本发明属药学领域，涉及群体感应多肽及其在制备肿瘤靶向诊治递药系统中的用途，具体涉及高度稳定且可靶向脑毛细血管内皮细胞、肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管和肿瘤细胞的群体感应多肽包括d构型多肽，及l构型多肽和稳定性d构型多肽的药物复合物和修饰的纳米递药系统，尤其涉及d构型多肽dwsw(d构型氨基酸序列dwdsdwdgdpdyds)，及l构型多肽lwsw(氨基酸序列为sypgwsw)和稳定性d构型多肽的诊断和治疗药物复合物、修饰的高分子载体材料及其所构建的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统，以及在制备脑肿瘤或外周肿瘤诊断和靶向治疗制剂中的应用。
背景技术
现有技术公开了肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病，死亡率高。外周肿瘤(尽管模型动物体内存在明显epr效应，但人类肿瘤epr效应差异极大，甚至不明显)存在血-肿瘤屏障(btb)，使药物分子和递药系统较难进入肿瘤组织，导致药物治疗不理想。脑部肿瘤存在血-脑屏障(bbb)、血-脑肿瘤屏障(bbtb)，限制了药物分子和递药系统进入脑内，使大多数抗肿瘤药物难以发挥作用，因而脑部肿瘤的治疗和预后远差于外周肿瘤。
近年来，主动靶向成为提高肿瘤组织药物靶向效率的重要策略。主动靶向策略主要针对肿瘤组织中高表达的受体或转运体，利用与特异性受体或转运体具有识别、结合能力的对应配体，将纳米递药系统递送至肿瘤组织或细胞中。常用的对应配体包括单克隆抗体、多肽、核酸适体、小分子化合物等。配体修饰后的纳米递药系统可通过屏障膜(如脑肿瘤的bbb和bbtb、外周肿瘤的btb)上特定受体或转运体而跨越屏障富集于肿瘤部位，再通过细胞表面受体或转运体与配体的特异性识别、结合、内化，将药物递送至肿瘤组织和细胞内，从而实现纳米递药系统对肿瘤的主动靶向目标。
群体感应现象是微生物间通过释放某些特定的小化学分子并感知其浓度变化来监测菌群密度并调控自身的某些生理行为从而适应周围环境的信号交流机制。有研究表明，一些特定的群体感应多肽能够与细胞之间产生相互作用。lwsw(l构型氨基酸序列为sypgwsw的多肽)是丙酮丁醇梭菌中提取出的群体感应七肽，能够选择性透过bbb；进一步研究还发现，该多肽除了可以选择性跨越bbb外，还能够靶向脑胶质瘤细胞和新生血管内皮细胞，但尚未见其在靶向递药方面的应用。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供新的群体感应多肽及其在制备肿瘤靶向诊治递药系统中的用途，具体涉及lwsw修饰的复合物及递药系统，并针对lwsw在体内易被酶降解而降低其肿瘤靶向能力的问题，提供d构型多肽靶向分子dwsw(d构型氨基酸序列dwdsdwdgdpdyds)，既提高wsw分子本身稳定性和肿瘤靶向效果，也改善其与复合物、与所修饰纳米递药系统对体内肿瘤靶向性能，更有效地实现对外周肿瘤和脑肿瘤靶向诊治的目标。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供群体感应多肽及其药物用途，具体涉及wsw多肽分子在肿瘤或脑肿瘤靶向诊治中的应用，并进一步优化其稳定性，达到更好的体内肿瘤或脑肿瘤靶向效果；尤其涉及制备具有高稳定性的d构型多肽分子dwsw(d构型氨基酸序列dwdsdwdgdpdyds)，并分别以lwsw(l构型氨基酸序列sypgwsw)和dwsw修饰药物分子和高分子载体材料，构建wsw-药物复合物、wsw修饰的纳米递药系统，以实现药物对外周肿瘤和脑肿瘤的靶向诊疗。
具体的，本发明利用固相多肽合成技术，设计并制备了d构型多肽分子dwsw，其对血清具有高稳定性，可靶向脑毛细血管内皮细胞、肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管和肿瘤细胞。
lwsw和本发明所设计的dwsw分别连接半胱氨酸后，可利用其分子中巯基与马来酰亚胺功能化荧光物质(如fluorescence、近红外染料cy5.5、ir820、dir、磁共振影像剂gd-dtpa、放射影像剂99mtc-dtpa等)反应而形成复合物。
lwsw和本发明所设计的dwsw分别修饰药物，包括通过马来酰亚胺己肼衍生物反应形成ph敏感腙键(涉及阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物)、或通过3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应形成二硫键(涉及紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱等含羟基或氨基的药物)、或通过多巴胺与药物中硼酸基团反应形成ph敏感硼酸脂(涉及药物硼替佐米等含硼酸基团的药物)、或通过固相合成直接形成酰胺键(涉及药物p53激活肽、抗菌肽、多肽毒素等多肽药物)的多肽-药物复合物。
lwsw和本发明所设计的dwsw分别连接半胱氨酸后，可修饰在含马来酰亚胺功能基的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(peg-dspe)、聚乙二醇-聚乳酸(peg-pla)、聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物(peg-plga)、聚乙二醇-聚己内酯(peg-pcl)等高分子载体材料上，可用于lwsw和dwsw分别修饰的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统的构建。
本发明所设计的lwsw和dwsw分别修饰的纳米递药系统可包载紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、表阿霉素、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱、硼替唑米、卡非佐米、小白菊内酯、p53激活肽、蜂毒肽、蝎毒肽等抗肿瘤药物；也可包载荧光物质，如香豆素6、fam，近红外染料cy5.5、ir820、dir、did、磁共振影像剂gd-dtpa、放射影像剂99mtc-dtpa等。
本发明所设计的dwsw可介导药物或纳米递药系统特异性靶向血脑屏障、肿瘤组织，用于脑肿瘤或外周肿瘤的靶向诊断和治疗。
本发明提供了dwsw制备和性质考察，以及lwsw和dwsw分别所修饰的药物复合物和纳米递药系统用于肿瘤诊疗的物质基础。本发明的试验结果表明：lwsw和dwsw均可介导肿瘤或脑肿瘤的体内主动靶向；与lwsw相比，dwsw在血清中稳定性更好，因而其介导的体内主动靶向效果更优。
1.wsw、wsw-cys及其荧光标记物(wsw-fluorescence)的合成
采用固相合成方法制备dwsw-cys、lwsw-cys。通过马来酰亚胺基团与巯基的michael加成反应合成了dwsw-fluorescence、lwsw-fluorescence。hplc、ms表征结构。
2.wsw-dtpa-gd与wsw-dtpa-99mtc的合成
通过马来酰亚胺基团与巯基的michael加成反应合成了dwsw-dtpa或lwsw-dtpa，螯合gd或99mtc获得wsw-dtpa-gd或wsw-dtpa-99mtc。
3.wsw稳定性和靶向能力评价
从血清稳定性方面进行dwsw和lwsw性质的考察。将dwsw和lwsw分别与小鼠血清在37℃进行孵育，在不同时间点检测多肽的浓度，进行稳定性的比较。比较dwsw-fluorescence、lwsw-fluorescence对脑毛细血管内皮细胞(bcec)脐静脉内皮细胞huvec和模型肿瘤细胞(脑胶质瘤细胞u87)的体外靶向性。比较体外3d肿瘤球模型对dwsw-fluorescence、lwsw-fluorescence的摄取能力。
4.wsw-药物复合物的制备
连接半胱氨酸后的dwsw和lwsw分别与药物的马来酰亚胺己肼衍生物反应，形成含ph敏感腙键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物。
连接半胱氨酸后的dwsw和lwsw分别与药物的3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应，形成含二硫键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱等含羟基或氨基的药物。
dwsw和lwsw分别通过修饰上多巴胺进而与药物的硼酸基团反应，形成含ph敏感硼酸脂的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括硼替佐米等含硼酸基团的药物。
dwsw和lwsw分别通过固相合成直接与多肽药物缩合制成融合多肽，其中所涉及药物包括p53激活肽、抗菌肽、多肽毒素等多肽药物。
5.wsw胶束的构建与表征
首先将连接半胱氨酸后的dwsw和lwsw分别与mal-peg-pla反应，合成dwsw和lwsw修饰的高分子材料dwsw-peg-pla和lwsw-peg-pla。1h-nmr表征。
然后分别制备dwsw、lwsw胶束(dwsw-micelle、lws-micelle)。一定量的dwsw-peg-pla或lwsw-peg-pla，mpeg-pla和药物(香豆素-6、dir或紫杉醇)采用成膜法制备胶束(wsw-micelle/c6、wsw-micelle/dir或wsw-micelle/ptx)，激光散射粒度仪表征胶束粒径和粒径分布。
6.wsw-micelle的体内外肿瘤靶向性评价
考察u87细胞、huvec细胞和u87肿瘤球体外模型对dwsw-micelle/c6、lwsw-micelle/c6和mpeg-micelle/c6的摄取情况。
通过荷u87原位瘤模型裸鼠尾静脉分别注射dwsw-micelle/dir、lwsw-micelle/dir和mpeg-micelle/dir，比较不同组在各时间点的肿瘤内分布。7.wsw-micelle/ptx的体内抗肿瘤效果评价
通过荷u87原位瘤模型裸鼠尾静脉分别注射dwsw-micelle/ptx,lwsw-micelle/ptx、mpeg-micelle/ptx、临床用制剂泰素和生理盐水，以瘤体积、瘤重以及肿瘤组织细胞凋亡、新生血管和拟态血管数量为指标评价不同载紫杉醇胶束的体内抗肿瘤效果。
附图说明
图1、dwsw-cys的hplc和esi-ms图谱，其中，
色谱方法：色谱柱(ymc，c18)：150×4.6mm；流动相a：水(含0.1％三氟乙酸)，流动相b：乙腈(含0.1％三氟乙酸)；洗脱程序：0-30min5％b-65％b；流速：0.7ml/min；柱温：40℃；检测：uv214nm，保留时间：18.7min。esi-ms：985.4，与理论分子量相符。
图2、lwsw-cys的hplc和esi-ms图谱，其中，
色谱方法同上，保留时间：20.3min。esi-ms：985.4，与理论分子量相符。
图3、dwsw-fluorescence的hplc和esi-ms图谱，其中，
色谱方法同上，保留时间：17.7min。esi-ms：1413.4，与理论分子量相符。
图4、lwsw-fluorescence的hplc和esi-ms图谱，其中，
色谱方法同上，保留时间：17.8min。esi-ms：1413.4，与理论分子量相符。
附图5、dwsw-cy7的hplc和esi-ms图谱
色谱方法：色谱柱(ymc，c18)：150×4.6mm；流动相a：水(含0.1％三氟乙酸)，流动相b：乙腈(含0.1％三氟乙酸)；洗脱程序：0-30min15％b-85％b；流速：0.7ml/min；柱温：40℃；检测：vis783nm，保留时间：20.4min。esi-ms：1676.4，与理论分子量相符。
图6、lwsw-cy7的hplc和esi-ms图谱，其中，
色谱方法同上，保留时间：20.4min。esi-ms：1676.4，与理论分子量相符。
图7、dwsw-peg3000-pla2000和lwsw-peg3000-pla2000的1h-nmr图谱，
其中，mal-peg-pla的核磁图谱6.9ppm显示出马来酰亚胺峰，而wsw-peg-pla的核磁图谱中该峰消失，显示mal-peg-pla中的马来酰亚胺基团已反应完全。
图8、dwsw和lwsw的血清稳定性，其中，
图纵坐标为完整多肽的残留百分比，可见dwsw在50％小鼠血清中的稳定性显著高于lwsw，孵育1小时，lwsw完全降解、dwsw几乎不降解。
图9、大鼠原代脑毛细血管内皮细胞(bcec),脐静脉内皮细胞(huvec)及人脑胶质瘤细胞(u87)对fluorescence标记多肽的摄取，其中，
图a和图b分别为fluorescence标记的dwsw和lwsw与bcec细胞作用4h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果。由图可见，bcec细胞对dwsw和lwsw的摄取明显高于游离荧光素，对dwsw、lwsw的摄取没有明显差异。且摄取的多肽和溶酶体共定位；
图c和图d分别为fluorescence标记的dwsw和lwsw与huvec细胞作用4h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果。由图可见，huvec细胞对dwsw和lwsw的摄取明显高于游离荧光素，对dwsw、lwsw的摄取没有明显差异。且摄取的多肽和溶酶体共定位；
图e和图f分别为fluorescence标记的dwsw和lwsw与u87细胞作用4h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果。由图可见，u87细胞对dwsw和lwsw的摄取明显高于游离荧光素，对dwsw、lwsw的摄取没有明显差异。且摄取的多肽和溶酶体共定位。
图10、fluorescence标记多肽在正常老鼠体内的分布，其中，
图a为icr小白鼠尾静脉注射fluorescence标记多肽1h后的离体脑组织荧光影像；图b为给药后各个时间点脑部荧光半定量结果；图c为离体脏器荧光半定量结果；图d为脑部荧光半定量变化趋势图。结果表明，fluorescence标记的dwsw和lwsw在脑内的蓄积均显著高于游离荧光素fam(***p<0.001)，且脑靶向效果为：dwsw>lwsw。
图11、cy7标记多肽的原位瘤内分布，其中，
图a为荷u87原位瘤裸鼠尾静脉注射cy7标记多肽2h后的离体肿瘤荧光影像；图b为给药后各个时间点在体脑部荧光半定量结果；图c为离体脏器的荧光分布图像；图d为离体脏器荧光半定量结果，结果表明，cy7标记的dwsw和lwsw在脑部肿瘤内的蓄积均显著高于游离荧光素cy7(***p<0.001)，且肿瘤靶向效果为：dwsw>lwsw。
图12、wsw-micelle/c6的体外bbb转运，其中，
图为dwsw-micelle/c6，lwsw-micelle/c6及mpeg-micelle/c6于不同时间点跨体外血-脑屏障模型转运的百分比。由图可见，在30min，1、2和4h，dwsw-micelle/c6，lwsw-micelle/c6转运通过体外bbb模型的量明显高于无靶胶束mpeg-micelle/c6(***p<0.001)，且前二者的转运百分率无明显差别。
图13、wsw-micelle/c6的体外bbtb转运，其中，
图为dwsw-micelle/c6，lwsw-micelle/c6及mpeg-micelle/c6于不同时间点跨体外血-脑肿瘤屏障模型转运的百分比，由图可见，在30min，1、2和4h，dwsw-micelle/c6，lwsw-micelle/c6转运通过体外bbtb模型的量明显高于无靶胶束mpeg-micelle/c6，且前二者的转运百分率无明显差别。
图14、wsw-micelle/c6的体外bbb转运后肿瘤球摄取，其中，
结果表明，dwsw-micelle/c6能有效跨越血-脑屏障并被下室u87三维肿瘤球摄取，且血清孵育前后其摄取无明显变化，血清孵育后lwsw-micelle/c6不能有效跨越血-脑屏障并被肿瘤球摄取。
图15、wsw-micelle/c6的体外bbtb转运后肿瘤球摄取，其中，
结果表明，dwsw-micelle/c6能有效跨越血-脑肿瘤屏障并被下室u87三维肿瘤球摄取，且血清孵育前后其摄取无明显变化，血清孵育后lwsw-micelle/c6不能有效的跨越血-脑肿瘤屏障并被肿瘤球摄取。
图16、载dir的wsw胶束的原位瘤内分布，其中，
图a为荷u87原位瘤裸鼠尾静脉给药后2、4、8及24h的在体荧光分布图像，从左到右依次为mpeg-micelle/dir组、lwsw-micelle/dir组和dwsw-micelle/dir组，图b为离体脑组织的荧光分布图像，图c为脑部荧光半定量结果，图d为离体脏器荧光半定量结果，结果表明，dwsw修饰的胶束能更好地将dir递送入脑并靶向肿瘤部位。
图17、载紫杉醇胶束的粒径，其中，
图为各载紫杉醇胶束的粒径图片，由图可见，各处方胶束大小均无显著差异。
图18、载紫杉醇胶束体外抗u87细胞和huvec细胞活性曲线，其中，
图a和图b分别为mpeg-micelle/ptx、dwsw-micelle/ptx、lwsw-micelle/ptx和泰素抗u87细胞和huvec细胞的活性曲线，由图a可见，u87细胞给药72h，其ic50分别为0.478、0.054、0.273和0.957μm，表明各组均能抑制u87细胞的体外生长，其中dwsw-micelle/ptx对体外u87细胞抑制活性分别为lwsw-micelle/ptx的5.05倍和mpeg-micelle/ptx的8.85倍，由图b可见，huvec细胞给药后培养72h，其ic50分别为0.81、0.343、0.3233和1.103μm，表明各组均能抑制huvec细胞的体外生长，其中dwsw-micelle/ptx对huvec体外细胞抑制活性为mpeg-micelle/ptx的2.36倍,与lwsw-micelle/ptx没有显著性差异。
图19、载紫杉醇胶束对体外新生血管形成的抑制和拟态血管形成的抑制，其中，
图为mpeg-micelle/ptx、dwsw-micelle/ptx、lwsw-micelle/ptx和泰素对拟态血管和新生血管体外模型的抑制照片(a)，b和c分别为拟态血管的定量结果和新生血管的定量结果，相比于mpeg-micelle/ptx和泰素，dwsw-micelle/ptx和lwsw-micelle/ptx抑制新生血管和拟态血管的形成更显著(**p<0.01,***p<0.001)。
图20、u87原位瘤模型裸鼠的生存曲线，其中，
由图可见，生理盐水组、游离泰素组、mpeg-micelle/ptx、dwsw-micelle/ptx和lwsw-micelle/ptx平均生存时间分别为19、20、21、25和27.5天，结果表明，与其余各组相比，dwsw-micelle/ptx可显著延长u87原位肿瘤模型裸鼠的生存时间(n＝8)。
图21、cd31/pas双染色及tunel结果，其中，
图a为mpeg-micelle/ptx、dwsw-micelle/ptx、lwsw-micelle/ptx和泰素抑制新生血管形成的cd31/pas双染色照片(bar＝100μm)，其中新生血管细胞核呈棕黄色或棕褐色；图c为新生血管数的统计结果，与mpeg-micelle/ptx和泰素相比，dwsw-micelle/ptx和lwsw-micelle/ptx抑制新生血管形成的作用更显著；
图b为mpeg-micelle/ptx、dwsw-micelle/ptx、lwsw-micelle/ptx和泰素促进脑胶质瘤凋亡的tunel染色照片(bar＝50μm)，其中凋亡的阳性细胞核呈棕黄色或棕褐色；图d为阳性细胞数的统计结果，与mpeg-micelle/ptx和泰素相比，dwsw-micelle/ptx和lwsw-micelle/ptx促进肿瘤组织凋亡的作用更显著。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但本发明不局限于如下描述范围。
实施例1
wsw-cys、wsw-cy7、wsw-fluorescence、wsw-药物、wsw-peg-pla的合成与表征
1.dwsw-cys和lwsw-cys的合成与表征
采用固相多肽合成法，合成由d构型氨基酸所构成的dwsw-cys(序列为dcdwdsdwdgdpdyds)以及l构型氨基酸所构成的lwsw-cys(序列为sypgwswc)；
具体方法：以boc固相多肽合成法，在pam树脂上按序列依次接入氨基酸，以hbtu/diea为缩合剂、tfa为脱保护剂进行反应。反应完成后，将树脂用含p-cresol的氟化氢进行切割，冰浴搅拌反应1h。反应结束后减压抽去氟化氢，冰乙醚沉淀并洗涤沉淀3次，沉淀以20％乙腈重新溶解，得到多肽粗品溶液。多肽粗品用乙腈/水(含0.1％tfa)体系分离纯化。hplc和esi-ms表征。hplc图谱、质谱图见附图1、图2；
2.wsw-fluorescence与wsw-cy7的合成与表征
将上述步骤得到的dwsw-cys或lwsw-cys溶于0.1m的pbs溶液中(ph7.2)，取fluorescence-5-maleimide溶于dmf，两者混合后搅拌反应，hplc监测，待dwsw-cys或lwsw-cys反应完全后停止反应，制备液相纯化，用乙腈/水(含0.1％tfa)体系分离纯化。冷冻干燥得dwsw-fluorescence或lwsw-fluorescence纯品。hplc图谱、质谱图见附图3、4；
wsw-cy7的制备方法同上。hplc图谱、质谱图见附图5、6；
3.wsw-dtpa-gd与wsw-dtpa-99mtc的制备
maleimide-dtpa溶于dmf，同上与dwsw-cys或lwsw-cys的pbs溶液混合搅拌反应，制备液相纯化，冷冻干燥得dwsw-dtpa或lwsw-dtpa纯品，螯合gd或99mtc即得wsw-dtpa-gd或wsw-dtpa-99mtc；
4.wsw-药物复合物的制备
以wsw-阿霉素复合物制备作为wsw连接含酮或醛基药物的实施例。10mgwsw-cys(dwsw-cys或lwsw-cys)溶于3ml磷酸盐缓冲液(0.1mm，ph7.0)，加入10倍摩尔量的三(2-羧乙基)膦(tcep)，于4℃搅拌20min。然后加入4倍摩尔量的阿霉素6-马来酰亚胺己肼衍生物，于室温避光反应1h。反应液用制备液相纯化，冷冻干燥得wsw-阿霉素复合物；
以wsw-紫杉醇复合物作为wsw以二硫键连接含羟基或氨基药物的实施例。200mg紫杉醇溶于10ml氯仿中，冷却至0-5℃，先后加入40mgdcc及60mg3-(2-吡啶二巯基)丙酸，加料完毕后，升至室温反应过夜。反应液过滤，经柱层析纯化(chcl3/meoh＝50:1-15:1，v/v洗脱)得紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物。紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物溶解在dmf中，1.5倍摩尔量的wsw-cys溶解在pbs中，溶液ph值保持4～5，将紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物滴加至wsw-cys溶液中，于室温反应6h，经制备液相纯化冻干得wsw-紫杉醇复合物；
以wsw-硼替佐咪复合物作为wsw连接含硼酸基团药物的实施例。依照wsw的序列在树脂上依次接入氨基酸，待多肽的所有氨基酸残基接入完毕，三氟乙酸脱去氮端的boc保护。加入含3倍摩尔量的丁二酸酐与diea的dmf溶液，于室温反应30min。洗涤树脂后，加入5倍摩尔量的三甲基氯硅烷保护多巴胺，并以hbtu/diea为缩合剂，于室温反应1h。树脂用hf切割，并经制备液相纯化得wsw-多巴胺衍生物。在ph7.4的缓冲液中，wsw-多巴胺衍生物与硼替佐咪以摩尔比1:1混合即得wsw-硼替佐咪复合物；
以wsw-pmi复合物作为wsw连接多肽药物的实施例。直接通过固相多肽合成法制得，具体方法为：确定wsw-pmi多肽序列后，在pam树脂上依次接入氨基酸，经hf切割并纯化后得wsw-pmi复合物；
5.wsw-peg-pla的合成与表征
通过wsw-cys的游离巯基与mal-peg-pla所含马来酰亚胺的反应实现材料的合成。将40mgmal-peg-pla溶解在5ml乙腈中，旋转蒸发，成膜，加入3mlpbs(ph8.0,0.2m)在37℃水化形成胶束。8h内加入9.6mgwsw-cys并反应过夜，hplc检测反应。过量的wsw-cys通过透析除去，冻干得wsw-peg-pla。1h-nmr表征(附图7)。
实施例2
wsw的血清稳定性考察
将dwsw或lwsw配成1mg/ml水溶液，取0.1ml加至0.9ml的50％小鼠血清中，37℃孵育，分别于0和15min，0.5、1、2和4h取出100μl反应液，加入20μl三氯乙酸(tca)沉淀血清中蛋白，4℃静置20min，12000转/分钟离心10min，取上清液20μl进行hplc分析。血清稳定性结果(附图8)表明，dwsw具有比lwsw更好的血清稳定性。
实施例3
wsw的体外细胞靶向性验证
1.wsw对脑毛细血管内皮细胞的的体外靶向性
4周龄sd大鼠断头后取脑，于冰冷的d-hanks溶液中迅速分离得到大脑皮层，除去脑膜和脑部大血管后剪碎，加入胶原酶和dna酶37℃消化90min后，1000转/分钟离心8min，弃去上清，转移至20％的bsa中，1000g/分钟4℃离心20min，弃去中上层液体，将底部微血管转移至培液中，1000转/分钟离心5min，用含20％胎牛血清的dmem培养液配成微血管段悬液，接种于共聚焦皿或12孔板中，37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养24h，换成含有嘌呤霉素的内皮专用培养液继续培养72h后，再换成含有细胞生长因子的内皮专用培养液培养72h，得原代脑毛细血管内皮细胞。用含10％胎牛血清的dmem培养液配制浓度为5μm的fam、dwsw-fluorescence及lwsw-fluorescence溶液。将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育12h，吸弃上清液。用pbs溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，dapi进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片及多肽与溶酶体共定位照片见附图9a。另用pbs洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果见附图9b；
2.wsw对人脐静脉内皮细胞huvec细胞的体外靶向性
取对数生长期的单层培养的单层培养的人脐静脉内皮细胞(huvec细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的dmem培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于共聚焦皿或12孔板中，每孔体积1ml，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养24h后，用含10％胎牛血清的dmem培养液配制浓度为5μm的fam、dwsw-fluorescence及lwsw-fluorescence溶液。将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育4h，吸弃上清液。用pbs溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，dapi进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片及多肽与溶酶体共定位照片见附图9c。另用pbs洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果见附图9d；
3.wsw对人脑胶质瘤细胞u87的体外靶向性
取对数生长期的单层培养的脑胶质瘤细胞(u87细胞)，同上试验，细胞内化照片及多肽与溶酶体共定位照片见附图9e。流式细胞仪分析结果见附图9f。
实施例4
wsw的体内靶向性验证
1.wsw体内跨血-脑屏障能力验证
小白鼠(体重约25克)尾静脉分别注射fam、dwsw-fluorescence、lwsw-fluorescence及dcdx-fluorescence，分别在15、30和60min用乙醚麻醉，生理盐水心脏灌流，4％多聚甲醛固定，取脑组织和主要脏器组织器官(心、肝、脾、肺和肾)，通过活体成像观察。结果如附图10所示，dwsw-fluorescence、lwsw-fluorescence及dcdx-fluorescence在脑组织中荧光强度显著大于fam，荧光强度大小依次为dwsw-fluorescence＞lwsw-fluorescence≈dcdx-fluorescence＞fam，说明wsw多肽分子可以介导荧光素跨越血-脑屏障，蓄积于脑组织内，且效果优于阳性对照多肽dcdx；
2.wsw体内肿瘤靶向性验证
原位脑胶质瘤模型鼠的建立：取对数生长期的u87细胞，每只裸小鼠接种5×105个细胞(分散于5μlpbs缓冲液中)。裸小鼠麻醉后，用脑立体定位仪固定，细胞接种于纹状体右部(前囟前0.6mm，侧1.8mm，深3mm)。定期观察裸小鼠状态。裸鼠接种肿瘤细胞后第5天进行试验，以0.15μmol/只的剂量将cy7、dwsw-cy7及lwsw-cy7溶液通过尾静脉注入荷瘤裸鼠模型体内，于注射后2h内，活体成像仪摄像记录体内荧光分布。2h后处死裸鼠，取出脑部肿瘤，用活体成像仪检测肿瘤的荧光分布(附图11a)并进行荧光半定量计算(附图11b)，以及离体脏器的荧光分布(附图11c)并进行荧光半定量计算(附图11d)。
实施例5
wsw胶束体内外靶向性验证
1.载c6及dir胶束的制备
称取1mgwsw-peg-pla，9mgmpeg-pla和5ugc6，溶解在2ml乙腈中，于37℃水浴减压(～0.085mpa)旋蒸成膜，室温真空干燥过夜，加入2ml生理盐水水化，cl-4b柱层析除去游离c6，制得wsw-micelle/c6，4℃避光保存，备用；
载dir胶束的制备方法同载c6胶束；
2.wsw胶束跨体外血-脑屏障能力考察
4周龄sd大鼠断头后取脑，于冰冷的d-hanks溶液中迅速分离得到大脑皮层，除去脑膜和脑部大血管后剪碎，加入胶原酶和dna酶37℃消化90min后，1000转/分钟离心8min，弃去上清，转移至20％的bsa中，1000g/分钟4℃离心20min，弃去中上层液体，将底部微血管转移至培液中，1000转/分钟离心5min，用含20％胎牛血清的dmem培养液配成微血管段悬液，接种于预先铺有鼠尾胶原的24孔transwell中，将transwell移入二氧化碳培养箱中，37℃，5％co2及饱和湿度条件下培养24h，换成含有嘌呤霉素的内皮专用培养液继续培养72h后，再换成含有细胞生长因子的内皮专用培养液培养72h，测得电阻超过200ω·cm2，即体外bbb模型成功建立。用含10％fbs的dmem培养液配制c6浓度为50ng/ml的dwsw-micelle/c6、lwsw-micelle/c6及mpeg-micelle/c6溶液，将transwell上室中的培养液吸出，分别加入上述溶液，分别于30min，1、2和4h取下室培养液测其荧光素浓度。各胶束bbb转运结果见附图12；
3.wsw胶束跨体外血-脑肿瘤屏障能力考察
将脐静脉内皮细胞huvec和u87按照1:5的比例分别铺于transwell的上、下室，培养72h，即得体外bbtb模型。用含10％fbs的dmem培养液配制含荧光素浓度为50ng/ml的dwsw-micelle/c6、lwsw-micelle/c6及mpeg-micelle/c6溶液，将transwell上室中的培养液吸出，分别加入上述溶液，分别于30min，1、2和4h取下室培养液测其荧光素浓度，结果见附图13；
4.wsw胶束体外跨bbb或bbtb靶向脑肿瘤验证
将2％的低分子琼脂糖溶液趁热加入48孔板中，每孔150μl，室温放置冷却凝固后，每孔接种400μlu87细胞悬液，细胞密度为2×103个/孔。置于二氧化碳培养箱中，37℃、5％二氧化碳及饱和湿度条件下培养7天即形成肿瘤球。将u87肿瘤球转移至bbb模型的transwell下室培养即得bbb/u87肿瘤球共培养模型。将u87肿瘤球转移至bbtb模型的transwell下室培养即得bbtb/u87肿瘤球共培养模型；
dwsw-micelle/c6、lwsw-micelle/c6及mpeg-micelle/c6与50％的血清孵育4h，将孵育前后的胶束用含10％fbs的dmem培养液配制含荧光素浓度为50ng/ml的dwsw-micelle/c6、lwsw-micelle/c6及mpeg-micelle/c6的溶液。将transwell上室的培养液吸出，分别加入上述溶液，继续培养4h，取下室的肿瘤球置于荧光显微镜下观察。结果(附图14及附图15)表明，仅wsw胶束能有效跨越血脑屏障或血脑肿瘤屏障并被下室u87三维肿瘤球摄取，其中，dwsw胶束组血清孵育前后其摄取无明显变化，而lwsw胶束组经血清孵育后不能被下室肿瘤球有效摄取；
5.wsw胶束的体内靶向性验证
分别尾静脉注射100μl的mpeg-micelle/dir、dwsw-micelle/dir及lwsw-micelle/dir，分别在注射后2、4、8及24h时麻醉小鼠，用活体成像仪记录dir在裸鼠体内的分布情况并进行荧光半定量计算(附图16)。
实施例6
载紫杉醇wsw胶束的体外药效学考察
1.wsw-micelle/ptx的制备及表征
载紫杉醇胶束制备方法同载c6胶束。胶束的粒径均一(附图17)；
2.wsw-micelle/ptx体外药效试验
以4.0×103个/孔将u87细胞接种于96孔板，24h后，将培养液吸出，加200μl一系列浓度的dwsw-micelle/ptx、lwsw-micelle/ptx、mpeg-micelle/ptx和泰素，共培养72h，后加入mtt溶液继续培养4h，弃去培养液，加入150μldmso，振荡至紫色颗粒溶解，用酶标仪在590nm处测定吸光度值。计算细胞存活率和半数致死剂量(附图18)；
3.wsw-micelle/ptx对拟态血管形成的抑制试验
取24孔培养板每孔加入50μl基质胶，平铺于24孔板内，37℃培养箱内孵育30min待其凝固。0.25％胰酶消化u87细胞，用含1μm紫杉醇的wsw-micelle/ptx、mpeg-micelle/ptx或泰素的dmem培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于24孔培养板中，37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养12h后观察血管样结构形成(附图19a)，并计算血管样结构的形成率(附图19b)；
4.wsw-micelle/ptx对新生血管形成的抑制考察
于24孔板，每孔加入50μl基质胶，平铺于板孔内，37℃培养箱内孵育30min待其凝固。0.25％胰酶消化huvec细胞，用含1μm紫杉醇的wsw-micelle/ptx、mpeg-micelle/ptx或泰素的dmem培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于24孔板中，37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养12h后观察血管样结构形成(附图19a)，并计算血管样结构的形成率(附图19c)。
实施例7
载紫杉醇wsw胶束的体内药效学考察
1.wsw-micelle/ptx体内药效学考察
荷原位脑胶质瘤模型裸鼠尾静脉分别注射生理盐水、泰素、mpeg-micelle/ptx、lwsw-micelle/ptx和dwsw-micelle/ptx。ptx给药总剂量为24mg/kg，分别在肿瘤种植后第10、13、16和19天给药，记录裸鼠的生存时间。裸鼠生存曲线见附图20，与其它各组相比，dwsw-micelle/ptx显著延长荷原位脑胶质瘤模型裸鼠生存时间；
2.wsw-micelle/ptx对肿瘤血管的抑制
荷原位脑胶质瘤模型裸鼠同上给药完成后，处死取出脑组织固定，石蜡包埋切片，进行cd31免疫组化染色与pas双染。在普通光学显微镜下连续观察3个高倍视野，计数cd31阳性血管数。结果见附图21a,统计学结果见附图21c；
3.wsw-micelle/ptx的促凋亡
同上荷瘤裸鼠给药完成后，处死取出脑组织进行固定，作冰冻切片，通过tunel法检测肿瘤凋亡情况。采用末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)介导的dutp缺口末端标记法(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddutpnickendlabeling，tunel)检测肿瘤细胞的凋亡程度。主要步骤为：石蜡切片常规脱蜡至水，pbs漂洗3次，每次3min，0.3％h2o2溶液室温处理20min，20μg/ml蛋白酶k37℃消化20min，pbs漂洗3次，每次3min，每张切片滴加tunel混合液(tdt和biotin-dntp)30μl置于湿盒中37℃孵育60min。阳性结果为细胞核呈棕黄色或棕褐色，细胞核内棕色颗粒阳性即判定为凋亡细胞。在普通光学显微镜下连续观察5个高倍视野，计数阳性细胞数，视野内细胞中阳性细胞数所占的百分比为凋亡指数。结果见附图21b,统计学结果见附图21d。