雪松精油的应用的制作方法

本发明涉及化妆品领域，具体涉及雪松精油以及含雪松精油的复合物作为功效添加剂在皮肤外用剂尤其是化妆品中的使用。

背景技术

雪松是松科雪松属植物，学名：cedrusdeodara(roxb.)g.don，别名喜马拉雅雪松，原产喜马拉雅山脉西部海拔1000～4000m地带。在原产地高达75m，树冠圆锥形。产于亚洲西部、喜马拉雅山西部和非洲、地中海沿岸，雪松是常绿乔木，树冠尖塔形，大枝平展，小枝略下垂；叶针形，长8－60厘米，质硬，灰绿色或银灰色，在长枝上散生，短枝上簇生；10-11月开花，球果翌年成熟，椭圆状卵形，熟时赤褐色。雪松是世界著名的庭园观赏树种之一，具有较强的防尘、减噪与杀菌能力，也适宜作工矿企业绿化树种。

雪松的药疗用途的历史很久远，最早可以追溯到圣经时代。雪松木中含有丰富的精油，可用蒸馏的方法将其从木片或木屑中萃取出来。雪松精油的主要成分包含雪松醇及韦德醇，具有防腐、杀菌、利尿、调经、祛痰、杀虫及镇静等医疗功效，还有助于治疗关节炎、支气管炎、风湿及呼吸道问题,在古埃及时期，就被应用于宫廷美容。

雪松精油的收敛、抗菌特性可用于改善粉刺、毛孔阻塞和皮炎，还可以用来治疗头皮屑及皮疹，改善油性皮肤。

皮肤被覆盖于整个人体表面，与外界环境直接接触，除了保护机体免受外界各种因素的伤害外，又是反应全身健康状态的一面镜子。皮肤由表皮、真皮、皮下组织构成，并含有皮肤附属器、丰富的神经、血管、淋巴管及肌肉。在真皮和表皮的连接区域又称为基底膜带，不仅是一层结构模型，而且具有多方面的功能。基底膜是上皮细胞的支撑垫，在上皮细胞组织与结缔组织之间起结构连接作用，同时，还具有其他方面的作用。比如，基底膜作为细胞的选择性通过屏障，通常可以阻止结缔组织细胞与基底膜上的上皮细胞接触，但允许淋巴细胞、巨噬细胞和神经元突触穿越通过；此外，细胞的形态、细胞的极性、细胞代谢、质膜上蛋白质的分布、细胞存活、细胞的增殖分化、细胞迁移等许多生命现象，均与基底膜有着非常密切的关系。

真表皮连接区主要由胶原、层粘连蛋白、内联蛋白和渗滤素组成。胶原蛋白是一类密切相关，但基因不同的大分子，目前超过20种脊椎动物胶原蛋白已经确定。所有的胶原蛋白分子由三个多肽亚基，称为α链，还有人类基因组编码这些多肽在多达25个不同的基因。基因不同的胶原蛋白有特征性的组织分布。例如，最丰富的胶原蛋白如i型和iii型分布广泛，较少的胶原蛋白是ⅶ型胶原(colvii)，在真皮和表皮交界处。胶原蛋白起到的锚定作用，使真表皮细胞之间形成牢固的连接，缺乏相应的胶原蛋白或相关基因发生突变，可导致多种疾病，例如大疱性疾病等。

层粘连蛋白(laminin)是一类具有多种生物功能的非胶原糖蛋白，在基底膜的构建及表皮基底层细胞的黏附、生长、迁移、分化中扮演着至关重要的角色。层粘连蛋白由α、β和γ三条多肽链通过二硫键连接组装成“十”字或者“t”字型结构，分子中有一长臂(多肽链的羧基端通过二硫键聚合构成)和三条短臂(三条多肽链的氨基端形成)。分子中具有与ⅳ型胶原、细胞以及蛋白多糖结合的功能位点。目前，已经证实的层粘连蛋白组成多肽链有5条α链，3条β链和3条γ链，迄今为止，发现15种层粘连蛋白，其中，层粘连蛋白-5在基底膜网状结构构建以及介导基底层细胞在基底膜上的黏附、迁移中，比其他类型的层粘连蛋白作用更大。层粘连蛋白-5(laminin5)在上皮细胞胞浆内的粗面内质网中合成，先形成β3γ2二聚体，再形成α3β3γ2三聚体，在高尔基复合体内完成糖基化反应后分泌到细胞外的基底膜中，在基底膜的构建、修复以及调节基底层细胞的黏附、归巢等过程中有重要作用。

真表皮连接区将表皮基底细胞和位于其下层相连接的组织分隔开,向细胞提供结构支撑,并通过表皮-真皮间细胞因子调节，维持表皮-真皮间机能。随着年龄增长及紫外线照射可引起皮肤基底膜的重叠与断裂。其与表皮、真皮之间的连接、信息传递受到阻碍，可引发多种肌肤烦恼,甚至皮肤病变。因此表皮-基底膜-真皮三者之间的顺畅循环沟通,是构成健康肌肤的重要因素，可以将其称之为“黄金循环”。引起基底膜变化的因素多种多样，光老化是其中一个重要因素。由uv介导的光老化主要通过引起基底膜中主要成分水平的变化，导致基底膜功能的改变，从而影响表皮和真皮功能，造成三者之间“黄金循环”的不顺畅，引发各种肌肤问题。

因此，研究如何维持真表皮连接区的稳定性，对于保护皮肤的健康、延缓皮肤衰老具有重要意义。

目前并没有雪松精油或者其复合物用于改善或延缓皮肤衰老、维持真表皮连接区稳定性以及稳固皮肤基底膜结构的报道，也没有雪松精油或者其复合物提高层粘连蛋白表达或者促进胶原蛋白合成的报道。

技术实现要素：

本发明旨在将雪松精油用于皮肤外用剂，尤其是具有抗衰老功能的皮肤外用剂。

本发明还提供了一种含雪松精油的复合物，即雪松精粹复合物，并将这种复合物用于皮肤外用剂，尤其是具有抗衰老功能的皮肤外用剂。

雪松精油可作为活性成分，用于制备皮肤外用剂，尤其作为抗衰老的活性成分用于皮肤外用剂。

雪松精油具有维持真皮连接区完整性和稳定性的作用，也可以促进生成层粘连蛋白或胶原蛋白，可作为活性成分用于皮肤外用剂。

雪松精油增加表皮层厚度、提高laminin5或colvii的表达。

以雪松精油作为活性成分的皮肤外用剂具有维持真皮连接区完整性和稳定性的作用，也可以促进生成层粘连蛋白或胶原蛋白。此类皮肤外用剂能够增加表皮层厚度、提高laminin5或colvii的表达。

雪松精油的添加量为0.00001wt％～10wt％，优选为0.00005wt％～5wt％，更优选为0.0001wt％～3wt％。

本发明的一个优选实施例显示，雪松精油含量为0.0001wt％时，就能够显著增加表皮层厚度、提高laminin5和colvii的表达，从而提高皮肤机能，延缓皮肤衰老。

皮肤外用剂为化妆品，例如化妆水、精华液、乳液、乳霜、面膜、眼霜、柔肤水、爽肤水、洁面霜、防晒霜/乳、粉底液、唇膏等。皮肤外用剂含有可接受的载体。

所述的皮肤外用剂中含有其他具有保湿、抗衰老、抗过敏、防晒或美白功能的活性成分。

优选的，皮肤外用剂中含有冰川水。冰川水ph值为7.1～7.9，氘含量为130～140ppm，还含有如下组分：sr²⁺0.2～0.5mg/l、k⁺0.5～10.0mg/l、na⁺1.0～5.0mg/l、ca²⁺14.0～30.0mg/l以及mg²⁺2.0～10.0mg/l；并且冰川水中的溶解性总固体含量为60～150mg/l，不含溴酸盐。优选的，冰川水的ph值为7.2～7.6，更优选为7.4。优选的，冰川水为喜马拉雅冰川水。

优选的，皮肤外用剂中还含有分散剂。本领域技术人员可以根据需要选择分散剂的类型及含量，例如辛酸/癸酸甘油三酯等。

雪松精油以雪松木和/或树皮为原料，尤其是喜马拉雅雪松木和/或树皮为原料，通过水蒸气蒸馏法、冷浸法或二氧化碳超临界萃取法制备。

优选的提取方法为水蒸气蒸馏法或二氧化碳超临界萃取法。水蒸气蒸馏法步骤包括：

(1)将雪松木和/或树皮浸没在水中，95～110℃蒸馏并收集馏分；

(2)馏分经水油分离，取油相并干燥过滤，制得雪松精油。

步骤(2)中，为加快水油分离，可以在馏分中加入盐进行水油分离，例如氯化钠、硫酸钠或碳酸氢钠的固体和/或溶液；取油相用无水硫酸钠或无水硫酸镁干燥，并微孔过滤。

含雪松精油的复合物，即雪松精粹复合物，其组分包括雪松精油和冰川水，其中雪松精油与冰川水的重量比为1：10～40000，优选为1：100～30000，更优选为1：5000～25000。

冰川水ph值为7.1～7.9，氘含量为130～140ppm，不含溴酸盐，还含有如下组分：sr²⁺0.2～0.5mg/l、k⁺0.5～10.0mg/l、na⁺1.0～5.0mg/l、ca²⁺14.0～30.0mg/l以及mg²⁺2.0～10.0mg/l；并且冰川水中的溶解性总固体含量为60～150mg/l。优选的，冰川水的ph值为7.2～7.6，更优选为7.4。优选的，冰川水为喜马拉雅冰川水。

含雪松精油的复合物还含有分散剂，用于均质和稳定。本领域技术人员可根据常识选择分散剂的类型，以及雪松精油与分散剂的用量比。

分散剂可选用辛酸/癸酸甘油三酯。

优选的，雪松精油与分散剂用量比为1：1～500；更优选为1：10～200。

本发明的一个优选方案中，含雪松精油的复合物的组成为：喜马拉雅雪松精油和分散剂辛酸/癸酸甘油三酯总量0.5wt％、冰川水99.5wt％。其中，雪松精油与分散剂辛酸/癸酸甘油三酯重量比1：99。

含雪松精油的复合物通过以下方法制备：将雪松精油与分散剂混匀后，加入冰川水混合均匀。所获得的复合物可添加到皮肤外用剂中。

含雪松精油的复合物作为活性成分，可用于制备皮肤外用剂，尤其是具有抗衰老功能的皮肤外用剂。

含雪松精油的复合物为活性成分，可用于制备具有维持真皮连接区稳定性和完整性作用的皮肤外用剂。

或者，含雪松精油的复合物作为活性成分，可用于制备能够促进生成层粘连蛋白或胶原蛋白的皮肤外用剂。

或者，含雪松精油的复合物可作为活性成分，用于制备增加表皮厚度、提高laminin5或colvii表达的皮肤外用剂。

含雪松精油的复合物还可以添加其他保湿、抗衰老、抗过敏、防晒或美白功能的活性成分。

皮肤外用剂中，作为活性成分的雪松精粹复合物的添加量为0.01wt％～90wt％，优选为0.5wt％～60wt％；以雪松精油的重量计，含量为0.0001wt％时就可以产生显著效果。

皮肤外用剂为化妆品，包括化妆水、精华液、乳液、乳霜、面膜、眼霜、柔肤水、爽肤水、洁面霜、防晒霜、粉底液、唇膏等。

本发明首次提出，雪松精油或雪松精粹复合物能够明显增加表皮的厚度，并显著提高皮肤真表皮连接处的关键蛋白colvii蛋白和laminin5蛋白的表达，具有维持dej(真表皮连接处)结构完整、保护长期的稳定性的功能，可用于制备具有延缓衰老、抗老化功效、有助于促进表皮新生，束紧真表皮结构保持皮肤机能的皮肤外用剂，尤其是化妆品。

附图说明

图1为实施例3中，未处理组和样品组3d皮肤模型表皮厚度图像分析

图2为实施例4中，未处理组和样品组laminin5免疫荧光表达分析

图3为实施例4中，未处理组和样品组colvii免疫荧光表达分析

具体实施方式

实施例1喜马拉雅雪松精油的提取

采用水中蒸馏法提取喜马拉雅雪松精油的步骤为：

1.将采集的喜马拉雅雪松木原料切成1.5～5cm的小段，用清水冲洗后沥去水份，并保持木料的湿度，放入蒸锅内，加入蒸馏水至没过木料的高度；

2.将蒸锅置于蒸馏装置内加热；100～105℃下蒸馏2～3小时，收集馏分得到油水混合物；可直接向蒸锅内通入100～105℃水蒸汽加热或者用电加热套进行加热；

3.分离油水混合物：待油水混合物分层后取油相；

为加速油水分离，可向油水混合物中加入氯化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠的固体或饱和溶液，至油水混合物中盐浓度为0.1～0.2g/ml；

4.干燥过滤：油相中加入无水硫酸镁或无水硫酸钠去除水分，再用0.22μm微孔膜过滤，得到喜马拉雅雪松精油。

也可以用采用二氧化碳超临界法，从喜马拉雅雪松木材中提取喜马拉雅雪松精油。

层粘连蛋白(laminin)是真表皮连接区的主要蛋白，其中laminin5在基底膜的构建及表皮基底层细胞的黏附、生长、迁移、分化中有重要作用，且比其他类型的层粘连蛋白作用更大。vii型胶原是真表皮中含量较少的胶原蛋白，在真皮和表皮交界处起到的锚定作用，使真表皮细胞之间形成牢固的连接。

真表皮连接处是反应皮肤屏障作用的重要代表，因此为了验证雪松提取物的对保护真表皮连接处的功效，我们从样品处理后的3d皮肤模型的生长状况及laminin5和colvii两个抗体的荧光染色强度两个方面进行分析。

如果添加雪松精油后，皮肤模型的生长状态良好，且真表皮连接区的完整性优于未添加样品组，紧接着可通过laminin5和colvii免疫荧光染色的方式检测荧光表达量，如果相对于未添加雪松精油的对照组其表达量上升，即可反映雪松精油对保护真表皮连接区的完整性具有作用，进一步达到抗衰老的功效。

实施例2雪松精粹复合物的制备

将1g的雪松精油与99g辛酸/癸酸甘油三酯混合均匀；取0.5g上述混合物与99.5g的冰川水混匀，即为喜马拉雅雪松精粹复合物，初始浓度为1。在细胞学实验中，后续的功效评估检测均使用2％的喜马拉雅雪松精粹复合物。

冰川水取自喜马拉雅北坡多吉曲登尼玛泉，不含溴酸盐，ph＝7.4，氘含量133-134ppm，含有以下成分：sr²⁺0.2～0.5mg/l、k⁺0.5～10.0mg/l、na⁺1.0～5.0mg/l、ca²⁺14.0～30.0mg/l以及mg²⁺2.0～10.0mg/l；并且冰川水中的溶解性总固体含量为60～150mg/l。

实施例3masson染色观察表皮厚度

试验方法如下：

(一)3d皮肤模型的培养

将人成纤维细胞nhdf-p4代及人角质细胞nhek-p2代接种到皮肤支架中，依次经过真皮培养阶段、表皮浸没培养及气液相培养阶段，进行3d皮肤模型的构建；培养过程中，从在支架上接种成纤维细胞后的d3到最终d35，分别用普通培养基或者含有2％喜马拉雅雪松精粹复合物的培养基对皮肤模型进行培养。

喜马拉雅雪松精粹复合物按照实施例1的方法制成，主要由雪松精油和喜马拉雅冰川水组成，初始浓度为即为100％。

将用普通培养基培养的3d皮肤模型定义为未处理组(nt)，用含2％喜马拉雅雪松精粹复合物培养基培养的皮肤模型定义为样品组。

(二)表皮厚度分析

通过石蜡切片技术将皮肤模型切成切片。用苏木精工作液染色，再浸泡在蒸馏水中清洗，然后用碱性品红染液染色；用磷钨酸溶液清洗，再用亮绿染液染色，并用去离子水清洗。最后进行脱水封片。

表皮厚度分析的方法为：取样品组和未处理组各3张masson染色图片，每张取10个点记录表皮厚度值且3组观察值，取平均值之后进行分析，分析结果如图1。

在3d皮肤模型表皮厚度测定的试验中，如果添加了提取物的皮肤模型生长状况更好，表皮厚度高于未添加组，则可初步判断雪松精粹复合物对皮肤生长具有一定良好的功效，可以提高皮肤机能。

未处理组及样品组的masson染色图片结果显示，两组3d皮肤模型均有完整的真表皮连接处，且表皮部分分化正常均有基底层、棘层、颗粒层及角化层，说明构建3d皮肤模型成功且具有皮肤类似功能可用于分析；且由图1可知，加入2％喜马拉雅雪松精粹复合物的样品组3d皮肤模型的厚度比未处理组提高20％，表皮厚度有显著增加，说明加入2％喜马拉雅雪松精粹复合物可以提高皮肤机能，具有助于延缓皮肤衰老的作用。

实施例4laminin5和colvii的荧光表达

3d皮肤模型的培养方法同实施例2。

培养32天后，未处理组及样品组的3d皮肤模型的冷冻切片，用冷丙酮固定；pbs复水后，加入含血清的pbs溶液，室温静置1h。加入一抗laminin5抗体及colvii抗体于4℃过夜，次日加入对应的二抗alexafluro568anti-mouse及dapi室温避光孵育。染色，最后加入封片剂封片，荧光显微镜下观察、拍照。

在免疫荧光染色的试验中，如果相对于未添加提取物的细胞组，laminin5和colvii的荧光表达量明显升高，真表皮连接处更加完整，可推断雪松精粹复合物可以诱导真表皮连接区的laminin5和colvii的表达，有利于dej基底膜结构的稳固，最终起到有助于延缓皮肤衰老的作用。

结果如图2和图3。从免疫荧光分析可以看到，与未处理组相比，加入2％喜马拉雅雪松精粹复合物的样品组laminin5蛋白表达增加了20％，colvii表达提高了47％。层粘连蛋白laminin5和vii型胶原蛋白作为dej中的关键蛋白，帮助维持dej结构，稳定真表皮的连接，和衰老是密切相关的。图2、3的结果说明，喜马拉雅雪松精粹复合物能显著提高真表皮连接区中laminin5和colvii的表达，激活了关键蛋白，从而起到有助于延缓皮肤衰老的作用。

采用超临界二氧化碳萃取的喜马拉雅雪松精油，同样可以明显增加表皮厚度，显著提高真表皮连接区中laminin5和colvii的表达。

结论

通过实施例2和3构建培养3d皮肤模型发现，相较于未处理组，含有喜马拉雅雪松精油和喜马拉雅雪松精粹复合物的培养基可增强皮肤机能，使表皮厚度增加20％；并且可以显著提高皮肤真表皮连接处的关键蛋白表达，能使colvii蛋白表达增加47％，laminin5蛋白表达增加20％。说明喜马拉雅雪松精油和精粹复合物能够通过激活提高真表皮连接区关键蛋白laminin5及colvii的表达，从而促进真表皮连接处发挥提高皮肤机能的作用，有利于基底膜结构的稳固，提高皮肤机能的功效，从而最终起到有助于延缓皮肤衰老的作用。