文实施例部分所述，样品中这些标记物中至少一种的水平的测量可用于评估ctl活化。t细胞或通常本发明的任何细胞的分选可以使用多种市售的细胞分选机中的任何一种进行，分选机包括但不限于moflo分选机(dakocytomation,fortcollins,colo.)、facsariatm、facsarraytm、facsvantagetm、bdtmlsrii、和facscaliburtm(bdbiosciences,sanjose,calif.)。
诊断和治疗
在一个实施方式中，本发明涉及诊断对象中癌症或发展癌症或转移的倾向的方法。方法包括测定来自对象的生物学样品中dkk2基因的表达水平，其中与正常对照dkk2表达水平相比，dkk2表达水平的增加表明对象患有癌症或具有发展癌症或转移的倾向。如本文公开的人源化的抗dkk2抗体在本发明的方法中用于测定生物学样品中dkk2的表达水平。
在另一个实施方式中，本发明涉及用于测定免疫疗法治疗在需要其的对象中治疗癌症的功效的方法。方法包括测定来自对象的生物学样品中dkk2基因的表达水平，其中与正常对照中dkk2的表达水平相比，dkk2的表达水平的增加是免疫疗法有效的表示。在本发明的一些方面，癌症的治疗可以包括实体瘤的治疗或转移的治疗。转移是癌症的一种形式，其中转化的或恶性的细胞将癌症从一个位点传播并扩散到另一个位点。这些癌症包括皮肤、乳腺、脑、宫颈、睾丸等的癌症。更具体地、癌症可包括但不限于以下器官或系统：心脏、肺、胃肠、泌尿生殖道、肝、骨骼、神经系统、妇科、血液、皮肤和肾上腺。更具体地，本文的方法可用于治疗神经胶质瘤(神经鞘瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤)、神经母细胞瘤、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、脑膜瘤、肾上腺皮质癌、肾癌、各种类型的血管癌、成骨细胞性骨癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫平滑肌瘤、唾液腺癌、脉络丛癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和巨核细胞白血病。皮肤癌包括恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波氏肉瘤、发育异常性痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕疙瘩和牛皮癣。如本文公开的人源化的抗dkk2抗体在本发明的方法中用于测定生物学样品中dkk2的表达水平。
dkk2的表达的对照标准量
本发明的方法包括将来自对象的生物学样品中测量的dkk2表达量与dkk2表达的对照量(即，参比)进行比较。
在一个实施方式中，dkk2的标准对照表达水平可以通过测量健康对象中dkk2的表达水平来获得。优选地，健康对象是相似年龄、性别和种族的对象，并且从未被诊断有任何类型的严重疾病，特别是任何类型的癌症。
在另一个实施方式中，dkk2的表达的对照量是本领域接受的dkk2的表达的值。此参比值可以是基于dkk2表达的平均值通过应用标准统计学方法对一组对象计算的基线值。
在一个实施方式中，通过选自以下的方法测定表达水平：检测基因的mrna、检测由基因编码的蛋白质、以及检测由基因编码的蛋白质的生物活性。
在本发明的某些方面，在来自对象的样品中测定dkk2的表达水平。样品优选包括肿瘤细胞、来自肿瘤细胞周围的任何流体(即，白血病血液、肿瘤组织等)或与肿瘤生理接触或接近的任何流体，或除了本文所述那些之外的任何其它体液也应被认为包括在本发明中。如本文公开的人源化的抗dkk2抗体在本发明的方法中用于测定生物学样品中dkk2的表达水平。
测量方法
可以使用本领域技术人员已知的任何方法来测定dkk2表达的水平。例如，可以使用微阵列。微阵列在本领域中是已知的，并且由与基因产物(例如mrna、多肽、其片段等)在序列上对应的探针可以特异性杂交或结合到已知位置的表面组成。为了检测至少一种关注基因，通过使测试样品与至少一种核酸探针接触来形成杂交样品。核酸探针可以是例如全长核酸分子或其部分，例如长度为至少10、15或20个核苷酸的寡核苷酸，并且足以在严格条件下与合适的靶标特异性地杂交。在本发明的情况下，在一些实施方式中，用于检测dkk2的探针是能够与人dkk2mrna或其片段杂交的标记核酸探针。在其它实施方式中，核酸探针的序列是编码选自seqidno:1、2和3(图16a-16b)的氨基酸序列中的一种或片段的核酸序列。将杂交样品保持在足以允许核酸探针与感兴趣的靶标特异性杂交的条件下。特异性杂交可以在高严格条件或中等严格条件下进行，视情况而定。在优选的实施方式中，用于特异性杂交的杂交条件是高严格性条件。然后使用标准方法检测特异性杂交(如果存在的话)。如果在核酸探针和测试样品中的基因之间发生特异性杂交，则存在于核酸探针中的序列也存在于对象的mrna中。也可以使用多于一种核酸探针。由扫描仪检测的杂交强度数据由affymetrix微阵列套件(affymetrixmicroarraysuite)(mass)软件自动获取和处理。使用150的目标强度将原始数据标准化为表达水平。测量少量不同基因的mrna表达谱的替代方法是通过例如经典的
样品——特别是mrna——的转录状态也可以通过本领域已知的其它核酸表达技术测量。可以使用本领域技术人员已知的任何方法从样品中分离mrna。非限制性实例包括商业试剂盒，例如可从qiagen(荷兰)购得的
另一种用于分析mrna表达的精确方法可以使用下一代测序(ngs)，包括第一、第二、第三以及后续的下一代测序技术。
在本发明的其它方面，通过本领域中用于测定样品中肽或多肽的量的所有已知方法，可以实现测定肽、多肽的量或检测其生物活性。这些装置包括可以利用各种夹心、竞争或其它测定形式的标记分子的免疫测定装置和方法。这样的测定将产生指示肽或多肽的存在或不存在的信号。此外，信号强度可以优选地与样品中存在的多肽的量直接或间接(例如反比例)相关。进一步合适的方法包括测量肽或多肽特异性的物理或化学性质，例如其精确的分子质量或nmr谱。所述方法优选包括生物传感器、与免疫测定偶联的光学装置、生物芯片、分析装置例如质谱仪、nmr分析仪或色谱装置。此外，方法包括基于微板elisa的方法、全自动或机器人免疫测定(例如可在elecsystm分析仪上获得)、cba(酶促钴结合测定，例如可在roche-hitachitm分析仪上获得)和乳胶凝集测定(例如可在roche-hitachitm分析仪上获得)。
试剂盒
本发明包括一组优选的抗体，被标记(例如，荧光剂，淬灭剂等)或未标记的，其可用于检测至少dkk2。
在某些实施方式中，提供了试剂盒。鉴于本说明书，用于这些方法的市售试剂盒是本领域技术人员已知的。通常，试剂盒将包含适合于检测所关注的多肽或核酸或mrna的存在的检测试剂。
在另一个实施方式中，存在一组探针组或抗体。在一些实施方式中，该组抗体包含靶向dkk2表位的人源化的抗dkk2抗体，所述人源化的抗dkk2抗体包含选自seqidno:4和5(图18)的氨基酸序列中的至少一种。在一些实施方式中，探针组的组被设计为检测dkk2的水平并提供关于癌症诊断或发展癌症或转移的倾向的信息。探针组是特别有用的，因为它们比意欲在特定基因组中检测尽可能多的肽的探针组更小且更便宜。在本发明中，探针组目的在于检测对癌基因有信息的多肽。探针组还可以包含大量或少量探针，其检测对于癌症没有信息的肽。此类探针可用作对照和用于标准化(例如，掺入标记物)。探针组可以是干混合物或溶液中的混合物。在一些实施方式中，探针组可以固定在固体基底上以形成探针阵列。探针可以是抗体或核酸(例如，dna、rna、dna和rna的化学修饰形式)、lna(锁定的核酸)或pna(肽核酸)或能够与关注的肽或核酸序列特异性相互作用的任何其它聚合化合物。
考虑试剂盒可以设计用于分离和/或检测基本上任何样品(例如，白血病血液、肿瘤细胞、肿瘤组织等)中的肽(例如dkk2、已知的癌症标记物、免疫激活剂或凋亡蛋白)或核酸序列，并且鉴于本说明书，多种试剂和方法是本领域已知的。
实施例
现在参考以下实施例描述本发明。提供这些实施例仅是出于说明的目的，并且本发明绝不应该被解释为局限于这些实施例，而是应该被解释为涵盖由于在此所提供的教导而变得明显的任何以及所有变化。
无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实施例制备和利用本发明的化合物并实施要求保护的方法。因此以下工作实施例特别指出本发明的优选实施方式，且不应理解为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1：dkk2在大范围的实体瘤中表达
公众可获得的基因表达数据库的分析揭示dkk2在许多胃肠癌中上调，包括直肠腺癌、结肠直肠癌、胃腺癌和胰腺导管腺癌(图1)。使用抗dkk2抗体的免疫组织染色还揭示dkk2蛋白在来自结肠、直肠、肾、肺和胃的肿瘤样品中上调，并且在来自肝、乳腺、子宫颈和卵巢的肿瘤样品中检测到(图2)。这些数据表明dkk2可以是用于治疗人癌症的相关的治疗靶标。
实施例2：遗传dkk2缺失导致apcmin/+小鼠中肿瘤负荷降低
将apc(min)(也称为apcmin/+小鼠)和apc(min)；dkk2-/-小鼠饲养在无特定病原体的动物房中。在不存在dkk2的情况下，肿瘤进展显著减少(图3和4)。相应地，肿瘤诱导的异常，例如脾肿大、胸腺萎缩和淋巴细胞减少(you,s.,等,intjexppathol,2006.87(3):p.227-36)在apcko小鼠中显著较低。这种肿瘤减小现象在高和低脂肪饮食的雄性和雌性小鼠组中观察到，具有一致的结果。总之，这些数据强烈地表明在不存在dkk2的情况下，结肠癌进展是显著更低的。
实施例3：抗dkk2抗体的生成
dkk2是分泌的，并且是使用抗体(ab)靶向以减少肿瘤负荷的合适候选物。虽然dkk2对于眼睑发育是重要的(gage等,devbiol,2008.317(1):p.310-24)，但不知道在成年小鼠中具有生命攸关的功能。研发了对dkk2具有高度特异性的两种mab的克隆(5f8和1a10)，其中和dkk2并抑制其wnt拮抗功能(图5)。生成携带5f8的相同cdr的人源化抗体，并且它们中的两个显示对dkk2蛋白的类似的亲和力(图15)。
实施例4：在结肠癌细胞的移植小鼠模型中靶向dkk2显示dkk2是调节肿瘤性状和微环境的重要参与者
来源于c57bl小鼠中的小鼠结肠癌的mc38细胞在移植到具有免疫活性的wtc57bl小鼠时进展非常快。因此，此异种移植模型充当侵略性晚期肿瘤模型的良好替代物，其可用于测试抗dkk2ab用于治疗晚期癌症的潜力。在一项研究中，用mc38细胞移植c57bl小鼠(每组n＝5)。六天后，经由腹膜内(ip)途径使用小鼠igg或mab5f8以8mg/kg处理小鼠，并且mab5f8显示了显著的抑制肿瘤生长(图9)。肿瘤切片的免疫染色揭示mab5f8增加肿瘤细胞凋亡和粒酶b阳性细胞(图10)。重要的是，浸润到这些移植的肿瘤的白细胞的流式细胞分析显示cd45、nk、cd8+、骨髓细胞或cd4的数目没有差异，但是yal008-1-5f8处理导致粒酶b阳性cd45阳性白细胞——包括粒酶b阳性nk和cd8+细胞——的显著增加(图11)。这些结果表明了如下机制：其包括dkk2中和介导的肿瘤进展的抑制中效应物免疫细胞的调节。
实施例5：dkk2抗体抑制同种异体移植模型中的肺肿瘤形成。
将小鼠llc肺癌细胞移植到c57bl小鼠并使用抗dkk2抗体(yal008-1-5f8)处理。此抗体抑制肿瘤形成(图7)，并且延长荷瘤小鼠的存活(图8)。
实施例6：dkk2和wnt对nk细胞活化的影响。
在dkk2、wnt3a、wnt5a和dkk1的重组蛋白存在或不存在并且存在或不存在wnt抑制剂(包括lgk-974)和gsk抑制剂(包括chir99021)下，测试来自脾和移植mc38的肿瘤的人nk细胞系nk-92和原代小鼠nk细胞的粒酶的表达和细胞毒性活性。以这种方式评估dkk2和wnt对nk细胞活化的调节。实验结果显示重组体dkk2和wnt5a抑制人nk92细胞中的粒酶b表达(图17)，这表明dkk2可以直接参与免疫效应物细胞的抑制。
实施例7：抗dkk2抗体以免疫依赖性方式抑制肿瘤形成。
当mc38细胞被移植至免疫缺陷nsg小鼠——其缺乏成熟的b和t淋巴细胞、髓样细胞和nk细胞——时，mab5f8和人源化5f8均未显示对肿瘤生长的任何抑制作用(图14)。这些结果指示dkk2中和取决于宿主免疫性的存在抑制肿瘤形成。
实施例8：当与pd-1抗体缔合时，抗dkk2抗体最佳地抑制肿瘤形成。
c57bl小鼠(每组n＝5)移植有llc或mc38细胞。数天后，经由腹膜内(ip)途径使用小鼠igg、抗dkk2抗体(5f8)和/或抗小鼠pd-1抗体以16mg(8mg/抗体)/kg处理小鼠。将mab5f8对肿瘤形成的作用与pd-1抗体进行比较(cancerres.2005feb1；65(3):1089-96)。在llc同种异体移植肺肿瘤模型中，mab5f8对肿瘤延缓的作用与pd-1抗体相似，并且mab5f8和pd-1抗体的组合显示出比单独的pd-1抗体更高的肿瘤进展的抑制(图7)；5f8以及5f8和pd-1抗体的组合显示出比单独使用pd-1抗体增加的存活(图8)。图9图解了当在mc38结肠癌模型中单独施用或与其它抗体组合施用时，mab5f8对肿瘤形成的对比作用。在此mc38模型中，pd-1抗体不显示对肿瘤形成的显著影响。
实施例9：人源化的抗dkk2抗体可以显著地抑制肿瘤生长。
制备人源化的抗dkk2抗体5f8-hxt1-v1和5f8-hxt1-v2并且显示以非常高的亲和力与人dkk2蛋白结合(图15)。两种抗体在同种异体模型(mc38细胞)中显示了肿瘤生长的显著抑制(图12)。图13展现了5f5-hxt1-v2处理增加粒酶b阳性免疫细胞，包括cd8阳性淋巴细胞和nk1.1阳性自然杀伤细胞。
将本文引用的各个和每个专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用以其全部并入本文中。
虽然本发明已经参照具体实施方式进行披露，但清楚的是在不偏离本发明的真实精神和范围下本发明的其它实施方式和变更可以由其它的本领域的普通技术人员来设计。所附权利要求书意欲解释为包括所有这类实施方式和等效变化方式。
序列表
<110>耶鲁大学
d·吴
b·陈
h·吴
<120>人源化的抗dkk2抗体和其用途
<130>047162-7073wo1(00462)
<150>us62/247,410
<151>2015-10-28
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