本发明属于医疗
技术领域：
，具体涉及一种含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂及其制备方法。
背景技术：
：龋齿被世界卫生组织(who)列为危害人类健康的三大慢性非传染性疾病之一，也是儿童的常见病、多发病。细菌感染是牙髓病和根尖周病的主要发病病因，其中以革兰氏厌氧菌为主要致病菌群，检出率高达98.33％。目前，龋齿的治疗主要通过祛腐、杀菌、填充等几步完成，其中祛腐的方法有车针祛腐和化学机械祛腐两种。现在化学机械法使用的试剂主要由次氯酸钠溶液和氨基酸凝胶两部分组成，临用前混合后使用。但是，上述试剂在保存过程中存在稳定性较差的问题，不能满足治疗的要求。另外，由于口腔内细菌的作用，特别是长期吸烟、喝茶、喝咖啡等，易使污渍附着在牙齿表面，形成牙渍。牙渍不仅影响美容、美观，而且利于细菌进一步的生成繁殖，产生破坏牙本质的酸性物质，形成蛀牙，最终可使牙整体坏死，严重影响人们的牙齿健康。木瓜蛋白酶是一种含疏基的肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶活性，在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质，有较广泛的特异性，在医药、食品、化妆品等多个领域均已有应用，是一种安全有效的食物蛋白酶。专利文献cn103800210a公开了一种含蛋白酶的牙科、口腔科制剂及其制备方法，所述制剂主要由氯胺-t和蛋白酶组成，该制剂可用于牙根管冲洗或龋齿祛腐，以及齿科美白、治疗小的口腔溃疡等。专利文献wo2005020946a1公开了一种化学组合物及其用于去除龋齿组织的方法，所述组合物由木瓜蛋白酶、氯胺-t、羧甲基纤维素、氯化钠、羟苯甲酯、氢氧化钠等组分组成，该化学组合物将木瓜蛋白酶与氯胺-t联合使用可以用于龋齿的治疗。然而，目前的去除龋齿的制剂均含有氯胺-t成分，该成分在使用的过程中会接触皮肤，经皮吸收后对人体具有较大的危害性，例如：会产生皮肤过敏，发红，水疱，在吸入呼吸道后易产生哮喘、呼吸困难等症状，会对人体产生严重的影响。同时，l.e.bertassoniandg.w.marshall在威利期刊公司(wileyperiodicals,inc.)发表了一篇题目为“papain-geldegradesintactnonmineralizedtypeicollagenfibrils(木瓜蛋白酶凝胶可降解完整的非矿化i型胶元纤维)”的文章(scanningvol.31,253–258(2009))，该文章表明：牙本质的微观基本结构是i型胶元纤维，经试验发现木瓜蛋白酶凝胶可部分降解完整的i型胶元纤维，即木瓜蛋白酶对牙i型胶元仍有一定的“伤害”作用。因此，研究和开发一种可以用于龋齿祛腐，齿科美白，而且对牙齿没伤害的口腔制剂仍是目前亟需解决的难题。技术实现要素：为了解决现有技术中去除龋齿口腔制剂存在的不足，本发明的目的在于提供一种含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂及其制备方法。本发明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂具有显著杀菌、祛腐、美白的作用，对龋齿具有显著的治疗效果。本发明提供了一种含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂，包括以下组分及其重量百分比：改性木瓜蛋白酶4～14％、柠檬酸8～12％、卡波姆1～4％和蒸馏水70～87％。进一步地，所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂，包括以下组分及其重量百分比：改性木瓜蛋白酶8％、柠檬酸10％、卡波姆2％和蒸馏水80％。进一步地，所述改性木瓜蛋白酶的制备方法为：s1取木瓜蛋白酶，加入浓度为90～100μmol/l的二酰胺溶液，静置10～15min，得修饰木瓜蛋白酶；s2将步骤s1得到的修饰木瓜蛋白酶，加入浓度为0.02～0.06mol/l，ph值为7～8的tris-盐酸缓冲液，于室温下边搅拌边加入氯化钠至饱和状态使游离酶沉淀，静置25～35min后，离心，取沉淀物，得修饰木瓜蛋白酶聚体；s3取步骤s2得到的修饰木瓜蛋白酶聚体加入质量分数为10～20％的聚乙二醇400溶液，于4℃条件下交联10～14h，即得。进一步地，所述步骤s1中木瓜蛋白酶与二酰胺溶液的固液比为1mg：8～12ml。进一步地，所述步骤s2中修饰木瓜蛋白酶与tris-盐酸缓冲液的固液比为1mg：1～2ml。进一步地，所述步骤s3中修饰木瓜蛋白酶聚体与聚乙二醇400溶液的固液比为1mg：3～5ml。进一步地，所述卡波姆为卡波姆940，所述卡波姆940为口服级别和医药级别卡波姆。进一步地，所述卡波姆为成凝胶物质，但不仅限卡波姆，亦可选用其它成凝胶物质，如羧甲基纤维素钠、羟丙甲基纤维素、透明质酸钠、壳聚糖等成分；优选为羧甲基纤维素钠和羟丙甲基纤维素。另外，本发明还提供了一种含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的制备方法，包括以下步骤：将改性木瓜蛋白酶溶于蒸馏水中，接着加入柠檬酸和卡波姆搅拌溶解后，加入ph值调节剂调节ph值至4～8，即得。进一步地，所述ph值调节剂为10％(w/v)氢氧化钠溶液。本发明采用二酰胺溶液对木瓜蛋白酶进行处理，将木瓜蛋白酶的巯基(-sh)氧化为二硫键(-s-s-)形式，接着将上述氧化后的木瓜蛋白酶加入聚乙二醇400溶液进行交联，从而改变木瓜蛋白酶的活性和稳定性，同时，该改性木瓜蛋白酶还可以降低木瓜蛋白酶对胶元纤维表层的降解作用。经试验发现，本发明提供的改性木瓜蛋白酶的制备方法制备得到的改性木瓜蛋白酶的酶活力大于11840μ/g，具有较高的酶活性，可以有效的提高木瓜蛋白酶的杀菌、祛腐、美白的作用，对龋齿具有显著的治疗效果。进一步地，经试验发现，本发明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂对正常牙本质涂布3次后，其牙本质的组织弹性模量(e)和硬度(h)基本无变化，说明本发明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂不会影响牙本质的机械性能，是一种安全，高效的治疗龋齿口腔凝胶剂。进一步地，本发明采用柠檬酸与卡波姆联合使用，不仅可以提高凝胶剂的抑菌能力，延长含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的保护期限，同时，该柠檬酸还可以降低卡波姆的吸湿性，解决卡波姆吸湿后易于结块导致溶解困难的缺陷。经试验发现，本发明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂在温度为25±2℃，相对湿度为60％±10％的条件下保存6个月，其外观、重量差异、微生物限度均符合规定，具有较高的稳定性。另外，本发明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的剂成分简单，美白去腐作用显著，生产成本低，是一种适合规模化生产的口腔凝胶剂，为广大龋齿患者带来福音。与现有技术相比，本发明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂具有以下优势：(1)本发明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂具有显著杀菌、祛腐、美白、治疗小的口腔溃疡等作用，对龋齿具有显著的治疗效果；(2)本发明提供的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂不会影响牙本质的机械性能，是一种安全，高效的治疗龋齿口腔凝胶剂。具体实施方式：以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。本发明的组分为常规的市售组分，而且都是食品级组分，对人体无毒副作用。实施例1、一种含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂由以下组分及其重量百分比组成：改性木瓜蛋白酶4％、柠檬酸12％、卡波姆9404％和蒸馏水80％；所述改性木瓜蛋白酶的制备方法为：s1取木瓜蛋白酶，加入浓度为90μmol/l的二酰胺溶液，上述木瓜蛋白酶与二酰胺溶液的固液比为1mg：8ml；静置10min，得修饰木瓜蛋白酶；s2将步骤s1得到的修饰木瓜蛋白酶，加入浓度为0.02mol/l，ph值为7的tris-盐酸缓冲液，上述修饰木瓜蛋白酶与tris-盐酸缓冲液的固液比为1mg：1ml，于室温下边搅拌边加入氯化钠至饱和状态使游离酶沉淀，静置25min后，离心，取沉淀物，得修饰木瓜蛋白酶聚体；s3取步骤s2得到的修饰木瓜蛋白酶聚体加入质量分数为10％的聚乙二醇400溶液，上述修饰木瓜蛋白酶聚体与聚乙二醇400溶液的固液比为1mg：3ml；于4℃条件下交联10h，即得。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的制备方法：将改性木瓜蛋白酶溶于蒸馏水中，接着加入柠檬酸和卡波姆940搅拌溶解后，加入ph值调节剂调节ph值至6，所述ph值调节剂为10％(w/v)氢氧化钠溶液，即得。实施例2、一种含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂由以下组分及其重量百分比组成：改性木瓜蛋白酶8％、柠檬酸10％、卡波姆9402％和蒸馏水80％；所述改性木瓜蛋白酶的制备方法为：s1取木瓜蛋白酶，加入浓度为95μmol/l的二酰胺溶液，上述木瓜蛋白酶与二酰胺溶液的固液比为1mg：10ml；静置12min，得修饰木瓜蛋白酶；s2将步骤s1得到的修饰木瓜蛋白酶，加入浓度为0.04mol/l，ph值为7.5的tris-盐酸缓冲液，上述修饰木瓜蛋白酶与tris-盐酸缓冲液的固液比为1mg：1ml，于室温下边搅拌边加入氯化钠至饱和状态使游离酶沉淀，静置30min后，离心，取沉淀物，得修饰木瓜蛋白酶聚体；s3取步骤s2得到的修饰木瓜蛋白酶聚体加入质量分数为15％的聚乙二醇400溶液，上述修饰木瓜蛋白酶聚体与聚乙二醇400溶液的固液比为1mg：4ml；于4℃条件下交联12h，即得。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的制备方法与实施例1类似。实施例3、一种含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂由以下组分及其重量百分比组成：改性木瓜蛋白酶14％、柠檬酸8％、卡波姆9401％和蒸馏水77％；所述改性木瓜蛋白酶的制备方法为：s1取木瓜蛋白酶，加入浓度为100μmol/l的二酰胺溶液，上述木瓜蛋白酶与二酰胺溶液的固液比为1mg：12ml；静置15min，得修饰木瓜蛋白酶；s2将步骤s1得到的修饰木瓜蛋白酶，加入浓度为0.06mol/l，ph值为8的tris-盐酸缓冲液，上述修饰木瓜蛋白酶与tris-盐酸缓冲液的固液比为1mg：2ml，于室温下边搅拌边加入氯化钠至饱和状态使游离酶沉淀，静置35min后，离心，取沉淀物，得修饰木瓜蛋白酶聚体；s3取步骤s2得到的修饰木瓜蛋白酶聚体加入质量分数为20％的聚乙二醇400溶液，上述修饰木瓜蛋白酶聚体与聚乙二醇400溶液的固液比为1mg：5ml；于4℃条件下交联14h，即得。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的制备方法与实施例1类似。实施例4、一种含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂由以下组分及其重量百分比组成：改性木瓜蛋白酶8％、柠檬酸10％、羧甲基纤维素钠2％和蒸馏水80％；所述改性木瓜蛋白酶的制备方法为：s1取木瓜蛋白酶，加入浓度为95μmol/l的二酰胺溶液，上述木瓜蛋白酶与二酰胺溶液的固液比为1mg：10ml；静置12min，得修饰木瓜蛋白酶；s2将步骤s1得到的修饰木瓜蛋白酶，加入浓度为0.04mol/l，ph值为7.5的tris-盐酸缓冲液，上述修饰木瓜蛋白酶与tris-盐酸缓冲液的固液比为1mg：1ml，于室温下边搅拌边加入氯化钠至饱和状态使游离酶沉淀，静置30min后，离心，取沉淀物，得修饰木瓜蛋白酶聚体；s3取步骤s2得到的修饰木瓜蛋白酶聚体加入质量分数为15％的聚乙二醇400溶液，上述修饰木瓜蛋白酶聚体与聚乙二醇400溶液的固液比为1mg：4ml；于4℃条件下交联12h，即得。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的制备方法：将改性木瓜蛋白酶溶于蒸馏水中，接着加入柠檬酸和羧甲基纤维素钠搅拌溶解后，加入ph值调节剂调节ph值至6，所述ph值调节剂为10％(w/v)氢氧化钠溶液，即得。对比例1、一种含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的组分及其重量百分比如实施例2；所述改性木瓜蛋白酶的制备方法为：s1取木瓜蛋白酶，加入浓度为95μmol/l的5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液，上述木瓜蛋白酶与二酰胺溶液的固液比为1mg：10ml；静置12min，得修饰木瓜蛋白酶；s2将步骤s1得到的修饰木瓜蛋白酶，加入浓度为0.04mol/l，ph值为7.5的tris-盐酸缓冲液，上述修饰木瓜蛋白酶与tris-盐酸缓冲液的固液比为1mg：1ml，于室温下边搅拌边加入氯化钠至饱和状态使游离酶沉淀，静置30min后，离心，取沉淀物，得修饰木瓜蛋白酶聚体；s3取步骤s2得到的修饰木瓜蛋白酶聚体加入质量分数为15％的聚乙二醇400溶液，上述修饰木瓜蛋白酶聚体与聚乙二醇400溶液的固液比为1mg：4ml；于4℃条件下交联12h，即得。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的制备方法与实施例1类似。与实施例2的区别在于，所述步骤s1中将二酰胺溶液替换为5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液。对比例2、一种含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的组分及其重量百分比如实施例2；所述改性木瓜蛋白酶的制备方法为：s1将木瓜蛋白酶，加入浓度为0.04mol/l，ph值为7.5的tris-盐酸缓冲液，上述木瓜蛋白酶与tris-盐酸缓冲液的固液比为1mg：1ml，于室温下边搅拌边加入氯化钠至饱和状态使游离酶沉淀，静置30min后，离心，取沉淀物，得木瓜蛋白酶聚体；s2取步骤s1得到的木瓜蛋白酶聚体加入质量分数为15％的聚乙二醇400溶液，上述木瓜蛋白酶聚体与聚乙二醇400溶液的固液比为1mg：4ml；于4℃条件下交联12h，即得。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的制备方法与实施例1类似。与实施例2的区别在于，没有对木瓜蛋白酶进行二酰胺溶液处理。对比例3、一种含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的组分及其重量百分比如实施例2；所述改性木瓜蛋白酶的制备方法为：s1取木瓜蛋白酶，加入浓度为95μmol/l的二酰胺溶液，上述木瓜蛋白酶与二酰胺溶液的固液比为1mg：10ml；静置12min，得修饰木瓜蛋白酶；s2将步骤s1得到的修饰木瓜蛋白酶，加入浓度为0.04mol/l，ph值为7.5的tris-盐酸缓冲液，上述修饰木瓜蛋白酶与tris-盐酸缓冲液的固液比为1mg：1ml，于室温下边搅拌边加入氯化钠至饱和状态使游离酶沉淀，静置30min后，离心，取沉淀物，得修饰木瓜蛋白酶聚体；s3取步骤s2得到的修饰木瓜蛋白酶聚体加入质量分数为15％的戊二醇溶液，上述修饰木瓜蛋白酶聚体与聚乙二醇400溶液的固液比为1mg：4ml；于4℃条件下交联12h，即得。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的制备方法与实施例1类似。与实施例2的区别在于，所述步骤s3中将聚乙二醇400溶液替换为戊二醇溶液。对比例4、一种含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的组分及其重量百分比如实施例2；所述改性木瓜蛋白酶的制备方法为：s1取木瓜蛋白酶，加入浓度为95μmol/l的二酰胺溶液，上述木瓜蛋白酶与二酰胺溶液的固液比为1mg：10ml；静置12min，得修饰木瓜蛋白酶。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的制备方法与实施例1类似。与实施例2的区别在于，没有对木瓜蛋白酶进行交联处理。对比例5、一种含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂由以下组分及其重量百分比组成：改性木瓜蛋白酶10％、卡波姆9404％和蒸馏水86％；所述改性木瓜蛋白酶的制备方法与实施例2类似。所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的制备方法与实施例1类似。与实施例2的区别在于，所述含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂不含有柠檬酸。试验例一、改性木瓜蛋白酶的活性测试试验1、试验材料：采用实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4的改性木瓜蛋白酶的制备方法制备得到的改性木瓜蛋白酶，ultrospec2100型紫外分光光度计。2、试验方法：采用国际gb/t23527-2009规定的方法进行测定，其中是以酪蛋白为底物，测定改性木瓜蛋白酶的酶活性，酶活力单位定义为：在测定条件下每分钟水解酪蛋白释放出的三氯乙酸可溶物在280nm处的消光值相当于浓度为1μg/ml酪氨酸消光时所需的酶量，为一个酶活力单位(u)。称取采用实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4的改性木瓜蛋白酶的制备方法制备得到的改性木瓜蛋白酶1.0005g，稀释倍数为250，计算改性木瓜蛋白酶的酶活力。3、试验结果试验结果如表1所示。表1改性木瓜蛋白酶的活性测试试验数据组别吸光度酶活力(μ/g)实施例1组0.70811560实施例2组0.73513035实施例3组0.69910840实施例4组0.67110345对比例1组0.6208207对比例2组0.5997351对比例3组0.6448524对比例4组0.6018036由表1可知，采用本发明实施例1、实施例2和实施例3的改性木瓜蛋白酶的制备方法制备得到的改性木瓜蛋白酶的酶活力大于11840μ/g，而对比例1-4组制备得到的改性木瓜蛋白酶的酶活力与本发明实施例1-3相比，至少降低了32％。说明本发明将木瓜蛋白酶先进行二酰胺溶液处理，接着进行聚乙二醇400溶液交联，可以有效的提高木瓜蛋白酶的酶活性。试验例二、含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂对牙齿的影响试验1、试验材料：实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂。2、试验方法：参考l.e.bertassoniandg.w.marshall在威利期刊公司(wileyperiodicals,inc.)发表的题目为“papain-geldegradesintactnonmineralizedtypeicollagenfibrils(木瓜蛋白酶凝胶可降解完整的非矿化i型胶元纤维)”的文章(scanningvol.31,253–258(2009))中的方法对健康牙本质进行机械性能测试，检测并记录第3次涂布凝胶后的牙本质的组织弹性模量(e)和硬度(h)。3、试验结果：试验结果如表2所示。表2含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂对牙齿的影响试验组别eh(gpa)正常牙本质组19.8±2.10.8±0.09实施例1组18.4±2.20.72±0.08实施例2组19.6±1.90.76±0.1实施例3组18.1±2.30.71±0.09实施例4组17.4±2.20.65±0.13对比例1组11.9±1.9**0.31±0.12**对比例2组10.2±2.4**0.45±0.2**对比例3组13.7±2.5**0.28±0.1**对比例4组10.9±2.3**0.36±0.2**注：与正常牙本质组相比**p＜0.01。由表2可知，本发明实施例1、实施例2和实施例3制备得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂对正常牙本质涂布3次后，其牙本质的机械性能基本无变化，而对比例1-4制备得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂对正常牙本质涂布3次后，与正常牙本质组相比，其牙本质的组织弹性模量(e)和硬度(h)极显著(p＜0.01)的降低，说明本发明提供的改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂对牙齿没有伤害作用，具有较高的安全性，适合长期使用。试验例三、含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的稳定性试验1、试验材料：实施例2和对比例5制备得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂。2、试验方法：将实施例2和对比例5制备得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂采用铝箔袋+纸盒包装，在温度为25±2℃，相对湿度为60％±10％，进行6个月温室留样试验，对样品的外观、重量差异、微生物限度进行考察测定。3、试验结果：试验结果如表3和表4所示。表3实施例2制备得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的稳定性试验表4对比例5制备得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂的稳定性试验由表3和表4可知，本发明制备得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂在温度为25±2℃，相对湿度为60％±10％的条件下保存6个月，其外观、重量差异、微生物限度均符合规定，具有较高的稳定性。而没有添加柠檬酸的对比例5制备得到的含改性木瓜蛋白酶的口腔凝胶剂在温度为25±2℃，相对湿度为60％±10％的条件下保存6个月后开始出现质量问题，严重影响口腔凝胶剂的功效。当前第1页12