本发明属于生物医药领域，涉及中药复方四神散的一种新用途，具体地讲，本发明提供了一种四神散水提物在制备抗帕金森药物中的应用。
背景技术：
：帕金森症(parkinson’sdisease,pd)是第二大神经退行性疾病，表现为运动能力和认识功能下降。运动能力上表现为肌肉僵硬、运动迟缓和震颤；行为和认知能力上表现为痴呆、抑郁、焦虑和睡眠紊乱。这一疾病的发病率在大于60岁的人群中迅速增加。病患生活质量随疾病发展不断下降，直至负累家庭，给社会和家庭带来沉重的负担。帕金森症的主要病理特征为α-突触核蛋白在脑组织中聚积。到目前为止，尚无有效的治疗方法。采用传统帕金森哺乳动物病理模型用于筛选抗帕金森药物周期长、成本高，而采用模式生物秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)可使筛选周期从月为单位下降至以天为单位，因此，秀丽隐杆线虫成为一个非常有用的多功能药物筛选和药物作用机制研究平台。它廉价、易培养；世代周期短、后代数目多，同时可获得大量背景一致的个体，保证实验重复性和采用大样本量进行实验，从而排除个体差异的影响；与高等生物在基因和分子通路方面高度保守(kalettaandhengartner，2006)。它作为一个从细胞体外水平药物初筛到小鼠体内水平药物复筛的一个桥梁，越来越受到药学家的青睐。美国devgen公司利用人源化线虫筛选的抗心律不齐药物已被fda批准进入临床研究。将人源α-突触核蛋白与yfp黄色荧光蛋白融合后，置于线虫肌肉特异性启动子之下，人类α-突触核蛋白便可在线虫肌肉组织特异性表达。由于线虫通体透明，利用荧光显微镜可清晰地观察到黄色荧光，荧光越强，人源α-突触核蛋白表达越高。对pd有治疗作用的药物可显著抑制α-突触核蛋白表达产生的荧光，待检药物抑制荧光能力越强，抗pd活性就越好(fuetal.,2014)。四神散为古方，收录于《太平惠民和剂局方》，主要由当归、川芎、干姜和赤芍四味中药组成，广泛应用于治疗产后留血不消，积聚作块，急切疼痛，犹如遁尸，及心腹绞痛，下痢。本发明公开了四神散水提物可显著减弱与人源α-突触核蛋白融合的黄色荧光蛋白在秀丽隐杆线虫肌肉组织中呈现的荧光强度，表明本发明四神散水提物具有显著下调人源α-突触核蛋白表达的活性，因此，这种四神散水提物可在制备抗帕金森症药物中应用。技术实现要素：本发明的目的是提供四神散水提物在制备抗帕金森症药物中的新用途，具体涉及四神散水提物在制备抗帕金森症药物中的应用。本发明所述的四神散包括以下原料药：当归、川芎、干姜、赤芍。优选地，本发明所述的四神散包括以下重量比的原料药：当归1份、川芎1份、干姜1份、赤芍1份。四神散的制备方法如下：称取当归6g、川芎6g、干姜6g、赤芍6g，加蒸馏水200ml，浸泡20min后，加热煮沸并保持30分钟，用纱布初步滤去药渣，收集药液备用，将药渣再次用150ml蒸馏水浸泡5-10min,加热煮沸并保持25min，再次用纱布滤去药渣获得上清液，将两次药液合并，浓缩并定容至50ml，12000rpm╳10min离心2次，弃去不溶沉淀，用0.22um水系滤头过滤除菌，分装后于-20℃保存备用。本发明所述的四神散在制备治疗抗帕金森症药物中的应用，可以将四神散添加药学上可接受的载体如填充剂、润滑剂、湿润剂、促进吸收剂、吸附载体、稀释剂、赋形剂等，必要时可加入甜味剂、香味剂等，制备成注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液、片剂等药物的多种剂型，这是本领域技术人员可以理解的。以下提供具体实施例以实现本发明所述的四神散水提物在制备抗帕金森症药物中应用，但本发明的保护范围不局限于以下所述。具体实施方式实施例一四神散水提物的制备煎煮法制备四神散：称取当归6g、川芎6g、干姜6g、赤芍6g，加蒸馏水200ml，浸泡20min后，加热煮沸并保持30分钟，用纱布初步滤去药渣，收集药液备用，将药渣再次用150ml蒸馏水浸泡5-10min,加热煮沸并保持25min，再次用纱布滤去药渣获得上清液，将两次药液合并，浓缩并定容至50ml，12000rpm*10min离心2次，弃去不溶沉淀，用0.22um水系滤头过滤除菌，分装后于-20℃保存备用。实施例二对比水提物的制备煎煮法制备对比制剂：称取当归6g、川芎6g、干姜6g，加蒸馏水200ml，浸泡20min后，加热煮沸并保持30分钟，用纱布初步滤去药渣，收集药液备用，将药渣再次用150ml蒸馏水浸泡5-10min,加热煮沸并保持25min，再次用纱布滤去药渣获得上清液，将两次药液合并，浓缩并定容至50ml，12000rpm*10min离心2次，弃去不溶沉淀，用0.22um水系滤头过滤除菌，分装后于-20℃保存备用。实施例三川芎水提物的制备煎煮法制备川芎：称取川芎6g，加蒸馏水200ml，浸泡20min后，加热煮沸并保持30分钟，用纱布初步滤去药渣，收集药液备用，将药渣再次用150ml蒸馏水浸泡5-10min,加热煮沸并保持25min，再次用纱布滤去药渣获得上清液，将两次药液合并，浓缩并定容至50ml，12000rpm*10min离心2次，弃去不溶沉淀，用0.22um水系滤头过滤除菌，分装后于-20℃保存备用。实施例四四神散对帕金森秀丽隐杆线虫的治疗作用1.生物材料(1)秀丽隐杆线虫ow13购自caenorhabditisgeneticscenter(cgc)；为转基因品系，人源α-突触核蛋白与yfp黄色荧光蛋白融合被插入肌肉特异性启动子之下，因此该株系线虫肌肉组织特异性表达人类α-突触核蛋白，以荧光显微镜观察，荧光越强，α-突触核蛋白表达越高。对pd有治疗作用的药物可显著抑制α-突触核蛋白表达产生的荧光，待检药物抑制荧光能力越强，抗pd活性就越好。本实施例采用秀丽线虫ow13株系作为筛选抗pd药物的病理模型。(2)大肠杆菌op50(尿嘧啶渗漏突变株)，购自caenorhabditisgeneticscenter(cgc)，作为秀丽隐杆线虫的食物。2.试剂(1)固体ngm(nematodegrowthmedium)培养基成分与制作(以1升为例)：成分含量nacl3.00gk2hpo42.34gkh2po417.23g蛋白胨2.50g琼脂17.00g补充h2o至1000ml固体ngm培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，在无菌操作台下加入5mg/ml胆固醇1ml，1mmgso41ml,1mcacl21ml摇匀，趁热倒入已灭菌的9cm培养板，约20ml/板。静置等待培养基凝固，备用。(2)m9液配方成分含量na2hpo46.00gkh2po43.00gnacl5.00g1mmgso41.00ml补充h2o至1000ml(3)裂解液的配制：6.4％naclo溶液和1mnaoh溶液按体积比1:1混合。3.配制含有四神散水提物及其它水提物的ngm平板将实施例一制备好的四神散水提物以无菌水稀释，加入ngm培养基的终浓度分别为2.4mg/ml，9.6mg/ml和48mg/ml，将ngm倒入各平板，静置等待培养基凝固。在培养基上均匀涂布大肠杆菌op50作为线虫的食物。将实施例二制备好的对比水提物以无菌水稀释，加入ngm培养基的终浓度分别为2.4mg/ml，9.6mg/ml和48mg/ml，将ngm倒入各平板，静置等待培养基凝固。在培养基上均匀涂布大肠杆菌op50作为线虫的食物。将实施例三制备好的川芎水提物以无菌水稀释，加入ngm培养基的终浓度分别为2.4mg/ml，9.6mg/ml和48mg/ml，将ngm倒入各平板，静置等待培养基凝固。在培养基上均匀涂布大肠杆菌op50作为线虫的食物。4.实施步骤(1)线虫的培养：将线虫接在涂有大肠杆菌op50的固体ngm板上，然后置于20℃的培养箱中培养，当线虫长到成虫时进行同步化处理。(2)线虫同步化：挑选含有大量成虫并且有部分线虫卵已经孵出的ngm培养基，用m9液将线虫从培养基上冲下，转移到离心管中，静置使线虫自由沉降至管底，弃上清。视线虫量多少向离心管中加入裂解液，在漩祸搅拌器上振荡5-7分钟待线虫全部断裂时停止涡旋,并分装于1.5ml离心管中，用m9溶液洗线虫卵三次。(3)各种水提物抑制人源α-突触核蛋白在秀丽隐杆线虫ow13肌肉组织中的表达将同步化后分装于离心管，m9缓冲中孵化48小时成为同步化的l1期幼体线虫，4000rpm,5min离心除去多余m9，将线虫转移到涂布有op50的ngm板中20℃培养至l3期，用m9液冲冼下线虫，4000rpm,5min离心除去多余m9，最终将线虫转移到含不同种类、不同浓度水提物的ngm培养皿和空白对照为涂布有op50并加有与水提物等体积无菌水的ngm培养皿中，所有ngm皿中均含有50μm5-氟脱氧尿苷(fudr)，用以抑制线虫繁殖，避免产生世代交叠。每个培养皿60条线虫，每个药物浓度三个培养皿作为平行，25℃继续培养72小时。再用m9将冲冼下来，4000rpm,5min离心除去多余m9，加入20mmnan3麻醉线虫，在荧光显微镜下观察，拍照。每组随机观察25条线虫，所有图片采用imagej软件定量分析荧光强度。结果见表1和表2。表1四神散水提物对pd线虫的治疗作用表2四神散水提物和对比水提物对pd线虫的治疗作用上表中的荧光强度，由于同α-突触核蛋白融合，因此代表α-突触核蛋白在线虫肌肉组织的表达量，此值越低，表明四神散水提物抗pd活性越高，即四神散水提物抗pd作用越强。control-表示无菌水空白对照。表1表示四神散水提物对pd线虫的治疗作用，表2表示四神散水提物和对比水提物对pd线虫的治疗作用。不同字母意味着差异显著p<0.05。实验结果表明，在本实施例中四神散水提物显著抑制了人源α-突触核蛋白在线虫肌肉组织的表达，提示四神散水提物对pd具有显著的治疗作用。通过以上实施例证明，本发明提供的四神散对pd秀丽隐杆线虫发挥显著的治疗作用，提示本发明提供的四神散水提物具有抗pd的潜力，可在制备防治pd的药物或保健品中应用。参考文献fur.h.,harnh.j.,lius.p.,chenc.s.,changw.l.,etal.n-butylidenephthalideprotectsagainstdopaminergicneurondegenerationanda-synucleinaccumulationincaenorhabditiselegansmodelsofparkinson’sdisease.plosone2014,9(1):e85305.doi:10.1371/journal.pone.0085305.kalettat,hengartnermo.findingfunctioninnoveltargets:c.elegansasamodelorganism.natrevdrugdiscov2006,5:387e398.ma,l.,qin,c.,wang,m.,gan,d.,cao,l.,ye,h.,etal.preparation,preliminarycharacterizationandinhibitoryeffectonhumancoloncancerht-29cellsofanacidicpolysaccharidefractionfromstachysfloridanaschuttl.exbenth.foodandchemicaltoxicology2013,60:269–276.fur.h.,wangy.c.,chenc.s.,tsair.t.,lius.p.,changw.l.,linh.l.,etal.acetylcorynolineattenuatesdopaminergicneurondegenerationanda-synucleinaggregationinanimalmodelsofparkinson’sdisease.neuropharmacology82(2014)108e120.当前第1页12