流感样疾病的疗法的制作方法

本申请是申请日为2011年03月10日，申请号为201180013592.5，发明名称为“流感样疾病的疗法”的申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及患有在确立的流感样疾病(ili)期间或之后发展的下呼吸道疾病的个体的治疗。我们用确立的流感样疾病来表示其中症状例如对于个体或护理人员而言已经明显持续至少24小时、更具体至少48小时的疾病。更具体地，本发明涉及通过气雾剂递送干扰素-β(ifn-β)或增加ifn-β表达的药剂至下呼吸道来治疗患有在ili期间或之后发展的下呼吸道疾病的个体、特别是住院患者。流感样疾病是特征为以下症状中的两个的疾病：头痛、咳嗽、喉咙痛和肌肉痛和/或确诊流感。更具体地，ili可以被定义为发烧>37.8℃加上以下症状中的两个：(头痛、咳嗽、喉咙痛和肌肉痛)和/或确诊流感病毒感染。

发明背景

季节性流感是常见感染，特别是在冬季。每年流感病毒株(a型或b型)传播，导致初级护理的临床接诊、住院治疗的发生(主要在老年人和幼童中，但偶尔也在中年人中)和死亡(主要在老年人中)。由于流感病毒感染的直接效应或其可能的并发症，最常见的是继发性细菌感染，可能需要初级护理和住院的治疗。针对ili的初级护理接诊和冬季病床压力的增加常常与已知社区流感活动期相关。

当出现新的流感病毒亚型时发生大流行流感，所述新的流感病毒亚型明显不同于近期传播的亚型和毒株，并且能够：

·感染人类；

·在人与人之间高效传播；

·在高比例的受感染者中引起显著的临床疾病。

因为病毒在人类中是新颖的，高比例的人群具有很少或没有免疫性，产生大量的易感者；因此，疾病广泛且迅速传播。

之前已经提出干扰素在流感治疗中的预防性或早期介入，但是取得的成功有限。

高致病性流感病毒是流感病毒的强毒力形式，例如h5n1，导致迅速且高水平的发病。

ili包括季节性流感、大流行流感和高致病性流感。

现在，我们已经发现了治疗患有在ili期间或之后发展的下呼吸道疾病的个体、特别是住院患者的新方法。

发明概述

相应地，本发明提供了选自以下的药剂：

(a)干扰素-β(ifn-β)；

(b)增加ifn-β表达的药剂；或

(c)能够表达(a)或(b)的多核苷酸；

用于治疗患有在确立的ili期间或之后发展的下呼吸道疾病的个体，其中所述治疗是通过气雾剂递送所述药剂至下呼吸道。

本发明还提供了治疗经诊断患有在确立的ili期间或之后发展的下呼吸道疾病的个体的方法，该方法包括向所述个体的下呼吸道气雾剂递送选自由以下组成的组的药剂：

(a)干扰素-β(ifn-β)；

(b)增加ifn-β表达的药剂；

(c)能够表达(a)或(b)的多核苷酸。

还提供了选自以下的药剂：

(a)干扰素-β(ifn-β)；

(b)增加ifn-β表达的药剂；或

(c)能够表达(a)或(b)的多核苷酸；

在制备用于治疗在确立的ili期间或之后发展的下呼吸道疾病的药物中的用途，其中所述治疗是通过气雾剂递送所述药剂至下呼吸道。

本申请提供了以下项目：

项目1.一种选自以下的药剂：

(a)干扰素-β(ifn-β)；

(b)增加ifn-β表达的药剂；或

(c)能够表达(a)或(b)的多核苷酸；

用于治疗患有在确立的ili期间或之后发展的下呼吸道疾病的个体，其中所述治疗是通过气道递送所述药物。

项目2.根据项目1所述的药剂，其中所述药剂是ifn-β。

项目3.根据项目2所述的药剂，其中所述ifn-β包括以下的序列：(a)人类ifn-β1a(seqidno:2)；或(b)人类ifn-β1b(seqidno:4)。

项目4.根据前述项目中任一项所述的药剂，该药剂与神经氨酸酶抑制剂组合。

项目5.根据项目4所述的药剂，其中所述神经氨酸酶抑制剂是局部活性的。

项目6.根据项目4或项目5所述的药剂，其中所述神经氨酸酶抑制剂是扎那米韦。

项目7.根据项目1至6中任一项所述的药剂，其中所述下呼吸道疾病是哮喘或copd。

项目8.根据项目1至7中任一项所述的药剂，其中所述个体是老年人，例如年龄超过60岁的老年人。

项目9.一种治疗经诊断患有在确立的ili期间或之后发展的下呼吸道疾病的个体的方法，该方法包括给所述个体气道施用选自由以下组成的组的药剂：

(a)干扰素-β(ifn-β)；

(b)增加ifn-β表达的药剂；

(c)能够表达(a)或(b)的多核苷酸。

项目10.根据项目9所述的方法，其中所述药剂是ifn-β。

项目11.根据项目10所述的方法，其中所述ifn-β包括以下的序列：

(a)人类ifn-β(seqidno:2)；或(b)人类ifn-β1b(seqidno:4)。

项目12.根据项目9至11中任一项所述的方法，其中所述药剂与神经氨酸酶抑制剂组合以同时、分别或顺序施用。

项目13.根据项目9至12中任一项所述的方法，其中所述下呼吸道疾病是哮喘或copd。

项目14.根据项目9至13中任一项所述的方法，其中所述个体是老年人，例如年龄超过60岁的老年人。

项目15.一种用于治疗流感样疾病的产品，包括用于同时、分别或顺序气道施用的(i)选自如项目1所定义的(a)至(c)的第一药剂和(ii)吸入型神经氨酸酶抑制剂。

项目16.如项目15所述的产品，该产品是用于气雾剂递送至气道、特别是下气道的药物组合物。

项目17.如项目15或项目16所述的产品，其中所述第一药剂是ifn-β。

项目18.根据项目1至8所述的药剂或者根据项目9至14中任一项所述的方法，其中所述药剂在ili症状变得明显之后至少48小时通过气雾剂递送至下呼吸道。

附图简述

图1a显示在a型流感病毒感染后96小时时期内感染的人肺支气管上皮细胞的百分比增加和从感染后48小时开始的ifn-β治疗的效应(n＝1次实验)。

图1b显示在a型流感病毒感染后96小时时期内感染的人肺支气管上皮细胞的百分比增加和从感染后48小时开始的ifn-β治疗的效应(n＝3次实验，包括原始数据)。

图2a显示在a型流感病毒感染人肺支气管上皮细胞之后96小时时期内的病毒脱落和从感染后48小时开始的ifn-β治疗的效应。病毒脱落在48至96小时达到稳态(n＝1次实验)。

图2b显示在a型流感病毒感染人肺支气管上皮细胞之后96小时时期内的病毒脱落和从感染后48小时开始的ifn-β治疗的效应。病毒脱落在48至96小时达到稳态(n＝3次实验，包括原始数据)。

图3显示人类ifn-β治疗对ifn-β依赖性抗病毒基因粘液病毒抗性蛋白1(mxa)在来自健康人类自愿者或食蟹猕猴的血细胞中表达的效应(n＝3)。全血用ifn-β(0-1000iu/ml)处理4小时，提取rna并测量对mxa基因表达的效应。

图4显示人类ifn-β治疗对ifn-β依赖性抗病毒基因2’-5’寡腺苷酸合成酶(2’-5’oas)在来自健康人类自愿者或食蟹猕猴的血细胞中表达的效应(n＝3)。全血用ifn-β(0-1000iu/ml)处理4小时，提取rna并测量对2’-5’oas基因表达的效应。

图5显示人类ifn-β在感染了季节性流感的食蟹猕猴细胞中的保护性效应(n＝4)。在用流感病毒株a/victoria/3/75(h3n2)以0.01的moi感染之前，用ifn-β(0、100或1000iu/ml)预处理食蟹猕猴细胞24小时。在病毒感染之后48小时收集上清液，通过空斑测定法测量病毒脱落。*指示p<0.05。

序列表简述

seqidno:1显示了人类ifn-β1a的核苷酸序列。seqidno:2显示了人类ifn-β1a的氨基酸序列。seqidno:3显示了人类ifn-β1b的核苷酸序列。seqidno:4显示了人类ifn-β1b的氨基酸序列。ifn-β1b与人类ifn-β1a相同，除了在残基17的半胱氨酸被丝氨酸替代。

发明详述

如前文所述，本发明涉及ifn-β的新治疗用途。具体地，例如，本发明涉及通过气雾剂递送至下呼吸道来治疗被诊断为患有在流感样疾病期间或之后发展的下呼吸道疾病的个体、特别是已经接纳住院的那些患者的ifn-β的治疗用途。

如上所述，之前已经提出干扰素用于预防或早期治疗ili。相应地，已经提出干扰素在ili症状显现之前或者在此类症状开始出现时使用。一般而言，已经将这些干扰素施用给上呼吸道，例如鼻咽。通常，用干扰素治疗的起始在症状出现24小时内开始。

相比之下，我们已经发现，可以通过将干扰素-β药剂气雾剂化递送至下呼吸道来治疗患有ili所产生的并发症、特别是患有下呼吸道疾病的已经住院的患者。通常，住院在症状首次出现之后48小时发生。

ifn-β的定义

如本文使用的，术语ifn-β将被理解为指保留天然ifn-β的生物活性并且优选保留在肺中和具体是支气管和/或肺泡上皮中存在的ifn-β的活性的ifn-β的任何形式或类似物。ifn-β可以与人类ifn-β1a(seqidno:2)或人类ifn-β1b(seqidno:4)的序列相同或者包括人类ifn-β1a(seqidno:2)或人类ifn-β1b(seqidno:4)的序列。ifn-β还指具有与seqidno:2或4的序列不同的氨基酸序列的变体多肽。可选地，ifn-β可以是化学修饰的。ifn-β的变体可以是天然存在的变体，例如，由非人类物种表达的变体。而且，ifn-β的变体包括与seqidno:2或4不同但不一定是天然存在的序列。就seqidno:2或4的氨基酸序列的全长而言，基于氨基酸同一性，变体优选与该序列至少80％同源。更优选地，基于氨基酸同一性，多肽在整体序列上与seqidno:2或4的氨基酸序列至少85％或90％且更优选至少95％、97％或99％同源。在40或更多、例如60、80、100、120、140或160或更多的连续氨基酸段上存在至少80％、例如至少85％、90％或95％的氨基酸同一性(“严格同源性(hardhomology)”)。可以使用本领域已知的任何方法确定同源性。例如，uwgcg软件包提供了bestfit程序，其可用于计算同源性，例如以其默认设置使用(devereux等人(1984)nucleicacidsresearch12,p387-395)。可使用pileup和blast算法来计算同源性或对齐序列(例如，鉴定相同残基或相应序列(通常基于其默认设置))，例如在altschuls.f.(1993)jmolevol36:290-300；altschul,s.f等人(1990)jmolbiol215:403-10中所描述的。用于进行blast分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nhn.nih.gov/)公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某一正值阈值得分t的长度w的短字来鉴定高得分序列对：(hsp)。t被称为相邻字得分阈(altschul等人，同上)。这些初始相邻字匹配用作开始检索以找到含有它们的hsp的种子。沿着每个序列的两个方向延伸字匹配，只要累加比对得分可以增加。当如下时停止每个方向上的字匹配延伸：累加比对得分从其达到的最大值减少了量x；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累加得分达到0或以下；或者到达任一序列的末端。blast算法参数w、t和x决定比对的灵敏度和速度。blast程序使用11的字长(w)、50的blosum62得分矩阵(参见henikoff和henikoff(1992)proc.natl.acad.sclusa89:10915-10919)比对(b)、10的预期(e)、m＝5、n＝4和双链对比作为默认值。blast算法进行两个序列之间相似性的统计分析；参见例如karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5787。由blast算法提供的相似性的一个量度是最小总和概率(p(n))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间碰巧发生匹配的概率的指示。例如，如果在一个序列与另一个序列对比中最小总和概率小于约1、优选小于约0.1、更优选小于约0.01和最优选小于约0.001，则认为第一序列与第二序列相似。可以对seqidno:1或2的氨基酸序列进行氨基酸取代，例如从1、2、3、4或5个至10、20或30个取代。例如，可以根据表1进行保守取代。第二列中同一单元格中的氨基酸和优选第三列中同一行中的氨基酸可以相互取代：表1–保守氨基酸取代，非芳族的：非极性的：gapilv，极性、不带电荷的：cstmnq，极性、带电荷的：dehkr，芳族的：hfwy

表1-保守氨基酸取代

seqidno:1或2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基可以可选地或额外地缺失。可以缺失从1、2、3、4或5个至10、20或30个残基或更多。ifn-β还包括上述序列的片段。此类片段保留ifn-β活性。片段长度可以是至少120或140个氨基酸。如下文更详细描述的，此类片段可用于产生嵌合剂(chimericagent)。ifn-β包括含有seqidno:2或4的片段或部分的嵌合蛋白。可以可选地或额外地向上述多肽添加一个或多个氨基酸。可以在seqidno:2或4的氨基酸序列或其多肽变体或片段的n端或c端设置延伸段。延伸段可以非常短，例如1至10个氨基酸长度。可选地，延伸段可以更长。载体蛋白可以与上述氨基酸序列融合。因此，本发明可以使用含有上述多肽之一的融合蛋白。ifn-β还包括经过化学修饰的seqidno:2或4或其变体。许多侧链修饰是本领域已知的，并且可对上述蛋白或多肽的侧链进行侧链修饰。例如，此类修饰包括糖基化，磷酸化，通过与乙醛反应、随后用nabh4还原的还原性烷基化对氨基酸的修饰，用乙酰亚胺酸甲酯的脒化，或者用乙酸酐的酰化。修饰优选是糖基化。ifn-β可以合成制备或者使用本领域已知的方法通过重组方式制备。可以修饰蛋白和多肽的氨基酸序列以包含非天然存在的氨基酸或者增加化合物的稳定性。当通过合成方式生成蛋白或肽时，可以在生成期间引入此类氨基酸。还可以在合成或重组生成之后修饰蛋白或肽。还可以使用d-氨基酸来生成ifn-β。在此类情况下，氨基酸将以c至n的方向以逆序列连接。这在本领域常规用于生成此类蛋白或肽。可以通过从重组表达载体原位表达多肽而在细胞中生成ifn-β。表达载体任选载有诱导型启动子以控制多肽表达。可以在重组表达之后通过任何蛋白液相色谱系统的纯化之后，大规模生成ifn-β或其类似物。优选的蛋白液相色谱系统包括fplc、akta系统、bio-cad系统、bio-radbiologic系统和gilsonhplc系统。本发明可使用ifn-β或其类似物的商业途径可获得的形式。实例包括和

增加ifn-β表达的药剂

本发明还可以涉及使用增加ifn-β在肺或优选在支气管和/或肺泡上皮中内源性表达的药剂。该药剂可以直接作用于ifn-β基因的启动子或其他调控序列。此类药剂可作用以减少ifn-β启动子的组成型沉默。可选地，该药剂可以通过在细胞表面的受体作用来刺激细胞产生内源性ifn-β。本发明关注的增加ifn-β内源性表达的药剂包括但不限于聚(肌苷酸)-聚(胞苷酸)(聚(ic))、ana773、培哚普利、bl-20803、替洛隆、abmp、drb、阿的平、10-羧基-9吖啶酮、cp-28888、溴匹立明和咪喹莫特。

本发明还涉及使用能够表达ifn-β的多核苷酸或者增加ifn-β在肺气道中内源性表达的药剂。这种多核苷酸可以优选是能够指导ifn-β表达的载体或诱导支气管和/或肺泡上皮中的ifn-β的药剂形式。生成的ifn-β或药剂则可以具有治疗效应(“基因疗法”)。多核苷酸可以编码上述ifn-β的形式的任何一种，包括其变体、片段和嵌合蛋白。编码ifn-β的多核苷酸可以包括人类序列(seqidno:1或3)或天然存在的序列变体，例如，由非人类物种表达的变体。而且，编码ifn-β的多核苷酸包括与seqidno:1或3不同但是不一定是天然存在的序列。就seqidno:1或3的氨基酸序列的全长而言，基于核苷酸同一性，变体优选与该序列至少80％同源。更优选地，基于核苷酸同一性，多核苷酸在整体序列上与seqidno:1或3的核苷酸至少85％或90％且更优选至少95％、97％或99％同源。在40或更多、例如60、80、100、120、140或160或更多的连续核苷酸段上存在至少80％、例如至少85％、90％或95％的核苷酸同一性(“严格同源性”)。可以如上文讨论的确定同源性。多核苷酸可以包括dna或rna，但优选包括dna。它们还可以是在其中包含合成或修饰核苷酸的多核苷酸。许多不同类型的多核苷酸修饰是本领域已知的。这些包括磷酸甲酯和硫代磷酸甲酯骨架，在分子的3'和/或5'末端添加吖啶或聚赖氨酸链。对于本发明目的，要理解，本文描述的多核苷酸可以通过本领域可用的任何方法来修饰。可以重组地、合成地或通过本领域技术人员可用的任何方式生成多核苷酸，例如dna多核苷酸。它们还可以通过标准技术来克隆。通常以分离和/或纯化的形式提供多核苷酸。一般使用重组方式，例如使用pcr(聚合酶链式反应)克隆技术，来生成多核苷酸。这包括为需要被克隆的所需基因的区域制备一对引物(例如，约15-30个核苷酸的引物)，使所述引物与从适合细胞获得的dna形成接触，在导致所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(例如，通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)并回收扩增的dna。可以将引物设计为含有适当的限制酶识别位点，使得可以将扩增的dna克隆进适合的克隆载体。尽管一般而言本文提到的技术是本领域公知的，可以具体参考sambrook等人,1989。如前文所述，优选地，多核苷酸在表达载体中使用，多核苷酸在表达载体中与控制序列可操作连接，所述表达载体能够提供编码序列在人肺气道中的表达。根据本发明使用的表达载体可以是常规用于基因疗法的任何类型的载体。它可以是作为裸dna或与一个或多个阳离子两亲化合物(例如，一个或多个阳离子脂质)复合(例如，以dna/脂质体形式)施用的质粒表达载体。可选地，可以采用病毒载体。之前已经描述了用于在人肺气道中表达治疗性蛋白的载体。例如，公布的国际申请wo01/91800(isisinnovationlimited)描述了为了这种目的的表达载体，包括人类泛素c启动子或其功能类似物。已经显示，人类泛素c启动子能够在小鼠气道中产生数周的高水平蛋白表达，因此被建议作为偏好启动子，用于许多呼吸道疾病的气道基因疗法。chow等人.proc.natl.acad.sci.usa1997；94:14695-14700中还描述了用于指导气道上皮中转基因表达的表达载体的实例。例如，此类表达载体可以经气道施用至鼻腔或气管。

可以适合气道递送的药物或药物组合物施用ifn-β、药剂或多核苷酸，所述药物或药物组合物通常还包含药学可接受的赋形剂。此类“赋形剂”一般指基本上惰性的材料，其是无毒的，并且不以有害的方式与组合物的其他组分相互作用。药学可接受的赋形剂包括但不限于液体，例如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油和乙醇。其中可以包括药学可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。尽管不要求，但是还优选的是，包含治疗剂的组合物或药物将含有用作稳定剂的药学可接受的载体，特别是用于肽、蛋白、多核苷酸或其他类似物质的稳定剂。还用作肽的稳定剂的适合载体的实例包括但不限于药物级的右旋糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、葡聚糖等。其他适合的载体包括但也不限于淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(peg)及其组合。还可能有用的是采用带电脂质和/或去污剂。适合的带电脂质包括但不限于磷脂酰胆碱(卵磷脂)等。去污剂通常是非离子的、阴离子的、阳离子的或两性的表面活性剂。适合的表面活性剂的实例包括例如和表面活性剂(unioncarbidechemicalsanaplastics,danbury,ct)，聚氧乙烯失水山梨糖醇，例如表面活性剂(atlaschemicalindustries,wilmington,de)，聚氧乙烯醚，例如brij，药学可接受的脂肪酸酯，例如硫酸月桂酯及其盐(sds)和类似材料。药学可接受赋形剂、载体、稳定剂和其他辅助物质的深入讨论可参见remingtonspharmaceuticalsciences(mackpub.co.,n.j.1991)。

例如，如美国专利号6,030,609所描述的，可以通过将冻干的ifn-β溶解于药学可接受的媒介物例如无菌蒸馏水或无菌生理盐水来配制适合气道递送ifn-β的组合物，任选添加一种或多种载体、稳定剂、表面活性剂或用于增强ifn-β活性剂效力的其他物质。

适合的组合物具有5至8、更优选5.5至7.5的ph。优选地，例如使用柠檬酸盐缓冲剂来缓冲组合物。

基于us6,030,609中公开的配方的rentschler组合物具有6.5的ph和290mosm/kg的渗透压。优选作为在一次性玻璃注射器中提供的无菌、澄清且无色的即用型喷雾水溶液来提供该组合物。

除了活性成分以外，组合物优选包含缓冲系统以使ph维持在5和8之间，更优选5.5和7.5之间，特别是6.5。组合物还优选包含抗氧化剂，例如dl-甲硫氨酸。

优选的组合物包含：

可以借助能够将活性成分的细颗粒递送至下呼吸道或气道的吸入装置方便地将包含治疗有效量的本文描述的ifn-β、药剂或多核苷酸的组合物递送至肺气道。通常，活性成分颗粒将具有1-10微米的质量中值直径。适合的吸入装置包括干粉吸入(dpi)装置、加压计量剂量吸入器(pmdi)和气雾剂喷雾器。

通常，吸入装置将产生具有如使用malvernmasterizers确定的粒度的气雾剂，具有1-10微米、优选3-8微米的质量中值直径，其中直径低于5微米的质量百分比是25-80％、优选30-65％。适合的喷雾器是i-neb装置，一种由philipsrespironics生产的ce标志的喷雾器。

适合的有效量可以通过适合的临床测试来确定，并且会随着例如所施用或诱导的ifn-β的活性而改变。例如，可以微克量施用ifn-β、药剂或多核苷酸。

以与剂型相容的方式和以有效实现预期效应的量将它们施用给待治疗的受治疗者。根据待治疗的受治疗者，每剂待施用的量可以是0.1μg至500μg，例如1至50μg。

治疗通常持续5-7天，如果症状持续则可以继续至14天。治疗可以每隔一天一次至一天数次提供。优选地，治疗以每天一次提供。

ifn-β、药剂或多核苷酸可以单独施用或者与另一治疗性化合物同时、顺序或分别地联合施用。具体地，ifn-β、药剂或多核苷酸可以与用于治疗呼吸道疾病的治疗性化合物或抗病毒剂联合施用给个体。ifn-β、药剂或多核苷酸和其他治疗性化合物可以配制为相同或不同的组合物。

在一个实施方案中，ifn-β、药剂或多核苷酸与吸入型皮质类固醇联合施用给患有哮喘的个体。

在另一实施方案中，ifn-β、药剂或多核苷酸可以与吸入型神经氨酸酶抑制剂同时、顺序或分别施用。因此，在本发明的另一方面，提供了用于治疗经诊断患有在流感样疾病期间或之后发展的下呼吸道疾病(或症状)的个体的产品，包括用于同时、分别或顺序的下呼吸道施用的(i)选自(a)ifn-β、(b)增加ifn-β表达的药剂和(c)能够表达(a)或(b)的多核苷酸的第一药剂和(ii)吸入型神经氨酸酶抑制剂。优选地，这种产品将提供ifn-β与吸入型神经氨酸酶抑制剂例如扎那米韦的同时、分别或顺序施用。例如，上述第一药剂和吸入型神经氨酸酶抑制剂可以适合气雾剂递送至气道的单一药物组合物的形式提供，例如，所述气雾剂递送借助干粉吸入器、加压计量剂量吸入器或气雾剂喷雾器。

可选地，ifn-β、药剂或多核苷酸可以与口服神经氨酸酶抑制剂例如奥塞米韦同时、顺序或分别地施用。

可选地，ifn-β、药剂或多核苷酸可以与全身施用的神经氨酸酶抑制剂例如帕拉米韦同时、顺序或分别地施用。

在另一实施方案中，ifn-β、药剂或多核苷酸可以与吸入型流感病毒附着抑制剂同时、顺序或分别地施用。因此，在本发明的另一方面，提供了用于治疗经诊断患有在流感样疾病期间或之后发展的下呼吸道疾病(或症状)的个体的产品，包括用于同时、分别或顺序的下呼吸道施用的(i)选自(a)ifn-β、(b)增加ifn-β表达的药剂和(c)能够表达(a)或(b)的多核苷酸的第一药剂和(ii)吸入型流感病毒附着抑制剂。优选地，这种产品将提供ifn-β和流感病毒附着抑制剂例如唾液酸酶融合蛋白das181的同时、分别或顺序施用。例如，上述第一药剂和吸入型流感病毒附着抑制剂可以适合气雾剂递送至气道的单一药物组合物的形式提供。

在另一个实施方案中，ifn-β、药剂或多核苷酸可以与抗细菌抗生素同时、顺序或分别地施用。优选地，所述抗细菌抗生素通过吸入施用。

在另一个实施方案中，ifn-β、药剂或多核苷酸可以与抗真菌抗生素同时、顺序或分别地施用。优选地，所述抗真菌抗生素通过吸入施用。

小于5岁的儿童但特别是小于2岁的儿童、65岁年龄和更老的成人、怀孕妇女和患有并存病(例如，慢性肺病、神经系统和神经发育病症、心脏病、血液疾患、内分泌紊乱、肾脏疾患、肝脏疾患、代谢紊乱、恶性疾病和归因于疾病或药物治疗的免疫系统削弱)的那些人处于发展并发症的最大风险，导致住院并且具有最差的结果，并且代表了本发明的特定目标群体。例如年龄超过60岁的老年人个体是特定的目标群体，罹患哮喘和/或copd的患者也是。

之前从未暴露于ili的患者也是风险群体。

实施例1

以下实施例中示例说明了外源性ifn-β在确立的下呼吸道感染的体外模型中抑制a型流感病毒感染的能力。

概要

在流感样疾病(ili)期间或之后发展的下呼吸道疾病(或症状)常常由于病毒感染从上呼吸道蔓延至下呼吸道而被加剧。而且，延长的症状和住院患者延长的住院时间与下气道中持续的病毒脱落有关。使用人类肺支气管上皮细胞(人类中流感复制的重要部位)，我们开发了确立的下呼吸道a型流感病毒感染的模型。考察了ifn-β在该模型中的效应。

方法

细胞培养和感染方案

在含有glutamax(invitrogen)、10％胎牛血清(fbs)(invitrogen)、青霉素(50u/ml)和链霉素(50μg/ml)(invitrogen)的最小必需培养基(mem)中培养人肺支气管上皮(hbe)细胞。将hbe细胞以1.5x10⁵/孔、传代41-49铺板于24孔板。大约60-70％汇合时，在减少血清的培养基(含有glutamax(invitrogen)和0.75-1％fbs(invitrogen)的mem)中培养细胞24小时。在37℃下用活化的流感病毒株(a型流感病毒/wsn/33(h1n1)(retroscreen))以0.0001moi感染细胞。一小时之后，通过洗涤去除未结合的病毒。添加减少血清的培养基并在37℃下培养细胞另外4天。在病毒感染后48小时，用1000iu/ml的人类ifn-β1a(rentschler)处理细胞。开始ifn-β治疗后，每24小时重复剂量。

确定流感阳性细胞百分比的流式细胞术

在感染后24、48、72和96小时收集细胞培养基并在-80℃贮存。在感染后24、48、72和96小时，用胰蛋白酶处理细胞，计数，并在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中洗涤。取出多达2x10⁵细胞用于流式细胞术分析。将细胞以400g离心并弃掉上清液。在二甲亚砜(dmso)(500μl)中重构活/死细胞染料(molecularprobes)并在pbs中1:100稀释。将稀释的活/死细胞染料(100μl)与细胞在室温下孵育30分钟。将细胞在pbs中洗涤，以400g离心并弃掉上清液。每管添加250μlcytofix/cytoperm(bdbiosciences)，使细胞在4℃下静置20分钟。通过在500g离心，用2mlperm/wash(bdbiosciences)溶液洗涤细胞两次。第二次洗涤之后，将细胞重悬于100μlperm/wash溶液并在室温下静置15分钟。将抗a型流感病毒基质蛋白抗体(serotec)在perm/wash溶液中稀释至2.5μg/ml，并向细胞添加100μl，在室温下持续30分钟。通过在500g离心，用2mlperm/wash溶液洗涤细胞两次。在perm/wash溶液中稀释抗小鼠igg-fitc(sigma)至5μg/ml，并向细胞添加100μl，在室温下避光持续30分钟。通过在500g离心，用2mlperm/wash溶液洗涤细胞两次。在perm/wash溶液中重悬细胞并使用facscalibur(bdbiosciences)和cellquestpro软件通过流式细胞术分析。随后使用winmdi软件分析数据。

确定病毒脱落的空斑测定法

在含有glutamax(invitrogen)、10％fbs(invitrogen)、非必需氨基酸(invitrogen)和青霉素/链霉素(invitrogen)的mem中培养madindarby犬肾(mdck)细胞。将mdck细胞以1.5x10⁵/孔、传代25-30铺板于12孔板。达到100％汇合时，用pbs洗涤细胞两次。在无血清培养基(dmem(invitrogen)、青霉素/链霉素(invitrogen)、l-谷氨酰胺(invitrogen)、非必需氨基酸(invitrogen)和丙酮酸钠(invitrogen))中稀释在感染实验期间收集的细胞培养基，以产生1:10至1:10⁶之间十倍稀释的稀释范围。向双重孔添加稀释的细胞培养基(200μl)。在37℃下孵育孔板1小时。吸出病毒并用pbs洗涤细胞。制备覆盖层培养基(100ml的10倍浓缩的mem(invitrogen)、20ml7.5％碳酸氢钠(sigma)、10ml1mhepes(fluka)、28ml7.5％牛血清白蛋白(bsa)级分v(sigma)、5ml1％deae-葡聚糖(sigma)、20ml青霉素/链霉素(invitrogen)、10ml200mm谷氨酰胺(invitrogen)、507mld.h2o)，并添加17.5ml至12.5μl1mg/ml胰蛋白酶和7.5mlavicel悬液(4.8gavicel(fmcbiopolymer)于186mld.h2o中)，所述胰蛋白酶经l-(甲苯磺酰氨基-2-苯基)乙基氯甲基酮处理(trtpck胰蛋白酶)(worthingtonbiochemicalcorp.)。通过翻转混合覆盖层培养基并每孔添加1ml。在无移动或摇动下，将孔板孵育2天。吸出覆盖层培养基，并用pbs洗涤细胞两次。添加结晶紫溶液(0.5ml)(0.65g结晶紫(sigma)、25ml甲醛(sigma)、25ml100％乙醇(sigma)、450ml1xpbs(5dulapbs片(sigma)+500mld.h2o))，室温下持续30分钟。去除结晶紫，将孔板在水中洗涤。使孔板干燥并计数空斑。

进行了三次独立实验。提供了来自第一实验的数据和汇总数据。

数据分析

使用graphpadprism软件分析数据。

结果

在该模型中，流式细胞术分析表明，5％至40％的细胞在48至96小时之间被感染(参考图1a和1b)，这类似于在峰值感染的临床环境中报道的高效感染细胞水平(baccam等人.(2006)journalofvirology,80:7590-7599)。相应地，该时期还与我们模型中病毒脱落的最高水平相关(图2a和2b)。

模拟确立感染的治疗，在感染后48小时用ifn-β治疗细胞，导致感染细胞比例和病毒脱落的大大减少(图1a、1b、2a和2b)。认为超过10倍的病毒载量的减少是临床上相关的(barnett等人.(2000)antimicrob.agentschemother44:78-87)。

结论

这些结果显示，ifn-β治疗具有改变肺中确立的流感病毒感染过程并因此减少在确立的流感样疾病(ili)期间或之后发展的呼吸道疾病的潜力。因为老年患者和罹患哮喘和/或copd的那些患者很可能在需要时难以产生ifn-β，本文描述的用途和方法对于这样的易感群体特别有用。

体内研究：

引言

流感样疾病的主要并发症是在病毒蔓延至下呼吸道之后发展的病毒性肺炎。

人类ifn-β在其生物学活性方面具有高度的物种特异性。食蟹猕猴是适合研究人类ifn-β的效应的物种。已经显示人类ifn-β将食蟹猕猴血细胞和人类血细胞中的干扰素敏感性抗病毒基因粘液病毒抗性蛋白1(mxa)(图3)和2’-5’寡腺苷酸合成酶(2’-5’oas)(图4)上调至相同程度。而且，在体外研究中，人类ifn-β保护食蟹猕猴细胞免受流感病毒感染(图5)。

使用食蟹猕猴开发了针对高度致病性a型流感病毒(h5n1)(rimmelzwaan等人.(2001)jvirol.75:6687-91)和2009年流行性a型流感病毒(h1n1)(herfst等人.(2010)vet.pathol.47:1040-7)的下呼吸道疾病的临床前模型。这些模型已经预测了神经氨酸酶抑制剂在感染之前施用时对抗流感病毒的临床效力。

本研究考察了肺递送的ifn-β在流感病毒诱导的下呼吸道疾病的类似食蟹猕猴模型中的效应。攻击病毒株是a/印度尼西亚/5/05(h5n1)和a/荷兰/602/2009(流行性h1n1)，已经显示两者在下呼吸道中复制并引起显著的肺病变(herfst等人.(2010)vet.pathol.47:1040-7；rimmelzwaan等人.(2001)jvirol.75:6687-91)。

本研究包括两个阶段。在第一阶段，通过显示在通过支气管-肺泡灌洗液(bal)获得的肺细胞中上调ifn-β依赖性抗病毒标志物，建立了吸入型ifn-β的成功递送。临床研究中的类似数据支持了吸入型ifn-β作为抗病毒疗法的进一步发展。在第二阶段，考察了使用肺递送的ifn-β的预防性和治疗性治疗对流感引起的肺病变和肺病毒载量的效应。

第1阶段：ifn-β成功递送至肺的证实

简言之，通过喷雾器将溶液形式的ifn-β两次施用至食蟹猕猴的肺。在每剂之前和之后收集bal。使用定量pcr方法确定ifn-β依赖性抗病毒标志物(mxa，2’-5’oas和干扰素γ诱导的蛋白10kda(ip-10)在bal细胞中的基因表达。将上调水平与临床研究中产生的数据相比较，以选择下一阶段的剂量。研究方案和方法的更多细节在下文描述。

在施用吸入型ifn-β之前7天，年龄大约3岁的五只雄性食蟹猕猴用氯胺酮-dormitor麻醉，收集血液和支气管-肺泡灌洗液(bal)并测量其体重。bal涉及用10ml磷酸盐缓冲盐水冲洗肺，预想回收大约5ml。在每次，将bal样品分成上清液和细胞级分。在rlt缓冲液(qiagen)中溶解细胞级分并使用定量pcr方法分析ifn-β依赖性抗病毒生物标志物mxa、2’-5’oas和ip-10。

在第0天，在麻醉下，收集血液，测量体重，并将3ml吸入型ifn-β(rentschler)递送至每只猕猴。使用与小儿面罩(philipsrespironics，零件号hs81110eu-001)偶联的i-neb装置(philipsrespironics)通过吸入来递送ifn-β喷雾溶液。设计i-neb装置程序以在开启时产生连续的气雾剂流。

在第1天，在麻醉下，收集血液和bal并测量体重。

在第8天，在麻醉下，收集血液，测量体重，并将1.5ml或4.5ml吸入型ifn-β递送至每只猕猴。选择的ifn-β的剂量将取决于第1剂获得的结果。

在第9天，在麻醉下，收集血液和bal并测量体重。

第2阶段：使用肺递送的ifn-β的预防性和治疗性治疗对流感引起的肺病变和肺病毒载量的效应

本研究第2阶段包括三个治疗组：第1组接受安慰剂；第2组在用攻击病毒感染之前24小时接受吸入型ifn-β治疗，并且随后每天用ifn-β治疗；第3组在用攻击病毒感染之后4小时接受吸入型ifn-β治疗，并且随后每天用ifn-β治疗。治疗组在感染后4小时施用，因为在该模型中，相对高剂量的病毒被直接施用至下呼吸道以模拟确立的下气道疾病。样品大小计算指示，要求每组9只动物以观察治疗动物和对照(未治疗)动物之间病毒滴度的1.5对数差异的治疗效应。基于使用神经氨酸酶抑制剂的临床研究结果，认为这是临床上显著的(barnett等人.(2000)antimicrob.agentschemother.44:78-87)。下面显示了研究方案：

由于研究中包括的动物数目，使用了区块设计。分三个区块进行研究，每个区块由9只动物组成，从每个治疗组取三只动物。

病毒攻击之前14天，在被证实为循环流感病毒血清阴性的9只食蟹猕猴的腹腔中配备预先程序化的温度传感器，并在氯胺酮和dormitor麻醉下收集血液。

在第-1天，在从手术完全恢复之后，所有动物被麻醉、称重并收集样品(用于获得血清的全血和鼻/喉拭子)。在麻醉下给属于组1和组2的动物施用喷雾型安慰剂或ifn-β(以第1阶段确定的剂量)。

在第0天，组1和组2的动物用如上所述的喷雾型安慰剂或ifn-β治疗。然后用流感病毒(10⁵tcid50h5n1或10⁷tcid50h1n1)气管内攻击所有动物。气管内攻击之后4小时，组3动物被施用如上所述的喷雾型ifn-β。

在第1、2、3和4天，所有动物被麻醉、称重并收集样品(用于获得血清的全血和鼻/喉拭子)，并用如上所述的喷雾型安慰剂或ifn-β治疗。

在攻击后5天，所有动物被麻醉、称重并通过放血而安乐死。进行全身宏观病理(fullgrosspathology)，检查所有的主要器官并描述肺病变。从所有动物收集样品，包括：用于获得血清的全血、鼻/喉拭子和来自右肺的组织。整个实验收集的拭子和右肺切片经受定量pcr和病毒滴定以确定病毒载量。左肺用10％福尔马林膨胀用于随后的组织病理学评价。

主要终点是肺病毒载量和肺病理评分。每日采集的喉拭子会给出病毒感染的时间过程的指示。阳性数据，即特别是在用ifn-β治疗性治疗之后肺病毒载量或肺病变的减少，将支持用于治疗由流感引起的下呼吸道疾病的吸入型ifn-β的开发。

序列表

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