本发明涉及胰岛素用药技术领域，尤其涉及一种胰岛素介孔碳颗粒及其制备方法、口服制剂和应用。
背景技术：
目前对于糖尿病患者而言，胰岛素通过促进血糖摄入，依旧是维持血糖水平的首要药物。时至今日，胰岛素仍然是治疗ⅰ型糖尿病的一线药物，对ⅱ型糖尿病患者也有疗效。胰岛素主要仍以皮下注射的方式给药而不能口服，原因在于其在消化道环境中的不稳定，包括胃酸和蛋白酶的影响，较低的肠壁渗透率，以及肝脏的首过效应等。但是，长期皮下注射胰岛素可导致注射部位发生感染，并引起患者心理压力增大，从而导致患者依从性降低，进而导致无效治疗。另外，患者自行皮下注射胰岛素也有可能操作失误，导致过量注射，引起低血糖等不良反应。因此，全球至今仍致力于开发新型的非注射胰岛素药剂，以克服过往皮下注射胰岛素所带来的各种缺点。
目前，胰岛素非注射给药方式主要为喷雾剂经肺部吸入，但是这种给药方式带来了很多问题，比如其引起患者的哮喘或增加肺癌的患病风险等。而透皮方式给药则因为皮肤屏障的问题存在吸收、起效缓慢甚至无疗效的问题。因此，回归口服方式给药，制备新型的胰岛素口服化制剂尤为必要。
胰岛素口服化制剂的研发所遇到的障碍主要包括：(1)胃液的溶解和蛋白酶的消化；(2)肠道黏性黏膜层；(3)肠道上皮细胞。因此，目前口服胰岛素制剂的研发方向主要包括：(1)胰岛素吸收促进剂；(2)蛋白酶抑制剂；(3)肠道黏膜黏着剂；(4)微粒载药系统。总之，胰岛素口服化制剂的研究方向可总结为：(1)防止胰岛素被蛋白酶破坏；(2)在不改变胰岛素生理活性的前提下增强胰岛素在消化系统的吸收。
胰岛素口服化制剂的具体方式包括：(1)对胰岛素的化学结构进行修饰，避免被消化道酶水解；(2)胰岛素吸收增强剂，通过细胞旁路途径、跨细胞转移或改变肠壁上皮细胞特性，打破肠屏障从而促进胰岛素吸收；(3)酶抑制剂；(4)细胞穿透肽，通过提高质膜对蛋白、多肽的穿透性促进胰岛素吸收；(5)黏膜黏着性的聚合物系统，这是最有前途的研发方向，这类材料通过ph、温度、酶、光、电场或离子强度等环境时改变其黏膜黏附性能，如壳聚糖；(6)口服微粒给药系统，主要为1～1000μm的微囊给药系统，避免胰岛素在胃中溶出并增强其在肠道的吸收，比如β-环糊精、聚乳酸；(7)口服纳米粒给药系统，粒径范围为1～100nm，比如聚合物胶束。
虽然上述的胰岛素口服化制剂研发方向具备提高胰岛素稳定性、增强胰岛素吸收的优点，但是由于其存在成本过高、潜在的安全性及生物利用度不达标等问题，美国fda至今仍未批准任何口服胰岛素制剂上市。因此，对口服胰岛素制剂的研发还必须进行，且应该往安全无毒、提高生物利用度的方向研发。
根据国际纯粹与应用化学联合会(iupac)的定义，多孔材料可分为微孔材料、介孔材料和大孔材料。孔径大于50nm的为大孔材料，孔径介乎2nm～50nm的是介孔材料，孔径小于2nm的为微孔材料。介孔材料由于具有较高的比表面积、孔容以及可调的孔径结构、形貌等特点，对生物大分子、重金属离子及合成有机污染物等均有较强的吸附作用。
现有技术也有利用介孔材料制备胰岛素颗粒，例如，公开号为cn102961340b公开的《纳米级胰岛素及其制备方法》：其以二氧化硅气凝胶作为胰岛素的载体，所述二氧化硅气凝胶的孔隙率为95～99％、孔径为10～50nm、比表面积为200～1000m2/g、密度为3～300kg/m3、组成网络的胶体颗粒直径为1～50nm，所述纳米级胰岛素颗粒的直径在100nm以下；所述纳米级胰岛素颗粒还包括peg；
所述的纳米级胰岛素颗粒的制备方法包括以下步骤：
(1)将胰岛素溶解于0.01mol/l的盐酸溶液中；
(2)向上述盐酸溶液中加入二氧化硅气凝胶；
(3)待胰岛素与二氧化硅气凝胶吸附完全后，干燥；
(4)将peg溶解于无水乙醇中；
(5)将步骤(3)干燥所得的固体加入步骤(4)的乙醇溶液中；
(6)将步骤(5)的乙醇溶液送入乳化机中乳化；
(7)步骤(6)所得乳化液于恒温干燥箱中干燥；
(8)研磨步骤(7)干燥所得的固体，并过200目筛，即得纳米级胰岛素颗粒；
当步骤(2)中所述的二氧化硅气凝胶具有疏水性时，在加入盐酸溶液之前需先经300～1000℃热处理使其具有亲水性。
对比文件1解决了目前胰岛素口服的生物利用度低的问题，其改善了纳米粒被吸收的情况。然而，对比文件1采用的载体是二氧化硅气凝胶，可能引起细胞或脏器毒性反应，易于体内蓄积。且对比文件1的纳米级胰岛素颗粒制备复杂。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种胰岛素介孔碳颗粒及其制备方法，制备简单，生物相容性好，不会引起细胞或脏器毒性反应，体内排泄较快。
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种胰岛素介孔碳颗粒制成的口服制剂，所述口服制剂解决胰岛素在消化道环境中的不稳定和肝脏的首过效应的问题，实现口服，并保证多肽口服的高效治疗。
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种胰岛素介孔碳颗粒在治疗糖尿病中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种胰岛素介孔碳颗粒，包括介孔碳和胰岛素，所述胰岛素嵌入至介孔碳中，所述胰岛素与介孔碳的用量比为3-6:10-15。
作为上述方案的改进，所述胰岛素与介孔碳的用量比为4-5:11-13。
作为上述方案的改进，所述介孔碳的粒径为2nm～50nm。
作为上述方案的改进，所述介孔碳的粒径为10nm～40nm。
作为上述方案的改进，所述介孔碳选用mcn-1、mcn-2或mcn-3，其中，
mcn-1是指比表面积为755-765m2/g，孔容为0.8-0.95cm3/g，孔径分布为3.9-7.8nm的介孔碳；
mcn-2是指比表面积为740-754m2/g，孔容为0.96-1.15cm3/g，孔径分布为3.9-7.6nm的介孔碳；
mcn-3是指比表面积为480-530m2/g，孔容为0.50-0.80cm3/g，孔径分布为8.0-20nm的介孔碳。
相应的，本发明公开一种如胰岛素介孔碳颗粒的制备方法，包括:
将10-15mg介孔碳和3-6mg胰岛素置于试管中，加入0.4-1.2ml的醇溶液和0.1-0.4ml的酸溶液，酸溶液的浓度为0.005-0.03mol/l，涡旋振荡20-50min；
振荡后的样品转移到蒸发皿中，常温吹干，得到胰岛素介孔碳颗粒。
作为上述方案的改进，所述介孔碳的用量为11-13mg，所述胰岛素的用量为4-5mg，所述醇溶液的用量为0.6-1.0ml，所述酸溶液的用量为0.2-0.3ml，酸溶液的浓度为0.01-0.02mol/l，涡旋振荡的时间为25-35min。
作为上述方案的改进，所述醇溶液选用甲醇或乙醇，所述酸溶液为盐酸或乙酸。
相应的，本发明还提供了由上述胰岛素介孔碳颗粒制成的胰岛素口服制剂。
相应的，本发明还提供了胰岛素介孔碳颗粒在治疗糖尿病中的应用。
实施本发明，具有如下有益效果：
一、本发明提供一种胰岛素介孔碳颗粒，包括介孔碳和胰岛素，胰岛素与介孔碳的用量比为3-6:10-15，而且，本发明通过特定的制备方法，使得胰岛素分子融合进介孔碳的孔道，进而实现载药，成功合成胰岛素介孔碳纳米粒。
二、所述胰岛素介孔碳颗粒的制备方法简单，仅仅包括两个步骤，且醇溶液和酸溶液在一个步骤里面同时加入即可，简化了操作步骤，节省了制备时间。
三、本发明的吸附率分别为25-55％，载药量分别为8-15％，符合药效学需求；释放度为15-57％，实现在模拟肠液环境中的有效释放；口服给药4h后糖尿病大鼠血糖显著降低，与皮下注射相比具备缓释的效果；对结肠癌细胞具备一定的吸附能力，胰岛素介孔碳纳米粒可以在肠道细胞实现转运。
四、与制备复杂，生物相容性较差，可能引起细胞或脏器毒性反应以及易于体内蓄积的介孔二氧化硅相比，本发明的介孔碳材料毒性较低，具有良好的生物相容性，体内排泄较快，制备方法简便，产率较高。
附图说明
图1为空白介孔碳样品及胰岛素介孔碳样品的sem图谱(a.mcn-1；b.mcni-1；c.mcn-2；d.mcni-2；e.mcn-3；f.mcni-3)；
图2为空白介孔碳样品及胰岛素介孔碳样品的tem图谱(a.mcn-1；b.mcni-1；c.mcn-2；d.mcni-2；e.mcn-3；f.mcni-3)；
图3a为胰岛素、空白介孔碳样品及胰岛素介孔碳纳米粒的傅里叶红外光谱(a.insulin；b.mcn-1；c.mcni-1；d.mcn-2)；
图3b为胰岛素、空白介孔碳样品及胰岛素介孔碳纳米粒的傅里叶红外光谱(e.mcni-2；f.mcn-3；g.mcni-3)；
图4为胰岛素介孔碳纳米粒在ph7.4pbs溶液中的释放度的示意图；
图5为大鼠口服胰岛素介孔碳纳米粒后血糖的百分比变化值的示意图；
图6为fitc荧光标记的介孔碳材料作用于结肠癌hct-116细胞的示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
本发明提供了一种胰岛素介孔碳颗粒，包括介孔碳和胰岛素，所述胰岛素嵌入至介孔碳中，所述胰岛素与介孔碳的用量比为3-6:10-15。优选地，所述胰岛素与介孔碳的用量比为4-5:11-13。更佳地，所述胰岛素与介孔碳的用量比为4:12。
介孔碳是一类新型的非硅基介孔材料，2nm<孔径<50nm，具有巨大的比表面积(可高达2500m2/g)和孔体积(可高达2.25cm3/g)，以提供更大的载药量。与纯介孔硅材料相比，介孔碳材料表现出特殊的性质，有高的比表面积，高孔隙率；孔径尺寸在一定范围内可调；介孔形状多样，孔壁组成、结构和性质可调；通过优化合成条件可以得到高热稳定性和水热稳定性；合成简单、易操作、无生理毒性。其中，所述介孔碳的粒径为2nm～50nm。优选地，所述介孔碳的粒径为10nm～40nm。更佳地，所述介孔碳的粒径为10nm～40nm。
所述胰岛素与介孔碳的用量比为3-6:10-15，合适的胰岛素与介孔碳的质量比是保证其释放性能和载药效率的保证。若胰岛素的含量偏低，则有可能导致胰岛素的释放速率减缓；若胰岛素含量偏高，则有可能导致胰岛素释放加速，且造成无效载药，对胰岛素原料药的浪费。
本发明的胰岛素与介孔碳以特定的用量，并通过特定的制备方法，使得胰岛素分子融合进介孔碳的孔道，进而实现载药，成功合成胰岛素介孔碳纳米粒。合成后的胰岛素介孔碳纳米粒可克服胃液的溶解和蛋白酶的消化、肠道黏性黏膜层、肠道上皮细胞等阻碍，顺利在肠道释放，口服给药4h后糖尿病大鼠血糖显著降低，与皮下注射相比具备缓释的效果。
具体的，所述介孔碳可以选用mcn-1、mcn-2或mcn-3，但不限于此。优选地，所述介孔碳可以选用mcn-1或mcn-3。更佳地，所述介孔碳可以选用mcn-3。
需要说明的是，本发明通过比表面积(sbet)、孔容(vm)及孔径分布(dm)来定义mcn-1、mcn-2及mcn-3。
其中，mcn-1是指比表面积为755-765m2/g，孔容为0.8-0.95cm3/g，孔径分布为3.9-7.8nm的介孔碳；
mcn-2是指比表面积为740-754m2/g，孔容为0.96-1.15cm3/g，孔径分布为3.9-7.6nm的介孔碳；
mcn-3是指比表面积为480-530m2/g，孔容为0.50-0.80cm3/g，孔径分布为8.0-20nm的介孔碳。
相应的，本发明公开一种如胰岛素介孔碳颗粒的制备方法，包括:
将10-15mg介孔碳和3-6mg胰岛素置于试管中，加入0.4-1.2ml的醇溶液和0.1-0.4ml的酸溶液，酸溶液的浓度为0.005-0.03mol/l，涡旋振荡20-50min；
振荡后的样品转移到蒸发皿中，常温吹干，得到胰岛素介孔碳颗粒。
本发明胰岛素介孔碳颗粒的制备方法简单，仅仅包括两个步骤，且醇溶液和酸溶液在一个步骤里面同时加入即可，简化了操作步骤，节省了制备时间。而对比文件1需要将胰岛素先溶于盐酸，再加入二氧化硅，待胰岛素与二氧化硅气凝胶吸附完全后，干燥，得到固体；然后将peg溶解于无水乙醇，再将固体溶于乙醇溶液中，最后乳化干燥，得到颗粒。而且，二氧化硅气凝胶具有疏水性时，在加入盐酸溶液之前需先经300～1000℃热处理使其具有亲水性。
优选地，所述介孔碳的用量为11-13mg，所述胰岛素的用量为4-5mg，所述醇溶液的用量为0.6-1.0ml，所述酸溶液的用量为0.2-0.3ml，酸溶液的浓度为0.01-0.02mol/l，涡旋振荡的时间为25-35min。所述醇溶液选用甲醇或乙醇，所述酸溶液为盐酸或乙酸。
更佳地，所述介孔碳的用量为12mg，所述胰岛素的用量为4mg，所述醇溶液的用量为0.8ml，所述酸溶液的用量为0.2ml，酸溶液的浓度为0.01mol/l，涡旋振荡的时间为30min。所述醇溶液选用甲醇，所述酸溶液为乙酸。
相应的，本发明还提供了由上述胰岛素介孔碳颗粒制成的胰岛素口服制剂。所述口服制剂为药学上可接受的口服制剂，包括片剂、丸剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂或混悬剂。同时，本发明胰岛素介孔碳颗粒也有可能被制成药学上可以接受的注射剂或栓剂。
相应的，本发明还提供了胰岛素介孔碳颗粒在治疗糖尿病中的应用。
本发明以广东药科大学药剂学教研室提供的三种介孔碳材料mcn-1、mcn-2及mcn-3为原料，通过搅拌、挥发等方式合成三种性质不同的胰岛素介孔碳纳米粒mcni-1、mcni-2及mcni-3，通过扫描电镜图谱、透射电镜图谱、红外图谱以及比表面积、孔径分布测定对空白介孔碳材料和已合成的胰岛素介孔碳纳米粒进行对比表征，并通过测量介孔碳材料对胰岛素溶液吸附后滤液中的胰岛素浓度从而计算介孔碳材料对胰岛素的载药量，并研究了胰岛素在模拟肠道环境的介质中的释放行为。最后本发明进行胰岛素介孔碳纳米粒对糖尿病大鼠的口服药效学研究以及fitc荧光标记介孔碳材料对hct-116细胞的吸附试验。
结果表明，空白介孔碳材料和胰岛素介孔碳口服纳米粒的扫描电镜图谱和透射电镜图谱有显著区别，胰岛素介孔碳纳米粒的红外图谱显示出胰岛素的特征峰，胰岛素介孔碳纳米粒的比表面积比空白介孔碳材料显著降低，孔径分布显著变化。吸附率和载药量测试表明，mcni-1、mcni-2及mcni-3的吸附率分别为41.52％±1.99％、28.77％±0.30％及49.49％±1.78％，载药量分别为12.16％±0.51％、8.68％±0.08％及14.06％±0.43％，符合本实验的药效学需求。另外胰岛素介孔碳纳米粒在ph7.4pbs溶液中的释放研究中，mcni-1、mcni-2及mcni-3在15min内的释放度分别能达到48.20％±8.93％、15.68％±5.50％及53.11％±3.69％，实现在模拟肠液环境中的有效释放。胰岛素介孔碳纳米粒按胰岛素50iu/kg剂量对糖尿病大鼠的口服药效学试验表明，口服给药4h后糖尿病大鼠血糖显著降低，与皮下注射相比具备缓释的效果，其中mcni-1、mcni-2及mcni-3对糖尿病大鼠血糖最低能降职原初始血糖的13.2％±5.2％、62.3％±17.0％及48.7％±21.3％。fitc标记介孔碳对hct-116吸附试验表明，本文所使用的介孔碳材料对hct-116细胞具备一定的吸附能力，为日后胰岛素介孔碳纳米粒在肠道细胞的转运机制研究提供了基础。
以下为详细的试验内容。
1.胰岛素介孔碳纳米粒的理化特性表征
取介孔碳材料mcn-1、mcn-2及mcn-3各12mg置于1mlep管中，分别加入4mg胰岛素，加入0.8ml甲醇和0.2ml0.01mol/lhcl，涡旋振荡30min。之后将振荡完毕的样品转移到蒸发皿中，常温吹干，得供扫描电镜图谱测试使用的胰岛素介孔碳纳米粒mcni-1、mcni-2及mcni-3。另外，准备空白介孔碳材料mcn-1、mcn-2及mcn-3各12mg。扫描电子显微镜图谱测试条件：sem和高效能谱仪(energydispersivespectroscopy，eds)为德国merlinemissionelectronmicroscope，加速电压为5kv。透射电子显微镜图谱测试条件：200kv(日本jeol2100f)。将样品粉末在酒精超声分散，将悬浮液滴于富有多孔炭膜的铜网上，干燥后分析。胰岛素介孔碳纳米粒和空白介孔碳材料的比表面积由brunauer-emmett-teller(bet)法进行测定，孔容和孔径分布的计算方法为barrett-joyner-halenda(bjh)模型。
取上述制得的胰岛素介孔碳纳米粒mcni-1、mcni-2及mcni-3各2mg，分别与200mg干燥kbr粉末在红外灯下用玛瑙研钵干燥研磨均匀，用压片机制得薄片，置于红外分光光度计中检测，扫描范围：4000cm-1～500cm-1，扫描次数：32次，记录所得图谱。
图1为空白介孔碳样品及胰岛素介孔碳样品的sem图谱(a.mcn-1；b.mcni-1；c.mcn-2；d.mcni-2；e.mcn-3；f.mcni-3)，可知，胰岛素介孔碳纳米粒和空白介孔碳材料相比，空白介孔碳表面及孔道边缘清晰、均匀；而胰岛素介孔碳纳米粒的表面被胰岛素药物覆盖，致使介孔碳材料表面及其孔道边缘变模糊。
图2为空白介孔碳样品及胰岛素介孔碳样品的tem图谱(a.mcn-1；b.mcni-1；c.mcn-2；d.mcni-2；e.mcn-3；f.mcni-3)，空白介孔碳材料的孔道在透射电子显微镜下清晰可见，但已合成的胰岛素介孔碳纳米粒的孔道已经不能分辨，表明胰岛素分子已经融合进介孔碳的孔道，进而实现载药，成功合成胰岛素介孔碳纳米粒。
图3为胰岛素、空白介孔碳样品及胰岛素介孔碳纳米粒的傅里叶红外光谱(a.insulin；b.mcn-1；c.mcni-1；d.mcn-2；e.mcni-2；f.mcn-3；g.mcni-3)，由于空白介孔碳材料在烧制过程中不可避免产生-c＝o，因此空白介孔碳材料中的-c＝o峰(～1616.06cm-1)会与胰岛素的-c＝o峰发生重叠。而在4000～3000cm-1波数范围内，胰岛素的-nh-、-nh2、-oh及-cooh峰与介孔碳的c≡c或c-h结构的峰发生重叠导致了峰型的变化，甚至存在共轭效应导致宽峰的出现。在2000～1000cm-1波数范围内，胰岛素分子的-nh-、-nh2、-oh等峰在胰岛素介孔碳纳米粒中有所显示，表示胰岛素介孔碳纳米粒的合成成功。
表1为空白介孔碳样品和胰岛素介孔碳纳米粒的比表面积(sbet)、孔容(vm)和孔径分布(dm)：
表1
各型号胰岛素介孔碳纳米粒的比表面积及孔容均比原来对应的空白介孔碳材料减少，其中sbet减少的比例mcni-1>mcni-3>mcni-2，vm减少的比例mcni-1>mcni-2>mcni-3。bjh模型得出的孔径分布上，mcni-1对mcn-1没有明显变化，mcni-2较mcn-2相比则失去了3.9nm的孔径分布峰，mcni-3较mcn-3相比孔径分布峰由8.5nm减小为6.8nm。
2.介孔碳材料对胰岛素吸附率、载药量测定
通过测定介孔碳材料对溶液中胰岛素吸附后滤液所剩的胰岛素的浓度，间接计算介孔碳对胰岛素的吸附率和载药量。其中吸附率和载药量的计算方法为：
本试验采用高效液相色谱法(hplc)测定，按《中国药典》2015年版二部胰岛素项下测定，色谱条件为：
流动相：0.2mol/l硫酸盐缓冲液(含28.4g无水硫酸钠及2.7ml磷酸，用乙醇胺调ph至2.3)-乙腈(74:26)，流速1ml/min；色谱柱：c18(4.6×150mm，3μm)；检测器：d2(λ＝214nm)；出峰时间：约10min。
取4.0mg胰岛素和12.0mg的介孔碳材料(分别为mcn-1、mcn-2及mcn-3)置于10ml容量瓶中，加pbs溶液定容至刻度，将其置于冰浴中以150rpm转速摇床12h使介孔碳和胰岛素充分吸附。取其滤液经hplc法测各滤液的胰岛素峰面积，根据标准曲线，计算溶液中的胰岛素剩余浓度，间接计算各介孔碳材料对溶液中胰岛素的吸附率和载药量。
表2为介孔碳材料mcn-1、mcn-2及mcn-3对胰岛素的吸附率和载药量，
表2
由表二可知，试验中三种介孔碳材料对胰岛素均有明显的吸附作用。
3.胰岛素介孔碳纳米粒的释放性能研究
释放性能研究采用37℃的ph7.4pbs溶液作为释放介质，检测所制得的胰岛素介孔碳纳米粒在模拟结肠环境下的释放性能，为下一步药效学试验提供剂量依据。本次试验过程中每次取样后需要补充与取样相同体积的释放介质，因此本次试验过程中释放度的计算方法为：
其中：
cn—各取样点滤液中胰岛素的浓度(mg/ml)
cmax—胰岛素介孔碳样品在释放介质中理论上完全释放时滤液所应达到的浓度(mg/ml)
v—各时间点的取样体积(ml)
vmax—释放介质的总体积(ml)
本试验采用高效液相色谱法(hplc)测定，按《中国药典》2015年版二部胰岛素项下测定，色谱条件与前述相同。
准备三个100ml圆底烧瓶，各装入50ml的ph7.4pbs溶液作为释放介质，置于电热磁力搅拌器上，设水浴37℃，以300rpm转速搅拌。称取含胰岛素5.0mg的胰岛素介孔碳纳米粒mcni-1、mcni-2及mcni-3，待释放介质的温度维持在37℃时，将上述胰岛素介孔碳纳米粒加入释放介质中，并开始计时，每隔15min按0.2ml取样，30s内过滤至1mlep管中，取样后向释放体系中补充0.2mlph7.4pbs溶液，本试验维持至120min。各时间点所采集的滤液，经hplc法检测各滤液中胰岛素的浓度，根据标准曲线计算胰岛素介孔碳纳米粒mcni-1、mcni-2及mcni-3在各时间点的胰岛素释放度，表征其释放性能。
表3和图4为胰岛素介孔碳纳米粒在ph7.4pbs溶液中的释放度，
表3
*p＜0.001vsmcni-1ormcni-3
由表3和图4可知，15min内胰岛素介孔碳样品在ph7.4pbs溶液中能够实现快速释放，15min时mcni-1、mcni-2及mcni-3的胰岛素释放率分别达到48.20％±8.93％、15.68％±5.50％及53.11％±3.69％。
4口服胰岛素介孔碳纳米粒对糖尿病大鼠的降血糖的影响
药效学试验采用糖尿病模型大鼠作为试验动物，通过口服胰岛素介孔碳纳米粒的方式对糖尿病模型大鼠给药，每隔2h测定各大鼠的血糖变化，初步证明口服胰岛素介孔碳纳米粒的方式可降低糖尿病大鼠的血糖。
4.1链脲佐菌素注射液的配制和糖尿病模型大鼠的建立
链脲佐菌素可通过破坏大鼠体内胰岛b细胞的方式建立大鼠糖尿病模型，但链脲佐菌素高温、见光易分解，因此必须现配现用。为了使链脲佐菌素溶液稳定性提高，本实验采用0.1mol/lph4.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作为溶剂配制链脲佐菌素注射液，注射液中链脲佐菌素浓度为5mg/ml。
选健康雌性大鼠若干，按50mg/kg体重剂量腹腔注射上述配制的链脲佐菌素注射液，7d后再进行第二次注射。因给药初期胰岛b细胞被破坏后胰岛素将大量释放进血液导致过低血糖而死亡，给药2h后需将5％葡萄糖溶液给予大鼠饮用以维持血糖。距第二次注射7d后，对各大鼠空腹6h，用血糖仪测其尾静脉血糖，血糖大于11.1mmol/l的大鼠为糖尿病模型建立成功的大鼠。
4.2口服胰岛素介孔碳纳米粒对糖尿病大鼠的降血糖作用
取三只50ml离心管，分别装载74.0mg的mcn-1、mcn-2及mcn-3，然后各加入胰岛素3.7mg(相当于100iu)。加入1.0ml0.01mol/lhcl使胰岛素溶解，再加入19.0mlph7.4pbs溶液，密封涡旋振荡30min，并4℃静置过夜，得5iu/ml的胰岛素介孔碳纳米粒口服混悬液，作为试验组。
取一只50ml离心管，加入3.7mg胰岛素(相当于100iu)，加入1.0ml0.01mol/lhcl使胰岛素溶解，再加入19.0mlph7.4pbs溶液，摇匀，并4℃静置过夜，得5iu/ml的胰岛素口服溶液，作为空白对照组。
取一只50ml离心管，加入0.37mg胰岛素(相当于10iu)，加入1.0ml0.01mol/lhcl使胰岛素溶解，再加入19.0mlph7.4pbs溶液，摇匀，并4℃静置过夜，得0.5iu/ml的胰岛素皮下注射液，作为阳性对照组。
每组10只大鼠随机分配，试验前空腹2h，其中作为阳性对照的皮下注射组给药剂量为5iu/kg，作为空白对照的胰岛素灌胃组和作为试验组的胰岛素介孔碳纳米粒灌胃组给药剂量为50iu/kg，给药开始后每隔2h用血糖仪测量各大鼠的血糖浓度，并与初始血糖(0h)比较，计算各时间点的血糖与初始血糖的百分比，绘制血糖变化曲线。
图5为大鼠口服胰岛素介孔碳纳米粒后血糖的百分比变化值，阳性对照组(皮下注射5iu/kg组)在给药后2h到达血糖最低值，为初始血糖的16.0％±2.9％，随后血糖逐渐回升，给药后8h回到初始血糖(92.9％±7.8％)。mcni-1口服组(50iu/kg)于给药后4h达血糖最低值(13.2％±5.2％)，给药后12h仅回到初始血糖的70.3％±29.6％。mcni-2口服组(50iu/kg)于给药后4h达血糖最低值(62.3％±17.0％)，给药后10h回到初始血糖(104.1％±20.7％)。mcni-3口服组(50iu/kg)于给药后6h达血糖最低值(48.7％±21.3％)，给药后8h回到初始血糖(100.5％±2.9％)。
5介孔碳材料对结肠癌细胞hct-116的吸附试验
通过fitc荧光标记的介孔碳材料mcn-1、mcn-2及mcn-3对结肠癌hct-116细胞的吸附试验，考察上述介孔碳材料对hct-116细胞的吸附性能，为日后胰岛素介孔碳纳米粒在结肠环境的转运机制研究提供基础。
5.1fitc荧光标记介孔碳材料的合成
取三只100ml圆底烧瓶，用铝箔包裹避光，每只各加入20ml乙醇、10mgfitc粉末及100μl，25℃下避光搅拌8h，得反应液。与此同时，准备三只15ml离心管，分别称取mcn-1、mcn-2及mcn-3各20mg，然后分别加入5ml30％过氧化氢将介孔碳表面氧化，为时8h。之后将氧化后的介孔碳材料分别用0.22μm微孔滤膜过滤并用乙醇洗涤，然后用10ml乙醇将其混悬，加入上述反应液中继续搅拌12h。随后将合成所得产物转移到铝箔包裹的50ml离心管中，以3000rpm转速离心5min，弃去上清液，加入乙醇10ml混悬、洗涤，再3000rpm离心5min，弃去上清液，再重复洗涤两次，得fitc荧光标记的介孔碳材料。
5.2介孔碳材料对结肠癌细胞hct-116的吸附试验
将hct-116细胞用含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基(以下简称dmem+10％fbs培养基)稀释成5×104ml-1，并接种至13个45cm培养皿中，培养24h。将所合成的fitc荧光标记介孔碳材料加入5ml75％乙醇摇匀、消毒，2000rpm离心4min，弃去上清液，并加入5ml灭菌pbs摇匀、洗涤，2000rpm离心4min，弃去上清液，再用灭菌pbs洗涤一次。弃去上清液后，加入10mldmem+10％fbs培养基使fitc荧光标记介孔碳的浓度为2mg/ml。
将13个培养皿分为三组，每组四个，剩余一个作为空白对照组。将各培养皿中的培养基弃去，空白对照组加入新的培养基，其余各组分别加入各个fitc荧光标记介孔碳材料混悬液各2ml。避光培养，距给药0.5h、1h、2h及4h弃去细胞上的混悬液，并用pbs溶液洗涤三次，用甲醇固定细胞，在荧光倒置显微镜下以488nm激发波长下观察hct-116所吸附的fitc标记介孔碳颗粒，放大倍数100×，并记录其荧光显微照片。
图6表明，fitc荧光标记的介孔碳材料作用于结肠癌hct-116细胞0.5h后，三种介孔碳材料均与hct-116细胞吸附，并随着时间的延后，参与吸附的介孔碳越多。本试验间接表明三种介孔碳对结肠细胞具有一定的吸附力，胰岛素介孔碳纳米粒可以在肠道细胞实现转运。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。