纳米珍珠粉/C‑HA复合支架的制备方法与流程

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种纳米珍珠粉/c-ha复合支架的制备方法。
背景技术：
：骨缺损已成为全球健康问题。随着人口老龄化和社会的发展，骨缺损的修复已成为一个重要的临床课题和社会需求。目前，临床上对于骨缺损的治疗主要依赖于同种异体骨移植或自体骨移植，但这两种治疗方式都存在很多的限制。长期以来，自体骨移植都被公认为骨移植的金标准，但存在可取骨量有限、供区并发症、移植的骨块易吸收等缺点；异体骨移植则存在免疫排斥反应和传播传染性疾病的风险。随着医学、生物学和材料科学的发展，金属材料、无机非金属材料和有机材料也被应用于骨缺损的修复。然而，研究较多的不锈钢、钛合金、氧化铝陶瓷等都属于生物惰性材料，不能很好地与组织结合，限制了其临床应用。因此，临床对具有促进骨组织再生，且具有良好力学性能和生物相容性的合成材料的需求持续增长。目前，骨组织工程已成为骨再生治疗的一种有效方法。与传统方法不同，骨组织工程旨在规避现有临床治疗方法的局限性，对受损的组织或器官制备个体化的生物替代品。骨组织工程通常是指利用多孔生物可吸收支架，引导组织细胞的粘附、增殖和分化，从而促进组织再生。支架可模拟天然骨的功能，是骨组织工程中最重要的部分。理想的支架应具备以下特征：①具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性；②具有合适的孔隙结构，有利于细胞的增殖、血管的生长和营养物质的运输；③具有良好的表面形态和理化性质，能够诱导细胞内信号的释放；④能适应骨缺损的特定形状。骨组织支架应具有适当的机械性能，适应人类骨骼系统复杂的应力环境，与新生骨组织结合。如果支架的弹性模量过大，植入一段时间后会导致应力遮挡，最终会导致骨修复的失败。支架的加工条件和应用环境在很大程度上取决于支架材料的物理性能和机械性能。生物活性陶瓷可以促进成骨细胞的生长和分化，然而，由于其脆性大，难以成型，降解非常缓慢等缺点，其临床应用受到限制。此外，生物活性陶瓷的精确性较差，且多孔陶瓷支架上形成的新骨也不能维持负重骨所需的机械负荷。因此，其临床应用也受到较多限制。支架除了需要适当的机械性能，还需要获得多孔结构，为细胞的粘附和增殖提供空间，这也是支架的关键点。天然骨具有多层次的三维孔隙结构，孔隙直径从几纳米到几百微米不等，可满足组织生长的不同要求。通常情况下，直径150-800μm的孔径可允许骨组织和大血管的长入；直径10-100μm的孔隙有利于毛细血管的生长，营养物质的交换和代谢废物的排出；纳米级的孔隙能够提供更大的比表面积，有利于磷灰石的形成和成骨细胞蛋白质的粘附，对成骨细胞的粘附和增殖具有重要意义。近年来，研究者们已找到一些制备具有可控孔隙结构和形状的支架的方法，如熔融沉积建模，立体光刻和3d打印技术。guo等通过模板化的fdm法制备了具有良好机械性能和拓扑性质的支架，他们发现，随着基体模量的增加，支架的孔径减小，并能促进骨髓干细胞的成骨分化。利用间接sl技术制备了磷酸钙骨水泥支架材料，支架的内部具有高度开放、互相连接的通道结构。利用3d打印技术将羟基磷灰石和聚(乙烯)乙醇制备成骨组织支架，支架的结构可以预先设计，并确保大部分的互联性。然而，由于光斑或喷嘴直径的局限性，这些技术很难制备孔径范围从几纳米到几微米的支架。因此，它不能满足不同组织生长的需求。冷冻干燥法又称升华干燥法，其原理是首先将含水的物料冷冻到冰点以下，使液态的水凝固成固态，然后在较高真空条件下，将冰直接升华为蒸气而除去。水分升华后留下的孔隙就构成支架的孔隙结构，因此，冷冻干燥法可通过控制溶液浓度的大小来控制孔隙率。干燥过程均在较低温度下进行，避免了对支架材料中蛋白的不良影响。由于这些优点，越来越多地学者选择冷冻干燥法来进行骨组织支架的制备。有人采用冷冻干燥法制备了多孔羟基磷灰石/壳聚糖-海藻酸钠复合支架，具有高度多孔性，孔隙之间相互关联。通过mtt试验发现，所制备的羟基磷灰石/壳聚糖-海藻酸钠复合支架未对mg-63细胞产生毒性，表明复合支架具有良好的细胞相容性。进一步将羟基磷灰石/壳聚糖-海藻酸钠复合支架植入小鼠的颅骨，发现复合支架可促进体内骨缺损的修复。也有人采用冷冻干燥法将珍珠粉与聚乳酸复合，成功制备了具有良好生物相容性的plla/文石型珍珠粉支架和plla/贝壳珍珠层粉支架，并发现这两种支架能够促进小鼠骨髓间充质干细胞的增殖和分化。还有人采用冷冻干燥法将贝壳粉加入到藻酸盐中，制备成三维多孔支架，发现能促进细胞的粘附和增殖，在骨组织工程有良好的应用前景。羟基磷灰石、β-磷酸三钙等磷酸盐生物陶瓷应用于骨组织工程，已有30多年的历史。但是，羟基磷灰石在体内不易降解，磷酸三钙的降解速度又无法调控，而天然生物材料具有良好的生物相容性及生物可降解性，并能通过诱导生物信号因子的释放，促进成骨细胞的粘附、增殖和分化。并且，随着组织工程技术的发展，将天然生物材料进行改性，可进一步增强其促进骨再生的能力，为骨缺损的修复带来了福音。长期以来，珍珠粉在中国被广泛应用于中药、化妆品和保健品等多个领域。珍珠粉有很高的药用价值，由文石型碳酸钙晶体和嵌入其中的有机基质组成，并含有多种能够促进骨形成的信号分子，具有良好生物相容性，是一种很有应用前景的骨修复材料。珍珠粉含有丰富的矿物质，尤其是含有高质量的钙和“信号蛋白”，能通过分泌信号因子控制细胞的生长和修复。珍珠粉所含有的信号蛋白，能促进皮肤再生和组织修复。研究表明，珍珠粉的水溶性基质和分子量大于14kda的不溶物都能够显著地促进成纤维细胞的增殖、胶原沉积和timp-1的生成，从而促进伤口愈合，且其主要活性成分可能是质量大于14kda的不溶物。此外，这些信号蛋白在促进骨骼健康方面也有重要作用；它们可以促进骨细胞的分化，加速其矿化，从而增加现有骨的密度。因此，如果可将珍珠粉应用在骨组织支架上，那么将会在三维细胞培养、组织工程支架和再生医学领域具有广泛的应用前景。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种具有合适的孔隙结构，有利于细胞的增殖、血管的生长和营养物质的运输，具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，能适应骨缺损的特定形状的纳米珍珠粉/c-ha复合支架制备方法。为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：纳米珍珠粉c-ha复合支架的制备方法，其操作方法为：一、将壳聚糖和透明质酸分别溶解到浓度为1％的醋酸溶液，以2000rpm的速度搅拌5min，室温条件下放置24h，得壳聚糖醋酸溶液和透明质酸醋酸溶液；二、24h后将壳聚糖醋酸溶液和透明质酸醋酸溶液混合，以2000rpm的速度搅拌5min；三、加入1～25％的纳米珍珠粉，以2000rpm的速度搅拌5min；四、-20℃冰箱24h，再冷冻干燥24h，得复合支架。采用本发明技术方案制备的纳米珍珠粉/c-ha复合支架，据试验研究，本发明的复合支架良好的润湿性、抗压强度，且有利于细胞的增殖，且具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，能适应骨缺损的特定形状的纳米珍珠粉/c-ha复合支架及其应用。进一步，所述的透明质酸、壳聚糖的比例为：透明质酸1％、壳聚糖4％。进一步，所述的原料中所含珍珠粉的比例为1～20％。进一步，所述的原料中所含珍珠粉的比例为5～20％。进一步，制备而成的复合支架，其形状为直径为10～20mm，高度为2～10mm的圆柱体，具有多个均匀分布的孔隙结构。进一步，制备而成的复合支架，其孔隙结构的孔隙率为89～93％之间。进一步，制备而成的复合支架，其晶型包括文石型碳酸钙晶型和方解石晶型。进一步，所述的制成的复合支架的直径为15mm，高度为5mm。通过本发明纳米珍珠粉c-ha复合支架的制备方法制备而成的复合支架，通过试验研讨了其复合支架的各项性能及其成骨机制，结论为：(1)随着纳米珍珠粉比例的增加，复合支架的润湿性和抗压强度增加，但是支架的孔隙结构受到干扰，孔隙率轻度下降。复合过程中，纳米珍珠粉的晶型未发生改变。(2)小鼠mc3t3-e1细胞在复合支架上生长良好，呈梭形，分布较均匀。纳米珍珠粉的增加促进了mc3t3-e1细胞的增殖和分化，对细胞的凋亡无明显影响，复合支架的细胞相容性良好。(3)rt-qpcr试验发现，纳米珍珠粉含量为10％和25％的支架组colαi、ocn、opn和runx2四个基因的表达高于对照组。westernblotting试验中，纳米珍珠粉含量为10％和25％的支架组colαi、ocn、opn和runx2四个蛋白的合成高于对照组；但纳米珍珠粉含量为0％的支架组部分蛋白的合成低于对照组。高比例的纳米珍珠粉/c-ha复合支架可能通过上调i型胶原蛋白、骨钙素、骨桥素和runx2基因的表达和蛋白的合成促进成骨。由此可见，纳米珍珠粉/c-ha复合支架在骨组织工程方面有良好的应用前景。附图说明图1是本发明实验一的各组复合支架的大致形态图；图2是本发明实验一的在扫描电镜下纳米珍珠粉浓度为0％的复合支架的孔隙形态图；图3是本发明实验一的在扫描电镜下纳米珍珠粉浓度为1％的复合支架的孔隙形态图；图4是本发明实验一的在扫描电镜下纳米珍珠粉浓度为2.5％的复合支架的孔隙形态图；图5是本发明实验一的在扫描电镜下纳米珍珠粉浓度为5％的复合支架的孔隙形态图；图6是本发明实验一的在扫描电镜下纳米珍珠粉浓度为10％的复合支架的孔隙形态图；图7是本发明实验一的在扫描电镜下纳米珍珠粉浓度为25％的复合支架的孔隙形态图；图8是本发明实验五的各组复合支架的xrd谱图；图9是本发明实验六中纳米珍珠粉的傅里叶变换红外光谱图；图10是本发明实验六中壳聚糖的傅里叶变换红外光谱图；图11是本发明实验六中透明质酸的傅里叶变换红外光谱图；图12是本发明实验六中纳米珍珠粉浓度为0％的复合支架的傅里叶变换红外光谱图；图13是本发明实验六中纳米珍珠粉浓度为1％的复合支架的傅里叶变换红外光谱图；图14是本发明实验六中纳米珍珠粉浓度为2.5％的复合支架的傅里叶变换红外光谱图；图15是本发明实验六中纳米珍珠粉浓度为5％的复合支架的傅里叶变换红外光谱图；图16是本发明实验六中纳米珍珠粉浓度为10％的复合支架的傅里叶变换红外光谱图；图17是本发明实验六中纳米珍珠粉浓度为25％的复合支架的傅里叶变换红外光谱图；图18是本发明实验六中纳米珍珠粉、壳聚糖、透明质酸、纳米珍珠粉的比例为0％～25％的复合支架的傅里叶变换红外光谱比较图；图19是本发明实验七中的扫描电镜下mc3t3-e1细胞的形态图；图20是本发明实验七中mc3t3-e1细胞在复合支架上的分布图。具体实施方式一、实施例：本发明纳米珍珠粉/c-ha复合支架，其中原料中含有珍珠粉的比例如表1所示，单位wt％：表1实施例原料中所含纳米珍珠粉的比例wt％实施例一1实施例二2.5实施例三5实施例四10实施例五25现以实施例三为例，具体说明本发明纳米珍珠粉/c-ha复合支架的制备方法；实施例三：1、试剂，如表2所示表2试剂公司和型号微米珍珠粉海南京润珍珠生物技术股份有限公司透明质酸钠h107141，aladdin壳聚糖c105803，aladdin醋酸分析纯，aladdin2、仪器如表3所示表33、操作步骤1)通过纳米陶瓷砂磨分散机采用机械球磨法将微米珍珠粉研磨成纳米珍珠粉，干燥消毒；2)将4wt％壳聚糖和1wt％透明质酸分别溶解到1％的醋酸溶液中，在thinky搅拌机中以2000rpm的速度搅拌5min，室温条件下放置24h，得壳聚糖醋酸溶液和透明质酸醋酸溶液；3)24h后将壳聚糖醋酸溶液和透明质酸醋酸溶液混合，在thinky搅拌机中以2000rpm的速度搅拌5min；4)然后加入2.5wt％的纳米珍珠粉，以2000rpm的速度搅拌5min；5)用注射器将溶液浇铸在24孔板中，每孔0.5ml，在-20℃冰箱24h，冷冻干燥24h，得纳米珍珠粉/c-ha复合支架。二：纳米珍珠粉/c-ha复合支架的性能确认1、实验组：实验组一：与实施例三相比，区别仅在于原料中所含纳米珍珠粉的比例为0wt％；实施例一～实施例五2、实验试剂与仪器与实施例的试剂与仪器相同一)、实验一：对复合支架表面形貌的确定1、通过扫描电子显微镜观察复合支架的表面形貌将样本切成3mm宽的薄片，使样品表面尽量平整。用真空冷冻干燥机干燥后将样品依次粘在导电胶上，在导电胶的左上角做好标记，将样本表面喷金60s。然后打开扫描电子显微镜(mira3，捷克)的样品室，将所要观察的样品固定，抽真空，用扫描电镜直接观察断面形貌。2、结论如图1所示，支架具有高度多孔性，孔隙均匀分布，连通良好。进一步观察发现，当纳米珍珠粉含量较低时，复合支架的孔隙结构与实验组一：单纯的壳聚糖-透明质酸支架相似。然而，如图2～图7所示，随着纳米珍珠粉含量从0％逐渐提高，当达到25％，支架的表面逐渐粗糙，孔隙结构趋于紊乱，局部发生断裂。说明原料中所含纳米珍珠粉的比例为1～25wt％，其形貌均可满足复合支架的外形要求。二)、实验二：对复合支架孔隙率的确定1、方法复合支架的孔隙率(％)、总入量(ml/g)和总孔面积(m2/g)通过高性能全自动压汞仪测得。将通过实施例一～实施例五、实验组一制备的复合支架样品放置在样品盒内，调节压力，使水银进入材料中所有的孔，测定样品浸润前后的重量。2、结论如表4所示：随着纳米珍珠粉比例的增加，支架的孔隙率和总入量减少，而总孔面积增加，但实验组一和实施例一～实施例五都具有较高的孔隙率，为89％至93％之间，实施例一的孔隙率低于实验组一和实施例二的支架。表4由此可见实施例一～实施例五的孔隙率均较高。三)、实验三：复合支架润湿性的确定1、方法润湿性主要是通过水滴在其表面形成的接触角来表征的，本发明通过jc2000c型静态接触角测量仪(powereach，上海中晨数字技术设备有限公司，中国)进行复合膜接触角的测定。2、结论各组别复合支架接触角的具体值如表5所示，可见，随着纳米珍珠粉比例的增加，复合支架的接触角变小，即复合支架的润湿性增加，实施例一的支架润湿性最差，实施例四、五的支架润湿性最佳。表5，单位：度四)、实验四：复合支架抗压强度的确定1、方法本发明采用ctm8050微机控制电子万能试验机(上海协强仪器科技有限公司，中国)进行复合支架抗压强度的测量。2、结论如表6所示，复合支架的抗压强度随着纳米珍珠粉比例的增加而显著增加。表6组别比例样品1样品2样品3实验组一0％0.1720.1640.155实施例一1％0.2110.2190.225实施例二2.5％0.2920.3090.295实施例三5％0.3120.3480.348实施例四10％0.3390.3990.4实施例五25％0.5750.5750.585五)、实验五：复合支架晶型的确定1、方法研究表明，文石型珍珠粉比球文石型的珍珠粉能更好地促进细胞的增殖和分化。在本发明中，支架复合的原料为文石型珍珠粉，复合的过程包括混合、搅拌、干燥和消毒。为了检测复合过程中珍珠粉的晶型是否发生改变，对复合支架用x射线衍射仪进行x射线衍射检测。2、结论如图8所示：当纳米珍珠粉的比例比较低时，它的特征峰不明显。当纳米珍珠粉的含量超过5％时，它的特征峰出现。在各组别的复合支架中，文石型碳酸钙为主要的晶型，仅出现少量方解石晶型。六)、实验六：复合支架的成分确定1、方法红外光谱是一种分子吸收的光谱，又称为振动转动光谱。其原理是，当分子受到红外光的辐射，产生振动能级的跃迁。当在振动时有偶极矩改变时，就吸收红外光子，从而形成红外吸收光谱。红外光谱法可从分子的特征吸收峰鉴定化合物的分子结构，从而进行物质的定性和定量分析，以定性分析为主。本发明通过傅里叶变换红外光谱学，检测分析纳米珍珠粉、壳聚糖、透明质酸不同成份分子之间的相互作用。2、结论通过傅里叶红外光谱检测实施例一～实施例五、实验组一复合支架复合过程中各成分间的反应。纳米珍珠粉/c-ha复合支架的ftir谱图，从谱图可以得到吸收峰的位置、吸收峰的强度和吸收峰的形状。如图9～图18所示：在谱图中，3600至3200cm-1的峰为o-h的伸缩振动吸收峰。纳米珍珠粉(npp)的谱图中，1488cm-1为c-o伸缩振动吸收峰，860cm-1为co32-弯曲振动吸收峰。壳聚糖(c)的谱图中，2879cm-1为c-h伸缩振动吸收峰，1650cm-1和1589cm-1处归属为酰胺i和酰胺ii两峰的重叠。1155cm-1为c-o-c反对称伸缩振动吸收峰，1085cm-1为糖骨架的c-o伸缩振动吸收峰。在透明质酸(h)的谱图中，2921cm-1为c-h伸缩振动吸收峰，1623cm-1和1413cm-1分别归属于coo-的不对称和对称伸缩振动吸收峰。1558cm-1为酰胺峰，1155cm-1为c-o-c反对称伸缩振动吸收峰，1044cm-1处相邻两峰分别归属为糖骨架上的c-h和c-o-c弹性振动吸收峰。由此可见：透明质酸对复合支架谱图的影响小于壳聚糖。与壳聚糖的谱图相比，各比例复合支架中酰胺i峰和酰胺ii峰均发生了蓝移，即向短波长移动。与透明质酸的谱图相比，各比例复合支架中1700至900cm-1的峰强度均减弱。在各比例复合支架的谱图中，纳米珍珠粉、壳聚糖、透明质酸三种成分的峰出现叠加，且随着纳米珍珠粉比例的增加，其特征峰(1488cm-1和860cm-1)逐渐明显。表明珍珠粉能够有效的嵌入到聚合物中。三、纳米珍珠粉/c-ha复合支架的细胞相容性实验在骨组织工程的研究中，对支架材料的选择，细胞相容性是首要的指标之一。虽然珍珠粉、透明质酸、壳聚糖三者都具有良好的生物相容性，但三者复合成支架后的生物相容性尚不清楚。在本发明中，观察各实施例及实验组的复合支架上细胞的形态和分布；通过cck-8试验检测各组细胞的增殖情况；通过alp试验检测各组细胞的分化；通过流式细胞术检测各组细胞的凋亡；从而评估纳米珍珠粉/c-ha复合支架的细胞相容性。1、实验组实验组一：与实施例三相比，区别仅在于原料中所含纳米珍珠粉的比例为0wt％实施例一～实施例五2、实验试剂，如表7所示表73、实验仪器，如表8所示表8一)、实验七：细胞培养、复合支架上的细胞形态、分布1、方法将制备好的实施例一～实施例五、实验组一的复合支架用钴60进行消毒，照射剂量为15kgy。将复合支架浸泡在α-mem基础培养基(hyclone，美国)中12h后进行细胞培养。将支架放在24孔板中，每孔注入含50,000个细胞的50μl完全培养基，放在37℃、含5％co2的培养箱中培养1h，待细胞贴壁后每孔加入1ml完全培养基进行细胞培养，隔日换液。将细胞在支架上培养7d后，将支架转移到新的24孔板里，用2.5％戊二醛溶液在4℃固定过夜，用梯度乙醇溶液(0％，30％，50％，75％，95％，100％)脱水，每个浓度脱水两次，最后用梯度叔丁醇溶液(25％，50％，100％))洗去乙醇。将支架冷冻干燥4h，在扫描电镜(mira3，捷克)下观察支架上细胞的形态。将样本切成3mm宽的薄片，使样品表面尽量平整。干燥后将样品依次粘在导电胶上，表面喷金60s。然后打开扫描电镜的样品室，将所要观察的样品固定，抽真空，用扫描电镜观察细胞的形态。2、结论将小鼠mc3t3-e1细胞培养在复合支架上，隔日换液，观察三维培养条件下细胞的形态。图19为扫描电镜下mc3t3-e1细胞的形态，箭头所示为mc3t3-e1细胞，呈梭形，细胞伸出伪足附在支架上。图20显示了mc3t3-e1细胞在支架上的分布，图中蓝色荧光(白点处)为mc3t3-e1细胞的细胞核，淡蓝色絮状物(灰白色絮状物)为支架材料，细胞在支架上的分布较均匀。复合支架上的mc3t3-e1细胞呈梭形，铺展情况较好，与在二维培养状态下细胞的形态相似，表明复合支架具有良好的机械性能，有利于细胞的粘附和生长。mc3t3-e1细胞在支架上分布较均匀，说明mc3t3-e1细胞能在复合支架上生长良好，表明支架具有良好的细胞相容性。二)、实验八：复合支架上细胞增殖情况的检测1、方法利用cck-8试剂盒分别于培养第1d、3d、5d、7d检测支架上细胞的增殖情况，每个样本设置3个复孔，用分光光度计(bio-radxmarktm，美国)检测450nm处的吸光度。2、结论于细胞培养第1d、3d、5d和7d通过cck-8测试评估各组细胞的增殖情况，如表9所示。随着时间的增加，各支架组的mc3t3-e1细胞均增殖明显。第1d各组间的细胞量无明显差异。3d后，各组的细胞均迅猛增加，并且随着纳米珍珠粉比例的增加，细胞增殖越明显，细胞增殖最多的为纳米珍珠粉比例为25％的支架组。随着时间的增加，各支架组mc3t3-e1细胞均增殖明显，表明复合支架材料具有良好的细胞相容性。随着纳米珍珠粉比例的增加，细胞增殖越明显，这表明纳米珍珠粉能够有效地促进mc3t3-e1细胞的增殖。第1d各组间的细胞量无明显差异，这可能是由于mc3t3-e1细胞在初始24h内主要进行贴壁，尚未进行细胞增殖。表9三)、实验九：复合支架上细胞分化的检测1、方法碱性磷酸酶能有效评估mc3t3-e1细胞的分化情况。将mc3t3-e1细胞以5×105个/支架的密度种于支架上，用成骨培养基培养28d，分别在0d、7d、14d、28d用碱性磷酸酶测试盒(a059-1，南京建成生物工程研究所)进行检测。2、结论于细胞培养第1d、7d、14d通过检测mc3t3-e1细胞的碱性磷酸酶的活性评估各组细胞的分化情况。各组支架材料样本中细胞悬液，经计算所得各组细胞的碱性磷酸酶活力(mg/gprot)结果如表10所示。随着时间的增加，碱性磷酸酶的活性增加；随着纳米珍珠粉的增加，碱性磷酸酶的活性逐渐增加，各组间的差异在第7d最明显。说明复合支架在早期提高了细胞碱性磷酸酶的活性,促进细胞的分化。表10四)、实验十：复合支架上细胞凋亡的检测1、方法annexinv是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。将mc3t3-e1细胞以5×105个/支架的密度种于支架上，培养3d、7d、10d后用胰酶消化后收集，通过annexinv流式细胞术检测细胞的凋亡情况。2、结论于细胞培养第3d、7d、10d采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。将各组细胞凋亡率统计如表11所示，各组的凋亡率均在正常范围内，且没有明显差异，表明复合支架未促进细胞的凋亡，且不受纳米珍珠粉比例的影响。结果表明，纳米珍珠粉/c-ha复合支架未促进细胞的凋亡，支架具有无毒性，且不受纳米珍珠粉比例的影响。表11综上所述：小鼠mc3t3-e1细胞成功生长在支架上，且在一定范围内，高比例的复合支架促进了细胞的增殖和分化，细胞相容性良好。四、纳米珍珠粉/c-ha复合支架对成骨相关基因表达、蛋白合成的影响骨一直被认为是一种结构器官。经典理论认为，骨在动物体内起结构支架作用，包含三种类型的细胞：成骨细胞、骨细胞和破骨细胞。成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞，能分化为骨细胞。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，其活性可以通过wnt信号通路等多种途径调节。破骨细胞能吸收骨组织，来源于单核/巨噬细胞系的单核细胞。骨细胞和成骨细胞能分泌一些信号因子，如i型胶原、骨钙素、骨桥素和runt相关转录因子2，来调节成骨细胞和破骨细胞的相互作用，从而进行骨的再生和重建。i型胶原是骨的细胞外基质中主要的蛋白之一。胶原蛋白能够提供到细胞表面的整合素受体的结合位点，如rgd基序，因此对细胞粘附、细胞存活、迁移和维持组织和器官的物理稳定性都是必不可少的。骨钙素是一种成骨细胞特异性蛋白，是细胞外基质中的一种主要的非胶原蛋白质。骨钙素由成骨细胞系合成和分泌，如成骨细胞、骨细胞。大多数的骨钙素存在于骨基质中，仅有少量存在于血液中，这是因为它对骨基质的亲和力较强。它有促成骨和骨形成的功能。成骨细胞能分泌骨钙素刺激成骨细胞分化和骨细胞的成熟。骨桥素自20多年前第一次被描述以来，在许多生理和病理过程中扮演重要角色，包括生物矿化、组织重塑和炎症。作为细胞外基质蛋白和促炎症细胞因子，opn被认为是促进单核细胞和巨噬细胞的募集，并介导白细胞分泌细胞因子。大量体内外研究采用runt相关转录因子2过表达来诱导骨髓间充质干细胞进行成骨分化，以及诱导一些成骨相关基因的活性，包括骨钙素、i型胶原、骨桥素和涎蛋白。有研究证明，c2c12细胞在成骨诱导早期高表达runx2基因；在成熟的成骨细胞中，runx2的表达显著降低；在成骨细胞分化为骨细胞的过程中，runx2则无法检测到。因此，runx2可能参与启动细胞分化为成骨细胞，其表达在后期降低，所以runx2的低表达对成骨细胞功能的维持是至关重要的。在本发明中，通过将无支架的空白对照组和实施例一～实施例五、实验组一的复合支架组细胞培养0d、3d、7d和14d，进行实时荧光定量多聚核苷酸链式反应试验，检测各组复合支架对成骨相关基因表达；于培养第0d、3d、7d、14d进行westernblotting试验，讨论纳米珍珠粉/c-ha复合支架对成骨相关蛋白合成的影响。1、试剂，如表12所示：表122、仪器如表13所示表133、实验方案将各组细胞培养在成骨诱导培养基中培养，于培养第0d、3d、7d、14d提取细胞rna采用sybr法进行实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(rt-qpcr)试验，检测纳米珍珠粉/c-ha复合支架对成骨相关基因表达的影响；于培养第0d、3d、7d、14d进行westernblotting试验，检测纳米珍珠粉/c-ha复合支架对成骨相关蛋白合成的影响。一)、实验十一：实时荧光定量多聚核苷酸链式反应1、细胞rna的提取2、rna反转录3、rt-qpcr的操作1)在ncbi上搜索目的基因colαi、ocn、opn和runx2的序列，引物设计如表14所示：表142)体系组成如表15所示表153)定量pcr扩增程序：将体系混匀，置于荧光定量pcr仪中。95℃×10min预变性后，然后以95℃×15s(变性)，60℃×1min(退火及延伸)为一个循环，进行40个循环。4、结论目的基因colαi、ocn、opn和runx2的相对表达量表16、17、18、19所示：细胞培养当天如表16所示，各组支架目的基因的表达差异无统计学意义。表16细胞培养第3d如表17所示，纳米珍珠粉含量为25％的支架组opn和runx2的表达高于空白对照组(p<0.05)，其余各组均无统计学意义。表17细胞培养第7d如表18所示，纳米珍珠粉含量为10％和25％的支架组colαi和runx2的表达高于对照组(p<0.05)；纳米珍珠粉含量为25％的支架组ocn和opn的表达也高于对照组(p<0.05)。表18细胞培养第14d如表19所示，纳米珍珠粉含量为10％和25％的支架组ocn和runx2的表达高于对照组(p<0.05)。表19本发明的rt-qpcr试验采用sybrgreen法，以β-actin为内参基因，发现纳米珍珠粉含量为10％和25％的支架组colαi、ocn、opn和runx2四个基因的表达总体上高于对照组；但纳米珍珠粉含量为0％的支架组基因的表达与对照组无统计学差异，说明高比例的纳米珍珠粉/c-ha复合支架可能通过上调i型胶原蛋白、骨钙素、骨桥素和runx2基因的表达促进成骨。二)、实验十二：westernblotting蛋白质印迹法实验目的蛋白colαi、ocn、opn和runx2蛋白的相对合成量如表20、21、22、23所示。细胞培养当天如表20所示，纳米珍珠粉含量为25％的支架组colαi、ocn和runx2蛋白的合成高于空白对照组(p<0.05)，纳米珍珠粉含量为10％的支架组runx2蛋白的合成高于空白对照组(p<0.05)，纳米珍珠粉含量为0％的支架组ocn和runx2蛋白的合成高于空白对照组(p<0.05)。表20细胞培养第3d如表21所示，纳米珍珠粉含量为25％的支架组colαi和runx2蛋白的合成高于空白对照组(p<0.05)，纳米珍珠粉含量为10％的支架组runx2蛋白的合成高于空白对照组(p<0.05)。而关于ocn蛋白，三个比例的纳米珍珠粉/c-ha复合支架组的合成均低于空白对照组(p<0.05)，且纳米珍珠粉含量为0％的支架组的colαi的合成低于空白对照组(p<0.05)。表21细胞培养第7d如表22所示，纳米珍珠粉含量为25％的支架组colαi、ocn、opn和runx2四个蛋白的合成均高于空白对照组(p<0.05)，纳米珍珠粉含量为10％的支架组colαi和runx2蛋白的合成高于空白对照组(p<0.05)，纳米珍珠粉含量为0％的支架组的ocn的合成高于空白对照组，但opn的合成低于空白对照组(p<0.05)。表22细胞培养第14d如表23所示，纳米珍珠粉含量为25％的支架组ocn蛋白的合成高于空白对照组(p<0.05)，纳米珍珠粉含量为10％的支架组colαi、ocn和runx2蛋白的合成高于空白对照组(p<0.05)，纳米珍珠粉含量为0％的支架组的ocn的合成高于空白对照组(p<0.05)。表23本发明细胞培养第3d，三个比例的纳米珍珠粉/c-ha复合支架组ocn蛋白的合成均低于空白对照组(p<0.05)，但是细胞培养第7d，纳米珍珠粉含量为0％和25％的支架组ocn蛋白的合成均高于空白对照组(p<0.05)，细胞培养第14d，三个比例的纳米珍珠粉/c-ha复合支架组ocn蛋白的合成均高于空白对照组(p<0.05)。ocn蛋白在第3d合成异常，但总体趋势是复合支架组的合成高于空白对照组。高比例的纳米珍珠粉/c-ha支架可能通过上调i型胶原(colαi)的表达，促进细胞外基质的形成。通过胶原蛋白提供的整合素受体的结合位点，促进细胞的粘附、迁移和维持组织和器官的物理稳定性。高比例的纳米珍珠粉/c-ha支架可能通过上调骨钙素ocn的表达，促进骨基质的形成，为小鼠mc3t3-e1的生长提供适宜的细胞外环境。高比例的纳米珍珠粉/c-ha支架可能通过上调骨桥素opn的表达，调节成骨细胞和破骨细胞的相互作用，以及各种因子的表达，抑制细胞凋亡。runx2/cbfα1也被称为多瘤病毒增强子结合蛋白2/核心结合因子或急性髓细胞白血病因子。高比例的纳米珍珠粉/c-ha支架可能通过上调runx2的表达，诱导小鼠mc3t3-e1细胞进行成骨分化，诱导colαi、ocn、opn等成骨相关基因的活性。综上所述：复合支架促进了colαi、ocn、opn和runx2等成骨分化相关基因的表达和蛋白合成。综合考虑纳米珍珠粉的含量在1～20之间的复合支架其形态稳定性好且性能较优，可广泛使用在骨组织工程方面。所述核苷酸序列表的可读载体内容为:<110>海口市人民医院<120>纳米珍珠粉c-ha复合支架的制备方法<160>10<210>1<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>1ccaaagccagagtggaccctt<210>2<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>2gcttccgtcagcgtcaacacc<210>3<211>20<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>3cagaatctccttgcgccaca<210>4<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>4attcgtcagattcatccgagt<210>5<211>19<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>5ctgacctcacagatgccaa<210>6<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>6catactggtctgatagctcgt<210>7<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>7gcgacctcaagatgtgccact<210>8<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>8ctctccaaaccagacgtgctt<210>9<211>20<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>9catcctgcgtctggacctgg<210>10<211>20<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>10taatgtcacgcacgatttcc。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。<110>海口市人民医院<120>纳米珍珠粉c-ha复合支架的制备方法<160>10<210>1<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>1ccaaagccagagtggaccctt<210>2<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>2gcttccgtcagcgtcaacacc<210>3<211>20<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>3cagaatctccttgcgccaca<210>4<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>4attcgtcagattcatccgagt<210>5<211>19<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>5ctgacctcacagatgccaa<210>6<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>6catactggtctgatagctcgt<210>7<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>7gcgacctcaagatgtgccact<210>8<211>21<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>8ctctccaaaccagacgtgctt<210>9<211>20<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>9catcctgcgtctggacctgg<210>10<211>20<212>rna<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>10taatgtcacgcacgatttcc当前第1页12