通过皮肤转移遗传信息调节疼痛和搔痒的系统和方法与流程

本申请要求2016年2月8日提交的美国临时申请系列号62/292,771、2016年4月8日提交的美国临时申请系列号62/320,422和2016年11月7日提交的美国临时申请系列号62/418,758的优先权。前述申请因而通过引用的方式完整并入本申请作为参考

发明领域

本发明总体上涉及在体内促进多种水平对细胞和组织控制的系统、装置和方法，并且更具体地涉及用于通过皮肤转移遗传信息治疗性调节疼痛和搔痒的系统和方法。

发明背景

疼痛和搔痒的感觉在皮肤真皮和表皮中初级感觉神经元的神经末梢活化后出现。电信号(动作电位)在神经末梢生成并沿着轴突传播，由此它们在脊髓或脑干输送至中枢神经系统。初级感觉神经元的细胞体位于背根神经节(“drg”)或三叉神经节(“tg”)并含有编码沿神经元整个长度表达的蛋白质的dna。

离子通道和泵维持跨神经元的膜电压并促进动作电位的生成和传播。一些经批准用于治疗疼痛和搔痒的药剂通过抑制这些离子通道，降低初级感觉神经元的电兴奋性而发挥作用。例如，利多卡因阻断电压门控钠(na⁺)离子通道并且吗啡激活降低电压门控钙(ca21)离子通道活性的阿片样物质受体。值得注意的是，多种药物如利多卡因和吗啡是相对强有力的镇痛药，但它们在其全身性影响方面无特异性，靶向身体的非靶向部分中(如心脏和中枢位置中)的多种电压门控离子通道，这限制了它们的治疗实用性；另外，已经发现这类药剂与美国和其他地方的重度成瘾问题(additionproblem)相关。公认降低初级感觉神经元的电兴奋性可以抑制疼痛。

基因治疗是向患者的细胞治疗性输送遗传信息(核酸聚合物，如dna和rna)以治疗疾病。遗传信息可以借助病毒或非病毒方法传输并且可以编码转基因蛋白质的表达或降低患者的现有蛋白质水平的信息。

基因治疗方法已经用来在动物疼痛模型中输送基因至初级感觉神经元。已经表达转基因蛋白质以降低初级感觉神经元的电兴奋性。例如，表达内源阿片样物质肽脑啡肽(其是δ阿片样物质受体的天然配体)可以在动物模型中降低疼痛水平。也已经表达了利用微生物光敏性或光响应性离子转运蛋白(通道和泵)的光遗传蛋白质来调节电兴奋性并减少疼痛。这些光遗传学模式中的某些涉及透皮或皮内递送光以激活离子通道或泵，以降低电兴奋性并阻断疼痛信号输送。输送遗传信息以降低内源靶蛋白水平也已经在动物模型中用来减少疼痛。例如，针对电压门控钠通道的小发夹rna(“shrna”)的表达已经在动物模型中降低电兴奋性并抑制疼痛。

与治疗疼痛和搔痒时的传统药物相比，使用这些方法的基因治疗可以具有几种益处。治疗性遗传信息可以输送至神经轴中的特定区域和/或细胞，导致遗传信息局限化浓积，减少全身性脱靶效应，并且还缓解至少某些前述的药物相关消极面。

向皮肤输送遗传信息是有吸引力的，因为它允许靶向受疼痛或搔痒影响的特定区域。因而，治疗性遗传信息可以由皮肤细胞本身摄取，或由皮肤层或表皮层中的初级感觉神经末梢摄取以导致在目的位置疼痛或搔痒减少。

发明概述

一个实施方案涉及一种用于改变哺乳动物中支配靶向的组织区域的感觉单元的功能的方法，所述方法包括以下步骤：确定靶向的组织区域；将腺相关病毒皮肤施用至靶向的组织区域中，其中病毒基因组编码至少一种外源蛋白；在靶向的感觉单元中表达外源蛋白；并且因外源蛋白表达而改变靶向的感觉单元的功能以治疗或恢复感觉反应，同时不影响附近感觉单元的功能。腺相关病毒可以具有选自腺相关病毒毒株1、腺相关病毒毒株6和腺相关病毒毒株8的外壳蛋白。外源蛋白可以是光响应性蛋白并且在靶向的感觉单元中表达外源蛋白还可以包括使靶向的感觉单元暴露于光。光响应性蛋白可以是刺激性视蛋白。刺激性视蛋白可以选自chr2、c1v1-t、c1v1-tt、catch、vchr1-sfo和chr2-sfo。光响应性蛋白可以是抑制性视蛋白。抑制性视蛋白可以选自nphr、enphr1.0、enphr2.0、enphr3.0、mac、mac3.0、arch、archt、ichr、ic1c2、ic++、swichr++和jaws。外源蛋白可以是通过降低电兴奋性或通过调节作为疼痛起因的受体、神经递质、离子通道、第二信使系统和炎症生物化学介质而减少疼痛的一种蛋白质。外源蛋白可以选自p2x、dor、nav1.7、nav1.8、cav1.2、nr2b、machr亚型m2、machr亚型m3、machr亚型m4、nts2、homer1、shank1、trpv1、dream、ccr2、gdnf、nr2b、pkc、toll样受体4、nmda的nr1亚基、连接蛋白43、gaba、内啡肽和配体相关g蛋白。可以至少部分地基于选自急性疼痛、慢性疼痛、异常性疼痛、异位性疼痛、神经病理性疼痛、搔痒和感觉异常的不利感觉反应选择靶向的组织区域。可以至少部分地基于麻木选择靶向的组织区域。可以至少部分地基于饱腹感选择靶向的组织区域。腺相关病毒可以是自身互补的。皮肤施用可以包括皮内或皮下施用。

另一个实施方案涉及一种通过改变哺乳动物中支配组织区域的感觉单元的功能，治疗或预防组织区域的不利感觉反应或感觉反应缺少的方法，所述方法包括以下步骤：确定具有、将具有感觉反应缺少或正缺少感觉反应的组织区域；向确定的组织区域皮肤施用包含选自腺相关病毒毒株1、腺相关病毒毒株6和腺相关病毒毒株8的外壳蛋白的腺相关病毒，其中病毒基因组编码至少一种导致rnai的分子；在靶向的感觉单元中表达rnai分子；并且因rnai表达而改变靶向的感觉单元的功能以治疗或恢复感觉反应，同时不影响附近感觉单元的功能。在不利感觉反应是疼痛的一个实施方案中，rnai可以是对减少选自以下的蛋白质的表达特异的：p2x、dor、nav1.7、nav1.8、cav1.2、nr2b、machr亚型m2、machr亚型m3、machr亚型m4、nts2、homer1、shank1、trpv1、dream、ccr2、gdnf、nr2b、pkc、toll样受体4、nmda的nr1亚基和连接蛋白43。不利感觉反应可以选自急性疼痛、慢性疼痛、异常性疼痛、异位性疼痛、神经病理性疼痛、搔痒和感觉异常。感觉反应的缺少可以是麻木。感觉反应的缺少可以是饱腹感。不利感觉反应可以是慢性疼痛并且可以通过对nav1.7特异的ddrnai实现rnai。腺相关病毒可以是自身互补的。皮肤施用包括皮内或皮下施用。

另一个实施方案涉及一种通过改变哺乳动物中支配组织区域的感觉单元的功能，治疗组织区域中神经病理性疼痛的方法，所述方法包括以下步骤：确定具有不利神经病理性疼痛的组织区域；将包含毒株6外壳蛋白的腺相关病毒皮肤施用入确定的组织区域，其中病毒基因组编码视蛋白ic++；在靶向的感觉单元中表达ic++并使感觉单元暴露于光；并且减少受该感觉单元支配的组织区域中的神经病理性疼痛，同时不影响附近感觉单元的功能。腺相关病毒是自身互补的。皮肤施用可以包括皮内或皮下施用。

另一个实施方案涉及一种通过改变哺乳动物中支配组织区域的感觉单元的功能，治疗组织区域中躯体浅表疼痛的方法，所述方法包括以下步骤：确定具有不利躯体浅表疼痛的组织区域；将包含毒株6外壳蛋白的腺相关病毒皮肤施用入确定的组织区域，其中病毒基因组编码ic++；在靶向的感觉单元中表达ic++并使感觉单元暴露于光；并且减少受该感觉单元支配的组织区域中的躯体浅表疼痛，同时不影响附近感觉单元的功能。aav是自身互补的。皮肤施用可以包括皮内或皮下施用。

另一个实施方案涉及改变动物中支配靶向的组织区域的感觉单元的功能的系统，所述感觉单元配置成表达光响应性蛋白，所述系统包含配置成对靶向的组织结构的至少一部分直接照射的光递送元件；和配置成向光递送元件提供光的光源；其中以辐射经皮肤照射靶向的组织结构，从而至少部分地因光响应性蛋白暴露于辐射而调节靶向的组织结构包含的细胞的膜电位。光源可以选自激光、发光二极管和化学发光化合物。感觉单元可以毗邻于施用一种或多种配置成引起感觉单元表达光响应性蛋白的临床用化合物之前已经改变的角质层。可以使用选自以下的配置改变角质层：胶带剥离配置、皮肤磨削配置、微皮肤磨削配置、脱毛化合物施加配置、超声促渗配置、离子导入配置、电穿孔配置、微皮肤磨削配置、微针配置、激光消融配置和光穿孔配置。光响应性蛋白可以是刺激性视蛋白。刺激性视蛋白可以选自chr2、c1v1-t、c1v1-tt、catch、vchr1-sfo和chr2-sfo。光响应性蛋白可以是抑制性视蛋白。抑制性视蛋白可以选自nphr、enphr1.0、enphr2.0、enphr3.0、mac、mac3.0、arch、archt、ichr、ic1c2、ic++、swichr++和jaws。感觉单元可以设置成通过向靶向的组织区域施用腺相关病毒而表达光响应性蛋白，其中病毒基因组编码至少一种在感觉单元中变得表达的光响应性蛋白。腺相关病毒可以具有选自腺相关病毒毒株1、腺相关病毒毒株6和腺相关病毒毒株8的外壳蛋白。可以至少部分地基于选自急性疼痛、慢性疼痛、异常性疼痛、异位性疼痛、神经病理性疼痛、搔痒和感觉异常的不利感觉反应选择靶向的组织区域。可以至少部分地基于麻木选择靶向的组织区域。可以至少部分地基于饱腹感选择靶向的组织区域。腺相关病毒可以是自身互补的。光源可以是使用至少部分地基于过氧化草酸酯(peroxyoxalate)氧化反应的化学发光反应所产生的化学发光化合物。

附图简述

图1显示一个实施方案的各方面，其中使用皮下注射，将携带ic++视蛋白的aav毒株施用至小鼠的后爪中。

图2显示表征与一个实施方案相关的机械阈值数据的图，其中在光存在下，相对于仅注射溶媒(盐水)，皮下注射表达ic++的aav后抑制疼痛(显示机械阈值水平升高)。

图3a显示五种不同视蛋白(包括ic++)的序列比对。加粗的前11个氨基酸指示c1c2和ic++之间的序列变化(添加了通道视紫红质(channelrhodopsin)-2的前11个氨基酸，以改善膜转运)。在ic1c2、ic1c2++和swichr++中，加粗的氨基酸是来自c1c2的突变。gtacr2中的加粗氨基酸是离子选择性的关键残基。

图3b显示在以下说明性实施方案中所讨论的aav毒株的二个反向末端重复序列(左侧itr和右侧itr)之间的载体结构。ic++是抑制性视蛋白，hsyn是人突触蛋白1启动子并且p2a是表达标签。wpre是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件并且pa是聚腺苷酸信号传导元件。

图4a显示实验性切口疼痛模型的一个实施方案的初始步骤。

图4b显示实验性切口疼痛模型的一个实施方案的测试阶段。

图4c显示在一个实施方案中仅注射溶媒(盐水)的疼痛模型的切割阶段之前、其期间和之后缩足阈值的变化(升高＝处理)。加深色阴影的柱代表“光照开启”状态，而加浅色阴影的柱代表“光照关闭”状态。缩足阈值在纵轴上对克(g)作图，在横轴上是切割之前、其期间和之后的天数。

图4d显示注射编码ic++的aav1时缩足阈值的变化。在描述的实验数据中，加星号的柱是统计显著的。

图4e显示注射编码ic++的aav5时缩足阈值的变化。

图4f显示注射编码ic++的aav6时缩足阈值的变化。加星号的柱是统计显著的。

图4g显示注射编码ic++的aav8时缩足阈值的变化。加星号的柱是统计显著的。

使用皮下注射，将携带ic++视蛋白的多个aav毒株施用至小鼠的后爪中。图4a-图4g和图5中显示来自这种实验配置的结果。

图5显示如依据病理学所示的表达ic++的神经元的百分数。基于染色强度，表达划分成高、中等和低。

图6a显示在大鼠中进行的图6实验里所用的切口疼痛模型的前二个步骤。

图6b显示在大鼠中进行的图6实验里所用的切口疼痛模型的测试阶段。

图6c显示仅注射溶媒(盐水)的疼痛模型的预施用病毒(仅光照关闭)时、切割阶段之前、其期间和之后缩足阈值的变化(升高＝处理)。加深色阴影的柱代表“光照开启”状态，并且加浅色阴影的柱代表“光照关闭”。缩足阈值在y-轴上对克(g)作图，在x-轴中是切割之前、其期间和之后的天数。加单个星号和加两个星号的柱是统计显著的。

图6d显示注射编码ic++的aav6的疼痛模型的预施用病毒(仅“光照关闭”状态)时、切割阶段之前、其期间和之后缩足阈值的变化(升高＝处理)。加深色阴影的柱代表“光照开启”状态，并且加浅色阴影的柱代表“光照关闭”。缩足阈值在y-轴上对克(g)作图，在x-轴中是切割之前、其期间和之后的天数。加单个星号和加两个星号的柱是统计显著的。

图7a显示在大鼠中进行的图7实验里所用的慢性压迫性疼痛(chronicconstrictionpain)模型的前二个步骤。

图7b显示在大鼠中进行的图7实验里所用的慢性压迫性疼痛模型的测试阶段。

图7c图示在神经压迫且仅注射溶媒(盐水)或注射aav6:ic++之前、其期间和之后缩足阈值的变化(升高＝处理)。加浅色阴影的柱代表“光照关闭”状态，加深色阴影的柱代表“蓝光照开启”，并且加阴影线的柱是“黄光照开启”。缩足阈值在y-轴上对克(g)作图，在x-轴中是切割之前、其期间和之后的天数。

图7d显示与图7a-c的实验的动物的缩足阈值变化相比，表达的神经元的百分数。

图8a显示如与小鼠中内侧爪相比，显示外侧爪中注射病毒的中靶和脱靶效应的实验设计。

图8b显示在蓝光照开启(加深色阴影的柱)和光照关闭(加浅色阴影的柱)时内侧感觉单元和外侧感觉单元上缩足阈值升高。加星号的柱是统计显著的，“n.s.”不是统计显著的。

图9a显示皮内注射和神经注射中均施用aav和固蓝染料。

图9b显示与皮内注射相比，神经中表达ic++的神经元的百分数。

图9c显示皮内注射和神经注射时固蓝着染的表达ic++的神经元的百分数。

图10显示在背部注射和后爪注射施用亲本形式和自我互补形式的aav6时gfp表达的对比百分数。

图11至图13显示了本发明用于干预的光遗传处理系统的示例性系统层级部署。

发明详述

本文展示了通过皮肤(如皮内或皮下)转移遗传信息调节疼痛和搔痒的系统、方法和配置。

在多个实施方案中，主题方法和主题配置提供靶向改变一个感觉单元的感觉反应。感觉单元是组织区域加那些在该组织内部携带感觉信息的特定神经或多根神经，其中神经末梢终止于某区域的某皮肤区域中。本说明书提供这样的手段，其通过病毒或其他输送方法，以靶向方式输送遗传信息，从而它将导致转导有限数目的神经细胞，尤其感觉单元的那些神经细胞。当病毒用于转导时，它在其基因组内部携带内源性基因或其他遗传信息。感觉神经因病毒所产生的转导和内源性基因或遗传信息表达，改变了组织区域的感觉反应并仅在该区域中改变。以这种方式，改变靶向的感觉单元的反应，同时不影响附近感觉单元的功能。

出于几个原因，这是令人惊讶的结果。首先，本领域认为通过皮肤施用观察到的借助病毒获得的转导水平低于借助病毒转导和表达遗传信息有效改变感觉单元的功能为必需的阈值。本文提供的数据显示并非如此。其次，尚未知皮肤定向施用是否将产生选择性转导–即，毗邻的感觉单元将不受这种施用方法影响。本文提供的数据显示的确如此。无论透皮或皮下，所述的皮肤定向施用产生所需的感觉单元靶向转导，在靶向的感觉单元中导致所需的功能变化，同时不改变附近但非靶向的感觉单元的功能。以这种方式，本发明方法提供了一种通过透皮或皮下施用病毒至待改变其功能的感觉单元中，选择性改变感觉反应的方法。

在多个实施方案中，可以采取这种途径以实现光遗传处理方法、系统或配置。在一个实施方案中，编码光激活型离子转运蛋白(如蓝光激活型氯离子通道，ic++)的遗传信息由腺相关病毒(aav)输送至表皮和/或真皮并由初级感觉神经末梢摄取。这种遗传信息转运至背根神经节(drg)或三叉神经节(tg)中的细胞体以导致光活化的离子通道蛋白表达，所述蛋白质向下回输至皮肤中的初级感觉神经末梢，在这里，可以通过皮内光递送调节它们以减少疼痛。也可以在特定神经层级、在drg层级或脊髓层级输送光，如通过使用植入式光递送技术输送。光激活型离子转运蛋白的其他例子包括但不限于蓝光兴奋性视蛋白、通道视紫红质2(chr2和变体)、抑制性黄光激活型氯泵、卤视紫红质(halorhodopsin)(nphr和变体)、蓝-绿光驱动的质子泵mac(和变体)、绿光激活型质子泵、arch(和变体)和红光激活型卤视紫红质jaws(和变体)。参考chow等人nature,463:98-102(2010)；chuong等人natureneuroscience17:1123-1129(2014)；berdnt等人proc.natlacadsciusa,vol.113(4):822-829(2016)，和专利申请公开us20130347137，所述文献各自通过引用的方式完整并入本文作为参考。也可以使用阶跃的视蛋白(step-functionopsin)如chr2(c128a)或chr2(128s)作为刺激性视蛋白或使用swichr++作为抑制性视蛋白。

在这些光遗传学实施方案的每者中，光激活型离子转运蛋白用来通过改变(常见地增加)离子转运，改变感觉单元的功能。如通过可以利用的多种视蛋白所示，这种方法可以用来通过光输送激发或抑制特定感觉单元的神经元内部动作电位的产生。结果取决于视蛋白提供的离子转运的性质和方向。特别地，如果离子带正电荷并且移动是进入细胞或如果离子带负电荷并且移动是离开细胞，则增加的转运导致刺激表达视蛋白的细胞(例如动作电位的概率升高或去极化)。这通常称作“刺激”。

相反，如果离子带负电荷并且和移动是进入细胞或如果离子带正电荷并且移动是离开细胞，则增加的转运导致抑制表达视蛋白的细胞(例如动作电位的概率降低或超极化)。这通常称作“抑制”。一个可能的特定方案是利用这些光遗传学方法治疗急性和慢性疼痛。

在另一个实施方案中，采取这种途径来实现蛋白质治疗性治疗方法。在这个实施方案中，编码对患者同源或异源的转基因(如人阿片样肽脑啡肽)的遗传信息由aav输送至表皮和/或真皮并由初级感觉神经末梢摄取。这种遗传信息转运至drg或tg中的细胞体以导致转基因的表达，其通过降低电兴奋性和/或通过调节作为疼痛起因的其他组分(如受体、神经递质、离子通道、第二信使系统和炎症生物化学介质)减少疼痛。转基因的其他例子包括但不限于一般意义上的阿片样肽，如强啡肽、孤啡肽，pomc(和其剪切产物γ-msh、α-msh、clip、cth、γ-lph、β-lph、β-内啡肽)。相关的背景参考文献包括neuropsychopharmacology，第3章，opioidpeptidesandtheirreceptors:overviewandfunctioninpainmodulation,mcnally和akil,第35-46页(acnp,2002)，所述文献通过引用方式完整并入本文作为参考。其他待提供的可能蛋白质将是gaba(γ-氨基丁酸)、内啡肽-1和内啡肽-2。

另一个可能的蛋白质疗法是输送并表达磁敏性离子通道，优选地通过病毒输送并表达。相关的背景参考文献包括chen等人,science347(6229(:1477-80(2015)，所述文献通过引用方式完整并入本文作为参考。在概念上类似于光遗传学，但是利用磁性而非光触发离子转运的改变，可以将这些专门工程化的蛋白质输送至细胞并且随后根据需要利用磁体去极化或低极化正在表达的细胞。通过使用本发明的方法向神经感觉单元提供这些蛋白质，实现所需的效果，如减少急性或慢性疼痛。

在另一个实施方案中，采取这种途径来实现基因沉默治疗方法。在这个实施方案中，编码内源蛋白(如靶向nav1.7电压门控钠离子通道的rnai)敲减或多种内源蛋白敲减的遗传信息由aav输送至表皮和/或真皮并由初级感觉神经末梢摄取。这种遗传信息转运至drg或tg中的细胞体以导致内源蛋白靶的水平降低，这通过降低电兴奋性和/或通过调节作为疼痛起因的其他组分(如受体、神经递质、离子通道、第二信使系统和炎症生物化学介质)导致减少疼痛。其他的敲减方法学例子包括但不限于基于crispr、talen、微rna和锌指核酸酶的方案。

可以在表达方面敲减的内源蛋白靶的其他例子包括但不限于其他电压门控钠离子通道、nav1.3、nav1.8和nav1.9和钙电压门控离子通道cav2.2和cav3.2。其他具体的敲减靶包括p2x、dor、nr2b、machr亚型m2、machr亚型m3、machr亚型m4、nts2、homer1、shank1、trpv1、dream、ccr2、gdnf、nr2b、pkc、toll样受体4、nmda的nr1亚基和连接蛋白43。利用对一个或多个基因(如这些基因)的敲减，在感觉单元内部实现所需的效果，如减少急性或慢性疼痛。

在另一个实施方案中，这种方法或配置可以用来实现受体调节或化学遗传方法以改变感觉单元功能。在这个实施方案中，编码配体激活的g-蛋白偶联受体(如设计者药物排他地激活的hm4设计者受体(“dreadd”)蛋白质)的遗传信息由aav输送至表皮和/或真皮并由初级感觉神经末梢摄取。这种遗传信息转运至drg或tg中的细胞体，以导致配体激活的g-蛋白偶联受体表达，后者随后可以通过全身性施用(静脉内或口服)其配体(如hm4dreadd蛋白的配体、氯氮平-n-氧化物(“cno”))来调节。通过其配体调节g-蛋白偶联受体可以通过降低电兴奋性和/或通过调节作为疼痛起因的其他组分(如受体、神经递质、离子通道、第二信使系统和炎症生物化学介质)减少疼痛。

在另一个实施方案中，遗传信息由aav输送至表皮和/或真皮并由初级感觉神经末梢摄取，其中遗传信息对搔痒反应具有已知影响或靶向泛化意义上抑制搔痒的神经元反应。这种遗传信息转运至drg或tg中的细胞体，以导致减少搔痒。遗传信息的例子包括但不限于i)光激活型离子转运蛋白(如ic++)，所述蛋白质在细胞体表达并向下回输至皮肤中的初级感觉神经末梢，在这里，可以通过皮内光递送调节它们以减少瘙痒，和ii)敲减在不调节触觉、痛觉和本体感觉的情况下选择性减少搔痒感觉的搔痒相关基因(如胃泌素释放肽(grp)和排钠利尿多肽b(nppb))。

在另一个实施方案中，编码减少疼痛或搔痒的转基因或内源蛋白敲减的遗传信息由任何能够被初级感觉神经末梢摄取的病毒载体输送。例子包括但不限于全部野生型腺相关病毒(aav)、单纯疱疹病毒(hsv)、腺病毒、慢病毒和狂犬病病毒及它们的工程化变体。特别地，已经指出一些病毒株在皮肤定向施用方面比其他病毒株更高效。对于aav，已经指出在本文所述的施用类型后产生转导方面，具有来自6型(指aav6)、1型(指aava1)和8型(指aav8)的外壳蛋白的aav比其他类型更高效。

本发明的数据还提供在本发明方法中使用亲本aav毒株或已经工程化以自身互补的那些毒株的能力。简而言之，自身互补的aav毒株(scaav)是已经过基因工程化以假定允许更高效转导的那些，如当感染时，宿主细胞不需要为复制阶段产生dna的第二链。相反，scaav的二个半部分将彼此结合，因此形成启动复制和转录所需的双链dna分子。使用这类毒株的缺点是转运容量较低，因为scaav仅可以携带约2.4kb遗传信息，而亲本株可以输送约4.7–6kb信息。但是，如本文中公开，可以工程化来得到满足这些大小要求的功能视蛋白。

在另一个实施方案中，编码减少疼痛或搔痒的转基因或内源蛋白敲减的遗传信息由任何能够被初级感觉神经末梢摄取的核苷酸递送方案输送。例子包括但不限于小干扰性rna、裸dna和脂质体包囊化的核苷酸。

在另一个实施方案中，编码减少疼痛或搔痒的转基因或内源蛋白敲减的遗传信息由干细胞方案输送。例子包括但不限于使用人胚胎干细胞衍生的表达蓝光敏感性或光响应性氯离子通道ic++的上皮角质形成细胞，其中通过皮内光递送激活所述氯离子通道以抑制初级感觉神经末梢中产生的动作电位。

在另一个实施方案中，将纯化的重组蛋白或多种重组蛋白的组合直接输送至表皮和/或真皮，以便由初级感觉神经末梢或皮肤细胞摄取来调节疼痛或搔痒。

在另一个实施方案中，编码减少疼痛或搔痒的转基因或内源蛋白敲减的遗传信息直接输送至表皮和/或真皮的细胞。例子包括但不限于将编码蓝光激活型氯离子通道ic++的遗传信息直接输送至角质形成细胞，从而皮内光递送可以抑制初级感觉神经末梢中产生的动作电位。

可以通过许多方法实现按照上文描述的配置输送遗传信息至表皮和/或真皮。皮肤配置或至少部分通过皮肤输送配置的例子包括但不限于皮下注射、透皮注射、皮内注射、局部施加和通过电穿孔、超声处理、微摩擦和包被的金微粒子输送法增强遗传信息转移。

上文描述的这类配置可以适用于特定的急性和慢性疼痛病症，包括但不限于神经病理性疼痛、三叉神经痛、复杂的区域疼痛综合征(crps，也称作反射性交感神经营养障碍(rsd)或反射神经血管营养不良(rnd))、术后疼痛、躯体疼痛、糖尿病性周围神经病、坐骨神经痛和疱疹后神经痛。应当指出慢性疼痛常见地定义为持续超过12周的任何疼痛。

上文描述的这类配置可以应用于特定的急性和慢性搔痒病症，包括但不限于疱疹后搔痒、异位性湿疹和接触性皮炎。

在另一个实施方案中，可以实现编码疼痛相关基因敲减和hsv基因敲减的遗传信息，因为可能存在涉及疱疹后搔痒和疱疹后神经痛的顾虑：病毒基因治疗可能导致hsv基因复活。

在另一个实施方案中，可以用表皮和/或真皮中来自神经末梢的摄取作用增强来工程化腺相关病毒变体。这种方法的例子包括但不限于aav衣壳定向进化、有性pcr和基于cre重组的aav靶向进化(create)系统。这里，将进行多轮表皮和/或真皮注射，随后在drg提取，以分离/产生初级感觉神经元摄取作用增强的载体。

在初始研究中通常参考图1和图2，通过光遗传学，注射皮下表达ic++的aav抑制疼痛。

如上文所示，疼痛管理是现代医疗中的重大关切之处。例如，术后疼痛是最大的疼痛市场(2010年59亿美元)，每年>1亿例手术需要术后疼痛治疗(大多是percocet和vicodin)。存在巨大的未满足需求，40％患者报告疼痛缓解不充分，主要归因于药物副作用的限制，包括头晕、镇静、恶心、呼吸抑制和欣快感。此外，阿片类具有高度成瘾性，在美国>2百万人成瘾，导致>20000例致死过量用药(超过海洛因致死过量用药2倍)。另外，在许多情况下，阿片类是其他违法麻醉药(narcotic)的途径药物(gatewaydrug)。术后疼痛对于光遗传学疗法有吸引力，因为这种疼痛大部分在皮肤表面出现，原因在于c纤维和adelta纤维敏化及异位活性。这里，发射光的光遗传学绷带将理想用于局部关闭这种活性，而无脱靶效应。另外，适应症需要治疗仅数周(us20160030765)而非数年，这减少临床前和临床开发时限。towne等人的美国专利申请公开描述了适于实施本文所述的多种方法的光遗传学配置；该参考文献通过引用方式完整并入本文作为参考。

在一个实施方案中，可以如下利用通过dna或mrna的病毒基因皮肤转移来调节疼痛的系统和方法。

一个目标是通过皮肤输送光遗传学蛋白(如ic++)的遗传信息以使用病毒治疗术后疼痛。可以通过局部、皮下或皮内递送携带dna或mrna的病毒，在皮肤和/或神经末梢中表达光遗传学蛋白。理想地，制剂可以揉到皮肤上(局部用药)。在基因输送后，在一个实施方案中，ic++蛋白可以由蓝光激活，以抑制c纤维和adelta纤维中的自发和致敏活性，以减少手术切开后的疼痛。可以通过发射光的光遗传学绷带皮内递送光。可以通过制剂递送病毒dna或mrna，所述制剂包含如选定的递送方法所需要的其他赋形剂。上文描述了这类方案的变种，包括但不限于治疗其他疼痛疾病、使用其他光遗传学蛋白、使用其他基因治疗剂和敲减方案和利用病毒输送的遗传信息治疗搔痒。

在一个实施方案中，可以如下利用通过dna或mrna的非病毒基因皮肤转移而调节疼痛的系统和方法。

一个目标是通过皮肤输送光遗传学蛋白(如ic++)的遗传信息以治疗术后疼痛。可以通过局部、皮下或皮内递送dna或mrna，在皮肤和/或神经末梢中表达光遗传学蛋白。理想地，制剂可以揉到皮肤上(局部用药)。在基因输送后，在一个实施方案中，ic++蛋白可以由蓝光激活，以抑制c纤维和adelta纤维中的自发和致敏活性，以减少手术切开后的疼痛。可以通过发射光的光遗传学绷带皮内递送光。可以通过制剂如阳离子聚合物(例如聚乙烯亚胺或明胶)、阳离子脂质、鱼精蛋白、磷灰石或金粒子递送dna或mrna。同样地，可以通过物理方法如电穿孔、超声处理或微摩擦实现dna或mrna的基因转移。在递送mrna的情况下，制剂可以直接递送mrna至含有mrna翻译装置的神经末梢，并允许在神经末梢处直接产生蛋白质，无需递送基因至tg或drg细胞体处的胞核。上文描述了这类方案的变种，包括但不限于治疗其他疼痛疾病、使用其他光遗传学蛋白、使用其他基因治疗剂和敲减方案和治疗搔痒。

参考图1、图2和图3，说明了透皮递送表达抑制性视蛋白的aav以升高未受伤小鼠中机械阈值水平的配置和方法的多个方面。

参考图3a和图3b，在一个实施方案中，使用标准克隆方法构建了腺相关病毒(aav)表达质粒，其含有人突触蛋白启动子控制下的ic++转基因。ic++是先前已经用来体内抑制神经活性的合成性蓝光敏感性氯离子通道。参考berndta,leesy,wietekj,ramakrishnanc,steinbergee,rashidaj,kimh,parks,santoroa,franklandpw,iyersm,paks,s,delpsl,malenkarc,josselynsa,carlénm,hegemannp,deisserothk.structuralfoundationsofoptogenetics:determinantsofchannelrhodopsinionselectivity.procnatlacadsciusa.2016jan26；113(4):822-9，所述文献通过引用方式完整并入本文作为参考。该表达盒还含有2a肽(p2a)序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)、多聚腺苷化(polya)信号和二个反向末端重复序列(itrs)。根据所用的包装质粒，这个表达盒可以包装入多个aav血清型。在这个例子中，表达盒包装在aav血清型8中。

通过之前描述的无腺病毒的三重转染方法，产生表达ic++的aav血清型8；参考xiaox,lij,samulskirj.productionofhigh-titerrecombinantadeno-associatedvirusvectorsintheabsenceofhelperadenovirus.jvirol.1998mar；72(3):2224-32；和matsushitat,elligers,elligerc,podsakoffg,villarreall,kurtzmangj,iwakiy,colosip.adeno-associatedvirusvectorscanbeefficientlyproducedwithouthelpervirus.genether.1998jul；5(7):938-45；所述每篇文献通过引用的方式完整并入本文作为参考。简而言之，用上文描述的ic++表达质粒、含有为识别itr并将其侧翼序列包装入病毒粒所要求的rep(复制)基因和cap(衣壳)基因的包装质粒和供应构建aav所要求的剩余腺病毒蛋白的辅助质粒，通过磷酸钙法转染hek293细胞。转染后四十八小时，借助细胞溶解从胞核释放包装的aav粒子并且将匀浆添加至氯化铯梯度，其中超速离心将aav粒子与细胞残片分开。使用针对表达盒中序列的引物对进行定量聚合酶链反应(pcr)来滴定载体粒子(病毒基因组/毫升，vg)。

再次参考图1，使用1mlbd极细胰岛素注射器的6mmx31g针，将悬浮于5ul磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的1x10¹¹vg表达ic++的aav血清型8注射入位于麻醉的6周龄c57bl7小鼠后爪上的足底无毛皮肤(每组n＝10)。将针在斜面向上情况下在足垫的最尾端部分插入，并且缓慢地前推，同时剩余部分平行于皮肤表面且刚刚在其下方。一旦针尖达到足部中点，则进行注射并且缓慢取出针头以防止泄漏。使用相同方法注射对照动物，但是仅注射溶媒。将动物返回其居住笼供未来实验。

3周后通过vonfrey测试的升降方法研究小鼠的机械阈值水平；参考chaplansr,bachfw,pogreljw,chungjm,yakshtl.quantitativeassessmentoftactileallodyniaintheratpaw.jneuroscimethods.1994jul；53(1):55-63，所述文献通过引用的方式完整并入本文作为参考。允许小鼠适应试验设置30分钟并且随后将各种力度的vonfrey细丝施加至已注射爪的底部以确定缩足阈值。在经由距皮肤表面1cm保持的光纤传输的从激光源(471nm)供应的2mw/mm²蓝光存在或不存在时，进行拨弄。参考图2，我们观察到aav处理的动物具有响应于蓝光的升高的机械阈值水平，不同于溶媒处理的动物，溶媒处理的动物保持不变的机械阈值水平。因此，皮内递送表达ic++的aav促进小鼠中光介导的机械阈值水平调节作用。

参考图4a-图5，说明了减少小鼠中术后疼痛并且具有血清型依赖性的表达抑制性视蛋白的aav透皮递送的配置和方法的多个方面。在这个实施方案中，在小鼠术后疼痛模型中测试皮内注射表达ic++的各种aav血清型后光施加的治疗作用。参考图1-图3b，使用aav血清型1、5、6和8的包装质粒，如上文所述生成四种不同血清型的表达ic++的aav载体。参考图4a，使用实施例1中描述的手术方法，对6周龄c57bl6小鼠分别注射1.4x10¹¹、8.8x10¹⁰、3.8x10¹⁰和1.9x10¹¹vg表达ic++的aav血清型1、5、6和9(每组n＝10)。产生溶媒注射组作为对照。

参考图4b，三周后，如上文所述参考图1-3，在蓝光存在或不存在时测定小鼠的机械阈值水平。参考图4c-图4g，我们随aav血清型6和8观察到光介导的机械阈值水平升高，但是在血清型1、5和溶媒中未观察到。2天后重复这种测定法，结果相同。

如前述，用解剖刀片在注射的后爪的跖面上切割小鼠，以产生切开后疼痛模型；参考pogatzkiem,rajasn.amousemodelofincisionalpain.anesthesiology.2003oct；99(4):1023-7，所述文献通过引用方式完整并入本文作为参考。简而言之，借助鼻罩输送1.5％至2.5％异氟烷，麻醉小鼠。用10％聚维酮碘溶液对后爪进行消毒准备后，用11号刀片穿透足底皮肤和筋膜跖产生一个5mm纵向切口。切口距足跟2mm开始并向趾延伸。用弯头镊提起下方的肌肉，保留肌肉起点和肌肉附着不受损伤。用单股8-0尼龙缝线对齐皮肤。随后将小鼠放回笼中恢复。

1、4、8、12和14天后，在光存在或不存在时测定小鼠的机械阈值水平。我们观察到，光施加至注射aav血清型1、6和8的小鼠的爪导致切口引起的机械性异常疼痛减少，而注射aav血清型5或溶媒的动物无变化。因此，皮内递送表达ic++的某些aav血清型促进小鼠中光介导的术后疼痛抑制作用。

为了组织学分析目的，用上文描述的aav载体注射6周龄初始c57bl6小鼠组(每组n＝3)。这里，注射相同的血清型和剂量，然而，在原始剂量的1/5和1/25稀释度检查每个血清型的二个追加剂量。4周后处死这些小鼠并且分析从脊椎水平l4和l5的背根神经节(drg)的转导。这里，将小鼠经心脏灌注pbs中的4％多聚甲醛并且在4摄氏度在相同溶液中剖取过夜固定后的组织。将drg冷冻包埋并且在低温恒冷器上按12um厚度切开。切片用针对ic++的抗体平行染色，所述抗体用第二抗体在绿色通道(488nm)检测并且用缀合于nissl染液的荧光alexafluor594在红色通道(594nm)检测。nissl是神经元特异性染液并且用来定量表达ic++的总drg神经元的百分数(图5)。我们观察到aav血清型1、6和8转导drg的神经元，而aav血清型5不转导。另外，aav血清型6在反梯度转运方面最高效，相对低剂量的该血清型比其他血清型转导更多细胞。

参考图6a-图6d，说明了透皮递送表达抑制性视蛋白的aav以减少大鼠中术后疼痛的配置和方法的多个方面。在这个实施方案中，在大鼠术后疼痛模型中测试皮内注射表达ic++的aav血清型6后光施加的治疗作用。实验与参考图4a-图5描述的实验类似地进行，例外在于仅检查aav血清型6并且实验在大鼠中进行。参考图6a和图6b，如图1-图3b所描述，将悬浮于20ulpbs中的2x10¹¹vg的aav血清型6递送至10周龄spraguedawley大鼠的后爪中。也产生溶媒注射组作为对照。在注射病毒后2周和4周，在蓝光存在或不存在时测定机械阈值水平。参考图6c和图6d，我们观察到，光施加升高了载体注射组的机械阈值水平，但不升高溶媒注射组的机械阈值水平。随后使用参考图4a-图5描述的方法，对大鼠在后爪上切割以产生切开后疼痛模型。在切开后1天和3天，在蓝光存在或不存在时测定机械阈值水平。我们观察到，光施加升高了载体注射组的机械阈值水平，但不升高溶媒注射组的机械阈值水平。因此，皮内递送表达ic++的aav6后的光施加抑制大鼠中的术后疼痛。

参考图7a-图7d，说明了透皮递送表达抑制性视蛋白的aav以减少小鼠中神经病理性疼痛的配置和方法的多个方面。在这个实施方案中，在小鼠神经病理性疼痛模型中测试皮内注射表达ic++的aav血清型6后光施加的治疗作用。如上文参考图1-3b所述，测定6周龄c57bl6小鼠的机械阈值水平。参考图7a-7c，接着，如前述，借助慢性压迫损伤产生神经病理性疼痛表型；参考bennettgj,xieyk.pain.1988apr；33(1):87-107，aperipheralmononeuropathyinratthatproducesdisordersofpainsensationlikethoseseeninman，所述文献通过引用方式完整并入本文作为参考。简而言之，借助鼻罩输送1.5％至2.5％异氟烷，麻醉小鼠。对大腿上皮肤进行消毒准备后，产生一个1cm切口以暴露股四头肌。通过钝性剥离暴露坐骨神经并且随后通过置入三根彼此相距1mm距离松散结系的6-0羊肠缝线来压迫。缝合封上皮肤并允许动物恢复。评估小鼠的机械阈值水平，揭示出指示神经病理性疼痛的机械阈值水平大幅下降。悬浮于5ulpbs中的1x10¹¹vg表达ic++的aav血清型6如实施例1中所述那样皮内注射入爪中。产生溶媒注射组作为对照。三周后，如实施例1中所述那样，在蓝光存在或不存在时评估机械阈值水平。此外，还在通过与发射594nm光的激光器连接的光纤供应的2mw/mm²黄光存在下测试动物。黄光不激活ic++通道并且充当波长特异性的对照。我们观察到，施加蓝光升高了载体注射组的机械阈值水平，但不升高溶媒注射组的机械阈值水平。另外，黄光不影响机械阈值水平。因此，皮内递送表达ic++的aav6后的光施加抑制小鼠中的神经病理性疼痛。

在行为实验后，如上文参考图4a-图5所描述那样，处死aav6注射的小鼠并且评估转导率。参考图7d，将这些转导率对蓝光和无光之间aav6注射的小鼠的机械阈值差异(即治疗作用)作图。我们观到，转导率和治疗作用之间的相关性存在趋势(r²＝0.223)。

参考图8a-图8b，说明了转基因中导致受限表达和受限治疗作用的aav透皮递送的配置和方法的多个方面。在这个实施方案中，产生小鼠组以借助组织学分析法检查皮内递送的受限治疗作用。如上文参考图6a-图6d所述那样，在出现神经病理性疼痛的小鼠中进行表达ic++的aav血清型6的皮内注射。参考图8a，指出，对于施用载体，将病毒注射入后爪的外侧跖面，并且未观察到病毒溶液泄漏至后爪的内侧跖面上。注射病毒后2周，在蓝光存在或不存在时，在后爪的外侧表面和内侧表面上评估动物的机械阈值水平。参考图8b，如预期的那样，我们观察到在注射部位(外侧爪)测试动物时，蓝光减少疼痛。但是，在内侧爪上测试动物时，我们未观察到作用。

参考图9a-图9c，产生小鼠组以借助组织学分析法检查皮内递送的受限表达。如实施例1中所述，将一个小鼠组(n＝5)用5ulpbs中的1x10¹¹vg表达ic++的aav6注射入后爪的外侧足底。如前述，将第二小鼠组(n＝5)用5ulpbs中的1x10¹¹vg表达ic++的aav6注射入坐骨神经；参考iyersm,montgomerykl,townec,leesy,ramakrishnanc,deisserothk,delpsl.virallymediatedoptogeneticexcitationandinhibitionofpaininfreelymovingnontransgenicmice.natbiotechnol.2014mar；32(3):274-8，所述文献通过引用方式完整并入本文作为参考。简而言之，如参考图7a-7d所述那样，暴露坐骨神经，使用35g斜面针注射载体溶液，并且随后用缝线缝合皮肤。注射后三周，将两个小鼠组用荧光逆行示踪剂(固蓝)皮内注射入后爪的外侧足底。五天后处死小鼠并且如实施例2中所述处理drg供组织学用。如预期的那样，神经注射导致比皮内注射更高的表达水平，分别转导大约20％和1.5％。但是，皮内递送导致比神经注射更高的固蓝共染色水平，分别是大约21％和2.5％(图8c)。总之，该数据表明，透皮输送aav导致转基因的受限表达和随后受限的治疗作用。

参考图10，说明了导致等同水平感觉神经元转导的自我互补性aav透皮递送的配置和方法的多个方面。在这个实施方案中，在巨细胞病毒(cmv)启动子控制下表达绿色荧光蛋白(gfp)的自身互补和单链的aav血清型6购自virovekinc(hayward,ca)。如上文参考图4a-图5所述，将4x10¹²vg每种载体皮内注射到大鼠的后爪(每组n＝4)。此外，将相同剂量的载体皮内注射到大鼠的背部上，对应于肩胛骨以上区域。两周后处死动物并且如实施例2中所述那样处理供组织学用。这里，我们观察到gfp在具有自身互补和单链的aav血清型6的动物的drg中表达。这些结果显示自身互补和单链的aav能够在皮内递送后转导drg。

一个实施方案涉及一种通过改变哺乳动物中支配组织区域的感觉单元的功能，治疗或预防组织区域的不利感觉反应或感觉反应缺少的方法，所述方法包括：确定具有、将具有感觉反应缺少或正缺少感觉反应的组织区域；向确定的组织区域皮内或皮下施用具有选自aav毒株1、aav毒株6和aav毒株8的外壳蛋白的腺相关病毒，其中病毒基因组编码至少一种外源蛋白；在靶向的感觉单元中表达该外源蛋白；并且因该外源蛋白的表达而改变靶向的感觉单元的功能以治疗或恢复感觉反应，同时不影响附近感觉单元的功能。外源蛋白可以是光响应性蛋白并且该方法还可以包括使靶向的感觉单元暴露于光。光响应性蛋白可以是刺激性视蛋白。刺激性视蛋白可以选自chr2、c1v1-t、c1v1-tt、catch、vchr1-sfo和chr2-sfo。光响应性蛋白可以是抑制性视蛋白。抑制性视蛋白可以选自nphr、enphr1.0、enphr2.0、enphr3.0、mac、mac3.0、arch、archt、ichr、ic1c2、ic++、swichr++和jaws。外源蛋白可以是通过降低电兴奋性或通过调节作为疼痛起因的受体、神经递质、离子通道、第二信使系统和炎症生物化学介质而减少疼痛的一种蛋白质。外源蛋白可以选自p2x、dor、nav1.7、nav1.8、cav1.2、nr2b、machr亚型m2、machr亚型m3、machr亚型m4、nts2、homer1、shank1、trpv1、dream、ccr2、gdnf、nr2b、pkcγ、toll样受体4、nmda的nr1亚基、连接蛋白43、gaba、内啡肽和配体相关g蛋白。不利感觉反应可以选自急性疼痛、慢性疼痛、异常性疼痛、异位性疼痛、神经病理性疼痛、搔痒和感觉异常(parathesia)。感觉反应的缺少可以是麻木。感觉反应的缺少可以是饱腹感(afeelingofsatiation)。aav可以是自身互补的。

另一个实施方案涉及一种通过改变哺乳动物中支配组织区域的感觉单元的功能，治疗或预防组织区域的不利感觉反应或感觉反应缺少的方法，所述方法包括：确定具有、将具有感觉反应缺少或正缺少感觉反应的组织区域；向确定的组织区域皮内或皮下施用包含选自aav毒株1、aav毒株6和aav毒株8的外壳蛋白的腺相关病毒，其中病毒基因组编码至少一种导致rnai的分子；在靶向的感觉单元中表达rnai分子；并且因rnai表达而改变靶向的感觉单元的功能以治疗或恢复感觉反应，同时不影响附近感觉单元的功能。不利感觉反应可以是疼痛并且rnai可以是对减少选自以下的蛋白质的表达特异的：p2x、dor、nav1.7、nav1.8、cav1.2、nr2b、machr亚型m2、machr亚型m3、machr亚型m4、nts2、homer1、shank1、trpv1、dream、ccr2、gdnf、nr2b、pkcγ、toll样受体4、nmda的nr1亚基和连接蛋白43。不利感觉反应可以选自急性疼痛、慢性疼痛、异常性疼痛、异位性疼痛、神经病理性疼痛、搔痒和感觉异常。感觉反应的缺少可以是麻木。感觉反应的缺少可以是饱腹感。不利感觉反应可以是慢性疼痛并且可以通过对nav1.7特异的ddrnai实现rnai。aav可以是自身互补的。

另一个实施方案涉及一种通过改变哺乳动物中支配组织区域的感觉单元的功能，治疗组织区域中神经病理性疼痛的方法，所述方法包括：确定具有不利神经病理性疼痛的组织区域；将包含毒株6外壳蛋白的腺相关病毒皮内或皮下施用至确定的组织区域中，其中病毒基因组编码视蛋白ic++；在靶向的感觉单元中表达ic++并使感觉单元暴露于光；并且减少受该感觉单元支配的组织区域中的神经病理性疼痛，同时不影响附近感觉单元的功能。aav可以是自身互补的。

另一个实施方案涉及一种通过改变哺乳动物中支配组织区域的感觉单元的功能，治疗组织区域中躯体浅表疼痛的方法，所述方法包括：确定具有不利躯体浅表疼痛的组织区域；将包含毒株6外壳蛋白的腺相关病毒皮内或皮下施用至确定的组织区域中，其中病毒基因组编码ic++；在靶向的感觉单元中表达ic++并使感觉单元暴露于光；并且减少受该感觉单元支配的组织区域中的躯体浅表疼痛，同时不影响附近感觉单元的功能。aav可以是自身互补的。

就转移遗传物质进入和/或跨过皮肤各层而言，在某些实施方案中，针对角质层(“sc”)的结构是有利的。皮肤是有高度免疫反应性的组织，其含有大量抗原呈递细胞、尤其在表皮内如此。角质层进一步提供物理屏障，阻止摄取大部分局部应用的物质实体。为了增强穿透皮肤的渗透作用，可能需要将本文公开的治疗剂直接注射入组织或者可以移除或改变角质层以提供达到下方组织的更直接通路。我们将采用术语递送靶来谈及待输注以治疗剂的细胞、细胞组分或组织。

可以使用多种方法，移除角质层，所述方法包括但不限于胶带剥离法、皮肤磨削术、微皮肤磨削术、脱毛化合物(如nair)和激光消融术。

可以使用多种方法，改变角质层的通透性，所述方法包括但不限于：超声促渗、离子导入、电穿孔、微皮肤磨削术、微针、激光消融(包括分层激光消融)和光穿孔法(激光诱导)。

直接穿透表皮并直送药剂至真皮的配置包括但不限于：针、微针和无针注射枪(抛射体递送)。

已经引入胶带剥离作为移除和研究sc细胞的手段，其中通过反复应加粘性赛璐酚胶带至皮肤表面移除sc的连续层。为了实施本发明，可以通过以下方式进行胶带剥离：施加粘性胶带(如3mblenderm外科胶带)至患者的洁净皮肤，随后用力按压固定它并且在移除前允许它停留≥10秒。这个过程可以在每个预期位置重复大约5次以移除至少一部分、经常绝大部分sc。尽管这种方法存在不可忽略的个体间变异性，术中显微术如使用从lucidinstruments,inc.可获得的vivoscope(rtm)产品的共聚焦扫描激光显微术(clsm)可以用来确定终点。在clsm下，sc可能因其不同的折射率而显得比下方组织更亮，并且因此提供检测sc充分剥离的稳健手段。

皮肤磨削术是一般使用具有粗糙边缘(或磨石或铰刀)的钢丝刷或金刚石轮移除皮肤上层的技术。刷子或磨石快速转动，脱去并弄平(或磨削或皮肤平整(dermaplaning))皮肤的顶层。微皮肤磨削术是意在仅影响sc的非外科技术，并且经常使用移动的刚玉或氧化铝晶体的液态浆液或粉末，其中将所述液态浆液或粉末横跨皮肤表面拖曳并进入真空腔体而非刷子或轮。可以调节真空压力和探测器区以调整影响。对于深度皮肤磨削术，清洁并标记待处理的区域。在治疗之前，局部麻醉药(如利多卡因)通常用来使皮肤麻木，并将冰袋施加至皮肤直至30分钟。如果麻醉药和冰袋未令皮肤足够紧致，则冷冻(深冷)喷雾剂有时可以用来硬化皮肤以更深磨削。微皮肤磨削术技术相似，但是该操作具有小得多的剧烈程度，并且可能不需要使用麻醉药。但是，使用冰袋或深冷剂硬化皮肤可以改善微皮肤磨削过程的功效和总效率。

脱毛化合物也可以用来移除患者皮肤的至少一部分sc和毛发。常见的有效成分是巯基乙酸钙或巯基乙酸钾，它们破坏角蛋白中的二硫键并弱化毛发，从而在毛发从毛囊冒出情况下容易地刮下它。由于表皮还富含角蛋白，与脱毛化学物接触将造成刺激作用，这转而可以起到以下作用：疏松sc并引起治疗剂通透性增加以渗入递送靶或中间组织。

激光消融术利用激光移除皮肤的上层并且暴露递送靶或提供到达它的更直接通路。分层消融涉及小消融坑样式而非剥离整个表面。激光消融的深度是所用激光波长(l)脉冲能量和脉冲持续时间的函数。可以使用例如在等于约2.94μm的波长运行的er:yag激光器以脉冲持续时间≤1ms和适宜的光束大小在组织上产生小至直径100μm及深至1.5mm的孔，以实现在约1j/cm²的消融阈值以上选择性移除组织。过长的脉冲持续时间可以导致消融坑周围的组织并行受热和凝固，这可能抑制渗入递送靶。通过非限制性例子，使用200mm工作距离的+200mm焦距单透镜，来自铥纤维激光器的波长约1920nm准直光(水吸收系数＝约126cm^-1)的40μj、400μs脉冲可以在皮肤表面上聚焦成μm点，并且产生的深消融坑。可以在皮肤表面手工或使用扫描仪光学地移动激光点，如美国专利号7,824,896中已经描述，所述文献通过引用方式完整并入本文作为参考。

抛射体、“生物射弹”或基因枪递送使用压力可调的氦气体脉冲将dna包覆、rna包覆或生物材料包被的金微载体从小塑料筒的内壁直接扫入靶细胞。所谓的基因枪已经在研究神经变性病(如阿尔茨海默病)的影响中用来递送质粒至大鼠drg神经元作为药学先驱。市售系统的例子是becton-dickinson,inc.生产的helios(rtm)基因枪产品。它是提供快速和直接体内转染入一系列靶的手持设备。可以使用woods和zito在doi:10.3791/675中描述的一般方法，进行生物射弹粒子的制备，所述文献通过引用方式完整并入本文作为参考。

电穿孔(或电泳)背后的基础是细胞的质膜，或用电场施加脉冲时，一组相邻细胞将伸展并变得透化，从而药物可以更轻易地进入递送靶。可以通过以下方式实现体内电穿孔：在皮肤上安置至少一种治疗剂，随后对含有至少一种治疗剂的皮肤区域内部或与之毗邻的也置于皮肤上的电极施加脉冲。随后可以通过可能产生短暂渗透性或甚至产生孔，将治疗剂引入细胞或其他递送靶或散在的组织。

离子运载法(ionophoration)(或离子导入)类似于电穿孔；然而，相比电穿孔中所用，它使用持续时间较长的较弱电场。

声致穿孔法(sonoporation)类似于电穿孔，其中dna沿电场受电动力驱动。声致穿孔法可以由被动扩散介导。转移效率可以取决于超声频率和强度。低频超声照射可以造成细胞膜的机械扰动，并且可以允许摄取空化泡附近的大分子。这些泡的塌陷可以引起细胞膜或其他递送靶或散在组织的通透性升高，如因细胞膜中产生小孔引起。这转而可以引起膜短暂透化。使用超声在递送靶或散在组织中形成这种小孔可以允许向细胞转移dna/rna。这种现象称作声致穿孔。声致穿孔法使用超声波打乱脂质，从而允许递送靶或散在组织的通透性升高。微泡的存在可以减少空化阈值。一个类型的微泡造影剂是充以气体并用壳稳定的球状体。一种这样的回声生成剂，即，来自gehealthcare,inc.的optison(rtm)(填气脂质微球体的悬液)，可以与载体组合使用，以借助微泡增强的空化引起的较大压力增强递送功效。声致穿孔法还可以刺激aav的内吞并增强基因转移效率。备选地，替代脂质泡或除其之外，也可以使用中空二氧化硅微球体来增强空化。这样一个实施方案是氨基官能化的大小范围在约1μm和约10μm之间的中空二氧化硅微球体。备选地，可以使用聚乙二醇改性的含有全氟丙烷的脂质体作为回声生成剂以增强空化。通过非限制性例子，在约2和约4mhz之间、约0.5w/cm2和4w/cm2之间的超声及约1％和约10％之间的占空比(dutycycle)可以与约2％至约10％之间的optison对靶区域的体积分数联合应用约30秒至约4分钟，以改善治疗剂的透皮递送。不利的加热可能在较高的占空比时出现。也可以使用阳离子聚合物作为基因递送载体，因为它们可以将dna浓缩成小粒子并可以促进内吞摄取。这些阳离子聚合物之一是聚乙烯亚胺(pei)。相对于低分子量pei，可以优选分子量范围在约5kda和约25kda之间的pei。对于基因递送，低分子量pei可能较低效，原因在于每分子的正电荷数量较少，这可能令这类pei配置难以适当地浓缩带负电荷的dna分子。

激光诱导法(或光穿孔法或光致穿孔(photoporation)或激光转染(laserfection)或光注射(optoinjection)或光转染(opticaltransfection)或光诱导的对流跨膜转运)，使用激光脉冲，通过类似于电穿孔和声致穿孔的机制，暂时升高递送靶或散在组织的渗透性，但是使用光能产生空化。现有的光穿孔法一般利用可以用来产生等离子体介导空化事件的短脉冲激光。如关于声致穿孔法所述那样，这些泡的塌陷可以引起细胞膜或其他递送靶或散在组织的通透性升高，如因细胞膜中产生小孔引起。通过非限制性例子，配置成实施本发明的系统可以利用近红外激光以产生持续时间10ns的脉冲，其中按≥50j/cm²的能量密度指引所述脉冲至递送靶或散在组织的表面，所述能量密度可能为引起介电击穿并造成后续空化所需要。类似地，光学扫描系统可以用来指引光束至多个位置，如上文相对于激光消融所描述。当然，也可以使用脉冲持续时间较短的激光，但是对短于约100ps的脉冲持续时间，这类系统的成本大幅度增加。不同于一般涉及体外单个细胞光穿孔的大部分光转染应用，本发明的一个实施方案可以寻求用单次曝光照射大面积皮肤以检查多种递送靶和/或散在组织。这个实施方案可以配置成利用q转换的nd:yag激光器，所述激光器提供约1/2ns至约100ns之间的脉冲持续时间和约1/10j至约100j/脉冲的输出能量。这可以借助光纤或铰接臂装置输送至递送靶或散在组织，其中所述的光纤或铰接臂装置止于机头中，以将系统的输出定位到递送靶或散在组织上并且提供超过激光诱导水分解阈值的影响，例如，如alfredvogel在doi:1077-260x(96)09598-6中所述，所述文献通过引用方式完整并入本文作为参考。

在一个实施方案中，在阵列中(如从3m公司可获得的中空微结构化透皮给药系统(rtm))或在辊上(如从dermarollersystemltd可获得的dermarollersystemrtm)包含的微针可以用来破坏角质层(sc)。微针装置可以如此配置，从而其针具有约50μm和约200μm之间的直径和约50μm和约3mm之间的高度。微针可以用来在角质层下方注射并注射入表皮和/或真皮，或用来给sc和/或表皮打孔以便后续施用治疗剂。在一些情况下，避开皮肤-表皮结合部附近的高度血管化区域可能是优选的，以使暴露浓集至神经组织，并且因此可以使用长度大于和/或小于表皮厚度的针头。

备选地，微针可以按照名义上均匀的样式分布在2cm宽×2cm直径圆柱辊的顶部。如报道，在相同皮肤区域上应用10至15次后，利用70μm直径针的这种微针辊的常见用法产生约240个穿孔/cm²的穿孔密度。治疗剂可以在sc穿孔后施加至皮肤。至少部分地包含治疗剂的封闭敷料也可以施加至处理的皮肤。

备选地，可以用添加与针连通的中央流体室配置微针辊。中央流体室可以还含有治疗剂并使其在微针操作期间分配治疗剂。可以进一步控制药剂的压力和/或流动以确保其递送。

透皮贴剂已经用于施用可以穿过皮肤轻易吸收的小分子亲脂药物。在一个实施方案中，一旦至少部分地例如通过上述方法之一绕过角质层屏障，也可以使用透皮贴剂。

前述的和通过引用方式并入的towne等人公开(us20160030765或‘765公开)描述了跨过或穿过各种组织层(如皮肤各层)照射的多种配置和方法。备选地，更“被动”的系统可以用来向靶提供光。电动系统(如前述并入的'765公开中描述的那些)可以在无基本上独立壳体的情况下使用，并且更直接地置于靶部位上。这些系统可以配置成按特定强度和/或占空比等照射组织。可以借助软件(如本文中详述)或使用独立组件实现照射参数的配置。这种独立组件可以按照比完全可编程系统更有成本效益的方式制作，并且本身可以更轻易地弃去及再循环。某些视蛋白(如阶跃的视蛋白)的低占空比要求可能更顺应这类配置，原因在于它们的量子效率相对高。

例如，如图11(等同于‘765公开的图135)中所示，led阵列可以用于照射治疗靶的表面，如皮肤。在这个描述性的示例性实施方案中，led的2-维阵列由发射器em组成，并且基座b构建在基底sub上，其含有具有电流由输送区段dsx提供的电路层(circuitlayer)、接触层(contactlayer)和支持层(backinglayer)。在这个实例中，几排led以一系列并行的配置排列，尽管其他配置也在本发明的范围内。发射器em可以包含表面安装led，如例如，luxeonz系列，或nichia180a，157x系列。发射器em可以驻留在基座b上，以形成电连接。接触层可以由名义上透明的、软的、柔性材料制成，如硅酮、pdms或其他这样的材料；其可以给患者提供一定水平的舒适性。可以对接触层的厚度进行配置，以在组织表面提供名义上均匀的照射。例如，使用来自luxeon或cree的led，间隔4mm(中心-到-中心)，使用2.5mm厚的硅酮片，照射可以均匀至10％峰谷值内。电路层可以是单层的基于卡普顿(kapton)的柔性电路，具有配置的痕迹，以携带至少部分基于拓扑结构、led数量及其峰值功率需要的电流。可以针对特定的治疗区域ta选择led的数量。支持层可以由柔性与接触层匹配的材料构成，但不需要是透明的，如buna或其他橡胶和/或高分子材料。可以选择接触层和支持层来具有提高的导热性，以限制由于led的电效率低下和由于组织色素沉着的并行加热的光热效应引起的组织加热。然而，应当注意到与传统激光皮肤病程序相比，皮肤冷却对于本发明的光遗传处理而言是个较小的问题，因为使用的辐照度比用于传统激光皮肤病程序的那些低得多；如去除纹身、血管损伤光热疗法和脱毛。这些传统疗法使用从5ns至500ms的脉冲暴露和1至100j/cm²的表面通量，其对应于50mw/mm²至20mw/mm²的大范围峰辐照度，尽管暴露时间短和脉冲重复率低。此外，盖子cover可以用于保持光学表面在使用前的清洁。其备选地可以用于封闭粘合剂，如绷带，用于固定于组织表面。递送段dsx可以收集至带连接器中，用于连接至治疗系统的剩余部分，如图12中所示。

图12(等同于‘765公开中的图136)涉及与以上关于图98所述的施加器一起使用的示例性治疗装置。施加器a，20mm宽和40mm长的平板式施加器，如关于国际申请号pct/us2013/000262(公开号wo/2014/081449)(所述文献通过引用的方式完整并入)的图18和图21-图23更详细描述，布署在靶组织n表面附近。电力经由递送段ds递送至施加器a，以给驻留在施加器a中的led提供动力。可以配置所得到的光场，以提供0.1-40mw/mm²的表面强度范围内的靶组织照射，并且可以取决于以下的一个或多个因素；使用的特定视蛋白、其在组织内的浓度分布、组织的光学性能和靶结构的大小，或其在较大组织结构内的深度。系统可以以脉冲模式运行，其中脉冲持续时间可以为0.5ms至1s，通常10ms的脉冲持续时间对于抑制性通道是有效的。此外，脉冲重复频率(prf)可以配置为0.1hz至200hz，通常1hz的prf对于抑制性通道是有效的。因此，占空比范围为0.005％至100％，通常1％的占空比对于抑制性通道是有效的。尽管为了本图的简洁和清楚没有显示，但如果与结构内的光穿透深度相比时，其是大的靶结构，可以将多个施加器和/或递送段用于特定靶结构。递送段ds可以配置成带状电缆。递送段ds可以进一步包含起伏波动u，其可以提供应力缓解。递送段ds可以经由连接器c1可操作地连接壳体h，并且经由连接器c2连接施加器。电力和/或电流可以通过控制器cont来控制，并且可以配置如光学强度、暴露时间、脉冲持续时间、脉冲重复频率和占空比这样的参数。为清晰起见，壳体h内部显示的控制器cont是相对于图10更详细描述的控制器的简化形式。外部临床医生编程器模块和/或患者编程器模块c/p可以通过遥测模块tm，借助天线ant通过通讯连接cl与控制器cont通讯。电源ps，为清晰起见未显示，可以使用外部充电器ec无线再充电。另外，外部充电器ec可以设置成驻留在支持装置mountingdevice内部。支持装置mountingdevice可以是马甲，如针对这个示例性实施方案特别充分地设置。外部充电器ec以及外部临床医生编程器模块和/或患者编程器模块c/p和支持装置mountingdevice可以位于体外间隙esp内部，而系统的剩余部分被植入并且可以位于体内间隙isp内部。外部充电器ec也可以是ac适配器，如通过点线和通用ac符号所示。

图32中描述了一个框图，所述框图描述一个实例壳体h的各组件。在这个实例中，植入式刺激器包括处理器cpu、存储器m、供电电源ps、遥测模块tm、天线ant和驱动电路dc用于光刺激发生器。为简洁和清晰起见，显示与一个递送段dsx连接的壳体h。它可以是如下含义的多通道装置，即它可以配置成包含可以输送不同光输出的多条光路(例如，多个光源和/或光波导管或导管)，其中某些光输出可以具有不同波长。递送段可以为从壳体可拆卸或是固定的。

存储器(mem)可以存储由处理器cpu执行的指令和/或从传感器获得并由传感电路sc处理的光学数据和/或传感器数据，如电池水平、放电率等，和/或关于患者治疗的其他信息，其中所述传感器包括位于壳体内部的传感器和部署在壳体(h)外部的传感器，可能在施加器a中，如光传感器和温度传感器。处理器(cpu)可以根据存储于存储器(mem)中的多个程序或程序组中选择的一个或多个程序或程序组，控制驱动电路dc向光源(未显示)输送功率。如先前所描述的，光源可以对于壳体h是内部的，或远距离位于施加器(a)中或其附近。存储器(mem)可以包括任何电子数据存储介质，如随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、电可擦除可编程rom(eeprom)、闪存等。存储器(mem)可以存储程序指令，其中当由处理器(cpu)执行时，所述程序指令引起处理器(cpu)执行授予处理器(cpu)和其子系统的多种功能，如决定光源的脉冲调制参数。

根据本公开中描述的技术，存储器(mem)中存储的信息可以包括关于患者先前已经接受过的治疗的信息。根据本公开，存储这类信息对后续治疗是有用的，例如，以使临床医生可以提取存储的信息以确定在他/她最后观察期间向患者施加的疗法。处理器cpu可以包括一种或多种微处理器、数字信号处理器(dsp)、专用集成电路(asic)、现场可编程门阵列(fpga)或其他数字逻辑电路。处理器cpu控制植入式刺激器的运行，例如，控制刺激发生器以根据从存储器(mem)取出的一个选定程序或程序组输送刺激疗法。例如，处理器(cpu)可以控制驱动电路dc以输送光学信号，例如，如刺激脉冲，其中强度、波长、脉冲宽度(如果适用)和速率由一个或多个刺激程序指定。处理器(cpu)还可以控制驱动电路(dc)，借助递送段(dsx)的子集有选择地输送刺激，并且刺激由一个或多个程序指定。如前述的，不同的递送段(dsx)可以指向不同的靶组织部位。

遥测模块(tm)可以包括允许植入式刺激器和临床医生编程器和患者编程器(c/p)每者之间双向通讯的射频(rf)收发器。遥测模块(tm)可以包括各种形式的天线(ant)。例如，天线(ant)可以由嵌入与医疗装置连接的壳体中的导电线圈或金属丝形成。备选地，天线(ant)可以安装在携带植入式刺激器的其他组件的电路板上或采取电路板上电路迹线的形式。以这种方式，遥测模块(tm)可以允许与控制器/编程器(c/p)通讯。考虑到能量需要和适度的数据速率要求，遥测系统可以配置成使用电感耦合以提供遥测通讯和用于再充电的功率，不过出于解释性目的，图10中显示独立的再充电电路(rc)。

针对患者和/或医师的外部编程装置可以用来改变已植入壳体的设置和性能。类似地，植入的装置可以与外部装置通讯以传递关于系统状态和反馈信息的信息。这可以配置成基于pc的系统或单独系统。在任何一种情况下，系统必须借助遥测模块(tm)的遥测电路和天线(ant)与壳体通讯。如适宜，患者和医师均可以利用控制器/编程器(c/p)修改刺激参数如治疗持续时间、光强度或振幅、脉冲宽度、脉冲频率、脉冲群长度和脉冲群速率。

一旦建立通讯连接(cl)，mmn编程器/控制器和壳体之间的数据传输可以开始。这类数据的实例是：

1.从壳体至控制器/编程器：

a.患者用法

b.电池寿命

c.反馈数据

i.装置诊断(如发射器对面的光传感器直接测量光递送)

2.从控制器/编程器至壳体：

d.基于装置诊断的更新的光照水平设置

e.脉冲方案的改变

f.嵌入式电路的再配置

i.fpga等

作为非限制性实例，低功率和/或低频率近场通讯(如zarlink/microsemi产生)可以用于遥测，以及蓝牙、低能量蓝牙、zigbee等。

较被动系统的另一个例子是这样的一个系统，其包含发光物质而非图11和图12的电激发光源，但是可以按照类似于对施加器a所示的方式容纳并且不需要驱动或控制电子部件或其连接。这种配置的一个非限制性例子是使用优势发射蓝光的化学发光性过氧化草酸酯氧化反应，如双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯(tcpo)+h2o2。备选地，另一个非限制性实施方案利用优势发射蓝光的鲁米诺+h2o2氧化化学发光反应。这两种化学发光系统均提供在450nm及附近的输出，这适于激活基于通道视紫红质的视蛋白，如ic++和swichr。可以使得照射水平为大约0.3mw/mm²，并且镜化盖可以用来重定向光，其中指引所述光远离靶返回镜化盖。也可以使用淬灭、稳定和催化化合物以延长并稳定化光发射。这样一个例子是使用基于tcpo的溶液的以下配方。15ml乙酸乙酯、3mg9,10-双(苯乙炔基)蒽、1g乙酸钠和800mgtcpo。这可以与3ml过氧化氢混合以启动反应。施加器的设计和配置可以基本上类似于由电激发光源组成的那些，如前述并入的授予towne等人的'765公开中的图26和图98的led。

类似地，替代上文描述的tcpo混合物或除其之外，可以使用，9,10-双(苯乙炔基)蒽(bpea)和/或2-氯-9,10-双(苯乙炔基)蒽以调节光的输出能谱以用于不同的视蛋白。

这些基于化学发光的系统中的任一者可以配置成利用化学组分之间使用前可能受损的物理隔离或屏障，如在施加器a中图11中所示电路层占据处或其附近的脆性聚合物层。这种配置的例子是将反应组分至少之一物理地分隔入某区室，如含有如果拉伸就撕裂开的部分厚度穿孔的硅氧烷袋。图13显示这种配置的例子，类似于图11的配置，其中施加器a包含进一步配置成遭受机械应力时(如扭动或牵拉)破裂并且因而释放至少一种反应物以允许反应物混合以启动化学发光反应的反应物容量。

本文中描述了本发明的多个示例性实施方案。在非限制性含义下参考这些实施例。提供它们以显示更广适用的本发明方面。可以对描述的本发明做出各种改变并且可以替换等同物而不脱离本发明的真实精神和范围。此外，可以作出许多修改以使得特定情形、材料、材料组成、方法、加工行为或步骤适应于本发明的目的、精神或范围。另外，如本领域技术人员将领会，本文所描述和展示的每种个体变型具有可以轻易地与其他几个实施方案的任一者的特征分离或与之组合的独立组分和特征，而不脱离本发明的范围或精神。全部这些修改均意图处于与本公开相关的权利要求的范围之内。

用于实施主题诊断流程或干预流程的所述任何装置可以在包装的组合中提供用于执行这类干预。这些提供的“试剂盒”还可以包含使用说明书并包装在如通常用于此目的无菌托盘或容器中。

本发明包括可以使用主题装置进行的方法。所述方法可以包括提供这种合适装置的行为。这类提供可以由最终使用者进行。换而言之，“提供”行为仅需要最终使用者在主题方法中获得、取得、接近、定位、建立、启动、加电或提供必要装置的另外行动。本文中描述的方法可以按所述事件的逻辑上可能的任何顺序以及按事件的所述顺序实施。

上文已经阐述了本发明示例性方面，连同关于材料选择和制造的细节。对于本发明的其他细节，这些细节可以联系以上参考的专利和出版物来理解，以及是本领域技术人员通常已知或理解的。根据如通常或逻辑上使用的附加动作，就基于方法的本发明各方面，同样可以适用。

此外，尽管已经参考任选并入多种特征的几个实施例描述本发明，但是本发明不意在限于被描述或显示为相对于本发明的每种变型所构思的那个实施例。可以对描述的本发明做出多种改变并且可以替换等同物(无论是否在此描述或为了简洁而不包括)而不脱离本发明的真实精神和范围。此外，在提供值范围的情况下，应当理解，本发明范围内涵盖在这个范围的上限和下限之间的每个居间值或所述范围中任何其他所述值或居间值。

另外，构思可以单独或与本文所述的任一个或多个特征组合情况下阐述所述的本发明变型的任何任选特征并对其要求权利保护。对单个事项的提及包括存在多个相同事项的可能性。更具体地，如本文和相关的权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”、“所述”和该”包括复数称谓，除非另外专门指出。换而言之，冠词的使用允许以上描述中的“至少一个”主题事项以及与本公开相关的权利要求。进一步指出，可以起草这类权利要求以排除任何任选要素。

因而，这种声明意在充当与描述权利要求要素相联系地使用这类排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定式”限制的先行基础。

在不使用这类排他性术语的情况下，与本公开应相关的权利要求中的术语“包含”应当允许纳入任何额外要素－无论在这类权利要求中是否例举给定数目的要素，或附加特征可以视作转变这类权利要求中所述的要素的性质。除非如本文中特别限定，本文所用的全部技术术语和科学术语意在按尽可能宽的通常理解含义给出，同时维持权利要求有效性。

本发明的范围不限于提供的实例或主题说明书，而仅受到与本公开相关的权利要求用语的范围限制。