胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途的制作方法

本发明涉及一种胶原蛋白植入物作为青光眼手术辅助复原物中的用途。更特别地，本发明涉及一种牛皮纯化胶原蛋白植入物用于辅助青光眼小梁切除手术(trabeculectomy)伤口复原的用途。
背景技术：
：青光眼是导致失明的最主要原因之一。全世界有超过6600万的青光眼患者，其占有人口比率的1.0～1.2％左右，全世界每年约有十分之一的青光眼患者需要进行显微手术，因此预估每年将有六百六十万人，超过1000万次的青光眼手术需求。据研究显示，估计到2020及2040年分别会有7600万及1.1亿的青光眼患者(y.c.tham等人,ophthalmology121:2081-2090,2014)。2013年统计，在亚洲的盛行率约为3.54％(95％credibleinterval(cri)1.83to6.28)，当中原发隅角开放性青光眼poag(2.34％,95％cri0.96to4.55)远高于原发隅角闭锁性青光眼pacg(0.73％,95％cri0.18to1.96)(e.w.chan等人,brjophthalmol,2016)。正常情形下房水(aqueoushumor)自睫状体(ciliarybody)生成后经小梁网(trabecularmeshwork)，流到薛氐管(canalofschlemm)然后流到血液中回收。青光眼患者是指此一流通渠道受阻，造成眼球内压力(intra-ocularpressure,iop)异常增加(一般人正常眼压在10-21mmhg，青光眼患者iop>21mmhg)，此高眼压会压迫视网膜及视神经，亦可能造成局部血管塌陷，影响眼球正常的血液供应，造成视神经萎缩及视野缺损，临床上称为青光眼。青光眼的治疗首要目的在于降低升高的眼球内压力，防止视神经及视野进一步恶化，以保护视网膜，视神经及其它组织。青光眼可依照前房隅角的情况分为隅角开放性青光眼(open-angleglaucoma)及隅角闭锁性青光眼(angle-closureglaucoma)，除此以外，还有先天性青光眼及续发性青光眼。当药物无法控制眼压导致常常疼痛会演变为难治型青光眼。对于使用降眼压药物仍无法控制病情的患者，目前治疗上多采用小梁切除术联合抗代谢药物(trabeculectomycombinedwithantimetabolites)或植入引流装置(drainagedeviceimplanttherapy)治疗，然而其成功率仍然不高且可能有并发症。由于传统青光眼手术(青光眼滤过性手术或小梁切除术)，对于新生血管性青光眼、青少年青光眼、非首次青光眼手术患者、及外伤性青光眼患者，手术的成功率不超过50％。而手术失败最主要的原因在于结膜下手术伤口的结疤，导致人造的房水流通通道受到阻塞，眼压再度升高。目前治疗上多采用小梁切除术联合抗代谢药物(trabeculectomycombinedwithantimetabolites)或植入引流装置(drainagedeviceimplanttherapy)治疗难治性青光眼取得较好的效果。但由于引流装置昂贵，同时两者都发生一些较严重的并发症。在小梁切除术或滤过性手术时常会使用antimetabolites(如mitomycin-c(mmc)或抗癌药物5-fluorouracil(5-fu)，后者目前并未经卫生福利部核准于青光眼手术适应症)来抑制结疤的形成。虽然mmc作为青光眼手术后并用治疗为现在国内标准治疗，但是根据国内回溯性研究显示[10]，mmc治疗原发性(primary)青光眼两年完全成功率(≦21mmhg)为60.6％，而在治疗继发性青光眼两年完全成功率(≦21mmhg)则仅达41.9％；然而，于青光眼小梁切除手术后并用mmc的治疗的并发症发生率却是58.5％。而且，antimetabolites(如mmc)可能引发许多的副作用(包括低眼压，浅前房，结膜变薄，眼内炎等等)。另外，房水引流管是植入一个不会被分解的引流管使得房水的流动通道能够建立。但是，这个不会被分解的植入物是个异物，手术的失败率很高常常伴随着通道被阻塞、眼球感染、引流管移位、眼球移动障碍等副作用。可吸收性胶原蛋白作为青光眼手术辅助是目前最有潜力的技术。截至目前为止此类可吸收性胶原蛋白作为青光眼手术辅助的临床研究，皆显示此技术是一个极安全的技术，而在有效性上并不比目前的青光眼手术加上mmc药物辅助差，且不会增加青光眼手术并发症的机率。胶原蛋白为动物体内含量最高的蛋白质，广泛存在动物体的结缔组织间造成稳固的支架作用。从猪或牛动物来源，经过去除引起免疫反应的端肽，并纯化的胶原蛋白在体内可以被完全分解。胶原蛋白常被用来诱导组织增生及防止伤口结疤的材料。目前已知的胶原蛋白超过20型，而第一型胶原蛋白以广泛应用在医疗器材作为组织的引导、再生或阻隔避免感染，例如“nanosigma”resorbablecollagenmembrane(卫署医器制字第002868号)、"sunmax"collagendentalmembrane(卫署医器制字第002868号)及“horien”collagendentalmatrix(卫署医器制字第003459号)皆为国内自制产品。目前于先前技术文献中所述及的眼科用植入胶原蛋白，多为aeonastroncorporation的ologentm(之前称作oculusgentm)或是lifespringbiotechco.的igentm，两者属同一技术来源，植入物为猪来源的胶原蛋白，组成为具有10-300微米3d孔洞的1％胶原蛋白/c-6-s共聚物(>90％冷冻干燥猪源性胶原蛋白与<10％的冷冻干燥糖胺聚醣(glycosaminoglycan))(w.c.hsu,j.y.等人,googlepatents,2006；美国专利usp7,544,368)。本发明遂尝试将一种具有三维多孔结构的可吸收性牛皮纯化胶原蛋白基质，应用于辅助青光眼小梁切除手术(trabeculectomy)，希望藉由该胶原蛋白植入物的多孔性结构，可于青光眼小梁切除手术伤口提供一个良好的再生环境，让组织细胞的增生随机的分布而不产生结膜下结疤，并且辅助小梁切除术降低眼压，增加手术成功率，及进而取代mmc等抑制结疤药物的使用，避免产生因为使用该等药物所导致的不良副作用。技术实现要素：基于以上的目的发现，本发明的可吸收性牛皮纯化胶原蛋白植入物在置入后，除了维持一个结膜下的空间外，基质内的孔会吸收房水，预防低眼压。饱和的基质同时形成一个压力作用在巩膜瓣下，而在结膜开/合的情况下，此压力的作用得以控制房水的进出，如此可以调节初期未愈合伤口下的眼内压力。于是，本发明的一方面是关于，一种胶原蛋白植入物在制备青光眼手术辅助复原物中的用途，其中该胶原蛋白植入物是由干燥脱水的牛皮纯化胶原蛋白组成，且该胶原蛋白植入物具有20-200微米的三维立体孔洞。于本发明的一些具体实施例中，该青光眼手术为青光眼小梁切除手术(trabeculectomy)。于本发明的一些具体实施例中，该胶原蛋白植入物是用于辅助青光眼小梁切除手术(trabeculectomy)的伤口复原。于本发明的一些具体实施例中，该胶原蛋白植入物是用于吸收房水稳定眼压。于本发明的一些具体实施例中，该胶原蛋白植入物具有生物可吸收性。于本发明的一些具体实施例中，该胶原蛋白植入物是由经干燥脱水的100％纯的牛皮纯化胶原蛋白所组成。于本发明的一些具体实施例中，该牛皮纯化胶原蛋白为第i型胶原蛋白(typeicollagen)。于本发明的一些具体实施例中，该牛皮纯化胶原蛋白为100％纯的第i型去端肽胶原蛋白(100％puretypeiatelocollagen)。于本发明的一些具体实施例中，该胶原蛋白植入物是用于在青光眼小梁切除术进行结膜缝合前植入巩膜瓣上的结膜下空间。于本发明的一些具体实施例中，该胶原蛋白植入物所具有三维立体孔洞用于提供植入部位组织细胞的增生环境。【附图说明】图1为本发明的可吸收性牛皮纯化胶原蛋白植入物外观的扫描式电子显微镜放大图；左图为植入物的侧面观察图，右图为植入物的正面观察图；图2为植入28天后取下围绕测试物与对照物的肌肉组织，进行固定制备得的组织病理切片观察图；图2a为试验组胶原蛋白植入物的组织病理切片观察(动物id:1左臀肌)，箭头指示为植入位置(20x,h&estain)；图2b为对照组植入物的组织病理切片观察(动物id:1右臀肌)，箭头指示为植入位置(20x,h&estain)；图3为兔子于术后3、7、14、21、28天的眼压变化百分比(iopchange％)；图4为胶原蛋白植入物植入21天后实验组切片染色图(h&estain)；植入物明显变薄，周围被新生组织包覆且孔洞内已有组织长入，图中所示圈内可发现生长进入的组织；图5为胶原蛋白植入物植入21天后的组织切片染色图(masson'strichrome染色)。箭头所指为新生的血管；图6为实验组植入胶原蛋白植入物28天后的组织切片染色图(h&e染色)。图7为对照组植入14天后的组织切片染色图(h&e染色)。箭头所指为结膜下方结痂及巩膜伤口的愈合。【具体实施方式】本发明的其他特色及优点将于下列实施范例中被进一步举例与说明，而该实施范例仅作为辅助说明，并非用于限制本发明的范围。在以下各实施例中，本发明的吸收性胶原蛋白植入物所含有的牛皮纯化胶原蛋白是由台湾台中工业区的“台科生物科技有限公司”出产的100％纯胶原蛋白，产品型号为fullyaidcollagenwounddressinglot:fa。实施例1.胶原蛋白植入物辅助小梁切除术的操作例于本发明所例举使用的胶原蛋白植入物，是完全由经干燥脱水的牛皮纯化100％纯第一型去端肽胶原蛋白(100％puretypeiatelocollagen)所组成，具有20～200微米的三维立体孔洞。通过试片外观放大的扫描式电子显微镜观察结果(图1)可以发现，在干燥的胶原蛋白层状结构中，每一层有许多微米级的孔(直径约为20～200微米)，而层和层之间约为10～20微米间隔的散乱排列，且有许多不规则的支架桥接形成孔洞。因此，本发明的胶原蛋白植入物所具有的立体结构可有利于纤维母细胞的成长，借此纤维母细胞在伤口形成的初期会在该胶原蛋白植入物的孔径内成长，如此便可预期形成一个没有结疤的组织复原。本发明的胶原蛋白植入物是为辅助小梁切除术设计，其手术进行亦与传统小梁切除术相同，只是在青光眼小梁切除术进行结膜缝合前，将本发明的胶原蛋白植入物置入巩膜瓣上的结膜下空间即可。胶原蛋白植入物辅助小梁切除手术的标准操作流程：进行球后麻醉(retrobulbaranesthesia)。使用碘酒进行消毒感控，放置无菌洞巾。放置眼睑窥器(eyelidspeculum)。使用0-0silk固定上直肌。使用11号手术刀于在十到十二点钟区域进行穹窿底结膜翻瓣(fornix-basedconjunctivalflap)。使用电灼刀进行巩膜止血(scleralhemostasis)。使用11号手术刀于在十到十二点钟区域进行轮部底巩膜翻瓣(limbal-basedscleralflap)。使用11号手术刀在巩膜翻瓣下进行部分厚度巩膜切除术(partialthicknesssclerectomy)。以25号针在两点钟方向(at2o’clockasasidepore)进行前房穿孔。在巩膜切除位置进行穿孔到前房。轮底翻瓣后方(post.lipoflimbalwound)进行小梁切除术(trabeculectomy)。测试过滤(filtration)功能及伤口渗漏。小梁切除位置旁进行手术周边虹膜切除术。在小梁切除手术进行结膜缝合前，研究人员(或助手)将本发明的胶原蛋白植入物的铝箔包装以无菌操作方式打开，医师使用夹子将胶原蛋白植入物取出，置入巩膜瓣上的结膜下空间，接着以10-0尼龙缝线进行结膜缝合。施予含有类固醇及抗生素的药物(例如vigamox、tobradex)。最后加上纱布加压。手术后，病患须于约定的时间定期回诊，同时医师通常会给予青光眼手术，术后含抗生素及类固醇用药的眼药水或眼药膏。实施例2.吸收性胶原蛋白植入物的内毒素含量测试内毒素是由革兰氏阴性菌所产生的物质，易引发人体的过敏反应与发炎反应。为了避免医疗器材在制造过程可能产生的内毒素对人体造成影响，必须审慎测试并评估其使用上的安全性。此试验体系为鲎试剂(limulusamebocytelysate,lal)。本实例遂以动力呈色法，测试本发明胶原蛋白植入物的内毒素含量。内毒素测定是根据iso10993-12、usp<85>与usp<161>规范所叙述的方法与条件进行处理及测试。取3件试验物质(胶原蛋白植入物)，每件依据0.2g±10％/ml比例以5.00ml无热原水于37±1℃萃取1小时，混合后的萃取液即为测试溶液。试验物质测试溶液以无热原水序列稀释后进行内毒素含量测试。取25μl无热原水及25μl不同序列稀释的测试试验物质溶液于96孔盘中后，再加入50μllal试剂溶液。检量线溶液：取50μl不同浓度检量线溶液，个别加于96孔盘中，再加入50μllal试剂溶液。阴性对照组:取50μl无热原水加于96孔盘中，再加入50μllal试剂溶液。阳性对照组：取25μl添加测试所使用的标准品内毒素溶液及25μl不同序列稀释的测试样品溶液于96孔盘中后，再加入50μllal试剂溶液。表1、以动力呈色法测试内毒素含量的结果试验物质eu/设备ub706590.0422阴性对照组-(通过)阳性对照组+(通过)*lal试剂灵敏度λ＝0.005eu/ml**阳性对照组：添加浓度为0.5eu/ml***侦测极限值(mdl)为0.002eu/设备由表1的结果显示，本发明的吸收性胶原蛋白植入物的内毒素含量为0.0422eu/device。检量线的回归系数为0.999，显示本产品制程及包装灭菌并不会产生残留毒性。实施例3.吸收性胶原蛋白植入物的生物安全性测试医疗器材组成应考虑是否对人体产生不良反应。当医疗器材预期与人体组织有接触时，应根据接触方式与时间来谨慎执行相关的生物兼容性测试，以避免医材在制造过程中产生或污染到有毒物质而导致可能的生理伤害。本实例是以肌肉植入刺激试验评估本发明的吸收性胶原蛋白植入物在sd大鼠肌肉植入试验物28天后的可能反应。使用usp高密度聚乙烯参考标准物(usphighdensitypolyethylenereferencestandard)(lot.no.iok217)当作对照组使用。测试物(本发明的胶原蛋白植入物)与对照物皆被裁剪成约宽1mm，长10mm大小再植入。对照物手术前以75％酒精消毒。试验前，先以电剪将大腿与臀部位置的毛剔除，在手术前动物皆以isofluorane(medi-unionco.,ltd)气麻麻醉。测试物和对照物分别以无菌手术法植入左臀和右臀肌肉中，植入时应顺着肌肉纤维平行置入测试物与对照物。术后伤口分层缝合，每只动物可得1个测试物植入与1个对照物植入。在本试验中，10只动物总共可得10个试验组和10个对照组。术后，动物在28天内需观察是否有病变或死亡等不良反应。在试验结束日(植入28天后)，将动物人道牺牲。取下围绕测试物与对照物的肌肉组织并进行肉眼巨观观察。之后，置于10％中性福尔马林中固定至少24小时以准备组织切片。于显微镜下做分析并记录各组得分。纪录试验组和对照组得分是依照iso10993-6与下列公式计算，若要无刺激反应，则试验组与对照组的平均得分需相差在2.9以内。总得分＝(细胞种类/反应的小计得分)×2+反应的小计得分得分差异＝试验组总得分/10-对照组总得分/10结果：在10只试验动物中，植入手术皆相当成功，在28天的观察期间并无任何症状，亦无任何动物死亡。在最后一天的肌肉巨观观察结果显示，在试验组或是对照组皆无观察到有明显的病变或症状。而且由试验组病理切片发现，以肉眼已观察不到本发明的吸收性胶原蛋白植入物，表示测试物已全数分解(图2a)。相较于对照组的组织病理切片观察结果，对照物植入物仍存在动物的植入部位(图2b)。针对个体组织病理评分的结果显示，试验组和对照组皆无明显异常的差别，而计算最终得分差异(evaluationscores)为(17*2+20)/10-(9*2+10)/10＝2.6(无刺激性得分:0～2.9)，因此当与对照组比较时，本发明的吸收性胶原蛋白植入物在28天肌肉植入后，对于大鼠肌肉组织并无刺激性与不良反应。。实施例4.吸收性胶原蛋白植入物用于青光眼小梁切开术的有效性评估多孔胶原蛋白植入物在体内降解时间受到组织来源、胶原蛋白萃取/纯化流程、制程、材料组成等因素影响，而在体内需要伤口愈合后尽速降解，然而体外实验无法模拟房水流出及体内实际受力下愈合的生理环境。因此动物实验为临床试验执行前确认体内降解时间的重要考虑信息，可以提供未来临床试验执行上对病患更加的保障。兔子眼球体积5～6cm3接近人类的6.5cm3，为适合眼球手术最小型哺乳动物。18只兔子进笼后由中心人员代养，手术当天陆续以宠物笼移至手术室秤重麻醉后，由彰化秀传医院两位眼科专科医师同时进行小梁切开术(trabeculotomy)，首先在角膜缘底部的结膜翻瓣后，制作一个3x4mm的方形巩膜翻瓣。沿着虹膜周边切开进行1x2mm的巩膜造口(sclerostomy)，由小梁网以手术剪剪开切入前房。使用10-0尼龙缝合线松缝一针关闭巩膜翻瓣。接着于右眼植入本发明的胶原蛋白植入物，左眼手术后自然愈合为对照组。最后再以10-0尼龙缝合线缝合关闭结膜翻瓣，手术过程约10～15分钟。术后回到兔笼继续由中心人员代养，给予抗生素(neomycin)及止痛剂(1％prednisoloneacetate)眼药水每日两次，持续到术后一周。本实验是在手术前及第3、7、14、21、28天，使用仪器(tono-pen；medtronic,fl)测量兔子眼压。每次量测由同一位人员操作取五点中位数。将每个量测点的眼压中位数相对于起始平均眼压的改变率(iopchange％)作为比较依据。于牺牲日领出兔子于手术室进行过量麻醉剂注射后，利用快速静脉注射kcl(2mmol/kg)来完成安乐死。在第3、7、14每个时间点牺牲三只，21、28天各牺牲四只。牺牲后以手术刀及组织剪裁取手术部分角膜及巩膜约1x1cm后立即以4％福尔马林固定至少一天。经过酒精梯度脱水后以xylene三次渗透试片后以石蜡包埋试片。使用切片机进行5～10μm切片，脱蜡后进行常规h&e及masson'strichromestain组织切片染色。经显微镜观察组织愈合情形并通过量测胶原蛋白产品厚度改变及残留情形。由动物实验结果发现，小梁切开术配合植入本发明的胶原蛋白植入物，于类似人眼球大小的17只纽西兰白兔眼球的结膜和巩膜之间，并没有任何造成感染发炎或眼压过低。比较术后初期眼压的变化发现，在实验组(本发明的胶原蛋白植入物)与对照组(trabeculotomyonly)的iop数值都下降。术前所有兔子的双眼平均眼压为18.6±4.9mmhg。由结果(图3)可以发现，两组眼压相同且都显著下降，术后3天实验组眼压为14.5±4.7mmhg，对照组眼压为14.4±4.1mmhg。而实验组在实验周期内眼压稳定略为增加，7、14、21、28天眼压分别14.3±1.9、13.7±2.1、15.1±1.4、15.5±0.5mmhg。但对照组在第21天眼压17.3±2.2mmhg已接近起始眼压平均值，而第28天眼压23.3±3.3mmhg已高于眼压平均值。由实验组与对照组标准差值差异亦发现，植入本发明胶原蛋白植入物的实验组的眼压较为稳定，而对照组相对有较大的标准偏差。组织切片结果显示，淋巴球聚集在实验组有较多的倾向，但并没有组织坏死(necrosis)的迹象。实验组持续有巨噬细胞进行植入物的代谢，并且有部分区域有新生血管长入植入区。由图4的实验组切片染色图可以发现，胶原蛋白植入21天后，生长进入植入物的组织为散乱方向的松散结构(参圈圈部份)。于图5中，箭头所指为生长进入胶原蛋白植入物的新生血管。术后第28天切片染色结果显示，大部分实验组植入28天后外观无法看出胶原蛋白植入物的确切位置，表示本发明的多孔胶原蛋白植入物几乎已分解代谢，剩余部分已被松散层状新生组织取代(图6)。相较于实验组，对照组在术后14天于结膜下方形成较致密的结痂，于巩膜切口也有愈合的伤口(图7)。综合上述，本发明的吸收性胶原蛋白植入物是由干燥脱水的牛皮纯化胶原蛋白组成，经由动物生物安全性(bio-safety)及生物兼容性(bio-compatibility)测试，显示已通过iso10993有关生物兼容性的安全测试，并且不会产生残留毒性。由动物眼刺激/肌肉植入刺激试验结果亦证明，本发明的吸收性胶原蛋白植入物不会造成眼球刺激，通过其吸水特性具有降眼压作用，且在90天肌肉植入后已100％分解，对周遭组织没有伤害，于动物体内可完全吸收，并可让组织细胞的增生达随机的分布，而不产生结膜下结疤。因此，通过使用本发明的吸收性胶原蛋白植入物，使病患可以在相同或更佳的降眼压效果下，减少mmc药物辅助并发症(>50％)造成的风险及永久性伤害。当前第1页12