一种长效促进脱矿牙本质再矿化的方法与流程

本发明涉及口腔医学领域，具体涉及一种长效促进脱矿牙本质再矿化的方法。

背景技术：

继发龋的发生是导致树脂填充修复失败的最主要原因；在美国，50%-70%的树脂充填物终因树脂充填修复的失败而需被更换，每年花费于更换树脂填充物的费用高达五十亿美元；因此，预防继发龋的发生、抑制继发龋的进展具有重要的临床意义；促进脱矿牙本质再矿化是预防继发龋、抑制继发龋进展的有效方法；人体口腔内的龋损病变常收到各种酸性环境的挑战；如口腔内众多产酸细菌在有糖类提供营养时可大量产酸，以及酸性饮料的摄入等等；仅靠唾液而促进脱矿牙本质再矿化对于抑制龋损进展的作用微乎其微；因此，多种生物材料的研究已经证实其可能用于促进脱矿牙本质再矿化的潜力，从而可能用于龋病的预防或治疗；然而，大多数的研究仅局限于证实生物材料即刻或短期内促进脱矿牙本质再矿化的能力；但继发龋并不会在树脂充填修复后的短时间内发生，继发龋通常发生于树脂充填修复后一年或更长的时间后；因此，为解决继发龋这一严峻的临床问题，寻找能够长效促进脱矿牙本质再矿化的树脂材料及方法具有极高的意义。

技术实现要素：

本发明提供一种能够长效促进脱矿牙本质再矿化的方法。

本发明采用的技术方案是：一种长效促进脱矿牙本质再矿化的方法，包括以下步骤：

（1）将nacl溶液加入到乳酸溶液中，直至乳酸溶液的ph值为4，得到配置好的乳酸溶液；将ebpm-nacp树脂条放置于配置好的乳酸溶液中，直至树脂条中的ca、p离子彻底释放；

（2）将步骤（1）中得到的树脂条浸泡于cacl2和hepes缓冲液构成的ph值为7的溶液中，其中cacl2终浓度为100mmol/l，hepes终浓度为50mmol/l，震荡1min，冲洗并干燥；

（3）将步骤（2）中得到的树脂条浸泡于k2hpo4和hepes缓冲液构成的ph值为7的溶液中，其中k2hpo4终浓度为60mmol/l，hepes终浓度为50mmol/l，震荡1min，冲洗并干燥；

（4）重复步骤（2）和（3）三次，将树脂条冲洗并干燥；

（5）将步骤（4）处理得到的树脂条放置到脱矿牙本质样本上，并置于模拟口腔环境中。

进一步的，步骤（5）处理之前还包括以下步骤：将脱矿牙本质样本用浓度为1mg/ml的端基为氨基的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液浸泡处理1h。

进一步的，所述步骤（1）中nacl溶液浓度为133mmol/l，乳酸溶液浓度为50mmol/l。

进一步的，所述步骤（1）中首先将ebpm-nacp树脂条放置到配置好的乳酸溶液中42天，然后换乳酸溶液再放置30天。

进一步的，所述ebpm-nacp树脂按以下组分和重量百分比组成，纳米无定形磷酸钙nacp40%、ebpm40%和钡硼铝硅酸盐玻璃20%；其中ebpm为双乙氧基双酚-a二甲基丙烯酸酯(ebpadma)和均苯四甲酸二酐甘油酯(pmgdm)按质量比为1:1构成的混合物中；加入上述混合物重量0.2%的樟脑醌和上述混合物重量0.8%的对-n，n-二甲氨基苯甲酸异戊酯构成。

本发明的有益效果是：

（1）本发明可长效促进脱矿牙本质再矿化，在一定时间段树脂中钙磷释放耗尽后仍可通过钙磷“再充电”实现长效促进脱矿牙本质再矿化，“再充电”过程临床上可通过使用漱口水而实现，可应用于预防继发龋发生、抑制继发龋进展；

（2）本发明方法操作简单、可行性高。

附图说明

图1为实施例1中ebpm-nacp树脂在乳酸溶液中浸泡42天期间测得的钙离子浓度初次释放曲线。

图2为实施例1中ebpm-nacp树脂在乳酸溶液中浸泡42天期间测得的磷离子浓度初次释放曲线。

图3为实施例2中四个处理组在模拟口腔环境中在不同时点测得的人工唾液中钙离子浓度值。

图4为实施例2中四个处理组在模拟口腔环境中在不同时点测得的人工唾液中磷离子浓度值。

图5为实施例2中四个处理组在模拟口腔环境中在不同时点测得的乳酸溶液中钙离子浓度值。

图6为实施例2中四个处理组在模拟口腔环境中在不同时点测得的乳酸溶液中磷离子浓度值。

图7为实施例3中四个处理组从模拟口腔环境的第1天到第35天的过程中，乳酸溶液浸泡15分钟后的ph值。

图8为实施例3中四个处理组从模拟口腔环境的第1天到第35天的过程中，乳酸溶液浸泡60分钟后的ph值。

图9为实施例3中四个处理组在模拟口腔环境第1天时，乳酸溶液浸泡处理60分钟过程中，乳酸溶液的ph值。

图10为实施例3中四个处理组在模拟口腔环境第35天时，乳酸溶液浸泡处理60分钟过程中，乳酸溶液的ph值。

图11为实施例4中四个处理组在模拟口腔环境中处理不同天数后牙本质硬度变化和正常牙本质、磷酸酸蚀后牙本质硬度图。

图12为实施例5中四个处理组在模拟口腔环境处理35天后垂直于牙本质小管方向观察牙本质样本的扫描电镜图。

图13为实施例5中四个处理组在模拟口腔环境处理35天后平行于牙本质小管方向观察牙本质样本的扫描电镜图。

图14为实施例6中四个处理组在模拟口腔环境处理35天后牙本质样本表面atr-ftir谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

一种长效促进脱矿牙本质再矿化的方法，包括以下步骤：

（1）将133mmol/lnacl溶液加入到50mmol/l乳酸溶液中，直至乳酸溶液的ph值为4，得到配置好的乳酸溶液；将2mm×2mm×12mm大小的ebpm-nacp树脂条放置于50ml配置好的乳酸溶液中，共放置42天；其中于第7、14、21、28、35、42天分别测量该乳酸溶液中的ca、p离子浓度，得到其初次释放曲线，即图1-2；随后，树脂条再置于100ml上述配制的乳酸溶液中30天，使其树脂条中的ca、p离子彻底释放；

（2）将步骤（1）中得到的树脂条浸泡于5mlcacl2和hepes缓冲液构成的ph值为7的溶液中，其中cacl2终浓度为100mmol/l，hepes终浓度为50mmol/l，震荡1min，用去离子水冲洗树脂条并于空气中干燥；对ebpm-nacp树脂条进行钙离子“充电”；

（3）将步骤（2）中得到的树脂条浸泡于5mlk2hpo4和hepes缓冲液构成的ph值为7的溶液中，其中k2hpo4终浓度为60mmol/l，hepes终浓度为50mmol/l，震荡1min，用去离子水冲洗树脂条并于空气中干燥；对ebpm-nacp树脂条进行磷离子“充电”；

（4）重复步骤（2）和（3）三次，将树脂条冲洗1min并在空气中干燥；

（5）将步骤（4）处理得到的树脂条放置脱矿牙本质样本上，并置于模拟口腔环境中。

进一步的，步骤（5）处理之前还包括以下步骤：将脱矿牙本质样本用浓度为1mg/ml的端基为氨基的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液浸泡处理1h；端基为氨基的聚酰胺-胺型树枝状聚合物采用第三代端基为氨基的聚酰胺-胺型树枝状聚合物，简称pamam；常温、常压下将10mgpamam粉末溶于10ml去离子水中得到1mg/ml的pamam溶液；第三代端基为氨基的聚酰胺-胺型树枝状聚合物是以乙二胺为起始核心，反复与丙烯酸甲酯通过michael加成反应后再与乙二胺通过酰胺化反应制备而成的；购自威海晨源化工新材料有限公司；

进一步的，所述ebpm-nacp树脂按以下组分和重量百分比组成，纳米无定形磷酸钙nacp40%、ebpm40%和钡硼铝硅酸盐玻璃20%；其中ebpm为双乙氧基双酚-a二甲基丙烯酸酯（ebpadma）和均苯四甲酸二酐甘油酯（pmgdm）按质量比为1:1构成的混合物中；加入上述混合物重量0.2%的樟脑醌和上述混合物重量0.8%的对-n，n-二甲氨基苯甲酸异戊酯构成；钡硼铝硅酸盐玻璃的粒度中值为1.4μm，为钡硼铝硅酸盐玻璃经4%的3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷和2%的正丙胺硅烷化所得，购自登士柏国际集团；樟脑醌和对-n，n-二甲氨基苯甲酸异戊酯作为含环戊二烯树脂的树脂的光引发剂；通过喷雾干燥法得到所用的纳米无定形磷酸钙的颗粒；具体方法如下：碳酸钙和磷酸二钙分别溶于醋酸溶液中，得到钙离子终浓度为8mmol/l、磷粒子终浓度为5.333mmol/l的溶液，将该溶液喷洒入一加热器中使水和酸蒸发，静电沉淀器收集干燥后的颗粒，此方法所得到的nacp颗粒平均粒径为116nm；将上述原材料调拌成功后置于2mm×2mm×12mm大小的模具中光固化处理，得到2mm×2mm×12mm大小的树脂条。

脱矿牙本质样本的具体制备方法如下：

（1）口腔门诊收集离体的健康第三磨牙，用0.005%的麝香草酚溶液消毒浸泡，于4℃保存；

（2）用金刚石刀片切得4×4×1mm的牙本质样本；

（3）牙本质样本用37%的磷酸溶液浸泡处理15s，模拟牙本质脱矿；

（4）脱矿的牙本质样本用蒸馏水超声处理10min以去除表面菌斑，用pbs（phosphate-bufferedsaline，ph=7.4）溶液浸泡，于4℃保存。

以下实施例中将脱矿后的牙本质样本分为四组，每组六个样本，每组具体处理方法如下：

（1）对照组：每一个脱矿牙本质样本用100μl去离子水浸泡处理1小时，再浸泡于pbs溶液中震荡72天，最后将每个样本从pbs溶液中取出并用去离子水冲洗，于空气中干燥；

（2）pamam组：每一个脱矿牙本质样本用100μlpamam溶液浸泡处理1小时，去离子水冲洗后再浸泡于pbs溶液中震荡72天，最后将每个样本从pbs溶液中取出并用去离子水冲洗，于空气中干燥；

（3）ebpm-nacp组：每一个脱矿牙本质样本表面接触放置3条ca、p离子释放尽并“充电”后的2×2×12mm的nacp树脂条；

（4）pamam+ebpm-nacp组：每一个脱矿牙本质样本用100μlpamam溶液浸泡处理1h后，表面接触放置3条ca、p离子释放尽并“充电”后的2×2×12mm的nacp树脂条。

将上述4组中每个牙本质样本均置于一容积为1.5ml的锥形瓶中，每天用1ml人工唾液浸泡处理23小时，ph为4的乳酸溶液浸泡处理1小时，每天均进行换液，共持续35天；并保证一直处于37℃条件；第（3）组和第（4）组在每天换液前，对每条树脂条均进行一次步骤（4）所述的钙离子和磷离子“充电”过程；人工唾液的配置方法为：依次将1.5mmol/lcacl2溶液，0.9mmol/lkh2po4溶液，130mmol/lkcl溶液，1.0mmol/lnan3溶液及20mmol/lhepes溶液溶于去离子水中,并用1mmol/lkoh溶液调ph至7.0；将脱矿牙本质样本每天保持在37℃浸泡于人工唾液中23小时及乳酸溶液中1小时，即模拟人体口腔环境；每天1小时的乳酸溶液浸泡与人体口腔每天所承受酸性环境挑战的时间相一致。

实施例1

用ph为4的乳酸溶液浸泡ebpm-nacp树脂条初次释放ca、p离子的过程中，分别于第7、14、21、28、35和42天测量乳酸溶液中的ca、p离子浓度，测试结果如图1-2所示，ca、p离子浓度均逐渐升高，说明ebpm-nacp树脂在乳酸溶液中不断的施放ca、p离子。

实施例2

在上述模拟口腔环境处理牙本质样本的过程中，分别于第1、3、5、7、10、14、21、28和35天后测量人工唾液及乳酸溶液中的ca、p离子浓度；测量结果如图3-6所示；从图2-5可以看出对照组人工唾液中的ca、p离子浓度始终恒定于初始浓度（ca1.5mmol/l，p0.9mmol/l）；pamam组钙磷离子浓度较对照组略有下降；ebpm-nacp组和pamam+ebpm-nacp组中钙磷离子浓度远高于对照组和pamam组；对照组和pamam组乳酸溶液中的钙磷离子浓度始终恒定于0；ebpm-nacp组和pamam+ebpm-nacp组中钙磷离子浓度远高于对照组和pamam组。

人工唾液中pamam组钙磷离子浓度较对照组略有下降说明pamam有吸附溶液中钙磷离子的作用；人工唾液及乳酸溶液中ebpm-nacp组和pamam+ebpm-nacp组中钙磷离子浓度远高于对照组和pamam组；说明“充电”后的ebpm-nacp树脂可持续释放脱矿牙本质长效再矿化所必需的钙磷离子，并且该能力并不会因每天换液而受影响，一直保持钙磷离子的持续释放。

实施例3

在上述模拟口腔环境中处理牙本质样本的过程中，分别于第1、3、5、7、10、14、21、28和35天时在乳酸溶液浸泡处理牙本质样本15分钟及60分钟后测量乳酸溶液的ph值；并在第1天和35天时分别在乳酸溶液浸泡处理牙本质样本10、20、30、40、50、60分钟后测量乳酸溶液的ph值；测量结果如图7-10所示，从图中可以看出对照组和pamam组的乳酸溶液ph始终恒定于4左右；ebpm-nacp组和pamam+ebpm-nacp组的乳酸溶液ph值在乳酸浸泡处理的15分钟后升至5.5左右，到60分钟时升至6.1左右，并且从第1天到第35天的过程中均能保持该中和乳酸溶液ph的能力不变；说明“充电”后的ebpm-nacp树脂可持续中和酸，长效调节ph，该能力并不会随时间延长而逐渐衰退。

实施例4

在上述模拟口腔环境处理牙本质样本的过程中，分别于第7、14、21、28、35天测量四组牙本质样本的硬度，维氏金刚石探头以20g的负载在样本上停留10s以测量硬度，每个样本测量6次；同时也测量健康牙本质样本，磷酸酸蚀脱矿后的牙本质样本的硬度作为对照，结果如图11所示；四组中正常牙本质及磷酸酸蚀脱矿后的牙本质硬度均相近；对照组的牙本质硬度相比对照组有所下降；ebpm-nacp组牙本质硬度相比对照组略有升高；pamam组牙本质硬度相比对照组也略有升高，高于ebpm-nacp组；pamam+ebpm-nacp组牙本质硬度升高最为显著，在第35天时已恢复接近至正常牙本质硬度；说明pamam溶液与“充电”后的ebpm-nacp树脂联用可在模拟的口腔环境中促进脱矿牙本质硬度的恢复。

实施例5

在上述模拟口腔环境处理牙本质样本的第35天结束后，每个样本用金刚石刀片切为两半，一半用于检测横断面（垂直于牙本质小管方向），另一半用于检测纵断面（平行于牙本质小管的方向）；每份样本浸泡于含1%戊二醛的pbs溶液中于4℃保存4h，然后用梯度乙醇脱水，100%的六甲基二硅胺冲洗后喷金；用扫描电镜观察样本；其扫描电镜检测结果如图12和图13所示；图12中a图表示对照组垂直于牙本质小管方向的扫描电镜图；图b为其局部放大图；图12中c图表示pamam组垂直于牙本质小管方向的扫描电镜图，图d为其局部放大图；图12中e图表示ebpm-nacp组垂直于牙本质小管方向的扫描电镜图，图f为其局部放大图；图12中g图表示pamam+ebpm-nacp组垂直于牙本质小管方向的扫描电镜图，图h为其局部放大图；图13中a图表示对照组平行于牙本质小管方向的扫描电镜图；图b为其局部放大图；图13中c图表示pamam组平行于牙本质小管方向的扫描电镜图；图d为其局部放大图；图13中e图表示ebpm-nacp组平行于牙本质小管方向的扫描电镜图；图f为其局部放大图；图13中g图表示pamam+ebpm-nacp组平行于牙本质小管方向的扫描电镜图；图h为其局部放大图；如图12和图13所示对照组的样本中牙本质小管开放，无矿物沉淀，高倍镜下可见暴露的牙本质胶原纤维；ebpm-nacp组样本中，可见少量矿物沉积于牙本质小管中；pamam组样本中可见更多量的矿物晶体沉积于牙本质小管中；pamam+ebpm-nacp组中可见最多的新生矿物晶体，大量针状矿物沉积于牙本质小管中，封闭牙本质小管。

实施例6

在上述模拟口腔环境处理牙本质样本的第35天结束后，每个样本表面进行atr-ftir检测，结果如图14所示。

ftir谱位于950-1150cm⁻¹之间的po4^3-峰高度为：pamam+ebpm-nacp组>pamam组>ebpm-nacp组>对照组；该结果再次证实pamam溶液与“充电”后的ebpm-nacp树脂联用可在模拟的口腔环境中最强地促进脱矿牙本质再矿化。

本发明实施例的实验结果表明，pamam溶液和“充电”后的ebpm-nacp树脂的联用可在体外模拟的口腔环境中，持续释放钙磷粒子，持续中和酸性环境的ph，长效促进脱矿牙本质再矿化；为今后临床上预防继发龋发生、抑制继发龋进展提供了新的方法与思路。