氢气在制备防治白癜风制剂中的用途的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及氢气在制备防治白癜风制剂中的应用。

背景技术：

资料公开了白癜风是一种常见的获得性、特发性色素减退性皮肤病，其临床特征表现为由局部黑素细胞缺失引起的色素脱失斑，，其发病率高，自发缓解率低，对患者生活质量影响很大。研究显示，白癜风的发病通常与外伤、日晒、精神创伤、怀孕等因素有关，其具体病因与发病机制尚不甚明确。目前，学界一致推测白癜风的发病可能起始于外因诱发的氧化应激状态，继而促使黑素细胞蛋白结构发生修饰变成新的抗原分子，激活自身免疫应答反应；机体异常的免疫应答反应又同时诱导一种慢性炎性环境，导致ros蓄积，从而对周围细胞发挥细胞毒性作用。有研究报道，氧化应激在白癜风的起始与进展阶段发挥关键作用，高水平ros可干扰l-苯丙氨酸(黑素合成关节酶酪氨酸酶的前体)的摄入，氧化并抑制黑素产生调控激素acth和α-msh的生物活性，抑制黑素细胞的粘附、迁移及黑素合成；同时，长期的慢性氧化应激，可下调黑素细胞和角质细胞的wnt通路活性，诱导黑素干细胞分化能力受损、改变黑素细胞转化的能力，并诱发黑素细胞凋亡。目前临床常用的白癜风治疗方法有，如抗炎、抗氧化及免疫调节药物，uvb光疗，光化学疗法，细胞和组织移植等等，总体上治疗相对比较困难。

氢气长期以来被生物界和医学界所忽视，2007年7月，日本太田成男教授在naturalmedicine报道，动物呼吸2％氢气可有效清除自由基，显著改善脑缺血再灌注损伤，首次证实氢气对羟基自由基和亚硝酸阴离子的选择性抗氧化效应。大量临床与基础研究相继证明，氢气对各类疾病过程中的氧化损伤、炎症反应、细胞凋亡和血管异常增生等具有治疗作用。

氢气在临床研究中获得广泛应用的另一个重要原因在于其高度的生物安全性。其安全性主要有以下三个方面的依据，一、国际潜水医学机构70余年的氢气潜水研究，证明高压氢气对人体无任何毒副作用；二、肠道菌群研究发现，大肠内细菌大肠埃希菌可产生氢气，有学者研究提出阿卡波糖对心脏的保护作用可能与其促进大肠内氢气产生密切相关，三、随着氢气在临床研究中的推广，迄今为止，尚无任何证据表明其对人体存在危害性，氢气已被中国、日本、欧盟等多个国家列为食品添加剂，因此其生物安全毋庸置疑。

迄今尚未见有关氢气用于白癜风治疗的相关报道。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供氢气在制备防治白癜风制剂中的新的用途。

技术实现要素：

本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供氢气的新用途，具体涉及氢气在制备防治白癜风制剂中的用途。

本发明所述的氢气，由上海潓美医疗科技有限公司提供相关细胞培养设备产生。

本发明进行了细胞实验，结果表明，氢气对人黑素细胞和角质形成细胞具有良好的抗氧化效应，可显著降低氧化应激所致黑素细胞的凋亡，并显著缓解氧化应激对黑素细胞增殖、迁移以及黑素生成的抑制效应。

本发明的实验结果显示，中高浓度氢气预处理显著降低黑素细胞(pig1和pig3v)和角质形成细胞(hacat)的活性氧自由基(ros)与丙二醛(mda，胞膜脂质过氧化指标)水平，氢气的抗氧化保护效应强度与氢气浓度及预处理时间呈正相关；氢气的抗氧化效应，与其对氧化损伤黑素细胞及角质形成细胞抗氧化还原酶(超氧歧化酶sod、过氧化氢酶cat和谷胱甘肽还原酶gpx)表达水平的促进作用密切相关；75％氢气预处理，可将氧化损伤pig1细胞的凋亡率由24.2％降至8.6％，而pig3v细胞的凋亡率则由31.6％降至12.8％(p＜0.01)。此外，氢气预处理还可显著改善氧化应激(1mmh2o2)对两种黑素细胞增殖、迁移以及黑素合成的抑制效应。75％氢气预处理后，氧化损伤(1mmh2o2)pig1细胞的增殖活性上升12％、细胞迁移水平上升22％、黑素合成水平上升23.6％，而氧化损伤pig3v细胞的增殖活性上升19.8％、细胞迁移水平上升4％、黑素合成水平上升35.6％，p值均小于0.05。

同时，氢气对人体黑素细胞和角质形成细胞具有较高的安全性。高中低浓度的氢气干预6h、12h及24h后，对黑素细胞与hacat细胞的增殖无明显影响。

本发明的氢气可制成防治白癜风的临床制剂，通过经口服富氢水、静脉注射富氢生理盐水等方式，以及呼吸氢气、富氢水泡浴等防治设备方式发挥治疗预防白癜风的作用。

本发明为氢气开辟了新的用途，为白癜风的临床治疗和预防保健提供了一种新的干预方法，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1，不同浓度氢气对人体黑素细胞(a和b)和角质形成细胞(c)增殖的影响。

图2，氢气可显著降低氧化损伤黑素细胞和角质形成细胞的ros与mda表达水平，

其中，a.不同浓度氢气干预对氧化损伤细胞胞内ros水平的影响；b.75％氢气经不同干预时间处理后对氧化损伤细胞胞内ros水平的影响；c.不同浓度氢气干预对氧化损伤细胞mda水平的影响；d.75％氢气经不同干预时间处理后对氧化损伤细胞mda水平的影响；^*p＜0.05，^**p＜0.01，与对照组进行比较；^#p＜0.05，^##p＜0.01，与模型组进行比较；ns，无统计学差异。

图3，75％氢气可显著改善氧化损伤黑素细胞与角质形成细胞的氧化还原酶表达水平，其中，^*p＜0.05，^**p＜0.01，与对照组进行比较；^#p＜0.05，^##p＜0.01，与模型组进行比较；ns，无统计学差异。

图4，75％氢气可显著改善氧化应激对黑素细胞增殖与凋亡的影响，其中，^*p＜0.05，^**p＜0.01，与对照组进行比较；^#p＜0.05，^##p＜0.01，与模型组进行比较。

图5，75％氢气可显著缓解氧化应激对黑素细胞迁移的抑制效应，其中，^*p＜0.05，^**p＜0.01，与对照组进行比较；^#p＜0.05，^##p＜0.01，与模型组进行比较。

图6，氢气可显著缓解氧化应激对人黑素细胞产黑素水平的损伤效应，其中，^*p＜0.05，^**p＜0.01，与对照组进行比较；^#p＜0.05，^##p＜0.01，与模型组进行比较。

下面结合实施例对本发明作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

具体实施方式

实施例1.不同浓度氢气对人体黑素细胞和角质形成细胞增殖活性的检测实验

实验材料：pig1和pig3v细胞(由美国芝加哥洛约拉大学carolinelepoole教授馈赠)，pig1为健康人体黑素细胞株，pig3v为白癜风患者黑素细胞株。hacat细胞为角质形成细胞株，由华山医院中心实验室提供；

细胞培养箱(thermoscientific8000)，氢气细胞培养箱(上海潓美医疗科技有限公司)，光学显微镜(xds-1a)，cck-8(碧云天)，酶标检测仪(thermomk3型)，摇床(qilinbeierts-1000)；

实验方法：待细胞生长至对数生长期时，调整细胞密度为1×10⁵cells/ml，接种至96孔板，每孔接种200μl，37℃，5％co2培养；次日细胞给予不同浓度的氢气(2％，35％，75％)，分别通气6h、12h及24h后进行cck8检测；每孔加入20μl的cck-8，37℃，5％co2培养箱内培养避光孵育1～4h。酶标仪450nm波长测出同一时间点od值，用测得的od值进行统计学分析；

实验结果如图1所示，其中显示低、中、高三种浓度的氢气干预不同时间后，均对人黑素细胞和角质形成细胞的增殖活性无影响；任一细胞同一时间点无论通氢干预与否，其组间增殖活性无统计学差异，提示氢气对黑素细胞核角质形成细胞具有较高的安全谱，高浓度氢气长时间干预无明显毒副作用。

实施例2.氢气显著降低氧化应激状态下人黑素细胞和角质形成细胞的ros与mda表达水平实验

实验材料：pig1和pig3v细胞以及hacat细胞同实施例1；

活性氧检测试剂盒(碧云天s0063)，mda(南京建成a003-1)，bca蛋白定量试剂盒(凯基kgdbca)。细胞培养箱(thermoscientific8000)，氢气细胞培养箱(上海潓美医疗科技有限公司)，摇床(qilinbeierts-1000)，光学显微镜(xds-1a)，荧光显微镜(leicaix71)，酶标仪(dnm-9602)；

实验分组：

a.不同氢气浓度的干预效果比较，三种细胞(pig1、pig3v和hacat细胞)各分成5组，对照组、模型组(黑素细胞予1mmh2o2处理，角质形成细胞予0.2mmh2o2处理)，模型组+2％氢气，模型组+35％氢气以及模型组+75％氢气；

b.不同通气时间的干预效果比较，三种细胞(pig1、pig3v和hacat细胞)各分成7组，对照组、模型组、模型+75％氢气(2h)、模型+75％氢气(4h)、模型+75％氢气(8h)、模型+75％氢气(12h)、模型+75％氢气(24h)；

ros检测：取对数生长期的黑素细胞和角质形成细胞，调整细胞浓度为3×10⁴cells/ml，接种于48孔培养板，每孔300μl，37℃，5％co2培养箱内培养24h，分组a.按实验分组不同浓度的氢气预处理24h，此后加入相应浓度h2o2作用12h，进行活性氧检测；分组b.按实验分组通入不同时间75％氢气预处理，加入相应浓度h2o2作用12h，进行活性氧检测。用无血清培养基稀释dhe探针(1∶1000)，37℃细胞培养箱孵育20min，每隔3-5min颠倒混匀下，使探针和细胞充分接触，用无血清培养基洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的dhe，将细胞置于荧光显微镜下观察拍照；

mda检测：取对数生长期细胞，调整细胞浓度为3×10⁴cells/ml，接种于48孔培养板，每孔300μl，37℃，5％co2培养箱内培养24h，实验分组方案同ros检测，elisa操作检测mda(具体见说明书)。elisa检测前收集细胞，每组分别加入200μl的ripa裂解液，并加入适量的pmsf，置于冰上裂解1h；12000rpm，4℃，离心10min；移上清于新的ep管中，进行蛋白质定量后贮存于-20℃冰箱；蛋白定量：将bca试剂a与试剂b按体积比为50∶1配制适量bca工作液，充分混匀；各孔加入200μlbca工作液；酶标板振荡30sec，37℃放置30min后在562nm下测定吸光度；以吸光值为纵坐标，蛋白浓度(μg/μl)为横坐标，绘制标准曲线；根据所测样品的吸光值，在标准曲线上计算相应的蛋白浓度(μg/μl)，酶标仪设定各试剂对应波长测出同一时间点od值，用测得的od值进行数据分析；

实验结果如图2a和2b所示，经0.2mm和1mmh2o2处理后，角质形成细胞与黑素细胞的ros和mda表达水平显著升高(p＜0.01)，低浓度氢气(2％)预处理无法改善三种细胞的氧化损伤水平(ros和mda无显著下降)，中高浓度氢气预处理则显著降低三种细胞的ros与mda水平，且75％氢气保护效果优于35％氢气；本发明进一步评估了不同干预时间对三种细胞的抗氧化效应(如图2c和2d所示)，75％氢气预处理至少4小时方可发挥抗氧化效应，且处理时间越长，ros与mda降低幅度越明显(p＜0.05)；结果表明，中高浓度氢气对氧化损伤黑素细胞和角质形成细胞具有良好的抗氧化保护效应，其效应强度与氢气浓度及预处理时间呈正相关。

实施例3.氢气显著提升黑素细胞及角质形成细胞的抗氧化还原酶表达水平实验

实验材料：黑素细胞(pig1和pig3v细胞)以及角质形成细胞(hacat细胞)同实施例1。fbs、dmem培养基均购自hyclone，gpx(biovision#k762-100)，cat(biovision#k773-100)，gsh和gssg(biovision#k264-100)，sod(南京建成a001-3)，bca蛋白定量试剂盒(凯基kgdbca)；

细胞培养箱(thermoscientific8000)，氢气细胞培养箱(上海潓美医疗科技有限公司)，光学显微镜(xds-1a)，酶标仪(dnm-9602)，荧光化学发光分析仪(thermofluoroskan型)；

实验分组：三种细胞pig1、pig3v和hacat细胞，均分为对照组、模型组与75％氢气干预组。黑素细胞(pig1和pig3v)模型组为1mmh2o2，角质形成细胞为0.2mmh2o2；

取对数生长期的pig1、pig3v和hacat细胞，调整细胞浓度为1×10⁵cells/ml，接种于6cm培养皿，每孔3ml，37℃，5％co2培养箱内培养24h。按实验分组75％的氢气预处理24h，pig1和pig3v加入h2o21000μmol/l、hacat加入h2o2200μmol/l作用12h，进行elisa检测(操作见说明书)，elisa检测前收集细胞，每组分别加入200μl的ripa裂解液，并加入适量的pmsf，置于冰上裂解1h；12000rpm，4℃，离心10min；移上清于新的ep管中，进行蛋白质定量后贮存于-20℃冰箱。蛋白定量，将bca试剂a与试剂b按体积比为50∶1配制适量bca工作液，充分混匀；各孔加入200μlbca工作液；酶标板振荡30sec，37℃放置30min，然后在562nm下测定吸光度；以吸光值为纵坐标，蛋白浓度(μg/μl)为横坐标，绘出标准曲线；根据所测样品的吸光值，在标准曲线上计算出相应的蛋白浓度(μg/μl)；分别酶标仪和荧光化学发光分析仪设定各试剂对应波长测出同一时间点od值，用测得的od值进行数据分析。

实验结果如图3所示，经0.2mm和1mmh2o2处理后，角质形成细胞与黑素细胞的超氧歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)及谷胱甘肽还原酶(gpx)显著下降(p＜0.01)，氧化型谷胱甘肽gssg水平显著升高(p＜0.05)，还原型谷胱甘肽gsh水平显著降低(p＜0.05)，提示氧化应激可显著抑制人黑素细胞与角质形成细胞的氧化还原酶活性；经75％氢气预处理24小时后，氧化损伤黑素细胞和角质形成细胞胞内的三种氧化还原酶(sod、cat、gpx)均显著升高(p＜0.05)，氧化型谷胱甘肽gssg水平显著降低(p＜0.05)，且黑素细胞中还原型谷胱甘肽gsh水平显著升高(p＜0.05)，表明氢气可显著提升黑素细胞及角质形成细胞的抗氧化还原酶表达水平。

实施例4.氢气显著改善氧化损伤对黑素细胞增殖与凋亡的影响实验

实验材料：黑素细胞pig1和pig3v细胞同实施例1；细胞培养箱(thermoscientific8000)，氢气细胞培养箱(上海潓美医疗科技有限公司)，cck8为sigma公司产品，酶标检测仪(thermomk3型)；annexinv-fitc/pi细胞凋亡双染试剂盒购于bd556547，流式细胞仪bd-facsverse；

实验方法：两种细胞各分为3组：对照组(control)，模型组(1mmh2o2)，模型组+氢气(75％)，75％氢气预处理24h后加入h2o2作用于pig1和pig3v细胞；

细胞增殖活性检测实验。取对数生长期的pig1和pig3v细胞，调整细胞浓度为3×10⁴cells/ml，接种于96孔培养板，每孔100μl，37℃，5％co2培养箱内培养24h。培养24h后，在每孔加入10μl的cck8，37℃，5％co2培养箱内培养避光孵育4h；酶标仪492nm波长测出同一时间点od值，用测得的od值进行细胞生长变化分析；

细胞凋亡检测。取对数生长期细胞，以细胞密度为1×10⁵个/ml接种于6孔板中，每孔3ml，于37℃，5％co2培养箱中培养。按上述实验分组处理细胞。培养24h后进行凋亡检测。用不含edta的胰酶消化收集后(注：胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与annexinv-fitc的结合)，在室温中，1500rpm离心5min，收集细胞。用预冷1*pbs(4℃)重悬细胞一次，1500rpm离心5min，洗涤细胞，加入300μl的1*bindingbuffer悬浮细胞。加入5μl的annexinv-fitc混匀后，避光，室温孵育15min。再加入10μl的pi染色，轻轻混匀细胞，于避光条件下室温孵育10min。pbs重悬细胞后于流式细胞仪检测，cellquest软件分析；

实验结果显示，由cck8检测(如图4a所示)：h2o2浓度为1mm时可显著抑制人黑素细胞的增殖，pig1细胞增殖水平降低17.2％(p＜0.01)，pig3v细胞则降低30.5％(p＜0.01)；提前通入75％氢气可以显著改善氧化应激对两种黑素细胞增殖活性的抑制效应，pig1细胞增殖水平较对照组降低5.2％，pig3v较对照组降低10.7％；由流式检测(如图4b所示)：h2o2浓度为1mm时可诱导pig1和pig3v细胞发生凋亡，其凋亡率分别升至24.2％和31.6％(p＜0.01)；提前通入75％氢气可以降低黑素细胞的凋亡率，pig1细胞降低8.6％与12.8％(p＜0.01)；结果表明，75％氢气可显著改善氧化应激对黑素细胞增殖和凋亡的损伤效应。

实施例5.氢气缓解氧化应激对人黑素细胞迁移的抑制效应实验

实验材料：黑素细胞pig1和pig3v细胞同实施例1；matrigel(bdincorporated，usa)，-20℃保存；tanswellplate(costar，coringincorporated，usa)，聚碳酯膜微孔(0.8μm)，苏木素染液。细胞培养箱(thermoscientific8000)，氢气细胞培养箱(上海潓美医疗科技有限公司)，光学显微镜(xds-1a)，倒置拍照显微镜(olympus，ix71)；

实验方法：两种细胞各分为3组：对照组(control)，模型组(1mmh2o2)，模型组(1mmh2o2)，模型组+75％氢气；

人工基底膜制备：取出-20℃保存的matrigel胶，将其在4℃下过夜解冻，以无血清专用培养液按照体积3∶1稀释matrigel胶；将boyden小室放置到24孔培养板，形成上下两室。将制备的人工基底膜100μl加入每个boyden小室的上室，37℃孵育2-6h使其呈凝胶状。取处于对数生长期的细胞，调整细胞浓度为5×10⁴cells/ml，接种于24孔板的上室每孔200μl，下室加入1ml的完全培养基，于37℃，5％co2培养箱内培养；按实验分组处理细胞，37℃，5％co2培养箱内培养24h后；取出小室，吸弃上室液体，用棉签仔细擦净膜上未迁移的细胞，37℃预温的pbs液漂洗两次，用冰预冷的4％多聚甲醛固定30min，结晶紫染色10min。小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来，封片后在显微镜下计数浸润到小室背面的细胞。光镜随机视野拍照；

实验结果如图5所示，经1mmh2o2处理后，pig1细胞和pig3v细胞的迁移效率分布降低53％和63％(p＜0.01)；而提前通入75％氢气可减缓其对细胞迁移的抑制作用，pig1细胞恢复至对照组迁移水平的75％，而pig3v细胞则恢复至对照组迁移水平的67％，p值均小于0.05，表明氢气可显著改善高浓度氧化损伤对黑素细胞迁移的抑制效应。

实施例6.氢气缓解氧化应激对人黑素细胞产黑素水平的损伤效应实验

实验材料：黑素细胞pig1和pig3v细胞同实施例1；细胞培养箱(thermoscientific8000)，氢气细胞培养箱(上海潓美医疗科技有限公司)，光学显微镜(xds-1a)，酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司，dnm-9602)；

实验分组：对照组、模型组(1mmh2o2作用于pig1和pig3v细胞)，模型+75％氢气组(75％氢气预处理24h后加入h2o2作用于pig1和pig3v细胞)；按照上述分组对细胞进行不同处理，24h后进行黑素的测定。吸弃培养基后，pbs洗涤1次，调整细胞密度，收集10⁶个细胞；2500rpm离心10min；吸弃上清，加1m的naoh/10％dmso1ml溶解细胞，100℃加热30min。用酶标仪测定400nm下的吸光值；

实验结果如图6所示：h2o2浓度为1000μmol/l时可使pig3v和pig1细胞的黑素含量明显减少，且pig3v降低幅度更大；提前通入75％氢气可以对细胞起到保护的作用，使黑素含量降低减少；

经1mmh2o2处理后，黑素细胞黑素含量明显减少，pig1细胞的产黑素水平降低为对照组的64.5％(p＜0.01)，pig3v细胞的产黑素水平降至对照组的38.4％(p＜0.01)；提前通入75％氢气可以对黑素细胞起到保护的作用，使黑素含量降低减少，两组黑素细胞的黑素表达分别为对照组的88.1％(pig1)和74.0％(pig3v)，p值均低于0.01，结果表明，氢气能显著改善氧化应激对人体黑素细胞黑素水平的损伤效应。