本发明涉及维生素B12产生及预防和/或治疗维生素B12缺乏症、肠道微生物群、肠粘膜屏障以及药物组合物、食品组合物或饲料组合物或益生菌组合物的领域，所述组合物包含产生假维生素B12的细菌霍氏真杆菌(E.hallii)和/或产丁酸盐肠单胞球菌(I.butyriciproducens)以及任选的一种或多种产丙酸盐细菌和/或粘蛋白降解细菌，例如嗜粘蛋白-艾克曼菌(A.muciniphila)。本发明还提供霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以及包含霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌及任选的产丙酸盐细菌和/或粘蛋白降解细菌(例如嗜粘蛋白-艾克曼菌)的组合物用于以下的用途和方法：1)用于预防和/或治疗个体的维生素B12缺乏症，2)用于促进和/或增加个体肠道中假维生素B12的产生，和/或3)用于促进和/或增加个体肠道中丙酸盐的产生。
背景技术：
类咕啉是含钴分子，其在多种生物体中起酶辅助因子的作用。特定的类咕啉可通过其轴向配体的结构进行鉴定。类咕啉的下轴向配体可以是苯并咪唑、嘌呤或酚类化合物。最常见于动物和许多细菌中的B12辅助因子含有5,6-二甲基苯并咪唑(DMB)作为轴向配体。这种特殊的B12辅助因子通常被称为维生素B12。
只有原核生物才具有合成类咕啉所需的酶。真菌、植物和动物(包括人类)都不能产生诸如维生素B12的类咕啉。动物和人类依赖天然富含类咕啉(例如维生素B12)的食物(例如鸡蛋、鱼、肉及其他食物)或添加有类咕啉(例如维生素B12)的产品或维生素B12补充剂作为维生素B12的来源。另外，肠道微生物群可以向动物和人类提供诸如维生素B12的类咕啉。可以仅通过细菌发酵合成在工业上生产维生素B12。
维生素B12也称为钴胺素，是一种水溶性维生素，已知其在DNA合成、最优造血和适当大脑发育以及神经功能中发挥作用。维生素B12通常参与人体每个细胞的新陈代谢，特别是影响DNA合成和调节，还影响脂肪酸代谢和氨基酸代谢。
具有除DMB之外的轴向配体的B12辅助因子是已知的，最常见的实例是假维生素B12，其中N7连接的腺嘌呤代替DMB作为轴向配体。
已经描述了人和肠细菌中的十几种酶促反应使用维生素B12作为辅助因子。在人类中，这些反应包括由甲基丙二酰辅酶A变位酶和B12依赖性蛋氨酸合酶催化的反应，与此同时在肠细菌中存在另外一组维生素B12依赖性酶(Degnan等，2014.Cell Metab.20(5)：769-778)。并非所有的肠道细菌都会产生维生素B12。因此，一些肠道细菌依赖于产生维生素B12的肠道细菌来维持其维生素B12的供应。因此，维生素B12的可用性也对肠道细菌有影响，并有助于肠道微生物群的结构和功能。由于对于人类而言维生素B12是限制性的，因此肠道中也存在维生素B12限制。肠道中的全部微生物转化都需要维生素B12。
在这些转化中，通过维生素B12依赖性甲基丙二酰辅酶A变位酶产生丙酸盐。丙酸盐和丁酸盐是通过膳食或宿主成分发酵在肠道中产生的最重要的短链脂肪酸(SCFA)。这些SCFA在人体中具有不同的功能，其中丁酸盐主要为结肠细胞提供能量，丙酸盐主要在肝脏中代谢(Guarner和Malagelada，2003.The Lancet 361：512-519)。此外，SCFA对结肠形态和功能有影响，例如降低pH、增加细胞增殖和粪便体积以及改变微生物组成。SCFA还控制体重和胰岛素敏感性(Canfora等，2015.Nature Reviews Endocrinology 11：577-591)。此外，已经发现SCFA通过G蛋白偶联受体(GPR41和GPR43)向宿主发出信号，已证明这些G蛋白偶联受体通过小鼠中的调节性T细胞影响免疫系统(Brown等，2003.J Biol Chem 278：11312-11319；Le Poul等，2003.J Biol Chem 278：25481-25489；Smith等2013.Science 341(6145)：569-573)。最后，SCFA还通过FFAR2受体向神经元回路发信号(Erny等2015.Nat Neurosci 18(7)：965-977)。丙酸盐是肝脏糖异生的底物，并且对脂质和胆固醇合成具有抑制作用，且对炎症和癌变具有保护作用(Hosseini等，2011.Nutrition Reviews 69：245-258)。人体中的膳食干预显示，还发现丙酸盐能增加饱腹感并调节食欲，从而使超重成人维持体重(Chambers等,2015.Gut 64(11)：1744-1754)。
维生素B12的建议每日摄入量(RDA)因年龄、性别和怀孕状况而异。例如，成人维生素B12的RDA约为2.4微克/天(男性和女性相同)。然而，由于饮食中摄入的维生素B12不足或导致维生素B12水平低或不足的其他条件，维生素B12的RDA并不总能实现。通常在具有特定饮食模式的个体(例如素食者和纯素食者)中观察到维生素B12摄入不足或有限，或者是由于疾病或身体状况所致，包括恶性贫血、萎缩性胃炎、慢性胰腺炎、去除部分胃部和/或部分小肠的外科手术(包括减肥手术)、影响小肠的病症(例如克罗恩病、乳糜泻、细菌生长或寄生虫等)、大量饮酒、免疫系统疾病(例如格雷夫斯病或狼疮)、长期使用减酸药物、营养不良、饮食失调(例如贪食症或神经性厌食症等)。
导致维生素B12水平低或不足的其他疾病或身体状况包括艾滋病毒/艾滋病、针对2型糖尿病患者的二甲双胍治疗、肥胖症或高体重指数(BMI)、糖尿病前期状态或伴有糖尿病前期状态的肥胖症或胰岛素抵抗、遗传性疾病(例如运钴胺素蛋白I和/或II的遗传性缺乏)以及许多其他疾病。
由于上述饮食缺陷或疾病状况，维生素B12水平低或不足的个体可能有发生维生素B12缺乏症的风险。根据严重程度、维生素B12缺乏或限制的持续时间和生命阶段(儿童、成年、老年)，维生素B12缺乏可能导致一系列疾病，从无症状表现到严重的血液病、神经疾病和精神病表现以及尽管经治疗也可能存在的不可逆转的神经损伤风险。
患有维生素B12缺乏症的个体可能表现出一种或多种症状，例如腹泻或便秘、疲劳、缺乏活力、站立时头晕、食欲不振、皮肤苍白、注意力不集中、呼吸短促(主要是在运动时)、舌头红肿或牙龈出血、精神状态混乱或改变(例如痴呆)、抑郁、失去平衡、手脚麻木和刺痛等。
维生素B12缺乏症通常通过测量个体血液中的维生素B12水平来诊断。通常，成人维生素B12血液水平低于120-180皮摩尔/升(170-250pg/mL)表明维生素B12缺乏。血液中甲基丙二酸水平升高(值>0.4微摩尔/升)也可能表明维生素B12缺乏。
根治或减轻个体维生素B12缺乏相关病症的治疗包括摄入维生素B12补充剂或注射维生素B12和/或改变饮食(即引入富含维生素B12的食物)。维生素B12补充的局限之一是，在胃肠道吸收维生素B12的能力受损的个体中，例如在用二甲双胍或其他药物治疗导致维生素B12吸收不良或血液中的维生素B12水平低的个体中，这种治疗的疗效可能有限或不令人满意。
因此，需要用于预防、治疗或减轻和/或改善个体的维生素B12缺乏症的组合物和方法。
技术实现要素：
本发明涉及一种包含霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)和/或产丁酸盐肠单胞球菌(Intestinimonas butyriciproducens)以及生理学上可接受的载体的组合物，其用于治疗和/或预防个体的维生素B12缺乏症。
在一个实施方案中，该个体的维生素B12缺乏症源自针对2型糖尿病的二甲双胍治疗、恶性贫血、萎缩性胃炎、慢性胰腺炎、去除部分胃部和/或部分小肠的外科手术、减轻体重(减肥)手术、炎症性肠病(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎等)、乳糜泻、细菌生长、大量饮酒、格雷夫斯病、狼疮、长期使用减酸药物、营养不良、贪食症、神经性厌食症、艾滋病毒/艾滋病、肥胖症、高体重指数、糖尿病前期状态、胰岛素抵抗、或者素食饮食或纯素食饮食。
本文教导的用途的组合物可以进一步包含产丙酸盐的细菌，例如嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)。
它可以是药物组合物或补充剂组合物，例如，其以选自胶囊、片剂和粉剂的剂型存在。
该霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌，以及任选地该产丙酸盐的细菌以冻干或微胶囊形式存在。
该霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌可以以约104个至约1015个细胞的量存在。另外，所述产丙酸盐的细菌(例如嗜粘蛋白-艾克曼菌)可以以约104个至约1015个细胞的量存在。
本文教导的组合物可进一步包含粘膜结合剂。
本文教导的组合物可进一步包含钴离子，例如钴盐形式的钴离子，钴盐例如氯化钴、硫酸钴、乙酸钴或硝酸钴。
本发明还涉及一种包含霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以及生理学上可接受的载体的组合物用于增加个体肠道中假维生素B12的产生和/或用于增加个体肠道中丙酸盐的产生的用途。
该个体可能患有维生素B12缺乏症。该个体的维生素B12缺乏症可源自针对2型糖尿病的二甲双胍治疗、恶性贫血、萎缩性胃炎、慢性胰腺炎、去除部分胃部和/或部分小肠的外科手术、减肥手术、炎症性肠病(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎等)、乳糜泻、细菌生长、大量饮酒、格雷夫斯病、狼疮、长期使用减酸药物、营养不良、贪食症、神经性厌食症、艾滋病毒/艾滋病、肥胖症、高体重指数、糖尿病前期状态、胰岛素抵抗、或者素食饮食或纯素食饮食。
本发明还涉及霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌用于治疗和/或预防个体的维生素B12缺乏症的用途。个体可能患有维生素B12缺乏症。该个体的维生素B12缺乏症可源自针对2型糖尿病的二甲双胍治疗、恶性贫血、萎缩性胃炎、慢性胰腺炎、去除部分胃部和/或部分小肠的外科手术、减肥手术、炎症性肠病(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎等)、乳糜泻、细菌生长、大量饮酒、格雷夫斯病、狼疮、长期使用减酸药物、营养不良、贪食症、神经性厌食症、艾滋病毒/艾滋病、肥胖症、高体重指数、糖尿病前期状态、胰岛素抵抗、或者素食饮食或纯素食饮食。
本发明进一步提供霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌用于增加个体肠道中假维生素B12的产生和/或用于增加个体肠道中丙酸盐的产生的用途。该个体可能患有维生素B12缺乏症。该个体的维生素B12缺乏症可源自针对2型糖尿病的二甲双胍治疗、恶性贫血、萎缩性胃炎、慢性胰腺炎、去除部分胃部和/或部分小肠的外科手术、减肥手术、炎症性肠病(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎等)、乳糜泻、细菌生长、大量饮酒、格雷夫斯病、狼疮、长期服用减酸药物、营养不良、贪食症、神经性厌食症、艾滋病毒/艾滋病、肥胖症、高体重指数、糖尿病前期状态、胰岛素抵抗、或者素食饮食或纯素食饮食。
定义
本文所用的术语“互养的”或“互养共栖”是指一个物种以另一物种的产物为食的现象。在这种关系中，一方的生长或改善取决于另一方提供的营养素、生长因子或底物。这个用于营养相互依赖的术语通常用在微生物学中来描述某些细菌物种之间的这种共生关系。
本文所用的术语嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphila或A.muciniphila)是指Derrien首先鉴定的厌氧性粘蛋白降解细菌(Derrien等，International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2004，54：1469-1476)。细胞呈椭圆形，为非运动性和革兰氏染色阴性。嗜粘蛋白-艾克曼菌(A.muciniphila)也可称为艾克曼菌(Akkermansia spp)或艾克曼菌样(Akkermansia-like)细菌。它属于衣原体门(Chlamydiae)/疣微菌门(Verrucomicrobia)。如果分类法改变，技术人员应知道如何适应分类学中的变化以推断出可以在本发明中使用的菌株。此外，嗜粘蛋白-艾克曼菌的完整基因组已经被van Passel等确定(van Passel et al，PLoS One 6，2011：el6876)。通常接受的是基因组相似性为约70％的菌株可以被认为是相同的物种。
本文所用的术语“粘液溶解细菌”或“肠粘膜相关菌种”或“粘液降解细菌”是指与肠粘膜屏障相关或存在于肠粘膜屏障附近的细菌。“肠粘膜相关菌种”的特征还在于它们能够降解粘液。“肠粘膜相关菌种”的非限制性实例包括嗜粘蛋白-艾克曼菌(ATTC BAA-835)、普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii，A2-165)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus，ATCC 53103)和短双歧杆菌(Bifidobacterium breve，DSM-20213)。
本文所用的术语“类咕啉”是指一类化学相关的化合物，其含有位于称为咕啉环的平面四吡咯环中心的生物化学稀有元素钴。维生素的基本结构的生物合成仅通过细菌和古细菌(其通常产生羟钴胺素)来实现，但是可以在人体中实现不同形式的维生素之间的转化。
术语“维生素B12”或“B12同效维生素”通常是指一类化学相关的化合物，所有这些化合物都显示出生物活性。维生素B12通常被称为“钴胺素”。本文所用的术语“钴胺素”通常是指所有形式的维生素B12。具体而言，钴胺素由一组含钴的同效维生素化合物组成，包括氰钴胺素、羟钴胺素(这种形式确实存在于自然界中并由细菌羟钴胺素产生)，以及两种人体内天然存在的辅助因子形式的B12，包括5'-脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。
本文所用的术语“假维生素B12”是指Coα-[α-(7-腺嘌呤基)]-Coβ-氰基钴胺酰胺。该分子与钴胺素的不同之处在于α-配体，其中该分子具有以α-糖苷键与核糖的C-1结合的腺嘌呤而不是5,6-二甲基苯并咪唑。
如本文所用，术语“维生素B12缺乏症”，也称为“低钴胺素血症”，是指维生素B12的血液水平不足或低，例如，成人维生素B12水平低于120-180皮摩尔/升(170-250pg/mL)。维生素B12缺乏症通常源于或起因于针对2型糖尿病的二甲双胍治疗、恶性贫血、萎缩性胃炎、慢性胰腺炎、去除部分胃部和/或部分小肠的外科手术、减肥手术、克罗恩病、乳糜泻、细菌生长、大量饮酒、格雷夫斯病、狼疮、长期服用减酸药物、营养不良、贪食症、神经性厌食症、艾滋病毒/艾滋病、肥胖症、高体重指数、糖尿病前期状态、胰岛素抵抗、或者素食饮食或纯素食饮食以及其他病症。
患有维生素B12缺乏症的个体可能表现出一种或多种症状，例如腹泻或便秘、疲劳、缺乏活力、站立时头晕、食欲不振、皮肤苍白、注意力不集中、呼吸短促(主要是在运动时)、舌头红肿或牙龈出血、红细胞低、心脏功能减退、神经损伤、精神状态混乱或改变(例如痴呆)、烦躁、抑郁、精神病、失去平衡、肌肉功能差、手脚麻木和刺痛、味觉下降、生殖力减弱等。在幼儿中，症状包括生长不良、发育不良和运动困难。在没有早期治疗的情况下，一些变化可能是永久性的。
本文所用的术语“二甲双胍”是指用于治疗2型糖尿病的药物。二甲双胍的使用与用该药物治疗的2型糖尿病患者中维生素B12缺乏的发病率增加和血清维生素B12水平降低有关。认为二甲双胍影响胃肠道吸收系统，因此在用该药物治疗的个体中引起维生素B12的吸收不良。
本文所教导的术语“肠粘膜屏障”是指天然粘膜屏障，其作为选择性屏障，允许吸收营养物、电解质和水并防止暴露于有害的大分子、微生物、膳食和微生物抗原(例如食物过敏原)。肠粘膜屏障基本上由一层粘液和下层上皮细胞(本文称为“肠上皮细胞”)组成。肠上皮细胞通过所谓的“紧密连接”彼此紧密相连，该“紧密连接”基本上是两个肠上皮细胞的膜之间的“物理接合”。维持肠道粘膜屏障，特别是维持肠上皮细胞层的物理完整性(即使细胞之间的连接保持紧密)，对于保护宿主免受病原微生物、抗原和其他不希望的物质从肠道向血液流的迁移是至关重要的。
肠道粘膜屏障也被大约1012-1014个共生微生物大量定殖，这些微生物主要是厌氧细菌或微需氧细菌，其中大多数与宿主共生。这些细菌在许多方面对宿主有益。它们通过合成维生素K和维生素B复合物的一些成分，提供对致病细菌的防护，并在宿主中发挥营养作用。此外，肠粘膜屏障已经进化出复杂的“肠粘膜免疫系统”，用于区分共生细菌(即有益细菌)和致病细菌及其他有害物质。肠粘膜免疫系统是肠粘膜屏障的组成部分，并且包括淋巴组织和特化免疫细胞(即淋巴细胞和浆细胞)，其广泛分散在整个肠粘膜屏障中。天然定殖于健康个体粘膜的微生物之一是粘蛋白降解嗜粘蛋白-艾克曼菌(A.muciniphila)，已公开其可增加肠屏障功能(Everard等，PNAS 110(2013)9066-71；Reunanen等，Appl Environ Microbiol 2015年3月20日)。
本文所用的术语“益生菌”或“益生菌产品”是指微生物，例如肠细菌，当以有效量施用或摄入时，赋予宿主(例如人类或哺乳动物)健康益处。优选地，当施用到个体时益生菌应该是活的或有活力的，以使益生菌定殖于宿主的大肠。然而，在某些条件下，益生菌在施用时也可以是死的，条件是益生菌产生的物质仍然对宿主产生益生的有利作用。大多数益生菌或益生菌产品由乳酸菌例如乳酸杆菌(Lactobacilli)或双歧杆菌(Bifidobacteria)组成。技术人员熟悉益生菌领域并且知道如何选择具有益生菌活性的乳酸菌。
如本文所用的术语“益生元”或“益生元产品”通常是指促进有助于宿主的健康的GI微生物的生长和/或活性的化合物。益生元或益生元产品主要由可发酵纤维或不易消化的碳水化合物组成。通过益生菌进行的这些纤维的发酵促进了有益的最终产物(例如SCFA，特别是丁酸盐)的产生。技术人员熟悉益生元领域并且知道如何选择具有益生元活性的成分。
本文使用的术语“共生菌”或“共生产品”通常是指将益生菌和一种或多种促进GI微生物的生长和/或活性的化合物(例如益生元)组合成一种产品的组合物和/或营养补充剂。共生菌通过选择性地刺激益生菌的生长和/或通过激活益生菌的代谢来改善胃肠道中益生菌的存活和定殖，从而有益地影响宿主，因此改善宿主健康。技术人员熟悉共生菌，并且知道如何选择可以组合成共生产品的成分。
本文所用的术语“有益肠道菌种”是指栖息在(即固有的)哺乳动物(例如人类)肠内并对其所在的哺乳动物的胃肠道、代谢和其他健康状况发挥有益作用(例如抵御致病菌种、产生丁酸和/或丁酸盐及其衍生物等)的菌种。
有益肠道菌种的非限制性实例包括来自乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的乳酸菌。有益肠道菌种的其他非限制性实例包括产生丁酸盐的菌种，其利用乙酰-CoA产生丁酸和/或丁酸盐及其衍生物，例如US2014/0242654、WO2014/150094或WO2013032328A1中公开的菌株。
本文所用的术语“有效量”是指实现本文教导的效果所必需的量。例如，本文教导的有效量的肠道菌株或由其衍生的菌株，即霍氏真杆菌(E.hallii)和/或产丁酸盐肠单胞球菌、以及任选的嗜粘蛋白-艾克曼菌的量是有效治疗、预防和/或减轻个体的维生素B12缺乏症的量。本领域普通技术人员无需过度实验即可容易地确定有效量。例如，技术人员可以通过测量血液中的维生素B12的水平来确定霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以及任选的嗜粘蛋白-艾克曼菌的量是否可以有效地治疗、预防和/或减轻个体的维生素B12缺乏症，并且可以确定血液中维生素B12的水平是否已恢复到正常水平(约137-546皮摩尔/升，参见Doets等，2013.Ann Nutr Metab 62：311-322)。
本文所用的术语“生理学上可接受的载体”或“饮食上可接受的载体”，“营养上可接受的载体”或“药学上可接受的载体”是指涉及提供本发明的多肽或宿主细胞的施用形式的生理学上可接受的或饮食上可接受的载体或营养上可接受的或药学上可接受的载体材料，例如，液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。从与组合物的其他成分相容并且对个体无害的意义上说，每种载体必须是“可接受的”，即适于食用或营养上可接受。术语“适于食用”或“营养上可接受”是指通常被认为对人类(以及其他哺乳动物)食用而言安全的成分或物质。可用作生理学上可接受的载体或营养上可接受的或药学上可接受的载体的材料的非限制性实例包括：(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)辅料，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇类，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；(21)药物制剂中使用的其他无毒相容物质等。此外，本文所用的术语“营养上可接受的”和“药学上可接受的”是指那些在合理的医学判断范围内的那些组合物、或者药剂、物质或组合物的组合和/或它们的剂型，适用于与人类和动物的组织接触，没有过多的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“适于食用”或“营养上可接受的”是指通常被认为对人类(以及其他哺乳动物)食用而言安全的成分或物质。
如本文所用，术语“约”表示本领域中的正常公差，例如在平均值的2个标准偏差内。术语“约”可以理解为包含偏离指示值最多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的值。
本文所使用的术语“包括”或“包含”及其变形是指这样的情况，其中以其非限制性意义使用所述术语以表示包括该词后面的项，但不排除未明确提及的项。它还包括更限制性的动词“基本上由……组成”和“由……组成”。
使用“一个”或“一种”提及的要素并不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一个要素。因此，“一个”或“一种”通常意味着“至少一个/一种”。
术语“增加”和“增加的水平”以及术语“降低”和“降低的水平”是指能够显著增加或显著降低或者显著增加的水平或显著降低的水平。通常，水平增加或降低，即与对照或参照中的对应水平相比时，水平分别增加或降低至少5％，例如增加或降低10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％。或者，当与对照或参照中的水平相比样品中的水平在统计学上显著增加或降低时，样品中水平可增加或降低。
具体实施方式
本发明人惊奇地现，包含霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以及可接受的载体的组合物可用于在施用有效量的该组合物的个体中治疗、预防和/或减轻维生素B12缺乏症。本发明人发现霍氏真杆菌和产丁酸盐肠单胞球菌具有产生假维生素B12的能力。
不受任何理论束缚，认为霍氏真杆菌和产丁酸盐肠单胞球菌原位(即在个体的肠中)产生和分泌假维生素B12。然后，假维生素B12可以立即被宿主的肠细胞吸收，在那里它可以直接用作维生素B12依赖性酶的辅助因子，或者可以被转化为维生素B12的一种不同形式，用作维生素B12依赖性酶的辅助因子。
已经证明假维生素B12可以作为肠沙门氏菌(Salmonella enterica)中三种维生素B12依赖性酶MetH、EutBC和PduCDE的辅助因子(Anderson等，2008.J Bacteriol 190(4)：1160-1171)。已经提出假维生素B12是由肠沙门氏菌产生的天然类咕啉(Taga和Walker.2008.J Bacteriol 190(4)：1157-1159)。假维生素B12已被证明是由梭菌(Clostridium cohlearium)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、念珠藻(Nostoc commune)，水华束丝藻(Aphanizomenon flos-aquae)和水前寺蓝藻(Aphanothece sacrum)产生的主要类咕啉。此外，已经证明罗伊氏乳杆菌(也是一种大量存在的小鼠肠道细菌)产生的假维生素B12可以减轻小鼠的维生素B12缺乏症(Santos等2007.FEBS Letters 581：4865-4870；Molina等2009.J Appl Microbiol 106：467-473)。
在第一方面，本发明涉及一种包含霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以及生理学上可接受的载体的组合物，其用于治疗和/或预防个体的维生素B12缺乏症。
生理学上可接受的载体可以是任何惰性载体。例如，合适的生理学或药学上可接受的载体的非限制性实例包括任何公知的生理学或药学载体、缓冲剂、稀释剂和赋形剂。应当理解，合适的生理学载体的选择将取决于本文所教导的组合物的预期施用方式(例如，口服)和该组合物的预期形式(例如饮料、酸奶、粉末、胶囊等)。技术人员知道如何选择适于本文所教导的组合物的生理学上可接受的载体或与本文所教导的组合物相容的生理学上可接受的载体。
在一个实施方案中，该个体的维生素B12缺乏症至少部分源自或起因于针对2型糖尿病的二甲双胍治疗、恶性贫血、萎缩性胃炎、慢性胰腺炎、去除部分胃部和/或部分小肠的外科手术、减肥手术、炎症性肠病(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎等)、乳糜泻、细菌生长、大量饮酒、格雷夫斯病、狼疮、长期服用减酸药物、营养不良、贪食症、神经性厌食症、艾滋病毒/艾滋病、肥胖症、高体重指数、糖尿病前期状态、胰岛素抵抗、或者素食饮食或纯素食饮食。
在一个实施方案中，如本文所教导用途的组合物可以进一步包含产生丙酸盐和/或粘蛋白降解细菌，例如但不限于嗜粘蛋白-艾克曼菌或罗伊氏乳杆菌。发现霍氏真杆菌和嗜粘蛋白-艾克曼菌对彼此有有益作用。不希望受理论束缚，认为是嗜粘蛋白-艾克曼菌为霍氏真杆菌提供了合适的底物，而霍氏真杆菌为嗜粘蛋白-艾克曼菌提供了维生素B12来源以增加其生长并使其代谢物谱向丙酸产生方向改变。预期在霍氏真杆菌和任何其他产生丙酸盐的细菌之间，或在产丁酸盐肠单胞球菌和任何产生丙酸盐的细菌(包括嗜粘蛋白-艾克曼菌)之间可以实现相同的有益效果。产生丙酸盐的细菌和/或粘蛋白降解细菌可以同时或依次施用于霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌。
在一个实施方案中，如本文所教导用途的组合物还包含钴化合物，例如钴盐形式的钴化合物，诸如氯化钴、硫酸钴、硝酸钴、乙酸钴等。补充钴的存在可确保产生足够的咕啉环作为由霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌产生的假维生素B12的前体。或者，这些钴化合物可以与本文教导的组合物联合施用于患有维生素B12缺乏症和本文教导的相关疾病和病症的个体或具有患上维生素B12缺乏症和本文教导的相关疾病和病症的风险的个体，在这种情况下，钴化合物可以同时或依次施用于所述个体。
在一个实施方案中，如本文所教导用途的组合物可以是液体形式，例如，霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以及任选的本文教导的嗜粘蛋白-艾克曼菌的稳定的悬浮液，或固体形式，例如本文教导的冻干宿主细胞的粉末。在将霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以及任选的嗜粘蛋白-艾克曼菌(A.muciniphila)冻干的情况下，可以使用冷冻保护剂，例如乳糖、海藻糖或糖原。对于口服施用，霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以及任选的嗜粘蛋白-艾克曼菌可以以固体剂型(例如胶囊、片剂和粉剂)或液体剂型(例如酏剂、糖浆、和悬浮液)施用。霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以及任选的嗜粘蛋白-艾克曼菌可以与非活性成分和粉末载体(例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁等)一起包封在胶囊(例如明胶胶囊)中。
优选地，霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以固体、冻干或干燥形式(例如以粉末或颗粒形式)存在于本文教导的组合物中。霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌可以例如微胶囊形式存在于本文教导的组合物中。技术人员能够基于众所周知的技术冻干或微胶囊化霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌。由于霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌是专性厌氧细菌，因此在冷冻干燥或微胶囊化期间，可以应用无氧条件以保持霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌的生存力。
微胶囊化技术在本领域中是众所周知的用于保存益生菌的技术(例如，如Serna-Cock和Vallejo-Castillo所述，2013.Afr J of Microbiol Res，7(40)：4743-4753，通过引用并入本文)。例如，Serna-Cock和Vallejo-Castillo所教导的任何保存技术和保存系统都可用于本发明。
冷冻干燥方法包括但不限于在干燥前缓慢、逐渐冷冻至-40℃，在干燥前置于-80℃下快速冷冻，或在干燥前通过将具有冷冻保护剂的细胞滴入液氮中进行超快速冷冻。
冷冻保护剂通常用于在冷冻干燥过程中保护益生菌组合物并延长保质期。非限制性地，可以使用选自以下的冷冻保护剂：蔗糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇、菊粉、甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、2-甲基-2,4-戊二醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚甘油、脱脂奶粉、乳蛋白、乳清蛋白、UHT乳、甜菜碱、阿东糖醇、蔗糖、葡萄糖、乳糖或它们的任何组合。
在冷冻干燥之前可以进一步加入益生元，例如淀粉和麦麸，以增强本文教导的霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌组合物的功效。如果需要的话，向冷冻干燥混合物中加入抗氧化剂(例如核黄素、核黄素磷酸盐或其生理学上可接受的盐、谷胱甘肽、抗坏血酸盐、谷胱甘肽和半胱氨酸)可进一步增强本文所教导的霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌组合物在储存期间的生存力。
在一个实施方案中，本文所教导用途的组合物可以是食品或食品补充剂组合物。此类食品或食品补充剂组合物可包括乳制品，更优选发酵乳制品，优选酸奶或酸奶饮料。
在一个实施方案中，本文所教导用途的组合物可以是药物组合物，例如选自胶囊、片剂和粉剂的形式的药物组合物。
在一个实施方案中，霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌可以以约104个至约1015个细胞(优选菌落形成单位(CFU))的量存在于如本文所教导的组合物中。例如，宿主细胞的有效量可以是约105个细胞或CFU至约1014个细胞或CFU，优选约106个细胞或CFU至约1013个细胞或CFU，优选约107个细胞或CFU至约1012个细胞或CFU，更优选约108个细胞或CFU至约1012个细胞或CFU。
在一个实施方案中，嗜粘蛋白-艾克曼菌可以以约104个至约1015个细胞(优选菌落形成单位(CFU))的量存在于如本文所教导的组合物中。例如，宿主细胞的有效量可以是约105个细胞或CFU至约1014个细胞或CFU，优选约106个细胞或CFU至约1013个细胞或CFU，优选约107个细胞或CFU至约1012个细胞或CFU，更优选约108个细胞或CFU至约1012个细胞或CFU。
在一个实施方案中，本文所教导用途的组合物还可包含粘膜结合剂。
本文所用的术语“粘膜结合剂”或“粘膜结合多肽”是指能够将其自身附着于哺乳动物(例如人类)的肠粘膜屏障的肠粘膜表面的试剂或多肽。本领域已经公开了多种粘膜结合多肽。粘膜结合多肽的非限制性实例包括细菌毒素膜结合亚单位，包括例如霍乱毒素的B亚单位，大肠杆菌(E.coli)不耐热肠毒素的B亚单位，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)毒素亚单位S2、S3、S4和/或S5，白喉毒素的B片段和志贺毒素或志贺样毒素的膜结合亚基。其他合适的粘膜结合多肽包括细菌菌毛蛋白，例如包括大肠杆菌菌毛K88、K99、987P、F41、FAIL、CFAIII ICES1、CS2和/或CS3、CFAIIV ICS4、CS5和/或CS6、P菌毛等。菌毛的其他非限制性实例包括百日咳博德特氏菌丝状血凝素、霍乱弧菌毒素-共调菌毛(TCP)、甘露糖敏感性血凝素(MSHA)、岩藻糖敏感性血凝素(PSHA)等。还有其他粘膜结合剂，包括病毒附着蛋白(包括流感病毒血凝素和仙台病毒血凝素)、动物凝集素或凝集素样分子(包括免疫球蛋白分子或其片段、钙依赖性(C型)凝集素、选择素、胶原凝集素或罗马蜗牛(Helix pomatis)血凝素)、具有粘膜结合亚单位的植物凝集素(包括伴刀豆球蛋白A、小麦胚芽凝集素、植物血凝素、相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白等)。
在一个实施方案中，本文教导的组合物可包含一种或多种成分，其适于促进霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以及任选的嗜粘蛋白-艾克曼菌在储存期间和/或在暴露于胆汁期间和/或在通过哺乳动物(例如人类)的胃肠道期间的存活和/或生存力和/或维持其完整性。这些成分的非限制性实例包括肠溶包衣和使得能够通过胃的控释剂。本领域技术人员知道如何选择合适的成分以确保活性成分(即霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以及任选的嗜粘蛋白-艾克曼菌到达其发挥作用的预期目的地。
在一个实施方案中，本文所教导用途的组合物可进一步包含选自益生元、益生菌、碳水化合物、多肽、脂质、维生素、矿物质、药剂、防腐剂、抗生素或其任何组合的成分。
在一个实施方案中，本文所教导用途的组合物可进一步包含一种或多种成分，其进一步增强本文教导的组合物的营养价值和/或治疗价值。例如，添加选自以下的一种或多种成分(例如营养成分、兽药或药剂等)可能是有利的：蛋白质、氨基酸、酶、矿物盐、维生素(例如盐酸硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、氯化胆碱、泛酸钙、生物素、叶酸、抗坏血酸、维生素B12、对氨基苯甲酸、维生素A醋酸酯、维生素K、维生素D、维生素E等)、糖和复合碳水化合物(例如水溶性和水不溶性单糖、二糖和多糖)、药用化合物(例如抗生素)、抗氧化剂、微量元素成分(例如钴、铜、锰、铁、锌、锡、镍、铬、钼、碘、氯、硅、钒、硒、钙、镁、钠和钾等的化合物)。技术人员熟悉适合于增强本文所教导的组合物的营养和/或治疗/药用价值的方法和成分。
另一方面，本发明涉及用于治疗和/或预防个体的维生素B12缺乏症的霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌。
在一个实施方案中，本文所教导用途的霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌特别适用于患有维生素B12缺乏症的个体，其中该个体的维生素B12缺乏症是由上述情况引起的。
方法和用途
在另一方面，本发明涉及一种包含霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以及生理学上可接受的载体的组合物用于增加个体肠道中假维生素B12产生的用途。
在一个实施方案中，该包含霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以及生理学上可接受的载体的组合物可以用于增加个体肠道中假维生素B12产生的方法中，该方法包括向该个体施用有效量的该组合物的步骤。
在一个实施方案中，该个体可以是患有维生素B12缺乏症的个体，其中该个体的维生素B12缺乏症是由上述情况引起的。
在另一方面，本发明涉及一种包含霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以及生理学上可接受的载体的组合物用于增加个体肠道中丙酸盐产生的用途。
在一个实施方案中，该包含霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌以及生理学上可接受的载体的组合物可以用于增加个体肠道中丙酸盐产生的方法中，该方法包括向该个体施用有效量的该组合物的步骤。
另一方面，本发明涉及霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌用于增加个体肠道中假维生素B12产生的用途。
在一个实施方案中，霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌可以用于增加个体肠道中假维生素B12产生的方法中，该方法包括向该个体施用有效量的该组合物的步骤。
在一个实施方案中，霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌可以用于增加个体肠道中假维生素B12产生的方法中，特别适用于患有维生素B12缺乏症的个体，其中维生素B12缺乏症起因于上述情况中的任一种或由上述情况中的任一种引起。
另一方面，本发明涉及霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌用于增加个体肠道中丙酸盐的产生的用途。
在一个实施方案中，霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌可用于增加个体肠道中丙酸盐的产生的方法中，该方法包括向该个体施用有效量的该组合物的步骤。
另一方面，本发明涉及一种产生假维生素B12的体外方法，该方法包括以下步骤：在允许产生假维生素B12的条件下培养霍氏真杆菌和/或产丁酸盐肠单胞球菌的细菌，以及分离产生的假维生素B12。
技术人员非常清楚分离产生的假维生素B12的方法。
通过以下实施例进一步说明本发明，但不限于此。从以上讨论和这些实施例中，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不脱离其教导和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和情况。因此，除了本文所示和所述的那些之外，对于本领域技术人员而言本发明的各种修改从前面的描述中是显而易见的。这些修改也旨在落入所附权利要求的范围内。
附图说明
图1示出添加和不添加维生素或维生素B12的粘液培养基上的嗜粘蛋白-艾克曼菌代谢物的测量结果。
实施例
实施例1
细菌生长条件
嗜粘蛋白-艾克曼菌
如前所述使嗜粘蛋白-艾克曼菌MucT(ATTC BAA-835)生长(Derrien等，2004；Duncan等，2002)。在用丁基橡胶塞密封的血清瓶中在37℃厌氧条件下进行温育，该厌氧条件由182kPa(1.5atm)N2/CO2(比例80/20)的气相提供。通过分光光度计在600nm处测量生长，表示为光密度(OD600)。
霍氏真杆菌
霍氏真杆菌L2-7在经过一些调整的YCFA中在37℃下厌氧生长。在添加或不添加10mM乙酸盐的基本培养基中进行粘蛋白糖利用。在用粘蛋白衍生的单糖(甘露糖、岩藻糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺或N-乙酰葡糖胺)进行实验的情况下，这些单糖的使用浓度为25mM。跟踪生长24小时，定期收集样品以进行OD600和HPLC分析。
共培养实验
在补充有粘液的基本培养基中进行共培养实验(Derrien等，2004)。如下所述建立最佳共培养条件。将嗜粘蛋白-艾克曼菌加入粘蛋白培养基中，然后培养8小时以获得可测量浓度的乙酸盐并释放出糖。随后，将霍氏真杆菌细胞加入含有嗜粘蛋白-艾克曼菌的培养物中。在被加入至共培养物以前，所有细胞都用PBS洗涤两次，以防止产物从预培养物中溢出。在共培养期间，每48小时向培养基中加入0.15％粘蛋白，以为嗜粘蛋白-艾克曼菌维持足够的可用的底物。
分析细菌共培养产生的发酵产物
用高效液相色谱(HPLC)分析来自上述共培养的发酵产物。为进行发酵产物分析，将1ml细菌培养物离心并将上清液在-20℃储存直至HPLC分析。用Thermo Scientific Spectra系高效液相色谱(HPLC)系统测量底物转化和产物形成，该系统配备有Varian Metacarb 67H 300×6.5mm柱，保持在45℃并以0.005mM硫酸作为洗脱液运行。洗脱液的流速为0.8ml/min，通过测定折射率来检测代谢物。
维生素B12分析
用超高效液相色谱质谱(UHPLC-MS)进行维生素B12分析。简而言之，将霍氏真杆菌细胞(0.2g)与10mL含有100μL 1％NaCN的提取缓冲液(8.3mM氢氧化钠和20.7mM乙酸，pH4.5)混合。通过将混合物置于沸水浴中30分钟，提取氰基形式的维生素。冷却后，通过离心(6900g，10分钟；Hermle，韦欣根，德国)回收提取物，最后通过免疫亲和柱层析(Easy-Extract；R-Biopharma，格拉斯哥，苏格兰)纯化。使用HSS T3C18柱(2.1×100mm；1.8μm)在配备有光电二极管阵列检测器(PDA；210-600nm)并与高分辨率四极杆飞行时间质谱仪(QTOF；Synapt G2-Si，Waters)连接的Waters Acquity UPLC系统(Milford，马萨诸塞周，美国)上分析复原的提取物的维生素含量。洗脱液是水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)的梯度流(0.32ml/min)，二者均用0.1％甲酸酸化：0-0.5分钟(95:5)；0.5-5分钟(60:40)；5-6分钟(60:40)和6-10分钟(95:5)。将柱22保持在30℃并记录361nm处的UV检测结果。MS分析采用电喷雾电离以正离子模式进行，扫描范围设定为m/z 50-1500。对应于维生素峰的母离子进一步片段化(MS/MS)并进行分析。
结果
霍氏真杆菌和嗜粘蛋白-艾克曼菌之间的维生素B12依赖性互养共栖
在嗜粘蛋白-艾克曼菌与霍氏真杆菌的共培养中，与嗜粘蛋白-艾克曼菌的单一培养相比，琥珀酸盐与丙酸盐的比例发生了变化。已知通过甲基丙二酰辅酶A合酶产生丙酸盐取决于辅助因子维生素B12。因此，测试了维生素和维生素B12对嗜粘蛋白-艾克曼菌的单一培养的作用。添加维生素混合物或仅添加维生素B12确实改变了嗜粘蛋白-艾克曼菌的琥珀酸盐与丙酸盐的分布，其方式与共培养中霍氏真杆菌存在下的表现相同(图1)。通过质谱进行的详细分析显示霍氏真杆菌能够在单一培养中合成B12同效维生素。该同效维生素的结构似乎是假维生素B12，因为其下配体含有腺嘌呤而不是5,6-二甲基苯并咪唑(DMB)。没有观察到DMB添加对该产生的B12同效维生素的结构的影响(数据未示出)。总之，这是嗜粘蛋白-艾克曼菌和霍氏真杆菌之间双向代谢交互共生的证据，其中嗜粘蛋白-艾克曼菌为霍氏真杆菌的生长载体提供糖，反过来霍氏真杆菌为嗜粘蛋白-艾克曼菌提供了足够的维生素B12类似物作为通过甲基丙二酰辅酶A合酶将琥珀酸盐转化为丙酸盐的辅助因子。维生素B12和假维生素B12均可被嗜粘蛋白-艾克曼菌用作辅助因子并激活甲基丙二酰辅酶A合酶。因此，当由霍氏真杆菌产生的B12同效维生素是假维生素B12形式时，这种互养的关系似乎在肠道内共同形成(co-evolved)。
在霍氏真杆菌情况下，观察到特定的代谢和辅助因子互养相互作用，因为它产生影响嗜粘蛋白-艾克曼菌内的碳通量的假维生素B12，导致丙酸盐的产生。从人类研究中已知，递送至结肠的丙酸盐具有多种有益效果，包括降低食欲(Chamberset等，2015，supra)。
在霍氏真杆菌存在下发现嗜粘蛋白-艾克曼菌的代谢谱变化的事实进一步证明了互惠互养的相互作用。互养共栖的双方共同产生更高的丙酸盐与琥珀酸盐比率，这有利于宿主细胞代谢。此外，产生的B12辅助因子可以被宿主用于预防和/或治疗维生素B12缺乏症。
许多胃肠道疾病与粘膜损伤和肠道屏障功能降低有关。肠道细菌可能直接或通过特定的免疫和代谢刺激对这两种因素产生影响，这进一步强调了在正确的部位具有正确的细菌的重要性。粘膜完整性的丧失和相关的粘膜生物群可以指示疾病状态及其发展。嗜粘蛋白-艾克曼菌与人类细胞类型中的瘦表型和有益的代谢基因调控呈正相关关系(Everard等，2013；Lukovac等，2015)。它的存在对于共同促进对宿主的这些作用的有益微生物的粘膜粘附网络可能是必需的。事实上，减肥研究通常报道疣微菌门(主要是嗜粘蛋白-艾克曼菌)以及其他几种微生物物种(Liou等，2013；Remely等，2015；Ward等，2014)的丰度增加。总之，这些结果进一步表明粘膜相关微生物网络及其代谢交互共生对于调节宿主健康相关参数和预防疾病的可能的重要性。
实施例2
由产丁酸盐肠单胞球菌产生维生素B12
如Bui等(Nature Comm 2015，6：10062)所述，在葡萄糖-乙酸盐培养基上生长产丁酸盐肠单胞球菌。通过质谱进行的进一步详细分析表明，产丁酸盐肠单胞球菌AF 211能够在单一培养中合成B12同效维生素。该同效维生素的结构与霍氏真杆菌产生的相同，并且由于其下配体含有腺嘌呤而不是5,6-二甲基苯并咪唑(DMBI)而被鉴定为假维生素B12。没有观察到DMB添加对产生的该B12同效维生素的结构的影响(数据未示出)。