本发明涉及护肤品
技术领域：
，具体涉及一种干细胞护肤组合物及其制备方法和使用方法。
背景技术：
：随着生活水平的不断提高，人们对健康尤其是皮肤的保养越来越重视。皮肤组织是人体最大组织器官，覆盖在人体表面，阻隔自然界一切有害物质对生命机体产生的损害作用。但是，随着年龄的增加，皮肤组织器官的功能逐渐老化，从美学观点看，严重影响人们对生命的热情；从生理学的角度看，影响人体内部器官的有效保护。于是各种各样的美容护肤品应运而生。干细胞是具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。除具有高度分化潜能外，干细胞还可分泌多种细胞因子，包括表皮生长因子(egf)、血小板源生长因子(pdgf)、转化生长因子(tgf)、碱性成纤维细胞生长因子(b-fgf)、胰岛素样生长因子(igf)和神经生长因子(ngf)等等。这些细胞因子可以促进人皮肤的新陈代谢、促进皮肤再生修复、延缓皮肤衰老，使皮肤重新恢复弹性和光泽。但目前相关的美容护肤品，多是一种或两种细胞因子添加到美容护肤品中。皮肤的细胞因子修复是一个系统的复杂的调节过程，一种或两种细胞因子不能满足皮肤修护、细胞更新的需求，多种因子联合应用才能促进表皮更新。而且这些因子因没有修饰，不能透过皮肤，实际上并不能真正起到作用。技术实现要素：本发明的目的是提供一种干细胞护肤组合物及其制备方法和使用方法，以解决现有技术的不足。本发明采用以下技术方案：一种干细胞护肤组合物，由a组分和b组分组成，a组分1-800质量份，包括干细胞提取物、血清白蛋白、甘露醇、arg9透膜肽冷冻干燥得到，其中，干细胞提取物为培养干细胞后的干细胞培养基和培养的干细胞的冻融裂解物；b组分按质量份数计，包括：使用时，将a组分和b组分进行混合。进一步地，血清白蛋白为干细胞提取物总质量的1％，甘露醇为干细胞提取物总质量的5％，arg9透膜肽为干细胞提取物总质量的0.05％。进一步地，干细胞提取物制备包括干细胞本源表达、质粒电转介导的干细胞因子表达、慢病毒介导的干细胞因子表达或者腺病毒介导的干细胞因子表达，其中，质粒电转介导的干细胞因子表达、慢病毒介导的干细胞因子表达或者腺病毒介导的干细胞因子表达制备时，将干细胞因子与透膜肽基因系列融合构建新的融合基因后再进行后续步骤，细胞因子与透膜肽基因系列可通过氨基酸系列在密码子表中查询。进一步地，干细胞包括动物源或人源的脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、造血干细胞、神经干细胞或肝干细胞。进一步地，透膜肽种类与氨基酸系列包括：透膜肽类型1：tat：rkkrrqrrr；透膜肽类型2：vp-22：daatargrgrsaasrpterpraparsasrprrpvd；透膜肽类型3：ntp：rqikiwfqnrrmkwkk；透膜肽类型4：transportan：gwtlnsagyllgkinlkalaalakkil；透膜肽类型5：pep-1：ketwwetwwtewsqpkkkrkv；透膜肽类型6：mpg：galflgflgaagstmgawsqpkkkrkv；透膜肽类型7：map：klalklalkalkaalkla：透膜肽类型8：kala：weaklakalakalakhlakalakalkacea；透膜肽类型9：pptg20：glfrallrllrslwrlllra；透膜肽类型10：arg9：rrrrrrrrr；或透膜肽类型11：hct(9-32)：lgtytqdfnkfhtfpqtaigvgap。进一步地，质粒电转介导的干细胞因子表达所用载体包括egfp-n1、n-p3xflag-cmv或pcdna3.1；慢病毒介导的干细胞因子表达所用载体包括phblv-cmvie-puro、plvx-tre3g、慢病毒包装系统plvx-ac－puro、pspax2、pmd2.g、ppack-h1-gag、ppack-h1-rev、ppack-h1-vsvg、plp1、plp2、plp-vsvg、pmdlg/prre、pres-rev、pcmv-vsvg、pcmv-deltar8或pcmv-vsvg；腺病毒介导的干细胞因子表达所用载体包括pdc315、pdc316、pdc311、pdc312、admaxtm腺病毒载体系统或admaxtmhi-iq腺病毒载体系统。进一步地，血清白蛋白包括人源血清白蛋白，动物源血清白蛋白，重组人源血清白蛋白，或重组动物源血清白蛋白。进一步地，鞣花酸来源包括红石榴。上述干细胞护肤组合物的制备方法，包括如下步骤：步骤1、将培养干细胞后的干细胞培养基、培养的干细胞的冻融裂解物、血清白蛋白、甘露醇、arg9透膜肽混合冷冻干燥，得到冻干粉；步骤2、将甘油、柠檬酸钠、鞣花酸、维生素e、水混合均匀，得到溶媒液；步骤3、将步骤1制备的冻干粉和步骤2得到的溶媒液分别包装，使用时再混合。上述干细胞护肤组合物的使用方法，包括如下步骤：将冻干粉和溶媒液混合均匀，轻晃至冻干粉全部溶化，之后进行使用；早晚各一次。本发明的有益效果：1、本发明基于皮肤代谢的研究与对皮肤衰老的分析，选择合适的组分、用量，诸多因子协同作用，重组皮肤深层弹性结构和功能，使老化变形、变硬的胶原讯速水解，重建胶原平衡，促使肌肤皱纹迅速浅化，令肌肤尽显白里透红的健康色彩。2、本发明将细胞因子的基因与透膜肽基因系列融合，并表达带有透膜肽的新的融合蛋白，同时配合人工合成的arg9透膜肽，可有效实现将这些因子透过皮肤，从深层增强皮肤的新陈代谢，延缓皮肤衰老，达到美白、预防或改善皮肤斑和皱纹、去痘、防过敏的目的。3、本发明活性成分(干细胞提取物和血清白蛋白)以冻干状态保存，使用时与溶媒液配合。作为蛋白的细胞因子，在冻干状态下，活性保持时间长，使用时与溶媒液混合，将其溶解，促进吸收。4、本发明干细胞护肤组合物不添加任何化学有害物质、重金属与激素，不会出现因护肤品自身功效成分对皮肤的渗透造成二次损伤(化学有害物质、重金属与激素慢性渗入皮肤导致使用一定时间后皮肤变薄、长斑、皱纹增加等)。本发明主要通过增强皮肤自身代谢能力，延缓皮肤衰老，达到美白、预防或改善皮肤斑、皱纹、去痘、防过敏的目的，长期使用无任何副作用。适合所有年龄段的男性与女性护肤。具体实施方式下面结合实施例对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。一种干细胞护肤组合物，由a组分和b组分组成，a组分1-800质量份，包括干细胞提取物、血清白蛋白、甘露醇、arg9透膜肽冷冻干燥得到，其中，干细胞提取物为培养干细胞后的干细胞培养基和培养的干细胞的冻融裂解物；血清白蛋白为干细胞提取物总质量的1％，甘露醇为干细胞提取物总质量的5％，arg9透膜肽为干细胞提取物总质量的0.05％；b组分按质量份数计，包括：使用时，将a组分和b组分进行混合。干细胞提取物制备包括干细胞本源表达、质粒电转介导的干细胞因子表达、慢病毒介导的干细胞因子表达或者腺病毒介导的干细胞因子表达等，其中，质粒电转介导的干细胞因子表达、慢病毒介导的干细胞因子表达或者腺病毒介导的干细胞因子表达制备时，将干细胞因子与透膜肽基因系列融合构建新的融合基因后再进行后续步骤，细胞因子与透膜肽基因系列可通过氨基酸系列在密码子表中查询。干细胞包括动物源或人源的间充质干细胞、脂肪干细胞、神经干细胞或肝干细胞等。透膜肽种类与氨酸酸系列包括但不限于：透膜肽类型1：tat：rkkrrqrrr；透膜肽类型2：vp-22：daatargrgrsaasrpterpraparsasrprrpvd；透膜肽类型3：ntp：rqikiwfqnrrmkwkk；透膜肽类型4：transportan：gwtlnsagyllgkinlkalaalakkil；透膜肽类型5：pep-1：ketwwetwwtewsqpkkkrkv；透膜肽类型6：mpg：galflgflgaagstmgawsqpkkkrkv；透膜肽类型7：map：klalklalkalkaalkla：透膜肽类型8：kala：weaklakalakalakhlakalakalkacea；透膜肽类型9：pptg20：glfrallrllrslwrlllra；透膜肽类型10：arg9：rrrrrrrrr；或透膜肽类型11：hct(9-32)：lgtytqdfnkfhtfpqtaigvgap。血清白蛋白包括人源血清白蛋白，动物源血清白蛋白，重组人源血清白蛋白，或重组动物源血清白蛋白。鞣花酸来源包括红石榴等。上述干细胞护肤组合物的制备方法，包括如下步骤：步骤1、将培养干细胞后的干细胞培养基、培养的干细胞的冻融裂解物、血清白蛋白、甘露醇、arg9透膜肽混合冷冻干燥，得到冻干粉；步骤2、将甘油、柠檬酸钠、鞣花酸、维生素e、水混合均匀，得到溶媒液；步骤3、将步骤1制备的冻干粉和步骤2得到的溶媒液分别包装，使用时再混合。上述制备的干细胞护肤组合物的使用方法，包括如下步骤：将冻干粉和溶媒液混合均匀，轻晃至冻干粉全部溶化，之后进行使用；早晚各一次。先用清水或洗面奶清洁皮肤，取适量产品轻抹于皮肤表面，轻拍直至全部吸收。早上使用半小时后再使用其它化妆品，晚上使用后建议不再使用其它护肤品。实施例1采用干细胞本源表达1、冻干粉的制备：1.1干细胞培养：将复苏好的干细胞10000000个与15毫升干细胞培养基接种于t75的细胞培养瓶，在5％co2和37℃条件下培养48－72小时。其中，干细胞培养基配方如表1所示。表1试剂贮备液浓度货号终浓度100ml培养基所需的量knockouttmdmemctstm—a128611x82.75mlknockouttmsrxenofreectstm—1261815％15mlglutamaxtm-ictstm200mma128602mm1mlneaa10mm111400.1mm1mlbfgf10μg/ml132568ng/ml80μl2-mercaptoethanol55mm219850.1mm182μl1.2收集和处理：收集培养干细胞后的干细胞培养基，另存于无菌容器中备用；用无菌生理盐水将培养的干细胞洗两次，加1毫升胰蛋白酶，37度处理5分钟，吸出消化的干细胞，收集到2毫升的ep管中，56度处理10分钟，再冷冻于-80度冰箱30分钟，再置于56度水浴直至溶化，如此反复三次(冷冻、溶化)。在12000转/分钟离心10分钟，收集上清并与上述无菌容器中的干细胞培养基混合，在10k的分子筛中浓缩十倍以上，加入5％的甘露醇，1％的血清白蛋白、0.05％的arg9透膜肽，混合均匀，再置于-80度冰箱过夜，在冷冻干燥仪中冷冻干燥，得到冻干粉。2、将4×106ug甘油、2×106ug柠檬酸钠、15ug鞣花酸、10ug维生素e、15×106ug水混合均匀，得到溶媒液。3、步骤1制备的冻干粉取400ug单独包装，步骤2制备的溶媒液单独包装。4、使用时，将冻干粉和溶媒液进行混合。实施例2采用质粒电转介导的干细胞因子表达1、冻干粉的制备：1.1分别将表皮生长因子(egf)、血小板源生长因子(pdgf)、转化生长因子(tgf)、碱性成纤维细胞生长因子(b-fgf)、胰岛素样生长因子(igf)和神经生长因子(ngf)、人角质细胞生长因子(kgf-2)、白介素-1受体拮抗剂(il-1r)基因5’端分别与透膜肽tat基因系列融合，并将融合后的基因分别克隆到egfp-n1载体。用于干细胞因子表达的载体不限于egfp-n1载体，包括其它能在动物细胞中表达的载体如n-p3xflag-cmv，pcdna3.1等。1.2、干细胞电转化1.2.1转化前干细胞的准备：(1)贴壁细胞干细胞转移至75cm2细胞培养瓶培养，至转化前使细胞汇合度约50-70％。此时细胞数约为2-10x106，而每次电转需约1-10x105个细胞。(2)12mlpbs缓慢冲洗细胞。(3)吸出pbs，用0.4ml胰蛋白酶消化细胞。(4)加入10ml含血清的培养基，中和胰酶。(5)400x离心5-7min收集细胞。(6)用pbs、hepes、无血清培养基等重悬细胞，使之密度为1-5x106cell/ml。1.2.2电转化：(1)设置电转程序，或选择预设程序。(2)将上述质粒加入电转杯，所需质粒量根据细胞不同而定，一般起始浓度为10-50ug/ml。(3)向电击杯中加入细胞，颠转电击杯使之混匀。细胞浓度和体积的使用建议请参照表2。表2(4)将电击杯放入电击槽中，脉冲电击一次。(5)脉冲后，将细胞转移至已含0.5ml干细胞培养基的孔中(6)轻轻晃动孔板，使细胞均匀分布，培养箱培养。(7)电转24-48小时后，参照实施例1收集和处理，得到冻干粉。2、将2.5×106ug甘油、0.1×106ug柠檬酸钠、0.1ug鞣花酸、0.1ug维生素e、10×106ug水混合均匀，得到溶媒液。3、步骤1制备的冻干粉取1ug单独包装，步骤2制备的溶媒液单独包装。4、使用时，将冻干粉和溶媒液进行混合。实施例3采用慢病毒介导的干细胞因子表达1、冻干粉的制备：1.1分别将表皮生长因子(egf)、血小板源生长因子(pdgf)、转化生长因子(tgf)、碱性成纤维细胞生长因子(b-fgf)、胰岛素样生长因子(igf)和神经生长因子(ngf)、人角质细胞生长因子(kgf-2)、白介素-1受体拮抗剂(il-1r)基因5’端分别与透膜肽tat基因系列融合，并将融合后的基因分别克隆到phblv-cmvie-puro载体。共获得八个表达载体质粒，分别命名为phblv-cmvie-egf，phblv-cmvie-pdgf，phblv-cmvie-tgf，phblv-cmvie-b-fgf，phblv-cmvie-igf，phblv-cmvie-ngf，phblv-cmvie-kgf-2，phblv-cmvie-il-1r。慢病毒表达载体不限于phblv-cmvie-puro，还包括其它慢病毒表达载体如plvx-tre3g，慢病毒包装系统plvx-ac-puro、pspax2、pmd2.g、ppack-h1-gag、ppack-h1-rev、ppack-h1-vsvg、plp1、plp2、plp-vsvg、pmdlg/prre、pres-rev、pcmv-vsvg、pcmv-deltar8、pcmv-vsvg等。1.2慢病毒包装：每个载体样品需要1×106个293t细胞，本方法中因有8个不同的表达载体质粒，共需包装8个不同的慢病毒，具体步骤如下：(1)、取1.5ml灭菌ep管，加入1.5μg包装混合质粒(pmd2.g和pspax2)和0.5μg表达质粒(phblv-cmvie-x，x代表不同上面八个基因)以及250μl的无血清optimem。轻柔混匀，室温孵育5min。(2)、取1.5ml灭菌ep管，取9μl脂质体2000l溶于250μl无血清opti-memi培养基中。轻柔混匀，室温孵育5min。(3)、将dna溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20min。(4)、用胰酶消化并记数293ft细胞。用含血清的dmem培养基重悬细胞。(5)、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入dna-脂质体复合物。(6)、将1ml重悬的293ft细胞(1×106个细胞/ml)加入到平板中。37℃co2孵箱中孵育过夜。(7)、移除含有dna-脂质体复合物的培养基，代之以dmem(含丙酮酸钠和非必须氨基酸)。(8)、转染后48-72h收获含病毒的上清。3000rpm离心20min，去除沉淀，上清用0.45um的微孔滤膜过滤。(9)、病毒上清-80℃贮存，以保存一年。包装出来的慢病毒对nih/3t3细胞达90％以上感染效率。1.3干细胞的感染与培养：贴壁细胞干细胞转移至八瓶75cm2细胞培养瓶培养，至转化前使细胞汇合度约50-70％。此时细胞数约为2-10x106。将3.2中收集到的八种慢病毒分别感染干细胞，加入1ml的慢病毒培养基以及1ml室温溶解的病毒液，终浓度为4ug/mlpolybere，第二天再次感染，将细胞放置于新鲜的干细胞培养基中培养48小时。1.4参照实施例1收集和处理，得到冻干粉。2、将6.5×106ug甘油、3×106ug柠檬酸钠、30ug鞣花酸、20ug维生素e、20×106ug水混合均匀，得到溶媒液。3、步骤1制备的冻干粉取800ug单独包装，步骤2制备的溶媒液单独包装。4、使用时，将冻干粉和溶媒液进行混合。实施例4采用腺病毒介导的干细胞因子表达1、冻干粉的制备：1.1、分别将表皮生长因子(egf)、血小板源生长因子(pdgf)、转化生长因子(tgf)、碱性成纤维细胞生长因子(b-fgf)、胰岛素样生长因子(igf)和神经生长因子(ngf)、人角质细胞生长因子(kgf－2)、白介素－1受体拮抗剂(il－1r)基因5’端分别与透膜肽tat基因系列融合，并将融合后的基因分别克隆到腺病毒载体pdc315中并命名为pdc315-egf、pdc315-pdgf、pdc315-tgf、pdc315-b-fgf、pdc315-igf、pdc315-ngf、pdc315-kgf-2、pdc315-il-1r。腺病毒表达载体包括pdc315、pdc316、pdc311、pdc312，以及admaxtm腺病毒载体系统与admaxtmhi-iq腺病毒载体系统等。1.2、分别将pdc315-egf、pdc315-pdgf、pdc315-tgf、pdc315-b-fgf、pdc315-igf、pdc315-ngf、pdc315-kgf-2、pdc315-il-1r与载体pbghloxp△e3通过lipo2fectamine2000共转染至293细胞。共转染后9～14天出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，应用qiaampdnabloodminikit提取重组腺病毒dna，经鉴定正确的增殖缺陷型腺病毒命名为pdc-egf、pdc-pdgf、pdc-tgf、pdc-b-fgf、pdc-igf、pdc-ngf、pdc-kgf-2、pdc-il-1r，进行大量扩增和纯化，并进行滴度测定。1.3、腺病毒对干细胞的感染贴壁细胞干细胞转移至八瓶75cm2细胞培养瓶培养，至转化前使细胞汇合度约50-70％。此时细胞数约为2-10x106。每一瓶分别感染pdc-egf、pdc-pdgf、pdc-tgf、pdc-b-fgf、pdc-igf、pdc-ngf、pdc-kgf-2、pdc-il-1r。加入干细胞培养基后培养72小时。1.4、参照实施例1收集和处理，得到冻干粉。2、将2.5×106ug甘油、3×106ug柠檬酸钠、10ug鞣花酸、10ug维生素e、10×106ug水混合均匀，得到溶媒液。3、步骤1制备的冻干粉取300ug单独包装，步骤2制备的溶媒液单独包装。4、使用时，将冻干粉和溶媒液进行混合。当前第1页12