本发明涉及一种包含多核苷酸或多肽的抗癌疫苗、其中使用这种抗癌疫苗治疗癌症的方法以及用于产生所述疫苗的方法。
发明背景
虽然癌症的治疗在过去几十年间已有改善，尤其归因于早期检测和诊断，这显著地延长了存活期，仅约60％诊断为癌症的患者在诊断后的5年内仍活着。
大多数在用的癌症治疗是手术操作、放射线和细胞毒性化疗剂，然而，它们都有严重的副作用。近来还使用了利用针对已知癌症相关抗原的抗体的治疗。
在最近几年间，借助于患者自己的免疫系统靶向癌细胞的癌症免疫疗法(即癌症疫苗)已引起了人们的关注，因为这种疗法可减少或甚至消除传统癌症治疗中所见的一些副作用。
免疫学的基础是基于自身-非自身辨别。诱导感染性疾病的大多数病原体含有可由宿主识别并触发免疫应答的分子签名。然而，肿瘤细胞来源于正常细胞，并且通常不表达任何分子签名，使得它们更难以与正常细胞区分
然而，大多数肿瘤细胞表达不同类别的肿瘤抗原。一类肿瘤抗原是所谓的肿瘤相关抗原，即在正常组织中以低水平表达且在肿瘤组织中以高得多的水平表达的抗原。近十年来，这种肿瘤相关抗原成为了癌症疫苗的靶标。然而，针对肿瘤相关抗原的免疫治疗存在的几个问题在于，肿瘤细胞可通过所讨论的抗原的下调而逃避免疫系统，且该治疗还可由于正常细胞破坏而产生毒性。
近来，已鉴别了另一类肿瘤抗原，即所谓的肿瘤新抗原或肿瘤特异性抗原。肿瘤新抗原是由于肿瘤基因组中的一个或多个突变而出现，所述突变在所讨论的蛋白质的氨基酸序列中产生变化。由于在正常组织中不存在这些突变，所以针对肿瘤相关抗原的治疗的副作用在用针对肿瘤新抗原的免疫治疗时并不出现。
体细胞的、肿瘤特异性非同义突变的平均数目对于恶性黑色素瘤来说介于100与120之间。一些基因改变可由免疫系统识别，代表理想的抗原。动物模型已证实了肿瘤新抗原的免疫效用，并且已经开始了两个临床试验，一个是用包含高达10个突变蛋白质的疫苗，而另一个是用rna疫苗(ivacmutanome)。rna疫苗包含2个rna分子，每个包含五个不同的突变编码序列。
然而，通过施用几种不同蛋白质或几个rna序列，难以控制针对所施用的或在体内表达的各种蛋白质的免疫应答。
因此，需要一种更高效的疫苗，其确保突变蛋白质在体内或体外的表达并且确保抗原的递送以及引发强t细胞应答所需的抗原呈递细胞的活化。
技术实现要素：
本发明涉及一种治疗性抗癌疫苗，所述疫苗是针对来自肿瘤新抗原的多个新表位，其中所述新表位作为称为疫苗体的二聚蛋白呈递给免疫系统。wo2004/076489详细地描述了称为疫苗体的二聚蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗性抗癌新表位疫苗，其包含免疫有效量的
1)包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码以下
○靶向单元
○二聚单元
○第一接头
○抗原单元，其中所述抗原单元包含n-1个抗原亚单元，每个亚单元包含癌症新表位序列的至少一部分和第二接头且所述抗原单元还包含最终癌症新表位序列，其中n为3至50的整数。
或
2)由如1)所定义的多核苷酸编码的多肽，或
3)由两个多肽组成的二聚蛋白，所述多肽是由如1)中所定义的多核苷酸编码。
另一方面，本发明涉及如上所定义的多核苷酸。这种多核苷酸例如适用于根据本发明的疫苗中。
第三方面，本发明涉及一种包含如上所定义的多核苷酸的载体，且第四方面，本发明涉及一种包含如上所定义的多核苷酸或载体的宿主细胞。
第五方面，本发明涉及一种由如上所定义的多核苷酸编码的多肽。这种多肽例如适用于根据本发明的疫苗中，且第六方面，本发明涉及一种由如上所定义的两个多肽组成的二聚蛋白。
第七方面，本发明涉及如上所定义的多肽、二聚蛋白或多核苷酸，它们是用作药剂。
如上所述，在一些实施方案中，所述疫苗包含多肽或二聚蛋白，且因此，第八方面，本发明涉及一种用于制备如上所定义的二聚蛋白或多肽的方法，其中所述方法包括
a)将如上所定义的多核苷酸转染到细胞群中；
b)培养所述细胞群；
c)收集并纯化由所述细胞群表达的二聚蛋白或多肽。
在其它实施方案中，所述疫苗包含多核苷酸，且因此，第九方面，本发明涉及一种用于制备包含免疫有效量的多核苷酸的疫苗(如dna或rna疫苗)的方法，其中所述方法包括
a.制备如上所定义的多核苷酸；
b.将在步骤a)获得的多核苷酸在药学上可接受的载体、稀释剂或缓冲剂中混合，由此获得所述疫苗。
第十方面，本发明涉及一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用本文所定义的疫苗。在替代的第十方面中，本发明涉及一种如上所定义的疫苗，所述疫苗是用于治疗癌症的方法中。
附图简述
图1示出了分别在各单体上具有3、10或20个新表位的根据本发明的二聚蛋白的示意图。
图2示出了在用vb10.neo构建体转染hek293细胞之后基于新抗原的疫苗体蛋白作为功能性同二聚体产生并分泌。图2的左上图示出了包含10个新表位的vb10.neoct26-x(vb4001)和vb10.neob16-x(vb4003)的蛋白质印迹，且图2的左下图示出了包含3个新表位的vb10.neoct26-iii(vb4002)和vb10.neob16-iii(vb4004)的蛋白质印迹。对于每个构建体(-还原剂)来说，功能性同二聚体的形成在蛋白质印迹的左图中示出。右图示出了单体(+还原剂)。图2的右图示出了检测来自用vb10.neo构建体转染的hek293细胞的上清液中的疫苗体蛋白的两个elisa实验的结果。右上图示出了vb10.neoct26构建体vb4001和vb4002的表达水平，且右下图示出了vb10.neob16构建体vb4003和vb4004的表达水平。
图3示出了当与包含3个新表位的疫苗体dna疫苗相比时，在用包含10个新表位的疫苗体dna疫苗单次注射之后，诱导强的和广泛的t细胞应答。左图示出了当注射分别包含3和10个新表位的vb10.neob16-iii(vb4004)或vb10.neob16-x(vb4003)时，在b16黑色素瘤模型中针对单独的新表位的ifn-γ应答。右图示出了当注射分别包含3和10个新表位的vb10.neoct26-iii(vb4002)或vb10.neoct26-x(vb4001)时，在ct26结肠癌模型中针对新表位的ifn-γ应答。x轴代表10个不同的新表位，pepm1-m10。
vb10.neoct26-x＝vb4001＝ct26pepm1-m10，
vb10.neoct26-iii＝vb4002＝ct26pepm1-m3，
vb10.neob16-x＝vb4003＝b16pepm1-m10，
vb10.neob16-iii＝vb4004＝b16pepm1-m3。
图4示出了与仅包含3个新表位的疫苗体dna疫苗相比，包含10个新表位的疫苗体dna疫苗诱导更强且更广泛的总免疫应答。上图：当分别用包含10个新表位的vb10.neob16-x(vb4003)和包含3个新表位的vb10.neob16-iii(vb4004)注射时，在b16黑色素瘤模型中针对新表位的免疫应答的比较。下图：当分别用包含10个新表位的vb10.neoct26-x(vb4001)和包含3个新表位的vb10.neoct26-iii(vb4002)注射时，在ct26结肠癌模型中针对新表位的免疫应答的比较。
vb10.neoct26-x＝vb4001＝ct26pepm1-m10，
vb10.neoct26-iii＝vb4002＝ct26pepm1-m3，
vb10.neob16-x＝vb4003＝b16pepm1-m10，
vb10.neob16-iii＝vb4004＝b16pepm1-m3。
图5.包含10个新表位的疫苗体dna疫苗诱导比相应的10个肽加上佐剂的混合物强得多的免疫应答。上图：通过夹心elisa所检测，在用相应的疫苗体dna构建体转染的hek293细胞的上清液中具有不同顺序的10个新表位的vb10.neob16-x的两个变体(vb4003和vb4014)的疫苗体表达水平的比较。在vb4003中，每隔一个新表位是疏水性或亲水性的，而在vb4014中，疏水性新表位位于新表位抗原模块的中心处。抗原模块中的新表位的疏水核心可改善在同一构建体中的功能性疫苗体蛋白的表达和分泌。下图：直方图示出了由dna疫苗vb10.neob16-xvb4003和vb4014以及10个肽加上佐剂的混合物(与在vb10.neob16-x构建体中所编码相同的10个新表位)诱导的免疫应答。新表位抗原模块内的新表位的顺序不改变单独的新表位的免疫原性的等级结构。
vb10.neob16-x＝vb4003＝b16pepm1-m10，
vb10.neob16-x＝vb4014＝b16疏水核心
(pepm9+pepm5+pepm1+pepm4+pepm6+pepm8+pepm10+pepm3+pepm7+pepm2)。
图6.与其中10个新表位被5个aa接头间隔的vb10.neob16-xdna疫苗(vb4003)相比，其中10新表位被10个氨基酸(aa)接头间隔的vb10.neob16-xdna疫苗(vb4011)诱导更强的总免疫应答。上图：通过夹心elisa所检测，在用相应的疫苗体dna构建体转染的hek293细胞的上清液中vb4003和vb4011的疫苗体表达水平的比较。针对vb4003和vb4011，观察到功能性疫苗体蛋白的相似表达和分泌。下图：直方图示出了在用vb4003或vb4011注射的小鼠中针对来自b16黑色素瘤模型的新表位的ifn-γ免疫应答。包含用10个氨基酸接头间隔的10个新表位的疫苗体dna疫苗的单次注射产生强的总免疫应答。纳入空载体作为阴性对照。
vb10.neob16-x＝vb4003＝b16pepm1-m10,5aa接头
vb10.neob16-x＝vb4011＝b16pepm1-m10,10aa接头
图7.与包含1x10个新表位的疫苗体dna疫苗(vb4003)相比，包含2x10个新表位的疫苗体dna疫苗(vb4018)诱导针对单独的新表位的更广泛的免疫应答。上图：通过夹心elisa所检测，在用相应的疫苗体dna构建体转染的hek293细胞的上清液中vb10.neob16-x(vb4003)和vb10.neob16-xx(vb4018)的疫苗体表达水平的比较。下图：直方图示出了在用vb4003或vb4018注射的小鼠中针对来自b16黑色素瘤模型的新表位的ifn-γ免疫应答。包括各新表位的2个拷贝的益处在总免疫应答上是有限的，然而，观察到针对单独的新表位的更广泛的免疫应答。纳入空载体作为阴性对照。
vb10.neob16-x＝vb4003＝b16pepm1-m10,5aa接头
vb10.neob16-xx＝vb4018＝b16pepm1-m4+m11+m6-m10x2,5aa接头
图8.在疫苗体构建体中每个新表位的几个拷贝产生针对5个所选最佳新表位的更统一的免疫应答。上图：通过夹心elisa所检测，在用相应的疫苗体dna构建体转染的hek293细胞的上清液中vb10.neob16-x(vb4003和vb4011)、vb10.neob16-xx(vb4018)、vb10.neob16-vx2(vb4019)及vb10.neob16-vx4的疫苗体表达水平的比较。下图：直方图示出了在用5种不同的疫苗体dna疫苗注射的小鼠中针对来自b16黑色素瘤模型的5个新表位(pepm3、pepm4、pepm7、pepm9和pepm10)的ifn-γ免疫应答，这5种疫苗全都包含这5个新表位，但呈不同的前后关系。纳入空载体作为阴性对照。该图示出了在疫苗体构建体vb4019(vx2)和vb4021(vx4)下观察到的各新表位的几个拷贝与其中5个所选新表位呈现一次的decatopevb4003相比介导针对5个共有新表位的更均匀的免疫应答。然而，拥有10个不同的新表位(即，在此测定中测试的5个新表位的仅单个拷贝)的构建体(因此重要的是，具有增加长度的接头(10个氨基酸，vb4011))诱导针对5个共有新表位的最强总免疫应答。
vb10.neob16-x＝vb4003＝b16pepm1-m10,5aa接头
vb10.neob16-x＝vb4011＝b16pepm1-m10,10aa接头
vb10.neob16-xx＝vb4018＝b16pepm1-m4+m11+m6-m10x2,5aa接头
vb10.neob16-vx2＝vb4019＝b16pepm3+m4+m7+m9+m10x2,5aa接头
vb10.neob16-vx4＝vb4021＝b16pepm3+m4+m7+m9+m10x4,5aa接头
图9示出了包含20个新表位的疫苗体vb4018以与包含10个新表位的疫苗体vb4017相同的水平表达。通过夹心elisa，在用不同疫苗体dna构建体转染的hek293细胞的上清液中检测到疫苗体蛋白。
vb10.neob16-x＝vb4017＝b16pepm1-m4+m11+m6-m10,5aa接头
vb10.neob16-xx＝vb4018＝b16pepm1-m4+m11+m6-m10x2,5aa接头
图10.比较了包含3-新表位的不同疫苗体构建体的表达水平。通过夹心elisa，在用不同疫苗体dna构建体转染的hek293细胞的上清液中检测到疫苗体蛋白。上图：与5aa接头(vb4004)相比，当3个新表位被10aa接头(vb4012)间隔开时，观察到功能性疫苗体蛋白的改善的表达和分泌。下图：该图示出了改变新表位的顺序可影响疫苗体的表达。
vb10.neob16-iii＝vb4004＝b16pepm1-m3,5aa接头
vb10.neob16-iii＝vb4012＝b16pepm1-m3,10aa接头
vb10.neob16-iii＝vb4015＝b16pepm1+m8+m3,5aa接头
vb10.neob16-iii＝vb4016＝b16pepm1+m3+m2,5aa接头
图11示出了在用包含10个新表位(vb4011)、15个新表位(vb4024)或20个新表位(vb4025)的疫苗体dna疫苗单次注射之后诱导的b16黑色素瘤小鼠中的免疫应答。上图：包含10、15或20个新表位的测试疫苗体构建体的表达水平。通过夹心elisa，在用不同疫苗体dna构建体转染的hek293细胞的上清液中检测到疫苗体蛋白。下图：与包含10个新表位的vb10.neob16-x(vb4011)相比，在用包含15个新表位的dna疫苗候选物vb10.neob16-xv(vb4024)或包含20个新表位的vb10.neob16-xx(vb4025)注射的小鼠中针对新表位的总免疫应答。该图示出了每106个脾细胞的ifnγ-斑点的总数。作为阴性对照，将小鼠用不包含新表位的空载体注射。该图示出了与仅包含10个新表位的疫苗体dna疫苗相比，包含20个新表位的疫苗体dna疫苗诱导更强且更广泛的总免疫应答。
图12示出了在用包含10个新表位(vb4009)、15个新表位(vb4026)或20个新表位(vb4027)的疫苗体dna疫苗单次注射之后诱导的ct26结肠癌小鼠中的免疫应答。上图：包含10个新表位的测试疫苗体构建体vb10.neoct26-x(左图)与分别包含15和20个新表位的疫苗体构建体vb10.neoct26-xv和xx(右图)的表达水平。下图：与包含10个新表位的vb10.neoct26-x(vb4009)相比，在用包含15个新表位的dna疫苗候选物vb10.neoct26-xv(vb4026)或包含20个新表位的vb10.neoct26-xx(vb4027)注射的小鼠中在ct26结肠癌模型中针对新表位的总免疫应答。该图示出了每106个脾细胞的ifnγ-斑点的总数。作为阴性对照，将小鼠用不包含新表位的空载体注射。该图示出了与仅包含10个新表位的疫苗体dna疫苗相比，包含20或15个新表位的疫苗体dna疫苗诱导更强且更广泛的总免疫应答。
neoct26-x＝vb4009＝ct26pepm1-m10,10aa接头
neoct26-xv＝vb4026＝ct26pepm1-m15,10aa接头
neoct26-xx＝vb4027＝ct26pepm1-m20,10aa接头
图13示出了与仅接受pbs的阴性对照小鼠相比，用包含10个新表位的vb10.neo疫苗候选物免疫两次的小鼠能够在a)b16黑色素瘤模型和b)ct26结肠癌模型中显著地延迟并减少肿瘤生长。该图示出了随时间的肿瘤体积发展。在ct26结肠癌实验中，小鼠被分成能够使肿瘤生长稳定的反应者和无反应者。
定义
肿瘤在本上下文中既表示实体肿瘤又表示见于中体液如血液中的肿瘤细胞。
肿瘤新抗原用于表示与宿主外显子组相比包含一个或多个突变的任何肿瘤特异性抗原并且与术语癌症新抗原同义使用。
肿瘤新表位用于表示肿瘤抗原中的任何免疫原性突变并且与术语癌症新表位同义使用。
肿瘤新表位序列用于描述在抗原亚单元中包含新表位的序列，并且与术语癌症新表位序列同义使用。
治疗性抗癌疫苗描述了以下实情：该疫苗是用于减少或破坏患者中已存在的肿瘤细胞。
发明详述
癌症通过一个或几个由于突变而开始异常不受控的细胞增殖的细胞由患者的正常组织发展而来。虽然癌细胞是突变的，但大多数基因组是完整的且与患者中的其余细胞相同。这也解释了先前在开发抗癌疫苗的尝试中的一些失败，即，该疫苗在某种程度上也针对患者中的正常细胞。如上所论述，如本发明所定义的攻击肿瘤的方法是使用以下认识：任何肿瘤由于突变而表达突变蛋白质，即所谓的新抗原，该新抗原与患者正常细胞中的任何蛋白质不相同，且因此所述新抗原是治疗性抗癌疫苗的有效靶标。肿瘤中所见的突变通常是高度个人的，且因此，对根据本发明的疫苗进行个性化以便仅用于具有所讨论的突变的患者中。
根据本发明的疫苗使用正常适应性免疫系统以提供针对肿瘤细胞的免疫力。适应性免疫系统是特异性的，因为每个外源抗原通过在称为抗原呈递的过程中识别特异性“非自身”抗原而引发特异性地针对所述外源抗原的免疫应答。适应性免疫系统的细胞是淋巴细胞，特别是b细胞和t细胞。b细胞参与了体液免疫应答，而t细胞参与了细胞介导的免疫应答。
具体来说，根据本发明的疫苗被设计来通过t细胞的活化引发针对新抗原的细胞介导的免疫应答。当t细胞已被加工并与如下文所论述的mhc分子一起复合呈递时，其识别新表位。
主要组织相容性复合体(mhc)
根据本发明的新表位被设计以存在于mhc-新表位复合体中。存在两种主要类别的主要组织相容性复合体(mhc)分子，即mhci和mhcii。
mhci见于体内所有有核细胞的细胞表面上。mhci的一个功能是将细胞内部的非自身蛋白质的肽展示给细胞毒性t细胞。将mhci复合体-肽复合体插入呈递肽到细胞毒性t细胞上的细胞的质膜中，由此触发细胞毒性t细胞针对特定的mhc-肽复合体的活化。肽位于mhci分子的沟中，从而容许肽长度为约8-10个氨基酸。
mhcii分子是通常仅见于抗原呈递细胞如树突细胞、单核吞噬细胞、一些内皮细胞、胸腺上皮细胞和b细胞上的分子家族。
与mhci相反，由ii类肽呈递的抗原来源于胞外蛋白。胞外蛋白被内吞，在溶酶体中消化，且所生成的抗原肽被加载到mhcii类分子上，然后呈递在细胞表面处。mhcii类分子的抗原结合沟在两端打开并且能够呈递更长的肽，通常长度介于15与24个氨基酸残基之间。
mhci类分子是由t细胞上的cd8和共受体识别，所述t细胞通常称为cd8+细胞，而mhcii类分子是由t细胞上的cd4和共受体识别，所述t细胞通常称为cd4+细胞。
疫苗
本发明的新抗原疫苗包含编码包含以下三个单元的多肽的多核苷酸，即靶向单元、二聚单元和抗原单元。归因于二聚单元，多肽形成称为疫苗体的二聚蛋白。
编码三个单元的基因被遗传工程化以作为一个基因表达。当在体内表达时，多肽/二聚蛋白靶向抗原呈递细胞(apc)，其产生了比相同的非靶向抗原增强的疫苗效力。
本发明涉及其中抗原单元包含抗原亚单元的疫苗，其中每个亚单元包含癌症新表位序列或至少一部分癌症新表位序列。新表位序列是通过为肿瘤dna或rna测序并鉴别代表新抗原的肿瘤特异性突变而获得。因此，获得特异性地靶向所鉴别的肿瘤抗原的个性化新抗原疫苗。
本发明的一方面涉及一种治疗性抗癌新表位疫苗，其包含免疫有效量的
包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码以下
○靶向单元
○二聚单元
○第一接头
○抗原单元，其中所述抗原单元包含n-1个抗原亚单元，每个亚单元包含癌症新表位序列的至少一部分和第二接头且所述抗原单元还包含最终癌症新表位序列，其中n为3至50的整数。
或
由如1)所定义的多核苷酸编码的多肽，或
由两个多肽组成的二聚蛋白，所述多肽是由如1)中所定义的多核苷酸编码。
因此，疫苗包含n个新表位或新表位序列和n-1个第二接头，其中n为3至50的整数。
抗原单元
根据本发明的抗原单元包含多个肿瘤新表位，其中每个新表位对应于肿瘤新抗原中所鉴别的突变。突变可为在至少一个氨基酸中引起变化的任何突变。因此，突变可为以下中的一个：
-引起氨基酸中的变化的非同义突变
-造成移码及由此突变后方向上的完全不同的开放阅读框的突变
-连读突变，其中终止密码子被修饰或缺失，产生具有肿瘤特异性新表位的更长蛋白
-产生独特的肿瘤特异性蛋白序列的剪接突变
-生成在两个蛋白的接合处具有肿瘤特异性新表位的嵌合蛋白的染色体重排
在抗原单元中，除了最后一个的肿瘤新表位在抗原亚单元中排列，其中每个亚单元是由肿瘤新表位序列和第二接头组成，而最后一个亚单元仅包含新表位，即没有这种第二接头。由于肿瘤新表位序列被所述第二接头分隔，每个新表位以对免疫系统最佳的方式存在，由此如下文所论述确保疫苗的效率。
癌症新表位序列优选具有适于由以上论述的mhc分子呈递的长度。因此，在一个优选实施方案中，癌症新表位为7至30个氨基酸长。更优选的是具有7至10个氨基酸长度的癌症新表位序列或具有13至30个氨基酸长度的癌症新表位序列。
为了避免肿瘤通过终止突变基因的表达来逃避免疫系统(如果疫苗是针对所述基因的表达产物的话)，最好将多个不同的新表位纳入到抗原单元中。通常，肿瘤必须终止的基因越多，肿瘤能够终止其全部并仍能增殖或甚至存活的可能性越小。此外，肿瘤之所以异质是因为不是每个新抗原都是由所有肿瘤细胞表达。因此，根据本发明，方法是将尽可能多的新表位纳入到疫苗中以有效地攻击肿瘤。并且，为了确保所有新表位都有效地加载到相同抗原呈递细胞上，它们被作为一条氨基酸链而非离散肽来排列。然而，如上所述，疫苗的目标是针对新表位激活t细胞，并且在太多新表位被纳入疫苗中的情况下，t细胞可被稀释，且因此，提供在抗原单元中具有最佳的新表位数目的疫苗是一种平衡。
如下文更详细地论述，分析肿瘤外显子组以鉴别新抗原且随后选择大多数抗原新表位。本发明者已发现，应选择至少3个新表位以掺入到疫苗中，如至少5个新表位、如至少7个新表位、如至少10个新表位，以便能够有效地“打击”大致上所有肿瘤细胞。
另外，本发明者已发现，将疫苗构建体中新表位的数目从3个新表位增至10个新表位，使得免疫应答产生惊人的增强(参见图4)。另外，已发现，将疫苗构建体中新表位的数目从10个新表位增至15或20个新表位，使得免疫应答产生进一步增强(参见图11和12)。
因此，在一个优选实施方案中，根据本发明的疫苗包含至少10个新表位。在另一优选实施方案中，根据本发明的疫苗包含至少15个新表位，如至少20个新表位。
在一个实施方案中，3至50个新表位被纳入疫苗中以便获得最有效的免疫应答，而不会稀释t细胞，如3至30个新表位、如3至20个新表位、如3至15个新表位、如3至10个新表位，且因此，n优选为3至50的整数，如3至30、如5至25、如3至20、如3至15、如3至10。
在另一实施方案中，5至50个新表位可被纳入疫苗中以便获得最有效的免疫应答，而不会稀释t细胞，如5至30个新表位、例如5至25个新表位、如5至20个新表位、如5至15个新表位、如5至10个新表位，且因此，n优选为5至50的整数，如5至30、如5至20、如5至15、如5至10。
在又一实施方案中，10至50个新表位可被纳入疫苗中以便获得最有效的免疫应答，而不会稀释t细胞，如10至40个新表位、如10至30个新表位、如10至25个新表位、如10至20个新表位、如10至15个新表位，且因此，n优选为10至50的整数，如10至30、如10至20、如10至15个新表位。
本发明者已显示包含10个新表位的疫苗体dna疫苗诱导比仅包含3个新表位的疫苗体dna疫苗更强且更广泛的总免疫应答(参见图4和实施例2)。此外，使新表位数目增至超过20个可产生有效性较低的疫苗，这归因于t细胞的稀释。更进一步，纳入超过20个新表位可与技术难点有关。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，疫苗包含10至20个新表位。
在又一实施方案中，15至50个新表位被纳入疫苗中以便获得最有效的免疫应答，而不会稀释t细胞，如15至30个新表位或如15至20个新表位，且因此，n优选为15至50的整数，如15至30或如15至20个新表位。
在一个实施方案中，抗原单元包含每个癌症新表位的一个拷贝，以便当10个新表位被纳入疫苗中时，可引发针对10个不同新表位的细胞介导的免疫应答。
然而，如果仅鉴别了几个相关抗原突变，那么抗原单元可包含至少一个新表位的至少两个拷贝以便增强针对这些新表位的免疫应答。而且出于制造和法规原因，保持质粒且即抗原单元的长度恒定可为有利的，且因此可有利地在抗原单元中包括相同新表位的一个以上拷贝。
如上所论述，保持抗原单元长度恒定可为有利的，且因此，在一个实施方案中，优选的是所有癌症新表位序列具有相同长度。然而，如果新表位中的一个或多个是由引起移码的突变或终止密码子突变产生，那么新表位可具有相当长的长度，如由蛋白质的至少突变部分、突变蛋白的最具抗原性部分或也许整个突变蛋白组成，由此新表位中至少一个的长度大致上长于由非同义点突变产生的新表位。
抗原单元的长度主要由抗原单元中排列的新表位的长度和新表位的数目确定，且为约21至1500，优选约30个氨基酸至约1000个氨基酸、更优选约50至约500个氨基酸、如约100至约400个氨基酸、约100至约300个氨基酸。
特别当新表位较短，如几个氨基酸长时，癌症新表位序列包含在两侧由氨基酸序列侧接的新表位。优选地，新表位大致上位于癌症新表位序列的中间，以便确保新表位在加工之后由抗原呈递细胞呈递。侧接在新表位上的氨基酸序列优选为侧接在新抗原中的新表位上的氨基酸序列，从而癌症新表位序列是癌症新抗原氨基酸序列的真正子序列。
虽然有可能获得针对肿瘤的相关免疫应答，如果新表位随机地在抗原亚单元中排列的话，但优选的是遵循用于为抗原单元中的新表位排序以便增强免疫应答的以下方法中的至少一种。
在一个实施方案中，根据所选新表位，抗原亚单元是以较大抗原性至较小抗原性的顺序从第一接头向最后一个新表位排列。
在另一实施方案中，特别是如果新表位之中的亲水性/疏水性极大地变化，那么优选的是，最具疏水性的抗原亚单元大致上位于抗原单元的中间且最具亲水性的抗原亚单元位于抗原单元的起始和/或末端处。或者，新表位可在亲水性与疏水性新表位之间交替排列。
此外，富gc的新表位应被间隔开以避免gc簇，优选地，富gc的新表位被至少一个亚单元间隔开。
第二接头被设计成非免疫原性的且优选还是柔性接头，从而，尽管有较高数量的抗原亚单元存在于抗原单元中，但肿瘤新表位是以对t细胞最佳的方式存在。优选地，第二接头的长度为4至20个氨基酸以保证柔性。在另一优选实施方案中，第二接头的长度为8至20个氨基酸、如8至15个氨基酸、例如8至12个氨基酸或例如10至15个氨基酸。在一个具体的实施方案中，第二接头的长度为10个氨基酸。
在一个特定实施方案中，本发明的疫苗包含10个新表位，其中第二接头的长度为8至20个氨基酸，如8至15个氨基酸，例如8至12个氨基酸或如10至15个氨基酸。在一个具体的实施方案中，本发明的疫苗包含10个新表位，且其中第二接头的长度为10个氨基酸。
第二接头优选地在所有抗原亚单元中是相同的。然而，如果新表位中的一个或多个包含类似于接头的氨基酸基序，那么用不同序列的第二接头取代相邻第二接头可为有利的。而且，如果新表位-第二接头接合点经预测构成表位本身，那么可能使用不同序列的第二接头。
第二接头优选地为丝氨酸-甘氨酸接头，如柔性ggggs接头，如gggss、gggsg、ggggs或其多个变体，如ggggsggggs或(ggggs)m、(gggss)m、(gggsg)m，其中m为1至5、1至4或1至3的整数。在一个优选实施方案中，m为2。
在一个优选实施方案中，丝氨酸-甘氨酸接头还包含至少一个亮氨酸(l)，如至少2个或至少3个亮氨酸。丝氨酸-甘氨酸接头可例如包含1、2、3或4个亮氨酸。优选地，丝氨酸-甘氨酸接头包含1个亮氨酸或2个亮氨酸。
在一个实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：lgggs、glggs、gglgs、gggls或ggggl。在另一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：lggsg、glgsg、gglsg、ggglg或gggsl。在又一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：lggss、glgss、gglss、gggls或gggsl。
在又一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：lglgs、glgls、gllgs、lggls或glggl。在另一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：lglsg、gllsg、gglsl、ggllg或glgsl。在又一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：lglss、glgls、gglls、glgsl或glgsl。
在本发明的另一实施方案中，第二丝氨酸-甘氨酸接头具有10个氨基酸的长度且包含1个亮氨酸或2个亮氨酸。
在一个实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：lgggsggggs、glggsggggs、gglgsggggs、ggglsggggs或gggglggggs。在另一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：lggsggggsg、glgsggggsg、gglsggggsg、ggglggggsg或gggslgggsg。在又一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：lggssgggss、glgssgggss、gglssgggss、ggglsgggss或gggslgggss。
在又一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：lgggslgggs、glggsglggs、gglgsgglgs、ggglsgggls或gggglggggl。在另一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：lggsglggsg、glgsgglgsg、gglsggglsg、ggglgggglg或gggslgggsl。在又一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：lggsslggss、glgssglgss、gglssgglss、ggglsgggls或gggslgggsl。
在一个优选实施方案中，根据本发明的疫苗包含至少10个新表位，这些新表位被10个氨基酸接头分隔。在另一优选实施方案中，根据本发明的疫苗包含至少15个被10个氨基酸接头分隔的新表位，如至少20个被10个氨基酸接头分隔的新表位。
在另一优选实施方案中，疫苗包含10至20个或10至25个被第二接头分隔的新表位。优选地，所述第二接头为10个氨基酸。第二接头也可具有如上文所定义的任何长度，例如8至12个氨基酸。
替代接头可选自由以下组成的组：gsat接头和seg接头、或其多个变体。
靶向单元
由于靶向单元，本发明的多肽/二聚蛋白导致树突细胞(dc)、嗜中性白细胞及其它免疫细胞的吸引。因此，包含靶向模块的多肽/二聚蛋白不仅能使抗原靶向特定的细胞，而且还能通过将特定的免疫细胞募集至疫苗施用位点来促进应答增强效应(佐剂效应)。此独特的机制在临床环境中非常重要，在此患者可在无任何另外的佐剂下接受疫苗，这是因为疫苗本身给予了佐剂效果。
如本文所用的术语“靶向单元”是指将多肽/蛋白质与其抗原一起递送至抗原呈递细胞以便于向cd4+t细胞的mhcii类限制性呈递或用于提供通过mhci类限制向cd8+t细胞的交叉呈递。
靶向单元通过二聚单元连接至抗原单元，其中后者位于多肽/二聚蛋白的cooh-末端或nh2-末端。优选的是，抗原单元处于多肽/二聚蛋白的cooh-末端。
靶向单元被设计来使本发明的多肽/二聚蛋白靶向相关抗原呈递细胞上表达的表面分子，如专门在树突细胞(dc)的子集上表达的分子。
apc上的这种靶表面分子的实例为人白细胞抗原(hla)、分化簇14(cd14)、分化簇40(cd40)、趋化因子受体和toll样受体(tlr)。hla是人类中的主要组织相容性复合体(mhc)。toll样受体可例如包括tlr-2、tlr-4和/或tlr-5。
本发明的多肽/二聚蛋白可借助于包含以下各物的靶向单元而靶向所述表面分子：例如对cd14、cd40或toll样受体有特异性的抗体结合区；配体，例如可溶性cd40配体；天然配体样趋化因子，例如rantes或mip-1a；或细菌抗原，像例如鞭毛蛋白。
在一个实施方案中，靶向单元对mhcii类蛋白有亲和力。因此，在一个实施方案中，编码靶向单元的核苷酸序列编码对选自由以下组成的组的mhcii类蛋白有特异性的抗体可变结构域(vl和vh)：抗-hla-dp、抗-hla-dr和抗-hla-ii。
在另一实施方案中，靶向单元对选自由以下组成的组的表面分子有亲和力：cd40、tlr-2、tlr-4和tlr-5。因此，在一个实施方案中，编码靶向单元的核苷酸序列编码针对抗-cd40、抗-tlr-2、抗-tlr-4和抗-tlr-5有特异性的抗体可变结构域(vl和vh)。在一个实施方案中，编码靶向单元的核苷酸序列编码鞭毛蛋白。鞭毛蛋白对tlr-5有亲和力。
优选地，靶向单元对选自ccr1、ccr3和ccr5的趋化因子受体有亲和力。更优选地，编码靶向单元的核苷酸序列编码趋化因子hmip-1α(ld78β)，所述趋化因子结合至在apc的细胞表面上表达的其关联受体、ccr1、ccr3和ccr5。
本发明的多肽/二聚蛋白与其关联受体的结合导致apc中的内化及蛋白质降解成小肽，这些小肽被加载到mhc分子上并呈递给cd4+和cd8+t细胞以诱导肿瘤特异性免疫应答。一旦刺激并借助于活化的cd4+t细胞，cd8+t细胞将靶向并杀伤表达相同新抗原的肿瘤细胞。
在本发明的一个实施方案中，靶向单元包含与seqidno:1的氨基酸序列24-93有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，靶向单元包含与seqidno:1的氨基酸序列24-93有至少85％序列同一性的氨基酸序列，如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％序列同一性。
在一个更优选的实施方案中，靶向单元是由与seqidno:1的氨基酸序列24-93有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成，如与seqidno:1的氨基酸序列24-93有至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如至少100％序列同一性。
二聚单元
如本文所用的术语“二聚单元”是指介于抗原单元与靶向单元之间的氨基酸序列。因此，二聚单元用来连接抗原单元和靶向单元，并促进两个单体多肽二聚化为二聚蛋白。此外，二聚单元还在多肽/二聚蛋白中提供柔性以容许靶向单元与抗原呈递细胞(apc)上的表面分子的最佳结合，即使它们相隔可变的距离。二聚单元可以是满足这些需要的任何单元。
因此，在一个实施方案中，二聚单元可包含绞链区和促进二聚化的任选另一种结构域，并且绞链区与该另一结构域可通过第三接头相连。
术语“绞链区”是指二聚蛋白中促进二聚化的肽序列。绞链区用作单元之间的柔性间隔物，从而容许两个靶向单元同时结合apc上的两个靶分子，即使它们是以可变的距离表达。绞链区可以是ig来源的，如来源于igg3。绞链区可通过共价键(例如二硫桥)的形成促进二聚化。因此，在一个实施方案中，绞链区具有形成一个或多个共价键的能力。该共价键可例如是二硫桥。
在一个实施方案中，促进二聚化的另一结构域是免疫球蛋白结构域，如羧基末端c结构域或大致上与c结构域或其变体相同的序列。优选地，促进二聚化的另一结构域是来源于igg的羧基末端c结构域。
免疫球蛋白结构域通过非共价相互作用(例如疏水性相互作用)促进二聚化。例如，免疫球蛋白结构域具有经由非共价相互作用形成二聚体的能力。优选地，非共价相互作用是疏水性相互作用。
优选的是，二聚单元不包含ch2结构域。
在一个优选实施方案中，二聚单元是由通过第三接头连接至人igg3的ch3结构域上的铰链外显子h1和h4组成。
在本发明的一个实施方案中，二聚单元包含与seqidno:3的氨基酸序列94-237有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，二聚单元包含与seqidno:3的氨基酸序列94-237有至少85％序列同一性的氨基酸序列，如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％序列同一性。
在一个更优选的实施方案中，二聚单元是由与seqidno:3的氨基酸序列94-237有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成，如与seqidno:3的氨基酸序列94-237有至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如至少100％序列同一性。
在一个实施方案中，第三接头是g3s2g3sg接头。
应理解的是，二聚单元相对于抗原单元和靶向单元可具有任何取向。在一个实施方案中，抗原单元处于二聚单元的cooh末端，而靶向单元处于二聚单元的n末端。在另一实施方案中，抗原单元处于二聚单元的n末端，而靶向单元处于二聚单元的cooh末端。优选的是，抗原单元处于二聚单元的cooh末端。
第一接头
抗原单元与二聚单元优选地通过第一接头相连。第一接头可包含限制性位点以促进多核苷酸的构建。优选的是，第一接头是glggl接头或glsgl接头。
信号肽
在一个优选实施方案中，多核苷酸还包含编码信号肽的核苷酸序列。信号肽被构建以便容许在用所述多核苷酸转染的细胞中分泌由本发明的多核苷酸编码的多肽。
可使用任何合适的信号肽。合适的肽的实例为igvh信号肽，如seqidno:31；人tpa信号肽，如seqidno:32；及包含与seqidno:1的氨基酸序列1-23有至少80％序列同一性的氨基酸序列的信号肽。
在一个优选实施方案中，信号肽包含与seqidno:1的氨基酸序列1-23具有以下序列同一性的氨基酸序列：至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％。
在一个更优选的实施方案中，信号肽是由与seqidno:1的氨基酸序列1-23具有以下序列同一性的氨基酸序列组成：至少80％，优选至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％。
序列同一性
序列同一性可如下测定：高水平的序列同一性表明第一序列可能来源于第二序列。氨基酸序列同一性需要两个比对序列之间的相同氨基酸序列。因此，与参照序列享有70％氨基酸同一性的候选序列需要：在比对之后，候选序列中的70％氨基酸与参照序列中相应的氨基酸相同。同一性可借助于计算机分析来测定，如但不限于clustalw计算机比对程序(higginsd.,thompsonj.,gibsont.,thompsonj.d.,higginsd.g.,gibsont.j.,1994.clustalw:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.nucleicacidsres.22:4673-4680)及其中建议的默认参数。使用在其默认设置下的此程序，将查询多肽的成熟(生物活性)部分与参照多肽进行比对。对完全保守的残基的数目计数并除以参照多肽的长度。这样做时，形成查询序列的一部分的任何标签或融合蛋白序列在序列同一性的比对和后续测定中被忽略。
clustalw算法可类似地用于比对核苷酸序列。序列同一性可以与针对氨基酸序列所示类似的方式来计算。
用于比较序列的数学算法的另一个优选的非限制性实例是myers和miller,cabios(1989)的算法。将这种算法结合到align程序(2.0版)中，align程序是fasta序列比对软件包(pearsonwr,methodsmolbiol,2000,132:185-219)的一部分。比对是基于全局比对来计算序列同一性。align0并未罚分至序列末端处的缺口。当利用alignogalign0程序来比较氨基酸序列时，优选使用具有–12/-2的缺口打开/延伸罚分的blosum50取代矩阵。
多核苷酸
本发明还涉及一种如上所述的多核苷酸。所述多核苷酸可包含dna核苷酸序列或rna核苷酸序列，如基因组dna、cdna和rna序列，呈双链或单链。
优选的是，多核苷酸被优化为表达本发明的多肽的种类，即，多核苷酸序列优选为人密码子优化的。
多肽和二聚蛋白
本发明还涉及一种由如上所定义的多核苷酸序列编码的多肽。多肽可在体外表达以便产生本发明的疫苗，或多肽可由于如上所定义的多核苷酸的施用而在体内表达。
由于二聚单元的存在，当表达多肽时形成二聚蛋白。二聚蛋白可为同二聚体，即，其中两条多肽链是相同的且因此包含相同的新表位，或二聚蛋白可为异二聚体，其包含两个在抗原单元中编码的不同单体多肽。后者可以是相关的，如果新表位的量超过抗原单元的尺寸上限的话。然而，优选的是，二聚蛋白为同二聚蛋白。
载体
此外，本发明涉及一种包含如上所定义的核苷酸序列的载体。优选的是，载体允许如上所述的各种单元的轻易互换，特别是抗原单元。具体来说，表达载体可以是pumvc4a载体或ntc9385r载体主链。抗原单元可与由sfii限制酶盒限制的抗原单元盒互换，其中5'位点被掺入glggl/glsgl接头中且3'位点被纳入载体中的终止密码子之后。
宿主细胞
本发明还涉及一种宿主细胞，其包含如上所定义的核苷酸序列或包含如上所定义的载体以用于表达本发明的多肽。
合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、昆虫或高级真核细胞。
用于制备疫苗的方法
根据本发明的疫苗在新抗原在患者肿瘤中被鉴别的意义上优选是个性化疫苗，且因此，疫苗完全是针对患者肿瘤中的特异性突变蛋白。
因此，一方面，本发明涉及一种通过在体外产生多肽来制备包含免疫有效量的如上所定义的二聚蛋白或多肽的疫苗的方法。多肽和蛋白质的体外合成可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行，如通过多肽在多种表达系统的任一种中的肽合成或表达，然后纯化。因此，在一个实施方案中，所述方法包括
a)将如上所定义的多核苷酸转染到细胞群中；
b)培养所述细胞群；
c)收集并纯化由所述细胞群表达的二聚蛋白或多肽，以及
d)将在步骤c)获得的二聚蛋白或多肽与药学上可接受的载体混合，由此获得所述疫苗。
在一个优选实施方案中，将在步骤c)获得的二聚蛋白或多肽溶于所述药学上可接受的载体中。
此外，可添加佐剂或缓冲剂到疫苗中。
纯化可根据任何合适的方法进行，如色谱法、离心或差异溶解度。
另一方面，本发明涉及一种用于制备包含免疫有效量的如上所定义的多核苷酸的疫苗的方法。在一个实施方案中，所述方法包括
a.制备如上所定义的多核苷酸；
b.将在步骤a)获得的多核苷酸与药学上可接受的载体混合，由此获得所述疫苗。
多核苷酸可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来制备。例如，多核苷酸可使用寡核苷酸合成器，通过化学合成来制备。
具体来说，较小的核苷酸序列(例如像编码靶向单元、二聚单元和/或抗原单元的亚单元的核苷酸序列)可单独合成，然后连接以在载体主链中产生最终的多核苷酸。
对于个性化疫苗的设计，上述方法是在鉴别有待纳入多核苷酸中的新表位的方法之前。
此方法优选地包括以下步骤：
-为肿瘤的基因组或外显子组测序
-鉴别包含来自所述肿瘤的新表位的肿瘤新抗原，
-基于预测的抗原性选择新表位。
肿瘤或肿瘤部分可通过任何合适的方法，如通过获得肿瘤的活组织检查或通过切除肿瘤，或来自任何合适的体液，如血液样品或尿液样品。
肿瘤基因组或外显子组的测序
基因组或外显子组(即基因组的编码部分)可使用任何合适的方法(如全外显子组测序)来测序。具体来说，测序仪可为illuminahiseq2500)，使用配对末端2x100-125或pe100-125(读取长度)，多重的。
鉴别肿瘤抗原
一旦鉴别了肿瘤特异性突变，下一步便是选择包含新表位的预测的抗原肽。
肿瘤突变是通过以下步骤发现：为肿瘤和正常组织测序并对所获得的序列进行比较。多种方法可用于检测特定的突变或等位基因在个体的dna或rna中的存在。举例来说，可应用以下技术，包括动态等位基因特异性杂交(dash)、微板阵列斜凝胶电泳(madge)、焦磷酸测序、寡核苷酸特异性连接、taqman系统以及各种dna“芯片”技术，如affymetrixsnp芯片。
或者，可进行通过直接蛋白质测序来鉴别突变的方法。
从肿瘤外显子组中的有可能成百或上千的突变中，基于预示性hla结合算法在电脑中选择新表位。意图是鉴别所有相关的新表位并且在排名或评分之后，确定新表位被纳入疫苗中用于所讨论的特定患者。
可使用任何合适的算法，如以下之一：
可获得的免费的肽-mhc结合的软件分析(iedb和netmhc)可从以下网站下载：
http://www.iedb.org/
http://www.cbs.dtu.dk/services/netmhc/
预测最佳肽以用于疫苗设计的可商购获得的高级软件可在这里找到：
http://www.oncoimmunity.com/
https://omictools.com/t-cell-epitopes-category
https://github.com/griffithlab/pvac-seq
http://crdd.osdd.net/raghava/cancertope/help.php
http://www.epivax.com/tag/neoantigen/
关于其抗原性对每个突变评分，并且在多核苷酸中选出并最佳地设计最具抗原性的新表位。如上所论述，根据本发明，3至50个新表位是优选的。
疫苗
随后产生包含以下之一的最终疫苗：
-如上所定义的多核苷酸
-由如上所定义的多核苷酸编码的多肽
-包含多肽链的二聚蛋白
疫苗还可包含药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或缓冲剂。
药学上可接受的载体、稀释剂和缓冲剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、无菌等渗含水缓冲剂及其组合。
特别是对于包含多肽/蛋白质的疫苗来说，药学上可接受的佐剂包括但不限于聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、咪喹莫特、imufactev1p321、ispatch、iss、iscomatrix、juvlmmune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a、montanideims1312、montanideisa206、montanideisa50v、montanideisa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、peptel.rtm、载体系统、plga微粒、瑞喹莫德、srl172、病毒颗粒及其它病毒样颗粒、yf-17d、vegf捕获剂、r848、β-葡聚糖、pam3cys、aquila的qs21刺激子、vadimezan和/或asa404(dmxaa)。
特别是对于包含多核苷酸的疫苗来说，载体可包括容易转染细胞的分子并且佐剂可包括包含编码趋化因子或细胞因子的核苷酸序列的质粒以便增强免疫应答。
疫苗被配制成任何合适的制剂，如液体制剂，以用于皮内或肌内注射。
施用
疫苗可以对于多肽/蛋白质疫苗或多核苷酸疫苗来说任何合适的方式施用，如通过真皮内、肌内、皮下注射来施用，或通过粘膜或上皮施用，如鼻内、经口、肠内或施用于膀胱。
具体来说，当疫苗为多核苷酸疫苗时，疫苗优选地肌内或真皮内施用。
在一个特定的实施方案中，疫苗是通过结内注射施用。如本文所用，术语“结内注射”意指疫苗被注射到淋巴结中。
治疗
多核苷酸、多肽和二聚蛋白优选地用于治疗癌症，并且在如上所论述的疫苗中配制。通过本文所述的方法，有可能治疗患有癌症的患者，这是通过检查存在于患者肿瘤中的任何突变，产生疫苗，然后用完全针对存在于他或她的肿瘤中的新抗原的疫苗免疫患者来实现。由于现在有用于测序、表位测定并产生核苷酸序列的快速和可靠的方法，患者在肿瘤切除后12周内接受疫苗是有可能的。
癌症可为其中癌细胞包含突变的任何癌症。癌症可为原发肿瘤、转移或这两者。检查突变的肿瘤可为原发肿瘤或转移。有待治疗的癌症尤其是已知具有高突变负荷的癌症，如黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌或结肠癌。
在一个优选实施方案中，用包含如上所述的多核苷酸的疫苗进行治疗，例如，其中多核苷酸为dna或rna。
优选的是肌内注射多核苷酸疫苗，如于大肌肉中，例如肩部、臀部或大腿。已发现多肽是局部产生的并且相关免疫细胞使大致上在产生位点处的多肽/蛋白质内化，且大致上没有多肽或蛋白质到达血流。
可使用注射多核苷酸的任何合适的方法，如通过利用喷射注射器或借助于电穿孔。
给药方案
疫苗可作为单剂量施用，或可重复施用。当重复施用疫苗时，优选的是以至少3周的时间间隔来施用，以避免t细胞的耗尽。
因此，在一个实施方案中，给药方案将为在第0、3、6周接种，然后每4周接种一次，只要患者具有临床益处。可施用疫苗持续至少一年。
疫苗是以免疫有效量施用。“免疫有效量”意指建立减小肿瘤的效果所需的疫苗的量。最终，内科医师确定该剂量对于dna疫苗来说通常在0.3-6mg的范围内，且对于多肽/蛋白质疫苗来说在5μg-5mg的范围内。
组合治疗
根据本发明的疫苗治疗可与任何其它抗癌治疗如放射疗法、化疗和外科治疗组合。
根据本发明的疫苗治疗也可与检查点阻断抑制剂治疗组合。
具体实施方案
1.一种治疗性抗癌新表位疫苗，其包含免疫有效量的
包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码以下
○靶向单元
○二聚单元
○第一接头
○抗原单元，其中所述抗原单元包含n-1个抗原亚单元，每个亚单元包含癌症新表位序列的至少一部分和第二接头且所述抗原单元还包含最终癌症新表位序列，其中n为3至50的整数。
或
由如1)所定义的多核苷酸编码的多肽，或
由两个多肽组成的二聚蛋白，所述多肽是由如1)中所定义的多核苷酸编码。
2.根据实施方案1的疫苗，其中所述抗原单元包含每个癌症新表位的一个拷贝。
3.根据实施方案1的疫苗，其中所述抗原单元包含至少一个新表位的至少两个拷贝。
4.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述癌症新表位序列具有7至30个氨基酸的长度。
5.根据实施方案4的疫苗，其中所述癌症新表位序列具有7至10个氨基酸的长度。
6.根据实施方案4的疫苗，其中所述癌症新表位序列具有13至30个氨基酸的长度。
7.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中每个癌症新表位序列具有相同长度。
8.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述癌症新表位基本上位于所述癌症新表位序列的中间。
9.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述癌症新表位序列是癌症新抗原的子序列。
10.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述抗原亚单元从所述第一接头开始呈较大抗原性至较小抗原性的次序。
11.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中最具疏水性的抗原亚单元大致上在所述抗原单元的中间且最具亲水性的抗原亚单元在所述抗原单元的末端处。
12.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述第二接头是柔性接头。
13.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述第二接头是非免疫原性的。
14.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述第二接头在所有抗原亚单元中是相同的。
15.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述第二接头是丝氨酸-甘氨酸接头。
16.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述第二接头的长度是4至20个氨基酸。
17.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述第二接头的长度是10个氨基酸。
18.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述抗原单元的长度为约100个氨基酸至约1000个氨基酸。
19.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中n是介于3与30之间的整数。
20.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述二聚单元包含绞链区和促进二聚化的任选另一种结构域，所述绞链区与所述另一种结构域任选通过第三接头相连。
21.根据实施方案20的疫苗，其中所述绞链区是ig来源的。
22.根据实施方案20-21中任一项的疫苗，其中所述绞链区具有形成一个或多个共价键的能力。
23.根据实施方案22的疫苗，其中所述共价键是二硫桥。
24.根据实施方案20-23中任一项的疫苗，其中促进二聚化的另一种结构域是免疫球蛋白结构域，优选是羧基末端c结构域或大致上与所述c结构域或其变体相同的序列。
25.根据实施方案24的疫苗，其中所述羧基末端c结构域来源于igg。
26.根据实施方案24-25中任一项的疫苗，其中所述二聚单元的免疫球蛋白结构域具有二聚化的能力。
27.根据实施方案24-26中任一项的疫苗，其中所述免疫球蛋白结构域具有经由非共价相互作用二聚化的能力。
28.根据实施方案27的疫苗，其中所述非共价相互作用是疏水性相互作用。
29.根据实施方案20-28中任一项的疫苗，其中所述二聚单元不包含ch2结构域。
30.根据实施方案20-29中任一项的疫苗，其中所述二聚单元是由通过所述第三接头连接至人igg3的ch3结构域上的铰链外显子h1和h4组成。
31.根据实施方案20-30中任一项的疫苗，其中所述二聚单元包含与seqidno:3的氨基酸序列94-237有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
32.根据实施方案30-31中任一项的疫苗，其中所述第三接头是g3s2g3sg接头。
33.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述抗原单元与所述二聚单元通过所述第一接头相连。
34.根据实施方案33的疫苗，其中所述第一接头包含限制性位点。
35.根据实施方案33或34的疫苗，其中所述第一接头是glggl接头或glsgl接头。
36.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述靶向单元对选自ccr1、ccr3和ccr5的趋化因子受体有亲和力。
37.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述靶向单元包含与seqidno:1的氨基酸序列24-93有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
38.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述靶向单元由与seqidno:1的氨基酸序列24-93有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
39.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述核苷酸序列还编码信号肽。
40.根据实施方案39的疫苗，其中所述信号肽包含与seqidno:1的氨基酸序列1-23有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
41.根据实施方案39或40的疫苗，其中所述信号肽由与seqidno:1的氨基酸序列1-23有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
42.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中在所述肽中的所述靶向单元、二聚单元和抗原单元是呈靶向单元、二聚单元和抗原单元的n末端至c末端顺序。
43.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述多核苷酸序列是人类密码子优化的。
44.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其中所述多核苷酸序列是dna核苷酸序列或rna核苷酸序列。
45.根据前述实施方案中任一项的疫苗，其还包含药学上可接受的载体和/或佐剂。
46.一种多核苷酸，其是如实施方案1-45中任一项所述。
47.一种载体，其包含如实施方案1-45中任一项所述的核苷酸序列。
48.一种宿主细胞，其包含如实施方案1-45中任一项所述的核苷酸序列或包含如实施方案47所述的载体。
49.根据实施方案46的多核苷酸，其经配制施用于患者以诱导二聚蛋白在所述患者中的产生。
50.一种多肽，其是由如实施方案1-45中任一项所述的核苷酸序列编码。
51.一种二聚蛋白，其是由如实施方案50所述的两个多肽组成。
52.根据实施方案51的二聚蛋白，其为同二聚蛋白。
53.如实施方案50所述的多肽，如实施方案51-52所述的二聚蛋白或如实施方案46所述的多核苷酸，它们是用作药剂。
54.一种用于制备疫苗的方法，所述疫苗包含免疫有效量的如实施方案50所述的二聚蛋白或如实施方案50所述的多肽，所述方法包括
e)将如实施方案46所述的多核苷酸转染到细胞群中；
f)培养所述细胞群；
g)收集并纯化由所述细胞群表达的二聚蛋白或多肽
h)将在步骤c)获得的二聚蛋白或多肽与药学上可接受的载体混合，由此获得所述疫苗。
55.一种用于制备包含免疫有效量的根据实施方案46的多核苷酸的疫苗的方法，所述方法包括
a.制备根据实施方案46的多核苷酸；
b.将在步骤a)获得的多核苷酸与药学上可接受的载体混合，由此获得所述疫苗。
56.根据实施方案55的方法，其包括以下步骤：
-为肿瘤的外显子组测序
-鉴别包含来自所述肿瘤的新表位的肿瘤新抗原，
-基于抗原性选择新表位，
之后进行制备所述多核苷酸的步骤。
57.一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用如实施方案1-45中任一项所述的疫苗。
58.根据实施方案57的方法，其中所述疫苗包含多核苷酸并且是真皮内或肌内施用的。
59.根据实施方案58的方法，其中所述多核苷酸是dna。
60.根据实施方案59的方法，其中所述多核苷酸是rna。
61.根据实施方案57至60的方法，其中施用是用喷射注射器进行。
62.根据实施方案57至60的方法，其中施用是借助于电穿孔进行。
实施例
实施例1：疫苗的构建和表达
根据以下结构设计基因序列：
先前描述的小鼠黑色素瘤癌细胞系b16-f10和小鼠结肠癌细胞系ct26的外显子组测序和rna测序揭示了成百至上千的肿瘤特异性非同义突变(castle等人2012,castle等人2014及kreiter等人2015)。将基于电脑中的方法用于鉴别潜在的免疫原性新表位。用编码突变表位的肽使小鼠免疫，且观察其免疫原性作为特异性t细胞免疫应答(elispot测定)。此外，用选自elispot的最具免疫原性的表位接种小鼠赋予了强抗肿瘤活性(castle等人2012和kreiter等人2015)。
每个新表位都是包含由柔性ggggs接头分隔的27个氨基酸的肽。对短肽(<20个氨基酸)进行加工并可将新型表位呈递于mhci类分子上并激活cd8+t细胞。然而，优选的是疫苗激活cd8+和cd4+t细胞且因此编码长肽(>20个氨基酸)的新表位被选出。由此可允许有效的肽加工及呈递于mhci类和ii类上(kreiter等人2015)。在前两个vb10.neo-x构建体中，所选的疏水性和亲水性新表位是均匀分布的。27聚体新表位之间的中性柔性ggggs接头对于避免在合并的新表位的接合点中生成新免疫原性表位来说是重要的。
见于b16-f10和ct26细胞系中的新表位的序列示于表1和2中。
表1-ct26细胞系
表2-b16-f10细胞系
实施例2：比较包含3或10个新表位的疫苗体
比较含有3或10个新表位的疫苗体疫苗。在10新表位疫苗体dna构建体中，前3个(n末端)肽的位置和顺序与3新表位疫苗体dna构建体中的相似。这样做是为了能够比较在含有3个表位的情形中和多含有7个表位的情形中这3个新表位的免疫原性。
vb4001(vb10.neoct26-x)、vb4002(vb10.neoct26-iii)、vb4003(vb10.neob16-x)和vb4004(vb10.neob16-iii)被选为疫苗候选物。疫苗体的示意图示于图1中。
用于疫苗vb4001-vb4021的新表位如下所示。例如，vb4015包含三个新表位，b16pepm1+pepm8+pepm3，它们是由5个氨基酸接头分隔开。vb4018包含以下10个新表位的2个拷贝，b16pepm1+pepm2+pepm3+pepm4+pepm11+pepm6+pepm7+pepm8+pepm9+pepm10，它们是由5个氨基酸接头分隔开。新表位序列示于表1和2中。
vb4001＝vb10.neoct26-x＝ct26pepm1-m10,5aa接头
vb4002＝vb10.neoct26-iii＝ct26pepm1-m3,5aa接头
vb4003＝vb10.neob16-x＝b16pepm1-m10,5aa接头
vb4004＝vb10.neob16-iii＝b16pepm1-m3,5aa接头
vb4011＝vb10.neob16-x＝b16pepm1-m10,10aa接头
vb4012＝vb10.neob16-iii＝b16pepm1-m3,10aa接头
vb4014＝vb10.neob16-x＝b16疏水核心，
(pepm9+pepm5+pepm1+pepm4+pepm6+pepm8+pepm10+pepm3+pepm7+pepm2),5aa接头
vb4015＝vb10.neob16-iii＝b16pepm1+m8+m3,5aa接头
vb4016＝vb10.neob16-iii＝b16pepm1+m3+m2,5aa接头
vb4017＝vb10.neob16-x＝b16pepm1-m4+m11+m6-m10,5aa接头
vb4018＝vb10.neob16-xx＝b16pepm1-m4+m11+m6-m10x2,5aa接头
vb4019＝vb10.neob16-vx2＝b16pepm3+m4+m7+m9+m10x2,5aa接头
vb4021＝vb10.neob16-vx4＝b16pepm3+m4+m7+m9-m10x4,5aa接头
所有新表位基因序列都是从genscript(newjersey,us)定购并克隆到拥有ld78β靶向单元和higg3二聚单元的表达载体pumvc4a中。
将所有构建体转染到hek293细胞中并且通过蛋白质印迹和/或夹心elisa验证上清液中的疫苗体蛋白。包括空的pumvc4a载体作为阴性对照。图2的左图：为了说明完整的同二聚蛋白的形成，在还原剂的存在或不存在下，通过抗hmip-1α抗体在蛋白质印迹中检测来自转染细胞的上清液中的蛋白质。同二聚体的形成示于左泳道(-还原剂)中，而单体示于右泳道(+还原剂)中。图2的右图示出了在用不同vb10.neo构建体转染的hek293细胞的上清液中疫苗体蛋白的表达水平，使用针对hmip-1α和higg3的抗体，通过夹心elisa来检测。右上图示出了分别包含10或3个新表位的vb10.neoct26-x(vb4001)和vb10.neoct26-iii(vb4002)构建体的表达水平。右下图示出了分别包含10或3个新表位的vb10.neob16-x(vb4003)和vb10.neob16-iii(vb4004)构建体的表达水平。为了比较包含3或10个新表位的疫苗体的免疫原性，将每种疫苗体候选物的20μg质粒dna肌内注射于c57bi/6-小鼠(对于b16构建体)或balb/c-小鼠(对于ct26构建体)的胫骨前肌中，然后使用trigrid,ichor,(us)进行电穿孔。在第13天，对小鼠施以安乐死并采集脾脏。
通过ifn-γelispot评价t细胞应答。结果示于图3中，其中t细胞应答表示为ifn-γ斑点的数目/106个脾细胞。我们观察到，包含10个新表位的疫苗体在同一小鼠中诱导针对10个所包括的新表位中4-6个的显著的t细胞应答。刺激最强ifn-γ应答的肽通常具有最佳的mhci结合评分。
由包含3或10个新表位的疫苗体构建体诱导的总新抗原特异性免疫应答示于图4中。当与包含3个新表位的疫苗体(vb10.neob16-iii和vb10.neoct26-iii)相比时，包含10个新表位的疫苗体(vb10.neob16-x和vb10.neoct26-x)产生增强的总新抗原特异性免疫应答。
实施例3：比较疫苗体dna疫苗与相应的肽加上佐剂疫苗的免疫原性
在vb10.neo构建体用于小鼠接种研究中之前，如先前在图2的文中所详细描述，使用夹心elisa测定验证hek293细胞中的疫苗体蛋白表达和分泌。新表位的顺序可对功能性疫苗体的表达和分泌有影响。在图5的上图中，观察到vb10.neob16-x构建体vb4014与vb10.neob16-x构建体vb4003相比具有功能性疫苗体蛋白的稍微改善的表达和分泌。vb4014中的10个新表位与vb4003相比是相似的，然而，新表位的顺序是改变的并且最具疏水性的新表位位于新表位抗原模块的核心中。为了测试疫苗体dna疫苗vb4003和vb4014与仅包含新表位的肽(与聚(i:c)佐剂组合递送)相比的免疫原性，将c57/b16小鼠用20μg的vb10.neob16-x构建体vb4003和vb4014注射(将所诱导的免疫应答与用20μg或200μg肽混合物+50μg聚i:c(包含由vb4003和vb4014编码的10个新表位)s.c.注射的小鼠的免疫应答相比。通过ifn-γelispot评价t细胞应答。图5的下图中所示的结果显示疫苗体明显诱导比肽+佐剂强得多的应答。此外，用vb10.neob16-xvb4014构建体免疫的一些动物响应于疫苗中所包括的所有10个新表位。
实施例4：比较包含具有5或10个氨基酸长度的第二接头的疫苗体
这些新表位各自是由第二接头分隔开。在本实施例中，第二接头是柔性ggggs接头。为了测试第二接头的长度是否对表达水平有任何影响，将hek293细胞用包含具有5或10个氨基酸长度的第二接头的vb10.neob16-x构建体转染。图6显示将接头长度从5个(vb4003)改变至10个(vb4011)氨基酸不会影响包含10个新表位的疫苗体的表达(图6，上图)。为了测试第二接头的长度是否对免疫应答有任何影响，将c57bl/6小鼠用包含10个具有5(vb4003)或10(vb4011)个氨基酸接头的新表位的vb10.neob16-x构建体注射。在第13天，将小鼠处死并采集脾细胞，用单独的相应新表位肽刺激24小时，并且在ifn-γelispot测定中量化t细胞应答。结果示于图6的下图中，并且显示包含10个氨基酸接头(vb4011)的疫苗体构建体与包含5个氨基酸接头(vb4003)的疫苗体相比产生增强的总免疫应答。包括空载体作为阴性对照。
实施例5：比较包含相同新表位的不同拷贝数的疫苗体
测试以下构建体：
vb4003＝vb10.neob16-x＝b16pepm1-m10,5aa接头
vb4018＝vb10.neob16-xx＝b16pepm1-m4+m11+m6-m10x2,5aa接头
将包含10个新表位的vb10.neob16-x(vb4003)构建体的表达水平与包含2x10个新表位的vb10.neob16-xx(vb4018)的表达水平相比。结果显示，包含20个新表位的vb10.neob16-xx(vb4018)与包含10个新表位的vb10.neob16-x(vb4003)相比稍微较少表达(图7，上图)。
通过用疫苗体dna疫苗vb10.neob16-x(vb4003)和vb10.neob16-xx(vb4018)肌内注射c57bl/6小鼠来测试包含10或20个新表位的疫苗体的免疫原性。在第13天，将小鼠处死并采集脾细胞，用单独的相应新表位肽刺激24小时，并且在ifn-γelispot测定中量化t细胞应答。图7下图中的结果显示，包括每个新表位(2x10个新表位)的2个拷贝的益处在总免疫应答上是有限的，然后，观察到针对单独新表位的更广泛的免疫应答。
然后，测试包含5个所选新表位pepm3、pepm4、pepm7、pepm9和pepm10的一个或多个拷贝的疫苗体构建体的表达水平(图8，上图)。
用以下疫苗体构建体注射c57bl/6小鼠：
vb4003＝vb10.neob16-x＝b16pepm1-m10,5aa接头
vb4011＝vb10.neob16-x＝b16pepm1-m10,10aa接头
vb4018＝vb10.neob16-xx＝b16pepm1-m4+m11+m6-m10x2,5aa接头
vb4019＝vb10.neob16-vx2＝b16pepm3+m4+m7+m9+m10x2,5aa接头
vb4021＝vb10.neob16-vx4＝b16pepm3+m4+m7+m9+m10x4,5aa接头
对于五个所选新表位各自的疫苗体候选物的免疫应答示于图8的下图中。五个新表位的多个拷贝对总免疫应答有有限的影响。然而，每个新表位(vb4018、vb4019和vb4021)的几个拷贝与其中5个新表位呈现一次的decatopevb4003相比给出针对5个共有新表位的更均匀的免疫应答。有趣的是，包含10个氨基酸的第二接头和仅一个新表位(vb4011)的疫苗体展现比包含五个新表位的多个拷贝的疫苗体更佳的总免疫应答。
实施例6：比较包含不同新表位数目的疫苗体
将包含不同数量新表位的疫苗体构建体的免疫应答相比较以测试添加其它新表位的免疫效应。
使用以下构建体测试b16黑色素瘤小鼠模型中的总免疫应答：
neob16-x＝vb4011＝b16pepm1-m10,10aa接头
neob16-xv＝vb4024＝b16pepm1-m15,10aa接头
neob16-xx＝vb4025＝b16pepm1-m20,10aa接头
新表位序列示于表2中。
三个测试疫苗体构建体的表达水平示于图11的上图中。
与包含10个新表位的vb10.neob16-x(vb4011)相比，用包含15个新表位的dna疫苗候选物vb10.neob16-xv(vb4024)或包含20个新表位的vb10.neob16-xx(vb4025)注射c57bl/6小鼠。图11的下图示出了每106个脾细胞的ifnγ-斑点的总数。具有15和20个新表位的构建体当与仅具有10个新表位的构建体相比时产生针对更多单独新表位的更广泛的免疫应答及更高的总t细胞应答。作为阴性对照，将小鼠用不包含新表位的空载体注射。如从图11的下图中可见，用空载体的注射针对单独的新表位不产生任何显著的免疫应答。
更进一步，使用以下构建体测试ct26黑色素瘤小鼠模型中的总免疫应答：
neoct26-x＝vb4009＝ct26pepm1-m10,10aa接头
neoct26-xv＝vb4026＝ct26pepm1-m15,10aa接头
neoct26-xx＝vb4027＝ct26pepm1-m20,10aa接头
新表位序列示于表1中。
与包含10个新表位的vb10.neoct26-x(vb4009)相比，用包含15个新表位的dna疫苗候选物vb10.neoct26-xv(vb4026)或包含20个新表位的vb10.neoct26-xx(vb4027)注射balb/c小鼠。图12的下图示出了每106个脾细胞的ifnγ-斑点的总数。具有15和20个新表位的构建体当与仅具有10个新表位的构建体相比时产生针对更多单独新表位的更广泛的免疫应答及更高的总t细胞应答。作为阴性对照，将小鼠用不包含新表位的空载体注射。如从图12的下图中可见，用空载体的注射针对单独的新表位不产生任何显著的免疫应答。
实施例7：比较不同疫苗体构建体的表达水平
测试以下构建体：
vb4004＝vb10.neob16-iii＝b16pepm1-m3,5aa接头
vb4012＝vb10.neob16-iii＝b16pepm1-m3,10aa接头
vb4015＝vb10.neob16-iii＝b16pepm1+m8+m3,5aa接头
vb4016＝vb10.neob16-iii＝b16pepm1+m3+m2,5aa接头
vb4017＝vb10.neob16-x＝b16pepm1-m4+m11+m6-m10,5aa接头
vb4018＝vb10.neob16-xx＝b16pepm1-m4+m11+m6-m10x2,5aa接头
对于vb10.neob16-x(vb4017)和vb10.neob16-xx(vb4018)观察到功能性疫苗体蛋白的相似表达和分泌(图9)。
与在vb10.neob16-iii(vb4004)构建体中的5aa接头相比，当在vb10.neob16-iii(vb4012)构建体中的3个新表位被10aa接头间隔时观察到功能性疫苗体蛋白的改善的表达和分泌(图10，上图)。此外，通过改变如经由比较vb4004、vb4015和vb4016(图10，下图)所示的三个新表位的顺序，可影响疫苗体的表达水平。
实施例8：治疗效果
vb10.neo被用作治疗性疫苗研究的疫苗候选物。
将7.5x104个b16.f10细胞或1x105个ct26细胞(atcc)注射于c57bi/6小鼠或balb/c小鼠的大腿区域中。在第1天和第8天之后，将小鼠用20μg质粒dna接种，然后电穿孔,trigrid,ichor,us.。每周测量肿瘤尺寸两至三次。图13显示包含10个新表位的vb10.neodna疫苗候选物能够显著地延迟和减少肿瘤生长。
实施例9：治疗性dna疫苗
通过根据管理机构的指南进行质粒疫苗的gmp制造并填充和完成dna疫苗来制备有待使用的治疗性dna疫苗。dna疫苗可通过以2-6mg/ml的浓度溶于盐水溶液如pbs中来配制。疫苗可被皮内或肌内施用，在或不在电穿孔之后，或替代地用喷射注射器。
序列
seqidno:1
包括信号肽和成熟肽(ld78-β)的c-c基序趋化因子3-样1前体，aa24-93：
mqvstaalavllctmalcnqvlsaplaadtptaccfsytsrqipqnfiadyfetssqcskpsvifltkrgrqvcadpseewvqkyvsdlelsa
seqidno:2
所有vb10.neo构建体的恒定编码部分的dna序列
仅仅为了说明，由具有按以下顺序的结构域的“i”分隔构建体的不同结构域：信号肽|人μιρ-ια|铰链hi|铰链h4igly-ser接头或gly-leu接头|hch3igg3|gly-ser接头或gly-leu接头|
所述构建体是可用于插入新表位的标准构建体。可在接头ggcctcggtggcctg之后添加新表位序列。
seqidno:3
所有vb10.neo蛋白:b4001的恒定编码部分的氨基酸序列
seqidno:4
b16-f10突变表位，b16-pepm1，氨基酸序列
pskpsfqefvdwenvspelnstdqpfl
seqidno:5
b16-f10突变表位，b16-pepm2，氨基酸序列
regvelcpgnkyemrrhgtthslvihd
seqidno:6
b16-f10突变表位，b16-pepm3，氨基酸序列
shchwndlavipagvvhnwdfeprkvs
seqidno:7
b16-f10突变表位，b16-pepm4，氨基酸序列
grghllgrlaaivgkqvllgrkvvvvr
seqidno:8
b16-f10突变表位，b16-pepm5，氨基酸序列
frrkaflhwytgeamdemefteaesnm
seqidno:9
b16-f10突变表位，b16-pepm6，氨基酸序列
vvdrnpqfldpvlaylmkglcekplas
seqidno:10
b16-f10突变表位，b16-pepm7，氨基酸序列
sspdevalvegvqslgftylrlkdnym
seqidno:11
b16-f10突变表位，b16-pepm8，氨基酸序列
efkhikafdrtfannpgpmvvfatpgm
seqidno:12
b16-f10突变表位，b16-pepm9，氨基酸序列
stanyntshlnndvwqifenpvdwkek
seqidno:13
b16-f10突变表位，b16-pepm10，氨基酸序列
dsgspfpaavilrdalhmarglkylhq
seqidno:14
ct26突变表位，ct26-pepm1，氨基酸序列
vilpqapsgpsyatylqpaqaqmltpp
seqidno:15
ct26突变表位，ct26-pepm2，氨基酸序列
lhsgqnhlkemaisvlearacaaagqs
seqidno:16
ct26突变表位，ct26-pepm3，氨基酸序列
pllpfyppdealeiglelnssalppte
seqidno:17
ct26突变表位，ct26-pepm4，氨基酸序列
agtqceywasraldsehsigsmiqlpq
seqidno:18
ct26突变表位，ct26-pepm5，氨基酸序列
aaykghhypgpgnyfwkclfmsglsev
seqidno:19
ct26突变表位，ct26-pepm6，氨基酸序列
dtlsamsnpramqvllqiqqglqtlat
seqidno:20
ct26突变表位，ct26-pepm7，氨基酸序列
dkplrrnnsytsyimaicgmpldsfra
seqidno:21
ct26突变表位，ct26-pepm8，氨基酸序列
eviqtskyymrdviaiesawllelaph
seqidno:22
ct26突变表位，ct26-pepm9，氨基酸序列
gyisrvtagkdsyialvdknimgyias
seqidno:23
ct26突变表位，ct26-pepm10，氨基酸序列
ehihragglfvadaiqvgfgrigkhfw
seqidno:24
第一接头，氨基酸序列:glsgl
seqidno:25
第一接头，氨基酸序列:glggl
seqidno:26
铰链区(igg3uh铰链)，12个氨基酸：elktplgdttht
seqidno:27
铰链区(igg3，mh铰链，15个氨基酸)：epkscdtpppcprcp
seqidno:28
gly-ser接头：gggssgggsg
seqidno:29
hch3igg3，氨基酸序列：
seqidno:30
vb4001的氨基酸序列＝vb10.neoct26-x＝ct26pepm1-m10,5aa接头
新表位序列被插入gggssgggsg之后。
seqidno:31
vb4002vb10.neoct26-iii的氨基酸序列＝ct26pepm1-m3,5aa接头
seqidno:32
vb4003的氨基酸序列＝vb10.neob16-x＝b16pepm1-m10,5aa接头(vb10.neo-10b)
seqidno:33
vb4004的氨基酸序列＝vb10.neob16-iii＝b16pepm1-m3,5aa接头
seqidno:34
信号肽
mnfglrliflvltlkgvqc
seqidno:35
信号肽
mdamkrglccvlllcgavfvsp
seqidno:36
b16-f10突变表位，b16-pepm11，氨基酸序列
anfesgkhkyrqtamftatmppaverl
seqidno:37
vb4011的氨基酸序列＝vb10.neob16-x＝b16pepm1-m10,10aa接头
seqidno:38
vb4012的氨基酸序列＝vb10.neob16-iii＝b16pepm1-m3,10aa接头
seqidno:39
vb4014的氨基酸序列＝vb10.neob16-x＝b16疏水核心，(pepm9+m5+m1+m4+m6+m8+m10+m3+m7+m2),5aa接头
seqidno:40
vb4015的氨基酸序列＝vb10.neob16-iii＝b16pepm1-m8-m3,5aa接头
seqidno:41
vb4016的氨基酸序列＝vb10.neob16-iii＝b16pepm1-m3-m2,5aa接头
seqidno:42
vb4017的氨基酸序列＝vb10.neob16-x＝b16pepm1-m4+m11+m6-m10,5aa接头
seqidno:43
vb4018的氨基酸序列＝vb10.neob16-xx＝b16pepm1-m4+m11+m6-m10x2,5aa接头
seqidno:44
vb4019的氨基酸序列＝vb10.neob16-vx2＝b16pepm3-m4-m7-m9-m10x2,5aa接头
seqidno:45
vb4021的氨基酸序列＝vb10.neob16-vx4＝b16pepm3-m4-m7-m9-m10x4,5aa接头
seqidno:46
vb4024的氨基酸序列＝vb10.neob16-xv＝b16pepm1-m15,10aa接头
seqidno:47
vb4025的氨基酸序列＝vb10.neob16-xx＝b16pepm1-m20,10aa接头
seqidno:48
vb4026的氨基酸序列＝vb10.neoct26-xv＝ct26pepm1-m15,10aa接头
seqidno:49
vb4027的氨基酸序列＝vb10.neoct26-xx＝ct26pepm1-m20,10aa接头
seqidno:50
ct26突变表位，ct26-pepm11，氨基酸序列
qaivrgcsmpgpwrsgrllvsrrwsve
seqidno:51
ct26突变表位，ct26-pepm12，氨基酸序列
dgqlellaqgaldnalssmgalhalrp
seqidno:52
ct26突变表位，ct26-pepm13，氨基酸序列
shdsrkstsfmsvnpskeikivsavrr
seqidno:53
ct26突变表位，ct26-pepm14，氨基酸序列
htpssyietlpkaikrrinalkqlqvr
seqidno:54
ct26突变表位，ct26-pepm15，氨基酸序列
mkafifkysaktgftklidasrvsete
seqidno:55
ct26突变表位，ct26-pepm16，氨基酸序列
egdpclrssdcidefccarhfwtkick
seqidno:56
ct26突变表位，ct26-pepm17，氨基酸序列
wkggpvkidplalmqaierylvvrgyg
seqidno:57
ct26突变表位，ct26-pepm18，氨基酸序列
vtsipsvsnalnwkefsfiqstlgyva
seqidno:58
ct26突变表位，ct26-pepm19，氨基酸序列
yrganlhleetlagfwarllerlfkql
seqidno:59
ct26突变表位，ct26-pepm20，氨基酸序列
kttlshtqdssqslqsssdsskssrcs
seqidno:60
b16-f10突变表位，b16-pepm12，氨基酸序列
nhsglvtfqafidvmsrettdtdtadq
seqidno:61
b16-f10突变表位，b16-pepm13，氨基酸序列
cgtaffinfiaiyhhasraipfgtmva
seqidno:62
b16-f10突变表位，b16-pepm14，氨基酸序列
fvvkaylpvnesfaftadlrsntggqa
seqidno:63
b16-f10突变表位，b16-pepm15，氨基酸序列
tpppeeampfefngpaqgdhsqpplqv
seqidno:64
b16-f10突变表位，b16-pepm16，氨基酸序列
pkpdfsqlqrnilpsnprvtrfhinwd
seqidno:65
b16-f10突变表位，b16-pepm17，氨基酸序列
ipsgttilncfhdvlsgklsggspgvp
seqidno:66
b16-f10突变表位，b16-pepm18，氨基酸序列
gfsqplrrlvlhvvsaaqaerlaraee
seqidno:67
b16-f10突变表位，b16-pepm19，氨基酸序列
ecritsnfvipseywveekeekqkliq
seqidno:68
b16-f10突变表位，b16-pepm20，氨基酸序列
niegidkltqlkkpflvnnkinkieni
seqidno:69.接头：gggss
seqidno:70.接头：gggsg
seqidno:71.接头：ggggs
seqidno:72.接头：lgggs
seqidno:73.接头：glggs
seqidno:74.接头：gglgs
seqidno:75.接头：gggls
seqidno:76.接头：ggggl
seqidno:77.接头：lggsg
seqidno:78.接头：glgsg
seqidno:79.接头：gglsg
seqidno:80.接头：ggglg
seqidno:81.接头：gggsl
seqidno:82.接头：lggss
seqidno:83.接头：glgss
seqidno:84.接头：gglss
seqidno:85.接头：gggls
seqidno:86.接头：gggsl
seqidno:87.接头：lglgs
seqidno:88.接头：glgls
seqidno:89.接头：gllgs
seqidno:90.接头：lggls
seqidno:91.接头：glggl
seqidno:92.接头：lglsg
seqidno:93.接头：gllsg
seqidno:94.接头：gglsl
seqidno:95.接头：ggllg
seqidno:96.接头：glgsl
seqidno:97.接头：lglss
seqidno:98.接头：glgls
seqidno:99.接头：gglls
seqidno:100.接头：glgsl
seqidno:101.接头：glgsl
seqidno:102.接头：lgggsggggs
seqidno:103.接头：glggsggggs
seqidno:104.接头：gglgsggggs
seqidno:105.接头：ggglsggggs
seqidno:106.接头：gggglggggs
seqidno:107.接头：lggsggggsg
seqidno:108.接头：glgsggggsg
seqidno:109.接头：gglsggggsg
seqidno:110.接头：ggglggggsg
seqidno:111.接头：gggslgggsg
seqidno:112.接头：gggslgggsg
seqidno:113.接头：glgssgggss
seqidno:114.接头：gglssgggss
seqidno:115.接头：ggglsgggss
seqidno:116.接头：gggslgggss
seqidno:117.接头：lgggslgggs
seqidno:118.接头：glggsglggs
seqidno:119.接头：gglgsgglgs
seqidno:120.接头：ggglsgggls
seqidno:121.接头：gggglggggl
seqidno:122.接头：lggsglggsg
seqidno:123.接头：glgsgglgsg
seqidno:124.接头：gglsggglsg
seqidno:125.接头：ggglgggglg
seqidno:126.接头：gggslgggsl
seqidno:127.接头：lggsslggss
seqidno:128.接头：glgssglgss
seqidno:129.接头：gglssgglss
seqidno:130.接头：ggglsgggls
seqidno:131.接头：gggslgggsl