Connexin模拟肽在制备预防或治疗急性肺损伤药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及connexin模拟肽在制备预防或治疗急性肺损伤药物中的应用。

背景技术：

缝隙连接（gapjunction）是由连接相邻两个细胞之间的连接通道排列而成的一种特殊膜结构，缝隙连接通道的主要成分是连接蛋白（connexin）。目前，在哺乳动物中发现的连接蛋白至少20种，依分子量不同而分别命名为cx32、cx50、cx26、cx43、cx36等，其中cx43作为主要的缝隙连接蛋白，广泛存在于哺乳动物各器官、组织中，其分子结构和功能特点决定了它与机体许多病理生理过程有密切的联系。一个缝隙连接通道由位于相邻细胞膜上的2个配对半通道（hemichannels）端对端连接而成。因此connexin既能形成半通道，又可以形成缝隙连接。这两种通道的共同特点是允许分子量少于1200道尔顿的分子或离子通过，而cx43允许小于1000kd的分子如camp等通过，而阻止大分子蛋白质和核酸通过。连接蛋白在形成细胞膜通道时都含有四个跨膜功能区，从而形成一个细胞内环和两个细胞外环，其中细胞外环是不同connexin蛋白分子中氨基酸序列较保守的区域。

急性肺损伤（acutelunginjury，ali）是重症病房的常见疾病，是各种肺内外致病因素导致的以顽固性的低氧血症和呼吸窘迫为特征的全身炎症反应综合征。急性肺损伤的其病理特征是肺泡-毛细血管屏障损伤、通透性增加而使富含蛋白的液体流入肺泡，引起肺不张，同期/血液比例失调而导致呼吸衰竭。全球每年有数百万病人，由于缺乏有效治疗手段，急性肺损伤常发展为急性呼吸窘迫综合症，其病死率达40～70%。

脓毒症是炎症性疾病，其病理进程与细胞外高迁移率族蛋白1（highmobilitygroupbox1，hmgb1）的水平有密切关系。授权公告号为cn103251627b的中国专利背景技术揭示了甘珀酸（盐）可以有效地抑制缝隙连接通道并保护新生鼠脑补缺血损伤，并且公开了一种已知化合物－甘珀酸或其药学上可接受的盐在制备治疗全身性的感染或全身性的炎症性疾病的药物中的新用途，其通过抑制由细菌脂多糖激发的双链核糖核酸依赖的蛋白质激酶的表达和磷酸化，从而抑制双链核糖核酸依赖的蛋白质激酶的活性，从而为败血症和脓毒症的治疗提供了新的途径。但是甘珀酸（盐）对缝隙连接或不同性质的半通道的选择性较差。

针对甘珀酸钠选择性差的问题，国际申请号为pct/us2016/045284的发明专利在cx43第一细胞外环中的保守区域氨基酸序列为模版设计了多个模拟肽，其中一个由六个氨基酸组成的connexin模拟肽（命名为el1p）作为半通道阻断剂，可抑制半通道的通透性，从而对患脓毒症的小鼠起到保护作用。

急性肺损伤乃至急性呼吸窘迫症的病因可以分为感染性和非感染性两类。hmgb1在两类病因造成的急性肺损伤发病过程都起重要作用（abrahame.,arcarolij.,carmodya.,wangh.,traceykj.(2000)hmg1asamediatorofacutelunginflammation.j.immunol.165(6)2950-4）；reisslk,uhligu,uhligs.modelsandmechanismsofacutelunginjurycausedbydirectinsults.eurjcellbiol.2012;91(6-7):590-601.）。目前，还没有报道el1p是否在预防或治疗急性肺损伤上的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种connexin模拟肽在制备预防或治疗致急性肺损伤药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种connexin模拟肽，其模拟区域是cx43连接蛋白中从氮端起第62到67个氨基酸，其包括谷氨酸-天冬酰胺-缬氨酸-半胱氨酸-络氨酸-天冬氨酸，英文缩写为envcyd，命名为el1p，详见背景技术中引用的发明专利pct/us2016/045284。

本发明提供一种connexin模拟肽的用途，connexin模拟肽用于制备

a：抑制hmgb1从血管内皮细胞释放／分泌的抑制剂；

b：治疗hmgb1从血管内皮细胞释放／分泌介导的疾病的药物。

进一步地，connexin模拟肽用于制备

c：抑制由lps引起的hmgb1从血管内皮细胞释放／分泌的抑制剂；

d：治疗由lps引起的hmgb1从血管内皮细胞释放／分泌介导的疾病的药物。

进一步地，所述抑制剂或药物用于预防或治疗lps造成的急性肺损伤或组织损伤。

进一步地，所述药物为组合物。

进一步地，以所述组合物的总重量计，所述组合物中connexin模拟肽的含量为0.001~99.9%。

进一步地，所述药物的剂型为口服剂型、贴附剂或注射剂。

进一步地，所述药物的给药方式为口服、吸入、皮下注射、贴附、静脉注射或腹腔注射。

进一步地，所述药物的施用对象为哺乳动物，优选为人类，在使用所述药物之前、同时或之后，配合使用其他预防或治疗急性肺损伤的活性物质，所述活性物质选自抗生素或抑制急性肺损伤的药物。

应理解，在本发明范围内，上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体描述的各技术特征之间都可以相互组合，从而构成新的或优选的技术方案，在此不再一一赘述。

本发明的有益效果为：

1.本发明提供的connexin模拟肽可用于制备预防或治疗急性肺损伤药物，该药物作为半通道阻断剂，可抑制半通道的通透性，但又不影响缝隙连接的形成和功能，为细菌内毒素脂多糖造成的急性肺组织损伤的预防和治疗提供了新的途径。

2.本发明运用细胞生物学方法，揭示了connexin模拟肽可用于制备预防或治疗急性肺损伤的机理，通过抑制细菌内毒素脂多糖引起的hmgb1从血管内皮细胞的释放/分泌，能显著降低肺泡灌洗液中免疫球蛋白和转氨酶的水平，从而减少lps引起的肺组织损伤并保护肺泡屏障的完整性，降低急性肺损伤小鼠死亡率，达到预防或治疗急性肺损伤的目的。

附图说明

图1是本发明一种connexin模拟肽的作用示意图。

图2是本发明一种connexin模拟肽对半通道和缝隙连接的影响示意图，其中图2-a为connexin模拟肽对半通道的通透性的影响示意图，图2-b为connexin模拟肽对缝隙连接的通透性的影响示意图，图2-c为connexin模拟肽对cx43缝隙连接形成的影响示意图。

图3是connexin模拟肽抑制由lps引起的hmgb1向血管内皮细胞释放／分泌的示意图。

图4是connexin模拟肽减少急性肺损伤小鼠肺泡灌洗液中免疫蛋白和转氨酶水平的示意图。

图5是connexin模拟肽降低急性肺损伤小鼠的死亡率的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规或按照制造商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同、此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法和材料仅作示范之用。

实施例1connexin模拟肽对半通道和缝隙连接的影响

一种connexin模拟肽，其模拟区域是cx43连接蛋白中从氮端起第62到67个氨基酸，如图1所示，图中nh2和cooh分别代表cx43分子的氮端和碳端。extracellular和intracellular分别代表细胞外和细胞内。

1.1connexin模拟肽对半通道的通透性的影响

选择hepg2细胞（即肝细胞）和raw264.7细胞（即巨噬细胞（macrophage）），设置不加入el1p的对照组和加入20微克/毫升el1p的实验组，用细菌内毒素脂多糖（lipopolysaccharide，lps）分别对上述两种细胞刺激，20小时后，进行el1p对半通道的通透性影响的观察实验。在实验组加入20微克/毫升el1p20分钟后，加入通道示踪剂荧光黄，15分钟后，使用0.1mol/l的磷酸缓冲液洗去荧光黄，采用质量分数为2%的多聚甲醛固定15分钟，再使用磷酸缓冲液洗去多聚甲醛，然后用含有4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，dapi）的抗荧光衰减封片剂封片。在荧光显微镜下观察、拍照，如图2-a所示，荧光黄信号代表半通道通透性总量，dapi信号代表总细胞数，荧光黄信号与dapi信号的比值反映一定数目细胞的半通道的通透性。由图2-a可知，el1p可显著减少hepg2细胞和raw264.7细胞半通道的通透性。

1.2connexin模拟肽对缝隙连接的通透性的影响

nih3t3成纤维细胞在培养皿中长满后分为不加el1p的对照组和加入20微克/毫升el1p的实验组。20小时后，使用磷酸缓冲液洗去培养基，加入示踪剂荧光黄（ly）和葡聚糖-若丹明（dextran-rhodamine，rd，其分子量为10000道尔顿），用移液枪头在细胞中划痕，5分钟后用磷酸缓冲液洗去示踪剂，采用质量分数为2%多聚甲醛固定15分钟，使用磷酸缓冲液洗去多聚甲醛，然后用抗荧光衰减封片剂封片。荧光显微镜下观察、拍照，如图2-b所示。由于示踪剂葡聚糖-若丹明的分子量为10000道尔顿，不能通过缝隙连接，而荧光黄可以通过缝隙连接扩散到周围细胞，因此，荧光黄的面积减去葡聚糖-若丹明的面积可反映缝隙连接的通透性。由图2-b可知，对照组与加入20微克/毫升el1p的实验组没有明显区别（样本数n=18，p=0.514），说明el1p对缝隙连接通透性没有影响。

1.3connexin模拟肽对cx43缝隙连接形成的影响

nih3t3成纤维细胞表达cx43并形成cx43缝隙连接。cx43缝隙连接的形成可以用cx43免疫染色确定。nih3t3成纤维细胞分成对照组和实验组。对照组中不加el1p。实验组中加入20微克/毫升的el1p并孵育20小时，采用质量分数为2%多聚甲醛固定，磷酸缓冲液冲洗，与兔抗cx43抗体孵育24小时，磷酸缓冲液冲洗，与驴抗兔荧光抗体孵育1小时，磷酸缓冲液冲洗后使用抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下观察、拍照，结果如图2-c所示。由图2-c可知，对照组和实验组之间cx43染色没有区别（颗粒状染色，白色箭头指示缝隙连接；较大的圆或椭圆状染色为细胞核），说明el1p对nih3t3成纤维细胞中cx43缝隙连接的形成没有明显影响。

实施例2connexin模拟肽抑制由lps引起的hmgb1向血管内皮细胞释放／分泌

将人脐带静脉血管内皮细胞分为对照组（cont）、加入20微克/毫升的el1p、加入1微克/毫升的lps和加入20微克/毫升的el1p+1微克/毫升的lps的三个实验组。干预16小时后，分别收集和浓缩各组培养基，然后用免疫印迹法测量各组中的hmgb1，结果如图3所示。由图3可知，加入lps的实验组中hmgb1的水平大幅增加，而加入el1p和lps组的实验组中hmgb1的水平显著低于加入lps的实验组（p<0.05），说明el1p抑制lps刺激的血管内皮细胞释放hmgb1。

实施例3connexin模拟肽减少急性肺损伤小鼠肺泡灌洗液中免疫蛋白和转氨酶水平

对照组为正常balb/c雄性小鼠，在2小时和16小时后通过腹腔注射生理盐水（200微升/小鼠/次）。将lps（10毫克/公斤体重）通过气管注入balb/c雄性小鼠肺中建立急性肺损伤（ali）模型，在2小时和16小时后通过腹腔注射生理盐水（200微升/小鼠/次），作为ali实验组。在2小时和16小时后通过腹腔向ali模型小鼠注射el1p（8毫克/公斤体重，溶于生理盐水，每次注射体积为200微升，共给药2次），作为ali+el1p实验组。

分别收集三组的肺泡灌洗液，浓缩后使用免疫印迹法分析灌洗液中的免疫球蛋白m（immunoglobulinm，igm）、人谷氨酸-草酰乙酸转氨酶1（got1）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶1（gpt1）蛋白水平，结果如图4所示，而igm的水平反映肺泡壁屏障的完整性，got1和gpt1反映肺组织损伤程度。由图4可知，相对于lps组（ali），el1p（elip+ali）显著降低肺泡灌洗液中这些蛋白的水平（n=10，p<0.05），说明el1p减少lps引起肺组织损伤并保护肺泡屏障的完整性。

实施例4connexin模拟肽可降低急性肺损伤小鼠的死亡率

每24小时观察记录实施例3的ali实验组和ali+el1p实验组中小鼠存活数量，如图5所示，在注射生理盐水的ali实验组，小鼠的10日存活率为20%，而ali+el1p实验组，小鼠的10日存活率为57%（n=30，p<0.05），说明el1p显著地提高了急性肺损伤小鼠的存活率。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明实施范围，故凡依本发明专利范围所述技术方案所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。