他扎罗汀在制备治疗乙肝病毒感染药物中的应用的制作方法

本发明属医药领域技术领域，涉及他扎罗汀的药物新用途，具体涉及他扎罗汀及其类似物在制备治疗乙肝病毒感染药物中的用途，尤其是在制备降低或消除乙肝病毒乙肝e抗原和表面抗原及靶向乙肝病毒复制模板dna的药物中的用途。

背景技术：

现有技术公开了乙肝病毒(hbv)感染是严重危害人类健康的重要疾病之一。据统计，近年来虽然随着乙肝疫苗接种的推行已经明显降低了新生儿感染hbv的风险，但全球仍有约2.4亿乙肝病毒慢性感染者(其中我国逾0.9亿)，每年大约有一百万人死于乙肝病毒感染所致肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。

目前，用于治疗慢性乙肝病毒感染的药物有核苷(酸)类似物干扰素：核苷(酸)类似物通过抑制hbv逆转录酶的作用能显著降低血清病毒载量，但其尚不能有效靶向hbv转录复制的模板—共价闭合环状dna(cccdna)，因此，大多患者需长期乃至终身服药，易出现耐药病毒株且停药后hbv复制水平极易反弹；干扰素是一种兼具直接抗病毒效应和间接免疫调节功能的细胞因子，据统计，虽较核苷(酸)类似物有相对高的促使hbve抗原(hbeag)和表面抗原(hbsag)转阴的作用，但48周干扰素治疗仍仅能使约30％患者hbeag转阴，小于5％患者hbsag转阴，且有明显的副作用。因此，当前临床治疗乙肝病毒尚不能有效达成乙肝病毒功能性治愈，因此开发寻找新型有效靶向hbv感染的药物分子十分必要且有现实意义。

他扎罗汀(tazarotene)是第三代芳香维a酸类药物，主要可选择性地结合维a酸受体(rar-β；rar-γ)，他扎罗汀主要用于临床治疗银屑病、痤疮、角化异常性疾病、毛囊皮脂腺疾病、皮肤癌前期病变等。迄今，尚未见有关他扎罗汀抑制乙肝病毒的报道。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供他扎罗汀的药物新用途，具体涉及他扎罗汀及其类似物在制备治疗乙肝病毒感染药物中的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于鉴于现有技术中尚无同时抑制病毒抗原表达及cccdna的药物的现状，提供他扎罗汀的药物新用途，具体涉及他扎罗汀及其类似物在制备治疗乙肝病毒感染药物中的用途；尤其是在制备降低或消除乙肝病毒乙肝e抗原和表面抗原及靶向乙肝病毒复制模板dna的药物中的用途。

本发明经试验显示，他扎罗汀具及其类似物阿达帕林(adapalene)具有抗hbv活性(包括抑制病毒抗原表达和病毒cccdna复制)的作用，他扎罗汀及其类似物可用于制备抑制乙肝病毒的药物。

本发明通过建立384孔板乙肝病毒感染原代肝细胞模型，进行高通量筛选，从美国药监局(fda)批准上市的药物库1442种小分子化合物中，筛选鉴定了他扎罗汀具有显著抗hbv活性。

本发明采用hbv感染的原代肝细胞(phh)系统和人heparg细胞的hbv感染模型进一步验证他扎罗汀对hbeag、hbsag及hbvdna的抑制作用，确认他扎罗汀对其均具有显著的抑制，其半数有效抑制浓度(ic50)在几十纳摩尔，而在相应抗病毒浓度下均对细胞无明显毒性效应。

本发明实验结果表明在含hbvcccdna的细胞系(hepdes19)中和在hepg2转染hbvcircledna的细胞中，他扎罗汀同样具有显著的抑制hbeag，hbsag的作用，而在宿主细胞基因组人工整合有hbv基因组并无cccdna的细胞系hep2.215中未发现有抑制hbv的活性，显示了他扎罗汀能相对特异地靶向细胞核内hbv模板dna的特征。

本发明中，实验结果证实他扎罗汀在hbv感染的原代细胞中，他扎罗汀可部分抑制cccdna的活性，对于cccdna为模板转录具有较强的抑制活性。

本发明中，实验结果还证实同属维a酸类药物且为他扎罗汀类似物的阿达帕林等亦具有较强的抗hbv活性，显示了维a酸类药物在制备抗hbv药物中的应用潜力。

本发明公开了他扎罗汀及其类似物在靶向hbvcccdna的抑制活性，提供了他扎罗汀及其类似物在制备治疗乙肝病毒感染药物中的应用；尤其是在制备降低或消除乙肝病毒乙肝e抗原和表面抗原及靶向乙肝病毒复制模板dna的药物中的应用，本发明为他扎罗汀最终应用于慢性乙肝病毒感染的干预治疗展示了非常好的前景并提供了实验理论基础。

为便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明所述他扎罗汀具有较好的抗hbv的活性进行阐述。需指出的是，所述附图和实施例仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出修改，这些修改也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1.他扎罗汀在hbv感染系统中抗hbv效应的评价，

其中，图1a.基于人原代肝细胞(phh)的hbv感染模型；

图1b.基于heparg细胞的hbv感染模型。

图2.他扎罗汀在hbv细胞系(hepdes19和hep2.215等)中抗hbv效应的比较。

图3.他扎罗汀对cccdna,hbvrna以及hbc含量的影响。

图4.他扎罗汀抑制hbv复制具有持久性活性。

图5.同属维a酸类药物且为他扎罗汀类似物的阿达帕林的抗hbv效应评价。

具体实施方式

实施例1hbv感染系统实施方式

将他扎罗汀处理感染有乙肝病毒颗粒的phh或heparg细胞，乙肝病毒e抗原(hbeag)、乙肝表面抗原(hbsag)和hbvdna的产生受不同程度抑制。

(1)heparg细胞的培养：heparg细胞系来源于人肝前体细胞系的终末分化细胞，保留了原代人肝细胞的很多特性，分化后可支持hbv感染；1)生长培养液：15％胎牛血清，100u/l青霉素，0.1mg/l链霉素，谷氨酰胺，0.023iu/ml胰岛素，4.7μg/ml氢化可的松，80μl/ml庆大霉素；2)分化培养液：生长培养液+2％dmso，需持续分化两周以上进行hbv感染；

(2)phh细胞的培养：购自上海瑞德生物并采用专用商业培养基培养；需指出的是，本发明研究过程中采用了两种不同个体来源的人原代肝细胞进行了实验及验证相关结果，结果具有一致性；

(3)phh细胞感染2天后，向细胞加入不同浓度的他扎罗汀，每3天进行换液及再处理；感染后第8天，收集细胞上清elisa检测hbv抗原标志物hbeag和hbsag，用特异性hbv引物qpcr检测上清中病毒dna的产生情况；结果显示扎罗汀能大幅降低hbv抗原标志物及hbvdna的含量，且相应工作浓度下均未检出细胞毒性(如图1a所示)；

分化的heparg细胞感染hbv5天后，向细胞加入不同浓度的他扎罗汀，每孵育72小时进行换液及再处理；感染后第15天，收集细胞上清elisa检测hbv抗原标志物hbeag和hbsag，用特异性hbv引物qpcr检测上清中病毒dna的产生情况；结果显示他扎罗汀可显著抑制hbv生物学抗原标志物及dna的含量，且呈现浓度依赖性(如图1b所示)；

类似的，本发明对他扎罗汀类似物阿达帕林在hbv感染系统中的抗hbv效应作了评价，结果显示，所述的阿达帕林能有效抑制hbv生物学抗原标志物hbsag和hbeag，且无细胞毒性(如图5所示)；

(4)在phh感染模型中，以不同浓度的他扎罗汀处理细胞，经加药三次后撤药，测算加药后和撤药后抗病毒指标计算出半数有效抑制浓度(ic50),结果显示撤药后ic50较撤药前几乎一样(如图4所示)，表明他扎罗汀具有优越的抗hbv活性且具有持有抑制hbv复制的能力；

(5)进一步以qpcr和qrt-pcr分别检测他扎罗汀对hbvcccdna及rna的影响(如图4所示)，结果显示他扎罗汀对cccdna有一定的抑制，同时对hbvrna转录具下调效应；免疫荧光实验显示他扎罗汀对乙肝病毒核心蛋白(hbc)表达具有很强的抑制效果。

实施例2.hbv复制型细胞系模型实施方式

测试他扎罗汀在hbv细胞系抑制情况：

(1)肝细胞系hep2.215的培养：采用dmem/f12培养液(gibco公司，加10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素和400mg/mlg418)在5％co2饱和水蒸气环境下37℃恒温培养；

(2)肝细胞系hepdes19的培养：采用dmem/f12培养液(gibco公司，加10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素和400mg/mlg418)在5％co2饱和水蒸气环境下37℃恒温培养；

(3)在hep2.215细胞和hepdes19细胞中，加入不同浓度的向细胞加入不同浓度的他扎罗汀，处理5天后收集细胞上清elisa检测hbv抗原标志物hbeag或hbsag；结果显示他扎罗汀在hep2.215细胞中没有活性(如图2a所示)，而在含有cccdna的hepdes19里他扎罗汀则具有抑制hbeag的活性图(如2b所示)，在hepg2转染hbvcircledna的系统中，他扎罗汀能抑制hbsag和hbeag，进一步说明他扎罗汀可能影响了hbvcccdna的稳定性或者抑制hbvcccdna的转录。

上述实施例说明本发明筛选鉴定了维a酸类药物他扎罗汀及其类似物在抗乙肝病毒中的效应，表明他扎罗汀在hbv自然感染系统中具有显著抗hbv效应，并且该种效应可持久性保持而不反弹；此外，他扎罗汀在含有hbvcccdna的细胞系中显示出抗hbv活性，而在宿主基因组人工整合有hbv基因组的细胞系中却未显示有抗hbv活性；进一步在人原代肝细胞中他扎罗汀具有一定得cccdna的抑制，并且在cccdna转录上具有较强的抑制活性，表明他扎罗汀具有相对特异靶向hbvcccdna的生物学效应。