诱导抗细胞凋亡BCL-2家族蛋白的降解的化合物及其用途的制作方法
本申请要求2016年4月21日提交的美国临时申请号62/325,856的权益，所述临时申请特此以引用的方式整体并入。
本发明涉及诱导抗细胞凋亡bcl-2家族蛋白的降解的组合物及其用于治疗各种癌症及治疗和预防与在老化期间衰老细胞的积累相关的疾病和病变的方法，所述疾病和病变诸如老化、癌症、慢性阻塞性肺疾病(copd)、骨关节炎、动脉粥样硬化、神经变性疾病、糖尿病以及许多其他疾病和病变。本发明还涉及包含这些化合物的药物组合物以及其各种用途。
背景技术：
老化对于人的大多数功能缺陷和许多疾病是主要的风险因素，诸如癌症、骨关节炎、骨质疏松、动脉粥样硬化、神经变性疾病以及糖尿病。越来越多的证据证明老化与衰老细胞的积累相关联(campisi,cell120:513–522,2005；campisi,curr.opin.genet.dev.21:107–112,2011；rodier和campisi,j.cellbiol.192:547–556,2011)。据信，由于衰老细胞产生的自由基和各种炎性介质的水平增加，组织和器官中的衰老细胞积累导致组织降解和功能丧失。因此，选择性消耗衰老细胞可能是可预防癌症和和与老化相关联的各种人疾病并且使身体更新以生活的更健康的新型抗老化策略。此假说被以下最新发现支持：通过基因方法在bubr1亚效等位基因早衰小鼠模型中选择性消除p16ink4a(p16)阳性衰老细胞通过延迟若干年龄相关病变(诸如白内障、少肌症和脊椎弯曲)的发病来延长动物的健康寿命(baker等人,nature479:232–236,2011；baker等人,nature530:184–189,2016)。这些研究验证靶向衰老细胞的较大治疗性潜力。
bcl-2(b细胞淋巴瘤-2)家族蛋白是通过诱导(促细胞凋亡)或抑制(抗细胞凋亡)细胞凋亡来在调节细胞死亡中发挥关键作用的一组调节物蛋白质。抗细胞凋亡bcl-2家族蛋白(诸如bcl-2、bcl-xl、bcl-w和mcl-1)已被证明是用于开发新型抗癌剂的有吸引力的靶(lessene等人,nat.rev.drugdiscov.7:989–1000,2008；vogler等人,celldeathdiffer.2009；16:360–367；delbridge等人,nat.rev.cancer16:99–109,2016)。已报道多种bcl-2小分子抑制剂(bajwa等人,expertopin.ther.patents22:37–55,2012；vogler,adv.med.1–14,2014)。以下是在药物开发的各个阶段研究的bcl-2小分子抑制剂中的一些：abt-737(us20070072860)、navitoclax(abt-263，wo2009155386)、venetoclax(abt-199、wo2010138588)、obatoclax(gx15-070，wo2004106328)、(-)-gossypol(at-101，wo2002097053)、sabutoclax(bi-97c1，wo2010120943)、tw-37(wo2006023778)、bm-1252(apg-1252)以及a-1155463(wo2010080503)。venetoclax(选择性bcl-2抑制剂)在2016年4月被fda批准用于治疗具有17-p缺失的慢性淋巴细胞性白血病。
还发现bcl-2家族蛋白是用于开发“senolytic”药物的潜在靶，所述药物靶向衰老细胞以用于延迟老化或治疗老化相关疾病。例如，navitoclax(abt-263)(bcl-2、bcl-xl和bcl-w的抑制剂)显示选择性地杀死培养物中的衰老细胞并且消耗老化小鼠中的衰老细胞(wo2015171591；chang等人,nat.med.22:78–83,2016；zhu等人,agingcell2016)。
因此，本领域中需要开发能够选择性地靶向衰老细胞并且降解bcl-2家族蛋白的化合物。
技术实现要素：
本发明的一方面涵盖一种具包含式(ii)的化合物：
其中
r1选自由以下组成的组：
r3不存在、是键或取代或未取代的c1-c10烷基；
a不存在、是键、取代或未取代的c1-c6芳基、取代或未取代的c1-c6环烷基或取代或未取代的c1-c6杂环基团；
r4是键或取代或未取代的c1-c10烷基；
n是从0至5的整数；
r2选自由以下组成的组：
本发明还涵盖一种杀死受试者中的一种或多种衰老细胞的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的化合物。
在另一方面，本发明涵盖一种用于延迟受试者的老化的至少一种特征的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的化合物。
在又一方面，本发明涵盖一种治疗年龄相关疾病或病状的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的化合物。
在再一方面，本发明涵盖一种杀死疗法诱导的衰老细胞的方法。所述方法包括向已接受dna损伤疗法的有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的化合物并且在dna损伤疗法之后杀死正常和肿瘤组织中的疗法诱导的衰老细胞。
附图说明
图1a和图1b描绘示出xz-13906(2μm)消耗正常wi38(nc-wi38)中的bcl-xl并且电离辐射诱导衰老wi38(ir-scwi38细胞)的图。
图2a和图2b描绘示出化合物11(xz-13861)(图2a)和xz-13906(图2b)以剂量依赖性方式选择性地抑制ir-scwi38细胞但不抑制正常wi38细胞的图。
图3a和图3b描绘示出xz-14439剂量依赖性地(图3a)且时间依赖性地(图3b)消耗ir-scwi38细胞中的bcl-xl的图。
图4a和图4b描绘示出xz-15416、xz-15405、xz-15418、xz-15421和pz-15227消耗ir-scwi38(图4a)和rs4；11(图4b)细胞中的bcl-xl的图。
具体实施方式
本发明涉及能够降解bcl-2家族蛋白的化合物。二价化合物将bcl-2小分子抑制剂或配体连接到e3连接酶结合部分诸如cereblon(crbn)e3连接酶结合部分(沙利度胺衍生物诸如泊马度胺)或希林二氏(vhl)e3连接酶接合部分(诸如hif-1α衍生的含有(r)-羟脯氨酸的vhle3连接酶配体)。crbn是含有cullin-4(cul4)的e3泛素连接酶复合物cul4-rbx1-ddb1-crbn(称为crl4crbn)的一部分。沙利度胺及其衍生物(诸如来那度胺和泊马度胺)特异性地与此crbn复合物相互作用并且诱导重要的ikaros转录因子的降解。vhl是含有cullin-2(cul2)的e3泛素连接酶复合物延伸蛋白bc-cul2-vhl(称为crl2vhl)的负责转录因子hif-1α的降解的部分。衍生自hif-1α的含有(r)-羟脯氨酸的vhle3连接酶配体已被识别为具有高亲和力。二价化合物可主动地将bcl-2家族蛋白募集到e3泛素连接酶，诸如crbn或vhle3连接酶，从而通过泛素蛋白酶系统引起其降解。
申请人已发现包含选择性地结合到e3泛素连接酶的部分和选择性地结合靶蛋白的部分的化合物通过泛素蛋白酶系统引起靶蛋白的泛素化和随后的降解。因此，本公开提供用于选择性地降解bcl-2家族蛋白的组合物和方法。本发明的另外的方面在以下描述。
i.组合物
一方面，本发明的组合物包含式(i)的化合物或式(ii)的化合物。如与未修改版本相比，可制备式(i)或式(ii)的衍生物来改善效能、生物利用率、溶解性、稳定性、处理特性或它们的组合。
除式(i)的化合物或式(ii)的化合物之外，本发明的组合物可任选地包含一种或多种另外的药物或治疗活性剂。本发明的组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。另外，本发明的组合物可含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、增味剂、盐(本发明的物质本身可以药学上可接受的盐的形式提供)、缓冲剂、涂层剂或抗氧化剂。
(a)式(i)的化合物
本文提供包含式(i)的化合物：
r1-l-r2(i)
其中
r1是蛋白质靶向单元，其结合到一种或多种抗细胞凋亡bcl-2家族蛋白；
l是接头单元，其通过烷基、支链烷基、醚、硫醚、酯、胺、酰胺、氨基甲酸酯、脲、砜、芳基、杂芳基、环烷基或杂环基团共价地连接r1和r2，两端可以是相同的或不同的；接头单元可含有烷基、支链烷基、醚、硫醚、酯、胺、酰胺、氨基甲酸酯、脲、砜、芳基、杂芳基、环烷基和杂环基团中的两个或更多个基团的组合；最短长度的接头单元包含1-30个原子的长度；并且
r2是e3泛素连接酶结合单元，其结合到crbn或vhle3泛素连接酶。
(b)式(ii)的化合物
通过式(ii)描述的化合物是通过式(i)描述的化合物的子集。因此，式(i)中的r1和r2分别等同于式(ii)中的r1和r2。式(i)中的l在式(ii)中如下定义：
本文还提供包含式(ii)或其异构体的化合物：
其中
r1选自由以下组成的组：
r3不存在、是键或取代或未取代的c1-c10烷基；
a不存在、是键、取代或未取代的c1-c6芳基、取代或未取代的c1-c6环烷基、取代或未取代的c1-c6杂环基团；
r4是键或取代或未取代的c1-c10烷基；
n是从0至5的整数；
r2选自由以下组成的组：
在一个实施方案中，式(ii)的化合物包括前述式(ii)的化合物中的任一种，其中r1可以是
在一个实施方案中，式(ii)的化合物包括前述式(ii)的化合物中的任一种，其中r3可以不存在、是未取代的c1-c6烷基或取代或未取代的c3-c6酮。
在一个优选的实施方案中，式(ii)的化合物包括前述式(ii)的化合物中的任一种，其中r3可以不存在、是键、未取代的c1-c3烷基或未取代的c3-c6酮。
在又一个优选的实施方案中，式(ii)的化合物包括前述式(ii)的化合物中的任一种，其中r3可以不存在、是键、2-戊酮或未取代的c2-c3烷基。
在另一个实施方案中，式(ii)的化合物包括前述式(ii)的化合物中的任一种，其中a可以不存在、是键或取代或未取代的c1-c6杂环基团。
在一个优选的实施方案中，式(ii)的化合物包括前述式(ii)的化合物中的任一种，其中a可以不存在、是键或未取代的c5杂环基团。
在又一个优选的实施方案中，式(ii)的化合物包括前述式(ii)的化合物中的任一种，其中a可以不存在、是键或三唑。
在另一个实施方案中，式(ii)的化合物包括前述式(ii)的化合物中的任一种，其中n可以是0至3。
在一个优选的实施方案中，式(ii)的化合物包括前述式(ii)的化合物中的任一种，其中n可以是0至2。
在又一个优选的实施方案中，式(ii)的化合物包括前述式(ii)的化合物中的任一种，其中n可以是1至2。
在另一个实施方案中，式(ii)的化合物包括前述式(ii)的化合物中的任一种，其中r4可以是键或取代或未取代的c1-c10烷基。
在一个优选的实施方案中，式(ii)的化合物包括前述式(ii)的化合物中的任一种，其中r4可以是键或取代的c1-c10烷基。
在另一个实施方案中，式(ii)的化合物包括前述式(ii)的化合物中的任一种，其中r2是
在一个实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在另一个实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在又一个实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在又一个实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在又一个实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在又一个实施方案中，本公开的化合物具有式(ii)，其中r1可以是
在一个不同的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物具有式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个优选的实施方案中，本公开的化合物包含式(ii)，其中r1可以是
在一个示例性实施方案中，式(ii)的化合物包括前述式(ii)的化合物中的任一种，可选自由以下组成的组：
(c)组合物的组分
本公开还提供药物组合物。所述药物组合物包含式(i)的化合物或式(ii)的化合物作为活性成分以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
所述药学上可接受的赋形剂可以是稀释剂、粘合剂、填料、缓冲剂、ph调节剂、崩解剂、分散剂、防腐剂、润滑剂、味道掩蔽剂、调味剂或着色剂。用于形成药物组合物的赋形剂的量和类型可根据药物科学的已知原理来选择。
在一个实施方案中，赋形剂可以是稀释剂。稀释剂可以是可压缩的(即，塑性可变形的)或研磨易碎的。合适的可压缩稀释剂的非限制性实例包括微晶纤维素(mcc)、纤维素衍生物、纤维素粉末、纤维素酯(即，乙酸酯和丁酸酯混合酯)、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、玉米淀粉、磷酸化玉米淀粉、预胶化玉米淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、淀粉-乳糖、淀粉-碳酸钙、淀粉羟乙酸钠、葡萄糖、果糖、乳糖、乳糖一水合物、蔗糖、木糖、乳糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、山梨醇、木糖醇、麦芽糖糊精以及海藻糖。合适的研磨易碎稀释剂的非限制性实例包括二元磷酸钙(无水或二水合物)、三元磷酸钙、碳酸钙以及碳酸镁。
在另一个实施方案中，赋形剂可以是粘合剂。合适的粘合剂包括但不限于淀粉、预胶化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯唑烷酮、聚乙烯醇、c12-c18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖类、寡糖、多肽、寡肽以及它们的组合。
在另一个实施方案中，赋形剂可以是填料。合适的填料包括但不限于碳水化合物、无机化合物和聚乙烯吡咯烷酮。通过非限制性实例的方式，填料可以是二元和三元硫酸钙、淀粉、碳酸钙、碳酸镁、微晶纤维素、二元磷酸钙、碳酸镁、氧化镁、硅酸钙、滑石、改性淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨醇。
在又一个实施方案中，赋形剂可以是缓冲剂。合适的缓冲剂的代表性实例包括但不限于磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、tris缓冲液以及缓冲盐水盐(例如，tris缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)。
在各种实施方案中，赋形剂可以是ph调节剂。通过非限制性实例的方式，ph调节剂可以是碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠、柠檬酸或磷酸。
在另一个实施方案中，赋形剂可以是崩解剂。崩解剂可以是非泡腾的或泡腾的。非泡腾崩解剂的合适的实例包括但不限于淀粉诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶化和改性淀粉、甜味剂、粘土诸如膨润土、微晶纤维素、藻酸盐、淀粉羟乙酸钠、树胶诸如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、梧桐胶、果胶和黄蓍胶。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例包括与柠檬酸组合的碳酸氢钠和与酒石酸组合的碳酸氢钠。
在又一个实施方案中，赋形剂可以是分散剂或分散增强剂。合适的分散剂可包括但不限于淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、纯化的木纤维素、淀粉羟乙酸钠、异非晶型硅酸盐以及微晶纤维素。
在另一个替代实施方案中，赋形剂可以是防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例包括抗氧化剂诸如bha、bht、维生素a、维生素c、维生素e或棕榈酸视黄酯、柠檬酸、柠檬酸钠；螯合剂诸如edta或egta；以及抗微生物剂诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇或苯酚。
在另一个实施方案中，赋形剂可以是润滑剂。合适的润滑剂的非限制性实例包括矿物质诸如滑石或硅石；以及脂肪诸如植物脂、硬脂酸镁或硬脂酸。
在又一个实施方案中，赋形剂可以是味道掩蔽剂。味道掩蔽材料包括纤维素醚；聚乙二醇；聚乙烯醇；聚乙烯醇和聚乙二醇共聚物；单甘油酯或三甘油酯；丙烯酸类聚合物；丙烯酸类聚合物与纤维素醚的混合物；乙酸邻苯二甲酸纤维素；以及它们的组合。
在一个替代实施方案中，赋形剂可以是调味剂。调味剂可选自合成风味油和调味芳香剂和/或天然油，来自植物、叶、花、果实的提取物以及它们的组合。
在又一个实施方案中，赋形剂可以是着色剂。合适的颜色添加剂包括但不限于食品、药物和化妆品色素(fd&c)、药物和化妆品色素(d&c)或外用药物和化妆品色素(ext.d&c)。
组合物中的赋形剂或赋形剂的组合的重量分数可以是组合物的总重量的约99％或更少、约97％或更少、约95％或更少、约90％或更少、约85％或更少、约80％或更少、约75％或更少、约70％或更少、约65％或更少、约60％或更少、约55％或更少、约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约15％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约2％、或约1％或更少。
所述组合物可配制成各种剂型并且通过递送治疗有效量的活性成分的多种不同的方式施用。此类组合物可以根据需要含有常规的非毒性的药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的剂量单位制剂口服、肠胃外或局部施用。局部施用还可涉及使用经皮施用，诸如经皮贴片或离子电渗装置。如本文所用，术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌内或胸骨内注射或输注技术。药物的配制在例如gennaro,a.r.,remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingco.,easton,pa.(第18版,1995)以及liberman,h.a.和lachman,l.编,pharmaceuticaldosageforms,marceldekker公司,newyork,n.y.(1980)中讨论。在一个具体实施方案中，组合物可以是食品补充剂或者组合物可以是化妆品。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、囊片、药丸、粉剂、球剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性成分通常与一种或多种药学上可接受的赋形剂(其实例在以上描述)组合。口服制剂还可作为含水悬浮液、酏剂或糖浆施用。为此，活性成分可与以下组合：各种甜味剂或调味剂、着色剂和(如果需要的话)乳化剂和/或悬浮剂以及稀释剂诸如水、乙醇、甘油以及它们的组合。
对于肠胃外施用(包括皮下、真皮内、静脉内、肌内和腹膜内)，所述制剂可以是含水的或基于油的溶液。含水溶液可包括无菌稀释剂诸如水、盐水溶液、药学上可接受的多元醇诸如甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂和/或抗真菌剂诸如苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、氯代丁醇、酚、硫柳汞(thimerosal)等；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和/或用于调整张力的试剂诸如氯化钠、右旋糖或多元醇诸如甘露糖醇或山梨醇。含水溶液的ph可用酸或碱诸如盐酸或氢氧化钠调节。基于油的溶液或悬浮液还可包含芝麻油、花生油、橄榄油或矿物油。
所述组合物可呈现在单位剂量或多剂量容器例如密封的安瓿和小瓶中，并且可在即将使用之前仅需要添加携带的无菌液体(例如，用于注射的水)的冷冻干燥(冻干)的条件中储存。临时注射溶液和悬浮液可由无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。
对于局部(例如，经皮或经粘膜)施用，通常在制剂中包含适用于待穿透的屏障的渗透剂。适于局部施用的药物组合物可配制为膏剂、霜膏、悬浮液、洗剂、粉剂、溶液、糊剂、凝胶、喷剂、气溶胶或油。在一些实施方案中，药物组合物作为局部膏剂或霜膏施加。当以膏剂配制时，活性成分可与石蜡或水混溶式膏剂基质一起采用。可替代地，活性成分可与水包油霜膏基质或油包水基质一起配制在霜膏中。适于局部施用到眼睛的药物组合物包括滴眼剂，其中活性成分溶解或悬浮在合适的载体尤其是含水溶剂中。适于在口中局部施用的药物组合物包括锭剂、软锭剂和漱口剂。经粘膜施用可通过使用鼻喷剂、气溶胶喷剂、片剂或栓剂来实现，并且经皮施用可通过如本领域通常已知的膏剂、油膏、凝胶、贴片或霜膏来实现。
在某些实施方案中，包含式(i)的化合物或式(ii)的化合物的组合物包封在合适的媒介物中以帮助将化合物递送到靶细胞，增加组合物的稳定性或使组合物的潜在毒性最小化。如技术人员所认识到的，各种媒介物适于递送本发明的组合物。合适的结构化流体递送系统的非限制性实例可包括纳米颗粒、脂质体、微乳液、胶束、树枝状聚合物和其他含有磷脂的系统。将组合物并入到递送媒介物中的方法在本领域中是已知的。
在一个可替代的实施方案中，可利用脂质体递送媒介物。根据实施方案，鉴于其结构和化学特性，脂质体适于递送式(i)的化合物或式(ii)的化合物。一般来讲，脂质体是具有磷脂双层膜的球形媒介物。脂质体的脂质双层可与其他双层(例如，细胞膜)融合，从而将脂质体的内容物递送到细胞。这样，包含式(i)的化合物或包含式(ii)的化合物可通过包封在与靶细胞的膜融合的脂质体中来选择性地递送到细胞。
脂质体可包含各种不同类型的具有变化的烃链长度的磷脂。磷脂通常包含两个脂肪酸，其通过磷酸甘油连接至多种极性基团中的一个。合适的磷脂包括磷脂酸(pa)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酰甘油(pg)、双磷脂酰甘油(dpg)、磷脂酰胆碱(pc)以及磷脂酰乙醇胺(pe)。构成磷脂的脂肪酸链的长度可在约6至约26个碳原子的范围内，并且脂质链可以是饱和的或不饱和的。合适的脂肪酸链包括(通用名呈现在括号中)正十二烷基酸酯(月桂酸酯)、正十四烷基酸酯(肉豆蔻酸酯)、正十六烷基酸酯(棕榈酸酯)、正十八烷基酸酯(硬脂酸酯)、正二十烷基酸酯(花生酸酯)、正二十二烷基酸酯(山嵛酸酯)、正二十四烷基酸酯(木蜡酸酯)、顺-9-十六碳烯酯(棕榈油酸酯)、顺-9-十八烷基酸酯(油酸酯)、顺,顺-9,12-十八碳二烯酸酯(亚油酸酯)、全顺-9,12,15-十八碳四烯酸酯(亚麻酸酯)以及全顺-5,8,11,14-十烷四烯酸酯(花生四烯酸酯)。磷脂的两个脂肪酸链可以是相同的或不同的。可接受的磷脂包括二油酰基ps、二油酰基pc、二硬脂酰基ps、二硬脂酰基pc、二肉豆蔻酰基ps、二肉豆蔻酰基pc、二棕榈酰基pg、硬脂酰基、油酰基ps、棕榈酰基、亚麻酰基ps等。
磷脂可来自任何天然来源，并且由此可包括磷脂的混合物。例如，蛋黄富含pc、pg和pe，大豆含有pc、pe、pi和pa，并且动物脑或脊髓富含ps。磷脂还可来自合成来源。可使用具有变化比率的个体磷脂的磷脂混合物。不同磷脂的混合物可产生具有活性特性的有利活性或稳定性的脂质体组合物。以上提及的磷脂可与阳离子脂质以最佳比率混合，所述阳离子脂质诸如n-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵、1,1’-二十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸酯、3,3’-脱庚烷氧基羰花青碘化物、1,1’-双十二烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸酯、1,1’-二油基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青甲磺酸酯、n-4-(二亚油基氨基苯乙烯基)-n-甲基吡啶碘化物或1,1,-二亚油基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸酯。
脂质体可任选地包含鞘脂，其中鞘氨醇是甘油以及磷酸甘油酯或胆固醇(动物细胞膜的主要组分)的一种脂肪酸中的一种的结构对应物。脂质体可任选地含有聚乙二醇化脂质，其是共价地连接到聚乙二醇(peg)的聚合物的脂质。peg的大小可在约500至约10,000道尔顿的范围内。
脂质体还可包含合适的溶剂。所述溶剂可以是有机溶剂或无机溶剂。合适的溶剂包括但不限于二甲基亚砜(dmso)、甲基吡咯烷、n-甲基吡咯烷酮、乙腈、醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或它们的组合。
携带式(i)的化合物或式(ii)的化合物(即，具有至少一种甲硫氨酸化合物)的脂质体可通过任何已知的制备用于药物递送的脂质体的方法来制备，所述方法例如像详述于美国专利号4,241,046、4,394,448、4,529,561、4,755,388、4,828,837、4,925,661、4,954,345、4,957,735、5,043,164、5,064,655、5,077,211和5,264,618中，其公开内容特此以引用的方式整体并入。例如，脂质体可通过在含水溶液中对脂质进行超声处理、溶剂注射、脂质水合、逆蒸发或通过重复冷冻和融化进行冷冻干燥来制备。在一个优选的实施方案中，脂质体通过超声处理形成。脂质体可以是多层的，其具有许多层像洋葱，或者是单层的。脂质体可以是大的或小的。连续的高剪切超声处理往往形成较小的单层脂质体。
如对于普通技术人员显而易见的，管控脂质体形成的所有参数可变化。这些参数包括但不限于温度、ph、甲硫氨酸化合物的浓度、脂质的浓度和组成、多价阳离子的浓度、混合速率、溶剂的存在和浓度。
在另一个实施方案中，本发明的组合物可作为微乳液递送到细胞。微乳液通常是透明的热力学稳定的溶液，其包含含水溶液、表面活性剂和“油”。在此情况下，“油”是超临界流体相。表面活性剂位于油水界面处。各种表面活性剂中的任一种适于在微乳液配制中使用，包括本文所述或本领域其他已知的那些。适于在本发明中使用的含水微区通常具有约5nm至约100nm的特征性结构尺寸。这样大小的聚集体是较差的可见光散射体，并且因此这些溶液是光学上透明的。如技术人员所认识到的，微乳液可具有并且将具有多种不同的微观结构，包括球形、棒状或圆盘状聚集体。在一个实施方案中，所述结构可以是胶束，其是通常为球形或圆柱形物体的最简单的微乳液结构。胶束类似于水中的油滴，并且反胶束类似于油中的水滴。在一个可替代的实施方案中，微乳液结构是层状。它包括通过表面活性剂层分开的水和油的连续层。微乳液的“油”最佳地包括磷脂。针对脂质体的以上所详述的磷脂中的任一种适于涉及微乳液的实施方案。包含式(i)或式(ii)的化合物可通过本领域通常已知的任何方法包封在微乳液中。
(d)另外的化合物
一方面，所述组合物还包含至少一种或多种抗癌治疗剂。
化学治疗剂是指可用于治疗癌症的化合物。所述化合物可以是一般来讲影响快速分裂的细胞的细胞毒性剂，或者它可以是影响癌细胞的失调蛋白质的靶向治疗剂。化学治疗剂可以是烷基化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、抗细胞骨架剂、拓扑异构酶抑制剂、抗激素剂、靶向治疗剂、光动力学治疗剂或它们的组合。
合适的烷基化剂的非限制性实例包括六甲蜜胺、苯并多巴(benzodopa)、白消安、卡铂、卡波醌、卡莫司汀(bcnu)、苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、氯脲霉素、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪(dtic)、雌氮芥、福莫司汀、异环磷酰胺、英丙舒凡、lipoplatin、洛莫司汀(ccnu)、马磷酰胺、甘露舒凡、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、美妥替哌、氮芥(氮芥(mechlorethamine))、二溴甘露醇、尼莫司汀、新氮芥、奥沙利铂、苯芥胆甾醇、哌泊舒凡、泼尼莫司汀、雷莫司汀、赛特铂、司莫司汀、替莫唑胺、硫替派、苏消安、三亚胺醌、三乙撑蜜胺、三乙烯磷酰胺(tepa)、三乙撑硫代磷酰胺(硫替派)、三羟甲蜜胺、曲磷胺、尿嘧啶氮芥和尿多巴。
合适的抗代谢物包括但不限于氨基蝶呤、环胞苷、阿扎胞苷、8-氮杂鸟嘌呤、6-氮尿苷、卡培他滨、卡莫氟(1-己基氨基甲酰基-5-氟尿嘧啶)、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷(阿糖胞苷(ara-c))、地西他滨、二甲叶酸、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他宾、氟尿苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲(羟基尿素)、甲酰四氢叶酸(亚叶酸)、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、萘福昔定、奈拉滨、奥利默森、培美曲塞、蝶罗呤、雷替曲塞、替加氟、噻唑呋林、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤(硫鸟嘌呤(thioguanine))以及三甲曲沙。
合适的抗肿瘤抗生素的非限制性实例包括阿克拉霉素、阿柔比星、放线菌素、阿霉素、奥瑞斯他汀(例如，单甲基奥瑞斯他汀e)、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素、加利车霉素、卡柔比星、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红菌素、地托比星、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、环氧霉素(epoxomicin)、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、光辉霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、普卡霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、稀疏霉素、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、戊柔比星、乌苯美司、净司他丁以及佐柔比星。
合适的抗抗细胞骨架剂的非限制性实例包括卡巴他赛、秋水仙碱、秋水仙胺、多西他赛、埃博霉素、伊沙匹隆、巨毛霉素、高三尖杉酯碱、奥塔他赛、紫杉醇(例如，dha-紫杉醇)、紫杉烷、替西他赛(tesetaxel)、长春碱、长春新碱、长春地辛以及长春瑞滨。
合适的拓扑异构酶抑制剂包括但不限于安吖啶、依托泊苷(vp-16)、伊立替康、米托蒽醌、rfs2000、替尼泊苷以及托泊替康。
合适的抗激素剂的非限制性实例诸如氨鲁米特、抗雌激素药、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、比卡鲁胺、非那雄胺、氟他胺、氟维司群、戈舍瑞林、4-羟三苯氧胺、那洛昔芬(keoxifene)、亮丙瑞林、ly117018、米托坦、尼鲁米特、奥那斯酮、雷洛昔芬、他莫昔芬、托瑞米芬以及曲洛司坦。
靶向治疗剂的实例包括但不限于单克隆抗体诸如阿伦单抗、卡妥莫单抗、依决洛单抗、依帕珠单抗、吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥佐米星、吉妥木单抗维多汀、替伊莫单抗、瑞妥昔、利妥昔单抗、托西莫单抗以及曲妥珠单抗；蛋白激酶抑制剂诸如贝伐珠单抗、西妥昔单抗、克唑替尼、达沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、莫立替尼、尼罗替尼、帕木单抗、帕唑帕尼、索拉非尼、舒尼替尼、托西尼布以及凡德他尼；
血管生成抑制剂诸如血管抑素、贝伐珠单抗、地尼白介素、内皮抑素、依维莫司、染料木黄酮、干扰素α、白细胞介素-2、白细胞介素-12、帕唑帕尼、培加尼布、雷珠单抗、雷帕霉素(西罗莫司)、坦西莫司以及沙利度胺；以及生长抑制性多肽诸如硼替佐米、促红细胞生成素、白细胞介素(例如il-1、il-2、il-3、il-6)、白血病抑制因子、干扰素、罗米地辛、血小板生成素、tnf-α、cd30配体、4-1bb配体以及apo-1配体。
光动力学治疗剂的非限制性实例包括氨基乙酰丙酸、氨基乙酰丙酸甲酯、类视黄醇(阿利维甲酸、他米巴罗汀、维甲酸)以及替莫泊芬。
其他抗肿瘤剂包括阿那格雷、三氧化二砷、天门冬酰胺酶、贝沙罗汀、溴匹立明、塞来昔布、化学连接的fab、乙丙昔罗、乙环氧啶(etoglucid)、铁锈醇、氯尼达明、马丙考、米替福新、米托胍腙、他仑帕奈、曲贝替定以及伏立诺他。
还包括以上列出的药剂中的任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂的施用模式可以并且将根据药剂以及肿瘤或瘤形成的类型而变化。合适的施用模式在以下部分ii(d)中详述。熟练的从业人员将能够确定化学治疗剂的适当剂量。
ii.方法
本公开涵盖一种选择性地杀死样品中的一种或多种衰老细胞的方法，所述方法包括使包含有效量的式(i)的化合物或式(ii)的化合物的组合物与所述样品接触。在另一方面，本公开涵盖一种选择性地杀死有需要的受试者的一种或多种衰老细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的式(i)的化合物或式(ii)的化合物的组合物。
本公开涵盖一种选择性地杀死样品中的一种或多种癌细胞的方法，所述方法包括使包含有效量的式(i)的化合物或式(ii)的化合物的组合物与所述样品接触。在另一方面，本公开涵盖一种选择性地杀死有需要的受试者的一种或多种癌细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的式(i)的化合物或式(ii)的化合物的组合物。
选择性地杀死一种或多种衰老细胞意指本发明的组合物在相同浓度下不明显地杀死非衰老细胞。因此，抑制剂在非衰老细胞中的半数致死量或ld50可以是抑制剂在衰老细胞中的ld50的约5至约50倍高。如本文所用，ld50是杀死细胞样品中的一半细胞所需的抑制剂的浓度。例如，抑制剂在非衰老细胞中的ld50可以是抑制剂在衰老细胞中的ld50的大于约5、约6、约7、约8、约9或约10倍高。可替代地，抑制剂在非衰老细胞中的ld50可以是抑制剂在衰老细胞中的ld50的大于约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50倍高。可替代地，抑制剂在非衰老细胞中的ld50可以是抑制剂在衰老细胞中的ld50的大于50倍高。在一个具体实施方案中，抑制剂在非衰老细胞中的ld50是抑制剂在衰老细胞中的ld500的大于10倍高。在另一个具体实施方案中，抑制剂在非衰老细胞中的ld50是抑制剂在衰老细胞中的ld50的大于20倍高。
活跃地分裂的细胞向代谢活性的非分裂细胞的发展被称为“衰老”或“细胞衰老”。如本文所用，术语“衰老”和“细胞衰老”可互换使用。术语“衰老”还是指在多轮分裂之后细胞所进入的状态，并且由于细胞途径，未来细胞分离被阻止发生，虽然细胞保持代谢活性。衰老细胞可在以下方式中的一个或多个方面与其衰老前的对应物不同：1)它们阻止生长并且不能被生理性的有丝分裂原刺激再进入细胞周期；2)它们变得对于凋亡细胞死亡有抗性；并且/或者3)它们获得改变的分化功能。
相比于不可控制地生长和分裂的癌细胞，分化最多的真核细胞增殖的能力是有限的。换言之，正常细胞对于它们通过其可发展的细胞分裂的次数具有固有地确定的限度。此现象被称为“重复性细胞衰老”并且是限制细胞的增殖能力、从而阻止致瘤性转化的固有抗癌机制。衰老的另一种形式是“过早细胞衰老”。类似于重复性细胞衰老，过早细胞衰老是有丝分裂细胞的最终命运，其特征在于永久性的细胞周期停滞。然而，与重复性细胞衰老不同，过早细胞衰老不需要端粒退化并且可通过各种胁迫源诱导，所述胁迫源包括但不限于紫外光、活性氧物质、化学治疗剂、环境毒素、吸烟、电离辐射、染色质结构变形、过多有丝分裂信号传导以及致癌突变。衰老的又一种形式是疗法诱导的衰老(tis)，其是指由治疗剂引起的被强迫进入衰老状态的肿瘤细胞子集的现象。已知tis是由于某些治疗包括放疗和化疗而发展。
受试者的各种器官和组织中的衰老细胞的数量随着年龄而增加。衰老细胞的积累可驱使老化和年龄相关疾病所基于的退化。例如，老化组织中衰老细胞的积累可促成年龄相关的组织功能障碍、再生能力降低和疾病。在此情况下，衰老被认为是有害的，因为它促成组织再生和功能的衰减。作为非限制性实例，当需要增殖时，老化组织可能缺少对胁迫做出应答的能力，从而产生在老化的情况下所看到的健康降低。此模型的关键部分是在没有病变的情况下或在病变之前，显著数量的衰老细胞应随着老化存在于组织中。
(a)衰老细胞
衰老细胞可以是停止分裂但是保持代谢活性的细胞。非分裂细胞可保持存活许多周，但是不能生长/复制dna，虽然培养基中存在足够的空间、营养物质和生长因子。因此，衰老生长阻滞基本上是永久性的，因为衰老细胞不能被已知的生理刺激物刺激而进行生殖。另外，本发明的衰老细胞对于某些细胞凋亡信号可以是耐受的，并且可能获得广泛的基因表达的变化。对于细胞凋亡的抗性可解释随着年龄衰老细胞的增加。促细胞凋亡蛋白和抗细胞凋亡蛋白的操纵可致使注定通过细胞凋亡而死亡的细胞衰老，并且相反地致使注定衰老的细胞经历细胞凋亡。
本发明的衰老细胞可能由于重复性细胞衰老、过早细胞衰老或疗法诱导的衰老而是衰老的。由于复制而衰老的衰老细胞可经历大于60次群体倍增。可替代地，由于复制而衰老的衰老细胞可经历大于40次、大于50次、大于60次、大于70次或大于80次群体倍增。过早细胞衰老的衰老细胞可通过但不限于以下因素诱导：紫外光、活性氧物质、化学治疗剂、环境毒素、吸烟、电离辐射、染色质结构变形、过多有丝分裂信号传导以及致癌突变。在一个具体实施方案中，过早细胞衰老可通过电离辐射(ir)诱导。在另一个具体实施方案中，过早细胞衰老还可用ras癌基因通过异位转染诱导。疗法诱导衰老的衰老细胞可暴露于dna损伤疗法。
本发明的衰老细胞通常可以是真核细胞。衰老细胞的非限制性实例可包括但不限于乳腺上皮细胞、角化细胞、心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞(大血管)、内皮细胞(微血管)、上皮细胞、成纤维细胞、毛囊真皮乳头细胞、肝细胞、黑素细胞、成骨细胞、前脂肪细胞、免疫系统的原代细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、神经元、神经胶质细胞、可收缩细胞、外分泌上皮细胞、胞外基质细胞、激素分泌细胞、角质化上皮细胞、胰岛细胞、晶状体细胞、间充质干细胞、胰腺腺泡细胞、小肠的潘氏细胞、造血谱系的原代细胞、神经系统的原代细胞、感觉器官和外周神经元支持细胞、润湿复层屏障上皮细胞以及干细胞。在一个具体实施方案中，所述干细胞是成人干细胞。成人干细胞是维持并修复它们所存在于的组织的干细胞并且通常由它们的起源组织来指代。成人干细胞的非限制性实例包括肌肉干细胞、造血干细胞、心脏干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、肠干细胞、皮肤干细胞、脂肪衍生的干细胞、内皮干细胞以及牙髓干细胞。在一个具体实施方案中，本发明的衰老细胞是成纤维细胞。在另一个具体实施方案中，本发明的衰老细胞是造血干细胞。
另外，本发明的衰老细胞可存在于可再生组织中，包括血管系统、造血系统、上皮器官和基质。本发明的衰老细胞还可存在于老化或慢性年龄相关病变诸如骨关节炎和动脉粥样硬化的部位处。另外，本发明的衰老细胞可与良性发育异常或瘤前病灶和良性前列腺增生相关联。在一个实施方案中，本发明的衰老细胞可在dna损伤疗法之后存在于正常和肿瘤组织中。在一个具体实施方案中，衰老细胞可存在于老化或年龄相关病变的部位处。
年龄相关病变可包括通过完全地或部分地由受试者的细胞或细胞群体中的非增殖或衰老状态的诱导或维持介导的任何疾病或病状。非限制性实例包括可缺少可见的病变指示或明显病变诸如变性疾病或功能降低病症的年龄相关组织或器官衰退。例如，阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、白内障、黄斑变性、青光眼、动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、中风、高血压、特发性肺纤维变性(ipf)、慢性阻塞性肺疾病(copd)、骨关节炎、2型糖尿病、肥胖症、脂肪功能障碍、冠状动脉疾病、脑血管疾病、牙周病以及癌症治疗相关失能诸如各种组织中的萎缩和纤维化、脑和心脏损伤和疗法相关的脊髓发育不良综合征。另外，年龄相关病变可包括加速老化疾病诸如早衰综合征(即，早年衰老综合症(hutchinson-gilfordprogeriasyndrome)、韦耳纳综合征(wernersyndrome)、布卢姆综合征(bloomsyndrome)、rothmund-thomson综合征、cockayne综合征、着色性干皮病、毛发性营养不良、组合的着色性干皮病-cockayne综合征以及限制性皮肤病)、共济失调毛细血管扩张症、范科尼贫血、弗里德赖希氏共济失调、先天性角化不良、再生障碍性贫血、ipf以及其他病变。一种鉴定如本文所述的年龄相关疾病或病状的方法可包括检测衰老细胞的存在。
(b)检测衰老细胞
一方面，本发明的方法可包括检测衰老细胞。衰老细胞可在体内或在体外检测。用于体外和体内检测衰老细胞的合适的标记物在本领域是已知的。例如，检测衰老细胞的方法可包括但不限于通过并入dna染色试剂(例如，5-溴脱氧鸟苷(brdu)、3h-胸腺嘧啶脱氧核苷)检测dna复制的缺少，针对蛋白质诸如增殖细胞核抗原(pcna)和ki-67进行免疫染色，针对衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)进行组织化学染色，检测p16、p19、pai1、igfbp2、il-6、mmp13、nrg1、分化胚软骨表达-1(dec1)、p15(cdk1)和诱饵死亡受体-2(dcr2)的表达，检测细胞学标记物诸如衰老相关异染色质病灶(sahf)和衰老相关dna损害病灶(sdf)。sahf可通过dna染料诸如4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)的优先结合以及某些异染色质相关组蛋白修饰(例如，h3lys9甲基化)和蛋白质(例如，异染色质蛋白-1(hp1))的存在来检测。另外，衰老细胞可如美国专利号5,491,069和美国专利申请号2010/0086941中所述来检测。在某些实施方案中，衰老细胞通过针对sa-β-gal的组织化学染色来检测。
在某些实施方案中，检测样品中的一种或多种衰老细胞。样品可以是来自受试者的细胞样品、组织样品或活组织检查物。一般来讲，样品可取决于年龄相关病变。例如，样品可以是组织活检材料。由此，组织样品可来自食道、胃、肝脏、胆囊、胰腺、肾上腺、膀胱、胆囊、大肠、小肠、肾、肝脏、胰腺、结肠、胃、胸腺、脾、脑、脊髓、神经、脂肪组织、心脏、肺、眼睛、角膜、皮肤或胰岛组织或器官。在一个具体实施方案中，组织样品可来自肺、骨骼肌和脑。在另一个具体实施方案中，组织样品可来自肝脏和心脏。可替代地，样品可以是细胞样品。由此，细胞样品可以是卵母细胞和/或精子、间充质干细胞、脂肪细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、可收缩细胞、外分泌上皮细胞、胞外基质细胞、激素分泌细胞、角质化上皮细胞、胰岛细胞、肾细胞、晶状体细胞、胰腺腺泡细胞、小肠的潘氏细胞、造血谱系的原代细胞、神经系统的原代细胞、感觉器官和外周神经元支持细胞或润湿复层屏障上皮细胞。衰老细胞的检测可用于评定组织的复制历史，从而提供用于评估组织的相比于实足年龄的生理年龄的方法。
衰老细胞的数量可随着年龄增加。组织或样品中的衰老细胞的数量可以是小于1％至大于15％。在一个实施方案中，组织或样品中的衰老细胞的数量可以是小于1％、小于2％、小于3％、小于4％或小于5％。在另一个实施方案中，组织或样品中的衰老细胞的数量可以是约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。在又一个实施方案中，组织或样品中的衰老细胞的数量可以是大于10％、大于11％、大于12％、大于13％、大于14％或大于15％。
(c)测量细胞死亡
一方面，本发明的方法可包括测量衰老细胞的细胞死亡。测量细胞死亡的方法在本领域中是已知的。例如，细胞死亡可通过以下来测量：吉姆萨染色、台盼蓝排除法、用于荧光显微镜法和流式细胞术的吖啶橙/溴化乙锭(ao/eb)双染色、碘化丙锭(pi)染色、膜联蛋白v测定、tunel测定、dna梯度、ldh活性和mtt测定。在一个优选的实施方案中，细胞死亡是由于细胞凋亡的诱导而发生。由于细胞凋亡的诱导而发生的细胞死亡可通过观察形态学特征来测量，所述形态学特征包括细胞收缩、细胞质浓缩、染色质分离和浓缩、膜起泡以及膜结合的凋亡小体的形成。由于细胞凋亡的诱导而发生的细胞死亡可通过观察生物化学标志来测量，所述生物化学标志包括核内小体dna裂解为寡核体长度的片段。测量由于细胞凋亡的诱导而发生的细胞死亡的传统的基于细胞的方法包括光和电子显微镜法、活体染料和核染色剂。生物化学方法包括dna梯化、乳酸脱氢酶释放和mtt/xtt酶活性。另外，使用dna片段的末端脱氧核苷酸转移酶介导的dutp-生物素切口端标记(tunel)和原位末端标记(isel)技术，当与标准流式细胞染色法结合时，其产生将细胞死亡与各种细胞参数关联起来的信息数据，所述细胞参数包括细胞周期和细胞表型。对于这些方法的评论，参见loo和rillema,methodscellbiol.1998；57:251-64，其以引用的方式并入本文。在一个示例性实施方案中，由于细胞凋亡而发生的细胞死亡可通过半胱天冬酶-3酶原的减少来测量。半胱天冬酶-3已被表明是与“死亡级联”的启动相关联的“效应”半胱天冬酶，并且因此是细胞进入细胞凋亡信号传导途径的点的重要标志物。半胱天冬酶-3通过上游半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9活化，并且因为它充当不同信号传导途径的汇合点，所以它在细胞凋亡测定中良好地适合用作读出。
这些方法的结果可用于确定活细胞的百分比。在一个优选的实施方案中，细胞死亡可测量为活细胞的减少。因为本发明的组合物选择性地杀死衰老细胞，所以活细胞的减少指示衰老细胞的减少。如在部分iii(b)中所述，样品中的衰老细胞的数量可以是小于1％至大于15％。由此，在施用本发明的抑制剂之后活细胞的减少可以是大于15％至小于1％。例如，活细胞的减少可以是小于1％、小于2％、小于3％、小于4％或小于5％。可替代地，活细胞的减少可以是约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。另外，活细胞的减少可以是大于10％、大于11％、大于12％、大于13％、大于14％或大于15％。
(d)施用
在某些方面，可向受试者施用治疗有效量的本发明的组合物。施用使用标准有效技术来执行，包括在外周(即，不通过施用到中枢神经系统中)或局部施用到中枢神经系统。外周施用包括但不限于口服、吸入、静脉内、腹膜内、关节内、皮下、肺部、经皮、肌内、鼻内、口腔、舌下或栓剂施用。局部施用(包括直接施用到中枢神经系统(cns)中)包括但不限于通过腰部、心室内或脑实质内导管或使用手术植入的受控释放制剂。施用途径可通过待治疗的疾病或病状来决定。例如，如果所述疾病或病状是copd或ipf，则组合物可通过吸入来施用。可替代地，如果所述疾病或病状是骨关节炎，则组合物可通过关节内发明来施用。基于待治疗的疾病或病状来确定施用途径是在本领域的技术人员的能力范围内。在一个具体实施方案中，本发明的组合物口服施用。
用于有效施用的药物组合物有意地被设计成适用于所选的施用模式，并且在适当时使用药学上可接受的赋形剂诸如相容的分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishing公司,eastonpa.,第16版isbn:0-912734-04-3(最新版本，以引用的方式整体并入本文)提供如从业人员通常已知的配制技术的纲要。
对于治疗性应用，向受试者施用治疗有效量的本发明的组合物。“治疗有效量”是足以产生可测量的应答(例如，衰老细胞的细胞死亡、抗老化应答、与变性疾病相关联的症状的改善或与功能降低的病症相关联的症状的改善)的治疗组合物的量。本发明的治疗组合物中的活性成分的实际剂量水平可变化，以便施用有效实现对于特定受试者的所需治疗应答的一种或多种活性化合物的量。所选的剂量水平将取决于各种因素，包括治疗组合物的活性、配制、施用途径、与其他药物或治疗的组合、年龄、年龄相关疾病或病状、变性疾病、功能降低的病症、症状以及正在治疗的受试者的身体状况和先前的病史。在一些实施方案中，施用最小剂量，并且在剂量限制毒性不存在的情况下逐步增加剂量。治疗有效剂量的确定和调整以及对于何时并且如何做出此类调整的评估对于医学领域的普通技术人员是已知的。
根据有效治疗症状的需要，给药的频率可以是每天给药或每周或每月一次、两次、三次或更多次。相对于疾病本身的治疗的施用时间安排和治疗的持续时间将通过病例周围的环境确定。治疗可诸如在损伤地点处立即开始，如紧急医务人员所施用的。治疗可在医院或诊所本身开始，或在出院之后晚点时间开始，或在门诊患者诊所看过之后开始。治疗持续时间可在一次基础上施用的单一剂量至治疗性治疗的终身疗程的范围内。
典型剂量水平可使用标准临床技术确定和优化，并且将取决于施用模式。
(e)受试者
受试者可以是啮齿动物、人、家畜动物、伴侣动物或动物园动物。在一个实施方案中，受试者可以是啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠等)。在另一个实施方案中，受试者可以是家畜动物。合适的家畜动物的非限制性实例可包括猪、牛、马、山羊、绵羊、美洲鸵和羊驼。在又一个实施方案中，受试者可以是伴侣动物。伴侣动物的非限制性实例可包括宠物诸如狗、猫、兔和鸟。在再一个实施方案中，受试者可以是动物园动物。如本文所用，“动物园动物”是指可存在于动物园中的动物。此类动物可包括非人灵长类、大型猫科动物、狼和熊。在一个优选的实施方案中，受试者是人。
人受试者可以是任何年龄。然而，因为衰老细胞通常与老化相关联，所以人受试者可以是较老的人受试者。在一些实施方案中，人受试者可以是约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95岁的年龄或更老。在一些优选的实施方案中，人受试者是30岁的年龄或更老。在其他优选的实施方案中，人受试者是40岁的年龄或更老。在其他优选的实施方案中，人受试者是45岁的年龄或更老。在再其他优选的实施方案中，人受试者是50岁的年龄或更老。在又其他优选的实施方案中，人受试者是55岁的年龄或更老。在其他优选的实施方案中，人受试者是60岁的年龄或更老。在再其他优选的实施方案中，人受试者是65岁的年龄或更老。在又其他优选的实施方案中，人受试者是70岁的年龄或更老。在其他优选的实施方案中，人受试者是75岁的年龄或更老。在又其他优选的实施方案中，人受试者是80岁的年龄或更老。在再其他优选的实施方案中，人受试者是85岁的年龄或更老。在又其他优选的实施方案中，人受试者是90岁的年龄或更老。
另外，有需要的受试者可以是患有如下所述的年龄相关疾病或病状的受试者。
(f)老化和年龄相关疾病
已证明衰老细胞驱动年龄相关病变并且选择性地消除这些细胞可预防或延迟年龄相关退化。因此，衰老细胞可以是老化和年龄相关疾病的治疗中的治疗靶标。由此，去除衰老细胞可延迟组织功能障碍并延长健康寿命。预期清除衰老细胞改善组织环境，从而改善剩余的非衰老细胞的功能。
本公开提供一种用于延迟受试者的老化的至少一种特征的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的式(i)的化合物或式(ii)的化合物的组合物。如本文所用，“老化的特征”可包括但不限于免疫系统的系统性衰退、肌肉萎缩和肌肉强度降低、皮肤弹性降低、伤口愈合延迟、视网膜萎缩、晶状体透光率降低、听力下降、骨质疏松、少肌症、毛发泛灰、皮肤起皱、视力低下、虚弱以及认知障碍。
一方面，本发明的组合物选择性地杀死衰老细胞。这样，靶向老化过程中的衰老细胞可以是预防性策略。因此，施用包含治疗有效量的式(i)的化合物或式(ii)的化合物的组合物可预防合并症并延迟较老受试者的死亡。另外，选择性地杀死衰老细胞可加强免疫系统，延长健康寿命并改善受试者的生活质量。另外，选择性地杀死衰老细胞可延迟少肌症。少肌症是与老化相关联的骨骼肌量、质量和强度的退化性丧失。由此，延迟少肌症可在受试者中减少虚弱、降低摔倒的风险、减少骨折并且减少功能失能。此外，选择性地杀死衰老细胞可延迟皮肤老化。老化皮肤具有增加的皱纹、降低的免疫屏障功能和增加的皮肤癌和创伤的易感性。由此，选择性地杀死衰老细胞可在受试者中延迟皮肤起皱、延迟降低的免疫屏障功能的发病并且降低皮肤癌和创伤的易感性。选择性地杀死衰老细胞还可延迟视网膜萎缩和降低的晶状体透光率(如通过视力测试测量)的发病。
测量老化的方法在本领域中是已知的。例如，老化可通过以下在骨中测量：易发生的非脊椎骨折、易发生的髋部骨折、易发生的总骨折、易发生的脊椎骨折、易发生的重复骨折、骨折之后的功能恢复、腰椎和髋部处骨密度降低、膝盖屈曲频率、nsaid使用、具有疼痛的关节的数量以及骨关节炎。老化还可通过以下在肌肉中测量：功能衰退、摔倒频率、反应时间和握持力、上肢和下肢肌肉量降低以及双重任务10米步态速度。另外，老化还可通过以下在心血管系统中测量：收缩和舒张血压变化、易发生的高血压、主要心血管事件诸如心肌梗塞、中风、充血性心脏病以及心血管死亡。另外，老化可通过以下在脑中测量：认知衰退、易发生的抑郁症和易发生的痴呆。老化还可通过以下在免疫系统中测量：感染的频率、上呼吸道感染的频率、类似流感的疾病的频率、导致住院的易发生的严重感染、易发生的癌症、植入物感染的频率以及胃肠感染的频率。老化的其他指示可包括但不限于口腔健康的衰退、牙缺失、gi症状的频率、空腹葡萄糖和/或胰岛素水平的变化、机体组成、肾功能衰退、生活质量、关于日常生活活动的易发生的失能以及易发生的疗养院住院。测量皮肤老化的方法在本领域中是已知的，并且可包括经皮水流失(tewl)、皮肤水合、皮肤弹性、眼角纹的面积比分析、敏感性、光泽度、粗糙度、斑点、松弛性、肤色均质性、柔软性以及凹凸度(深度变化)。
本公开还提供一种治疗年龄相关疾病或病状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含治疗有效量的式(i)的化合物或式(ii)的化合物的组合物，前提是所述年龄相关的疾病或病状不是癌症。如本文所用，“年龄相关疾病或病状”可包括但不限于变性疾病或功能降低的病症诸如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、白内障、黄斑变性、青光眼、动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、中风、高血压、特发性肺纤维变性(ipf)、慢性阻塞性肺疾病(copd)、骨关节炎、2型糖尿病、肥胖症、脂肪功能障碍、冠状动脉疾病、脑血管疾病、牙周病以及癌症治疗相关失能诸如各种组织中的萎缩和纤维化、脑和心脏损伤和疗法相关的脊髓发育不良综合征以及与加速老化和/或dna损害修复和端粒维持的缺陷相关联的疾病诸如早衰综合征(即，早年衰老综合症、韦耳纳综合征、布卢姆综合征、rothmund-thomson综合征、cockayne综合征、着色性干皮病、毛发性营养不良、组合的着色性干皮病-cockayne综合征以及限制性皮肤病)、共济失调毛细血管扩张症、范科尼贫血、弗里德赖希氏共济失调、先天性角化不良、再生障碍性贫血、ipf以及其他病变。诊断和鉴定年龄相关疾病或病状的方法在本领域中是已知的。
定义
可用于所述组合物和方法的化合物包括本文所述的呈其药学上可接受的形式的那些化合物，包括异构体诸如非对映体和对映体、盐、溶剂化物和多晶型物以及本文所述的化合物的外消旋混合物和纯异构体(在适用的情况下)。
本文所述的化合物具有非对称中心。含有非对称取代原子的本公开的化合物可以光学活性或外消旋形式分离。意图涵盖所有手性、非对映、外消旋形式和所有几何异构体形式的结构，除非具体地指示特定的立体化学或异构体形式。
当引入本文所述的实施方案的元素时，冠词“一个(a)”、“一种(an)”、“所述(the)”和“所述(said)”意图意指存在一种或多种元素。术语“包含”、“包括”和“具有”意图包括端值在内并且意指可能存在除所列的元素以外的附加元素。
如本文单独使用或作为参考bcl-2家族蛋白的成员的组的一部分的“bcl-2”包括以下bcl-xl、mcl-1、bcl-w、bfl-1/a1、bcl-b、bax、bak和bok。
如本文单独使用或作为组的一部分的“烷基”是指具有直链或支链烃链或在存在至少3个碳原子的情况下具有环烃或它们的组合的饱和单价烃基团，并且含有1至20个碳原子(c1-c20烷基)、合适地1至10个碳原子(c1-c10烷基)、优选地1至8个碳原子(c1-c8烷基)、更优选地1至6个碳原子(c1-c4烷基)以及甚至更优选地1至4个碳原子(c1-c4烷基)。烷基基团的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
如本文单独使用或作为组的一部分的“芳基”包括通过去除一个氢而衍生自芳香烃的有机基团，并且包括单环和多环基团，诸如苯基、联苯基、萘基。
如本文单独或组合使用的“环烷基”意指饱和或部分饱和的单环、双环或三环烷基基团，其中每个环部分含有约3至约8个碳原子、更优选地约3至约6个碳原子。此类环烷基基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
“杂原子”意指例如在杂环基团的环或杂基团的链中的除碳以外的原子。优选地，杂原子选自由硫、磷、氮和氧原子组成的组。含有多于一个杂原子的基团可含有不同的杂原子。
如本文单独或组合使用的“杂芳基”包括通过去除一个氢而衍生自芳香烃的有机基团，并且包括至少一个杂原子。杂芳基的实例包括吡咯、噻吩、呋喃、吲哚、吡嗪、吡啶、三唑、咪唑、噻唑、噁唑等。
“取代的”意指结合到链或环中的碳原子的氢原子中的一个或多个被其他取代基替换。合适的取代基包括：单价烃基，包括烷基基团，诸如甲基基团；以及单价杂基团，包括烷氧基基团，诸如甲氧基基团。“未取代的”意指碳链或环不含有除碳和氢以外的其他取代基。
“支链的”意指碳链不只是直链。“非支链的”意指碳链是直链碳链。
“杂原子”意指例如在杂环基团的环或杂基团的链中的除碳以外的原子。优选地，杂原子选自由硫、磷、氮和氧原子组成的组。含有多于一个杂原子的基团可含有不同的杂原子。
“杂环基团”意指在环中含有碳原子和1个或多个杂原子的饱和或不饱和环结构。杂环基团不是芳族的。杂环基团是单环的或多环的。多环的杂芳基团可以是稠合的、螺接或桥接的环系统。单环的杂环基团在环中含有4至10个主原子(即，包含碳原子和至少1个杂原子两者)、合适地4至7个并且更合适地5至6个主原子。双环杂环基团在环中含有8至18个主原子、合适地9或10个主原子。
如本文所用，“异构体”、“异构体形式”、“立体化学异构体形式”或“立体异构体形式”定义所有可能的异构体以及构象形式，其由通过相同的键序列结合的相同原子构成但是具有不可互换的在所述工艺过程中获得的化合物或中间体可能具有的不同三维结构。除非另外提及或指示，否则化合物的化学名称涵盖所述化合物可能具有的所有可能的立体化学异构体形式的混合物。所述混合物可含有所述化合物的基本分子结构的所有非对映异构体、差向异构体、对映体和/或构象异构体。更具体地，立体中心可具有r-构型或s-构型，非对映异构体可具有顺式构型或反式构型，二价环状饱和基团上的取代基可具有顺式构型或反式构型，并且烯基基团可具有e构型或z构型。呈纯形式或呈与彼此的混合物形式两者的所述化合物的所有立体化学异构体形式意图包括在本发明的范围内。
实施例
包括以下实施例以证明本公开的各种实施方案。本领域技术人员应理解以下实施例中公开的技术表示由本发明人发现的在本发明实践中发挥良好作用的技术，并且因此可被认为构成本发明实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域的技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出许多改变。
本发明的化合物可以有机合成领域的技术人员熟知的多种方法制备。更具体地，本发明的新型化合物可使用本文所述的反应和技术制备。在以下所述的合成方法的描述中，应理解所有提出的反应条件(包括溶剂、反应气氛、反应温度、实验持续时间和后处理程序的选择)被选择为对于此反应标准的条件。有机合成领域的技术人员应理解，各种分子部分上存在的功能性必须与所提出的试剂和反应相容。对于取代基(其对于反应条件是不相容的)的此类限制将对于本领域的技术人员是显而易见的，并且然后必须使用替代方法。除非另外声明，否则本文含有的实施例的起始材料是可商购获得的或者易于由已知材料通过标准方法制备。式(i)或式(ii)的化合物可通过使用可商购获得的起始材料和试剂通过对于有机合成领域训练的技术人员已知的标准有机化学方法和纯化技术来合成。
使用以下缩写：s：单峰；d：双重峰；t：三重峰；q：四重峰；m：多重峰；dd：双重峰的双重峰；dt：三重峰的双重峰：dq：四重峰的双重峰；br：广泛的；acoh＝乙酸；dcm＝二氯甲烷；dipea＝n,n-二异丙基乙胺；dmap＝4-二甲基氨基吡啶；dmf＝n,n-二甲基甲酰胺；dmso＝二甲基亚砜；edci＝1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺；edta＝乙二胺四乙酸；etoac＝乙酸乙酯；fbs＝胎牛血清；hatu＝1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐；hcl＝盐酸；momcl＝氯甲基甲基醚；pbs＝磷酸盐缓冲盐水；tbaf＝四正丁基氟化铵；tbscl＝叔丁基二甲基氯硅烷；tbs-t＝tris缓冲盐水；tea＝三乙胺；thf＝四氢呋喃；以及tfa＝三氟乙酸。
实施例1：xz-13906的合成
(4-溴-2-氟苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷(2)的制备
将4-溴-2-氟苯酚(1.0g，5.24mmol)、tbscl(1.03g，6.83mmol)和咪唑(713mg，10.48mmol)溶解在20mldmf中，并且将混合物在室温下搅拌16小时。将水添加到反应混合物并且用etoac萃取。将合并的有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将所得的油通过柱色谱法进一步纯化以得到作为无色油的1.60g化合物2。产率100％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.22(dd,j＝10.1,2.4hz,1h),7.15–7.07(m,1h),6.79(t,j＝8.7hz,1h),1.00(s,9h),0.19(d,j＝0.9hz,6h)ppm。
4-(丙-2-炔基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(4)的制备
将1-boc-哌嗪3(1.0g，5.38mmol)、80％3-溴丙-1-炔甲苯溶液(900μl，8.07mmol)和dipea(1.78ml，10.76mmol)溶解在25mldcm中并且将混合物在室温下搅拌16小时。将水添加到反应混合物并且将水相用dcm萃取。将合并的有机相用盐水洗涤、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将所得的油通过柱色谱法进一步纯化以得到1.13g化合物4。产率94％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.54–3.42(m,4h),3.33(d,j＝2.4hz,2h),2.57–2.46(m,4h),2.26(t,j＝2.4hz,1h),1.46(s,9h)ppm。
4-(3-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-3-氟苯基)丙-2-炔基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(5)的制备
将化合物2(612mg，2mmol)、化合物4(448mg，2mmol)、pd(pph3)4(68mg，0.06mmol)、cui(12mg，0.06mmol)和tea(700μl，4.2mmol)的混合物在100℃下在氩气下在15mldmf中搅拌20小时。将水添加到反应混合物并且用etoac萃取。将合并的有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将所得的油通过柱色谱法进一步纯化以得到220mg化合物5。产率25％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.13(dd,j＝11.1,2.0hz,1h),7.10–7.04(m,1h),6.83(t,j＝8.5hz,1h),3.58–3.41(m,6h),2.68–2.50(m,4h),1.47(s,9h),1.00(s,9h),0.19(d,j＝0.9hz,6h)ppm。
4-(3-(3-氟代-4-羟基苯基)丙-2-炔基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(6)的制备
向在5mlthf中的化合物5(180mg，0.4mmol)的溶液逐滴添加0.8mltbaf溶液(1.0m在thf中)。在30分钟之后，将水添加到反应混合物并且用etoac萃取。将有机相用饱和nh4cl(水溶液)洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将所得的混合物通过柱色谱法进一步纯化以得到呈褐色固体的126mg化合物6。产率94％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.09–7.00(m,2h),6.89(t,j＝8.8hz,1h),3.59–3.45(m,6h),2.70–2.54(m,4h),2.08(s,1h),1.47(s,9h)ppm。
2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-(2-(2-(2-(丙-2-炔氧基)乙氧基)乙氧基)乙基氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(9)的制备
根据具有微少修改的报告的方法(chem.biol.22:755–763,2015)合成2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟代异吲哚啉-1,3-二酮(7)。将在4mldmf中的化合物7(100mg，0.36mmol)、胺8(68mg，0.36mmol)和dipea(120μl，0.72mmol)在90℃下搅拌16小时。将水添加到反应混合物并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将所得的混合物通过柱色谱法进一步纯化以得到呈绿色固体的95mg化合物9。产率59％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.02(s,1h),7.64–7.34(m,1h),7.10(d,j＝7.1hz,1h),6.93(d,j＝8.6hz,1h),6.67–6.11(m,1h),4.91(dd,j＝12.1,5.3hz,1h),4.20(d,j＝2.2hz,2h),3.83–3.60(m,10h),3.55–3.40(m,2h),2.99–2.60(m,3h),2.43(t,j＝2.1hz,1h),2.21–2.03(m,1h)ppm。
2-(8-(苯并[d]噻唑-2-基氨基甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-基)-5-(3-(4-(3-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)丙-1-炔基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-羧酸(11)的制备
根据具有微少修改的报告的方法(acsmedchemlett.5:1088-1093,2014)合成化合物10。将在5mldmf中的化合物6(200mg，0.60mmol)冷却至0℃并且将40mg95％nah添加到所述溶液。将所得的反应混合物搅拌10min，然后添加在5mlthf中的化合物10(250mg，0.40mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时并且通过添加1ml水猝灭。使用1nhcl(水溶液)将ph调整至5并且将所得的溶液用etoac提取。将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将所得的混合物通过柱色谱法进一步纯化以得到130mg化合物11。产率41％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.90–7.76(m,1h),7.69–7.59(m,1h),7.54–7.41(m,1h),7.36–7.29(m,4h),7.14–7.05(m,2h),6.80(t,j＝8.5hz,1h),4.93(s,2h),4.00(t,j＝6.2hz,2h),3.79–3.65(m,2h),3.57–3.49(m,6h),3.28(t,j＝7.3hz,2h),3.09–2.88(m,2h),2.74–2.46(m,4h),2.30–2.06(m,2h),1.46(s,9h)ppm。
2-(8-(苯并[d]噻唑-2-基氨基甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-基)-5-(3-((2-氟代-4-(3-(哌嗪-1-基)丙-1-炔基)苯氧基)丙基)噻唑-4-羧酸(12)的制备
将在3mldcm中的化合物11(130mg)和tfa(1ml)的混合物在室温下搅拌1小时。在减压下去除溶剂并且将粗产物在et2o和meoh中结晶以得到呈淡黄色固体的110mg化合物12。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.93(d,j＝7.7hz,1h),7.78(d,j＝7.7hz,1h),7.63(d,j＝7.2hz,1h),7.52–7.28(m,5h),7.18–7.07(m,2h),6.99(t,j＝8.7hz,1h),4.91(s,2h),4.07(t,j＝6.1hz,2h),3.89–3.77(m,2h),3.62(s,2h),3.28–3.20(m,6h),3.09–3.05(m,2h),2.93–2.80(m,4h),2.20–2.07(m,2h)ppm。
5-(3-(4-(3-(4-(4-叠氮丁酰基)哌嗪-1-基)丙-1-炔基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(8-(苯并[d]噻唑-2-基氨基甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-基)噻唑-4-羧酸(13)的制备
将在4mldcm中的化合物12(100mg)和tea(157μl)在室温下搅拌。然后将在660μldcm中的4-叠氮丁酰基氯化物(16.4mg)逐滴添加到混合物。在搅拌10分钟之后，通过添加1mlmeoh将反应猝灭。添加dcm并且将混合物用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物在meoh中结晶以得到85mg浅黄色固体。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.86(d,j＝7.8hz,1h),7.69–7.59(m,2h),7.44–7.29(m,4h),7.15–7.05(m,2h),6.82(t,j＝8.7hz,1h),4.95(s,2h),4.04(t,j＝6.3hz,2h),3.81–3.64(m,6h),3.44–3.24(m,6h),3.06(t,j＝5.9hz,2h),2.89–2.58(m,4h),2.42(t,j＝7.2hz,2h),2.22–2.11(m,2h),1.99–1.87(m,2h)ppm。
2-(8-(苯并[d]噻唑-2-基氨基甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-基)-5-(3-(4-(3-(4-(4-(4-((2-(2-(2-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)丁酰基)哌嗪-1-基)丙-1-炔基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-羧酸(xz-13906)的制备
向在氩气下的在1mlt-buoh中的化合物13(18mg)、化合物9(10mg)的混合物添加在0.2ml水中的cuso4·5h2o(1.0mg)和抗坏血酸钠(0.8mg)。将混合物在65℃下搅拌16小时并且用dcm萃取。将有机相用盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用反相制备型hplc纯化以得到呈黄色固体的4.0mg纯产物。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.17(s,1h),7.92–7.82(m,2h),7.71(d,j＝6.9hz,1h),7.53(s,1h),7.50–7.43(m,2h),7.37(t,j＝7.5hz,1h),7.33–7.27(m,2h),7.15–7.02(m,3h),6.87(d,j＝8.6hz,1h),6.79(t,j＝8.4hz,1h),6.48(brs,1h),4.99–4.83(m,3h),4.70–4.53(m,2h),4.37(t,j＝5.9hz,2h),4.11–3.94(m,4h),3.82–3.56(m,16h),3.42(t,j＝4.8hz,2h),3.35–3.06(m,6h),3.02(t,j＝5.7hz,2h),2.89–2.67(m,3h),2.33–2.05(m,7h)ppm。
实施例2：xz-13942的合成
5-(3-叠氮丙基)-2-(8-(苯并[d]噻唑-2-基氨基甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-基)噻唑-4-羧酸乙酯(14)的制备
将化合物10(100mg)和nan3(13mg)在45℃下在5mldmso中搅拌过夜。将混合物倒入水中并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥以得到呈白色固体的85mg纯产物。产率98％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.82(d,j＝6.7hz,1h),7.54(d,j＝7.6hz,1h),7.35–7.26(m,4h),7.18(t,j＝7.6hz,1h),4.87(s,2h),4.28(q,j＝7.1hz,2h),3.90–3.79(m,2h),3.31(t,j＝6.6hz,2h),3.11(t,j＝7.4hz,2h),3.03–2.92(m,2h),1.98–1.82(m,2h),1.31(t,j＝7.1hz,3h)ppm。
5-(3-叠氮丙基)-2-(8-(苯并[d]噻唑-2-基氨基甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-基)噻唑-4-羧酸甲氧基甲酯(15)的制备
将化合物14(85mg)和naoh(26.5mg)在50℃下在乙醇和水的混合物中搅拌5小时。将混合物冷却至室温并且用1nhcl(水溶液)中和。采集沉淀的固体并且溶解在4mldmf中。然后将na2co3(17mg)和momcl(12mg)添加到混合物中。在16小时之后，将混合物倒入水中并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将所得的混合物使用etoac和己烷作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到53mg化合物15。产率61％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.88(d,j＝7.7hz,1h),7.75(d,j＝7.1hz,1h),7.68(d,j＝7.9hz,1h),7.51–7.29(m,5h),5.40(s,2h),4.94(s,2h),3.90(t,j＝6.1hz,2h),3.50(s,3h),3.35(t,j＝6.8hz,2h),3.17(t,j＝7.5hz,2h),3.08(t,j＝6.1hz,2h),1.99–1.88(m,2h)ppm。
2-(8-(苯并[d]噻唑-2-基氨基甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-基)-5-(3-(4-((2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)丙基)噻唑-4-羧酸(xz13942)的制备
向在氩气下的在2mlt-buoh-thf(1:1，v/v)中的化合物15(10mg)、化合物9(8.7mg)的混合物添加在0.4ml水中的cuso4·5h2o(0.9mg)和抗坏血酸钠(0.7mg)。将混合物在60℃下搅拌16小时并且用dcm萃取。将有机相用盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到14mg化合物16。产率78％。将化合物16(9.0mg)和0.1mltfa在3mldcm中搅拌1小时。在减压下去除溶剂。然后将et2o添加到残余物中并且采集沉淀的固体以得到8.4mg纯xz13942。产率79％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.03(s,1h),7.94(d,j＝6.4hz,1h),7.87(d,j＝7.7hz,1h),7.77(d,j＝6.7hz,1h),7.64–7.29(m,6h),7.07(d,j＝7.0hz,1h),6.88(d,j＝8.5hz,1h),5.03–4.86(m,3h),4.75–4.55(m,2h),4.46–4.30(m,2h),3.86–3.58(m,12h),3.46–3.33(m,2h),3.25–2.98(m,4h),2.92–2.68(m,3h),2.28–2.05(m,3h)ppm。
实施例3：xz-14424的合成
2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(18)的制备
将在5mldmf中的化合物7(107mg)、胺17(84mg)和dipea(193μl)在85℃下搅拌16小时。将水添加到反应混合物并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将所得的混合物使用etoac和己烷作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到作为呈固体的50mg化合物18。产率32％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.98(s,1h),7.62–7.35(m,1h),7.11(d,j＝7.1hz,1h),6.93(d,j＝8.5hz,1h),4.92(dd,j＝11.9,5.3hz,1h),4.21(d,j＝2.3hz,2h),3.78–3.66(m,6h),3.49(t,j＝5.4hz,2h),2.93–2.68(m,3h),2.48–2.41(m,1h),2.18–2.09(m,1h)ppm。
5-(3-(4-(3-(4-(4-叠氮丁酰基)哌嗪-1-基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)-2-(8-(苯并[d]噻唑-2-基氨基甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-基)噻唑-4-羧酸甲氧基甲酯(19)的制备
将化合物13(26mg)、na2co3(4.1mg)和momcl(2.8mg)在2mldmf中搅拌24小时。然后将它倒入水中并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将所得的混合物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到15mg化合物19。产率58％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.90–7.77(m,1h),7.54(d,j＝7.6hz,1h),7.37–7.25(m,4h),7.18(t,j＝7.6hz,1h),7.12–7.04(m,2h),6.81(t,j＝8.4hz,1h),5.34(s,2h),4.88(s,2h),4.03(t,j＝6.2hz,2h),3.81(t,j＝6.0hz,2h),3.76–3.64(m,2h),3.63–3.49(m,4h),3.44(s,3h),3.36(t,j＝6.3hz,2h),3.25(t,j＝7.4hz,2h),3.00(t,j＝5.9hz,2h),2.71–2.53(m,4h),2.40(t,j＝7.2hz,2h),2.23–2.06(m,2h),1.98–1.84(m,2h)ppm。
2-(8-(苯并[d]噻唑-2-基氨基甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-基)-5-(3-(4-(3-(4-(4-(4-((2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)丁酰基)哌嗪-1-基)丙-1-炔-1-基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-羧酸(xz14424)的制备
向在氩气下的在2mlt-buoh-thf(1:1，v/v)中的化合物19(13.0mg)、化合物18(8.0mg)的混合物添加在0.4ml水中的cuso4·5h2o(0.82mg)和抗坏血酸钠(0.65mg)。将混合物在55℃下搅拌16小时并且用dcm萃取。将有机相用盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到20mg化合物20。产率91％。将化合物20(20.0mg)和0.1mlhcl溶液(4.0m在1,4-二噁烷中)在4mldcm-甲醇(3:1，v/v)中搅拌3小时。在减压下去除溶剂。然后将et2o添加到残余物并且采集沉淀的固体以得到15.4mg纯xz14424。产率73％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.02(s,1h),7.92(d,j＝7.9hz,1h),7.79(d,j＝7.9hz,2h),7.61–7.44(m,4h),7.36(t,j＝7.5hz,1h),7.31–7.18(m,2h),7.12–6.95(m,3h),5.14(s,2h),5.01(dd,j＝12.7,5.4hz,1h),4.64(s,2h),4.47(t,j＝6.5hz,2h),4.34(s,2h),4.16(t,j＝5.5hz,2h),3.99–3.88(m,2h),3.77–3.44(m,14h),3.38–3.33(m,4h),3.26–3.19(m,2h),2.89–2.62(m,3h),2.52–2.38(m,2h),2.25–2.04(m,5h)ppm。
实施例4：xz-14418的合成
n-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧异吲哚啉-4-基)-2-(2-(2-(丙-2-炔氧基)乙氧基)乙氧基)乙酰胺(22)的制备
将来那度胺(61mg)、化合物21(57mg)、hatu(94mg)和dipea(59μl)在5mldcm中搅拌过夜。将混合物在减压下浓缩并且使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到58mg化合物22。产率56％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.92(s,1h),7.97(s,1h),7.74(d,j＝7.5hz,1h),7.68(d,j＝7.9hz,1h),7.49(t,j＝7.7hz,1h),5.20(dd,j＝13.3,5.1hz,1h),4.45(s,2h),4.14(d,j＝3.4hz,2h),3.96(s,2h),3.83–3.57(m,8h),2.98–2.70(m,2h),2.49–2.28(m,2h),2.27–2.13(m,1h)ppm。
2-(8-(苯并[d]噻唑-2-基氨基甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-基)-5-(3-(4-(3-(4-(4-(4-((2-(2-(2-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧异吲哚啉-4-基氨基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)丁酰基)哌嗪-1-基)丙-1-炔基)-2-氟苯氧基)丙基)噻唑-4-羧酸(xz14418)的制备
向在氩气下的在4mlt-buoh-thf(1:3，v/v)中的化合物19(12.0mg)、化合物22(7.4mg)的混合物添加在0.4ml水中的cuso4·5h2o(0.70mg)和抗坏血酸钠(0.56mg)。将混合物在55℃下搅拌16小时并且用dcm萃取。将有机相用盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到15.0mg化合物23。产率85％。将化合物23(15.0mg)和0.1mlhcl溶液(4.0m在1,4-二噁烷中)在4ml5mldcm中搅拌10分钟。在减压下去除溶剂。然后将et2o添加到残余物中并且采集沉淀的固体以得到11.8mg纯xz14418。产率75％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.00–7.89(m,2h),7.84–7.76(m,2h),7.69(d,j＝7.8hz,1h),7.64(d,j＝7.1hz,1h),7.59–7.43(m,4h),7.37(t,j＝7.6hz,1h),7.31–7.19(m,2h),7.06(t,j＝8.5hz,1h),5.23–5.04(m,3h),4.57–4.45(m,4h),4.41(t,j＝6.8hz,2h),4.33(s,2h),4.23–4.12(m,4h),3.93(t,j＝5.7hz,2h),3.82–3.63(m,10h),3.37–3.33(m,8h),3.21(t,j＝5.5hz,2h),2.96–2.67(m,2h),2.57–2.36(m,3h),2.28–2.11(m,5h)ppm。
实施例5：xz-14455的合成
(2s,4r)-1-((s)-2-叔丁基-4-氧代-6,9,12-三氧杂-3-氮杂十五烷-14-炔)-4-羟基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(25)的制备
将在dcm中的化合物21、化合物24、hatu和dipea的混合物在室温下搅拌过夜。将混合物在减压下浓缩并且使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到标题化合物。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.68(s,1h),7.60–7.25(m,6h),4.70(t,j＝8.0hz,1h),4.62–4.37(m,3h),4.33(dd,j＝15.0,5.3hz,1h),4.22–4.10(m,2h),4.02–3.91(m,3h),3.65–3.46(m,9h),2.55–2.37(m,5h),2.21–2.09(m,1h),0.91(s,9h)ppm。
2-(8-(苯并[d]噻唑-2-基氨基甲酰基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-基)-5-(3-(2-氟代-4-(3-(4-(4-(4-((s)-12-((2s,4r)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-13,13-二甲基-10-氧代-2,5,8-三氧杂-11-氮杂十四烷基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)丁酰基)哌嗪-1-基)丙-1-炔-1-基)苯氧基)丙基)噻唑-4-羧酸(xz14455)的制备
向在氩气下的在4mlt-buoh-thf(1:1，v/v)中的化合物19(17.0mg)、化合物25(17.0mg)的混合物添加在0.4ml水中的cuso4·5h2o(1.0mg)和抗坏血酸钠(0.8mg)。将混合物在50℃下搅拌5小时并且用dcm萃取。将有机相用盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到14.9mg化合物26。产率51％。将化合物26(3.5mg)和0.1mltfa在2mldcm中搅拌6小时。在减压下去除溶剂。将et2o添加到残余物中。将沉淀的固体过滤并且用etoac、接着用dcm-己烷(1:1v/v)洗涤以得到3.5mg纯xz14455。产率83％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.86(s,1h),8.00–7.89(m,2h),7.78(d,j＝7.9hz,1h),7.71–7.59(m,1h),7.53–7.30(m,8h),7.29–7.17(m,2h),7.02(t,j＝8.5hz,1h),4.89(s,2h),4.73–4.20(m,12h),4.17–3.96(m,4h),3.92–3.59(m,15h),3.40–3.33(m,2h),3.28–3.23(m,2h),3.07(t,j＝5.8hz,2h),2.49–2.36(m,5h),2.31–1.94(m,6h),1.02(s,9h)ppm。
实施例6：xz-14439的合成
2,2,2-三氯乙基(r)-4-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-羧酸酯(29)的制备
向在15mldcm中的化合物27(592mg)、化合物28(753mg)和tea(1.12ml)的混合物添加638mgnabh(oac)3。将溶液在室温下搅拌1小时。然后将它倒入水中并且用dcm萃取。将有机相用盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用etoac和己烷作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到733mg化合物29。产率68％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.43–7.36(m,2h),7.32–7.27(m,2h),7.19(t,j＝7.3hz,1h),5.44(brs,1h),4.76(s,2h),3.99–3.84(m,1h),3.72–3.49(m,4h),3.23(dd,j＝13.3,4.6hz,1h),3.10–2.95(m,1h),2.61–2.31(m,6h),1.96–1.61(m,2h),1.43(s,9h)ppm。
2,2,2-三氯乙基(r)-4-(3-氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-羧酸酯(30)的制备
向在5mldcm中的化合物29(733mg)的混合物添加5mlhcl溶液(4.0m在1,4-二噁烷中)。将混合物在室温下搅拌1小时并且在减压下去除溶剂。将固体用et2o洗涤以得到呈白色固体的647mg化合物30。产率99％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.41–7.33(m,2h),7.31–7.26(m,2h),7.23–7.15(m,1h),4.74(s,2h),3.73–3.41(m,4h),3.20–2.66(m,5h),2.58–2.28(m,6h),1.84–1.57(m,2h)ppm。
2,2,2-三氯乙基(r)-4-(4-(苯硫基)-3-((4-氨磺酰基-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)丁基)哌嗪-1-羧酸酯(32)的制备
将在20ml乙腈中的化合物30(647mg)、4-氟代-3-((三氟甲基)磺酰基)苯磺酰胺31(417mg)和tea(945μl)的混合物回流4小时。将溶剂在减压下蒸发并且将粗产物使用etoac和己烷作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到呈白色固体的780mg化合物32。产率79％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.24(d,j＝2.2hz,1h),7.84(d,j＝9.1hz,1h),7.42–7.37(m,2h),7.36–7.27(m,3h),7.05(d,j＝8.6hz,1h),6.65(brs,1h),5.13(brs,j＝10.8hz,2h),4.76(s,2h),3.94(s,1h),3.58(s,4h),3.16–2.97(m,2h),2.82–2.26(m,6h),2.17(s,1h),1.77(s,1h)ppm。
2,2,2-三氯乙基(r)-4-(3-((4-(n-(4-(4-((4'-氯代-4,4-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-羧酸酯(34)的制备
将在dcm中的化合物32(780mg)、4-(4-((4'-氯代-4,4-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸33(470mg)、edci(411mg)和dmap(262mg)的混合物在室温下搅拌过夜。将溶剂在减压下蒸发并且将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到呈白色固体的859mg化合物34。产率70％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.35(s,1h),8.10(d,j＝8.7hz,1h),7.66(d,j＝8.0hz,2h),7.43–7.18(m,7h),7.12–6.96(m,3h),6.74(s,1h),6.56(d,j＝7.9hz,1h),4.74(s,2h),3.93–3.83(m,1h),3.61–3.42(m,4h),3.39–3.25(m,4h),3.16–2.83(m,4h),2.44–2.02(m,15h),1.77–1.60(m,1h),1.56–1.42(m,2h),0.98(s,6h)ppm。
(r)-4-(4-((4'-氯代-4,4-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-((1-(苯硫基)-4-(哌嗪-1-基)丁-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺(35)的制备
将锌粉(960mg)添加到在20mlthf中的化合物34(316mg)和acoh(600μl)的混合物。将反应在室温下搅拌5小时。通过过滤去除固体并且将滤液倒入水中并且用etoac萃取。将有机相用盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm、甲醇和tea作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到210mg化合物35。产率78％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.21(s,1h),7.93(d,j＝9.2hz,1h),7.85(d,j＝8.6hz,2h),7.33–7.24(m,2h),7.22–7.15(m,6h),7.15–7.08(m,1h),6.92(d,j＝8.3hz,2h),6.77(d,j＝8.4hz,1h),6.66(d,j＝8.7hz,2h),6.46(d,j＝9.3hz,1h),3.83–3.67(m,1h),3.17–3.08(m,4h),3.02–2.92(m,5h),2.89–2.78(m,1h),2.72(s,2h),2.64–2.13(m,12h),2.04–1.91(m,3h),1.62–1.49(m,1h),1.39(t,j＝6.3hz,2h),0.91(s,6h)ppm。
(r)-n-((4-((4-(4-(4-叠氮丁酰基)哌嗪-1-基)-1-(苯硫基)丁-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)-4-(4-((4'-氯代-4,4-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺(36)的制备
将hatu(30mg)添加到在2mldcm中的化合物35(50mg)、4-叠氮丁酸(6.7mg)、dipea(13.5μl)的混合物。将混合物在室温下搅拌1小时。在减压下去除溶剂并且将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到40mg化合物36。产率72％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.35(d,j＝2.2hz,1h),8.11(dd,j＝9.2,2.2hz,1h),7.67(d,j＝8.9hz,2h),7.40–7.35(m,2h),7.34–7.27(m,3h),7.26–7.24(m,2h),7.09(d,j＝8.5hz,1h),7.02–6.96(m,2h),6.76(d,j＝9.0hz,2h),6.58(d,j＝9.4hz,1h),3.99–3.81(m,1h),3.72–3.60(m,1h),3.53–3.33(m,5h),3.32–3.22(m,4h),3.11(dd,j＝13.8,4.9hz,1h),3.00(dd,j＝13.8,7.5hz,1h),2.87(s,2h),2.51–2.20(m,14h),2.19–2.08(m,1h),2.06–1.99(m,2h),1.97–1.85(m,2h),1.71–1.64(m,1h),1.46(t,j＝6.4hz,2h),0.97(s,6h)ppm。
4-(4-((4'-氯代-4,4-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-(((2r)-4-(4-(4-(4-((2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)丁酰基)哌嗪-1-基)-1-(苯硫基)丁-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺(xz-14439)的制备
向在氩气下的在2mlt-buoh-thf(1:1，v/v)中的化合物36(7.5mg)、化合物9(3.7mg)的混合物添加在0.4ml水中的cuso4·5h2o(0.35mg)和抗坏血酸钠(0.28mg)。将混合物在50℃下搅拌3小时并且用dcm萃取。将有机相用盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到5.9mgxz14439。产率56％。1hnmr(400mhz,cdcl3和cd3od)δ8.33(s,1h),8.10(d,j＝7.8hz,1h),7.79–7.65(m,3h),7.54–7.44(m,1h),7.43–7.35(m,2h),7.33–7.32(m,1h),7.30–7.22(m,4h),7.12–7.02(m,2h),6.99(d,j＝8.3hz,2h),6.92(d,j＝8.6hz,1h),6.77(d,j＝8.9hz,2h),6.61(d,j＝9.3hz,1h),5.02–4.85(m,1h),4.66(s,2h),4.41(t,j＝6.6hz,2h),4.00–3.79(m,1h),3.80–3.58(m,12h),3.52–3.38(m,4h),3.31–3.23(m,4h),3.12(dd,j＝13.8,5.0hz,1h),3.02(dd,j＝13.9,7.3hz,1h),2.84–2.77(m,5h),2.50–2.06(m,18h),2.01(s,2h),1.74–1.63(m,1h),1.46(t,j＝6.4hz,2h),0.98(s,6h)ppm。
实施例7：pz-15227的合成
4-(4-((4'-氯代-4,4-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-(((2r)-4-(4-(4-(4-((2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)丁酰基)哌嗪-1-基)-1-(苯硫基)丁-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺(pz-15227)的制备
向在氩气下的在3mlt-buoh-thf(1:2，v/v)中的化合物36(25.0mg)、化合物18(11.0mg)的混合物添加在0.3ml水中的cuso4·5h2o(1.15mg)和抗坏血酸钠(0.91mg)。将混合物在50℃下搅拌过夜并且用dcm萃取。将有机相用盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到23mgpz15227。产率67％。1hnmr(400mhz,cdcl3和cd3od)δ9.05(brs,1h),8.36(s,1h),8.10(d,j＝7.8hz,1h),7.79–7.64(m,3h),7.54–7.42(m,1h),7.43–7.22(m,7h),7.10–7.02(m,2h),6.99(d,j＝7.2hz,2h),6.92(d,j＝8.8hz,1h),6.77(d,j＝8.8hz,2h),6.61(d,j＝9.3hz,1h),6.50(brs,1h),4.99–4.85(m,1h),4.69(s,2h),4.42–4.37(m,2h),4.00–3.77(m,1h),3.80–3.58(m,8h),3.52–3.20(m,8h),3.12–3.00(m,2h),2.84–2.75(m,5h),2.45–1.98(m,20h),1.74–1.60(m,1h),1.46(t,j＝6.4hz,2h),0.97(s,6h)ppm。
实施例8：xz-14509的合成
4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-2-(2-氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(39)的制备
将在5mldmf中的化合物7(200mg)、胺37(178mg)和dipea(240μl)在90℃下搅拌16小时。将水添加到反应混合物并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将所得的混合物通过柱色谱法纯化以得到183mg化合物38。产率50％。向在5mldcm中的化合物38(160mg)的混合物添加0.5mltfa。将混合物在室温下搅拌2h并且在减压下蒸发溶剂。将盐用et2o洗涤以得到纯化合物39。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.63(brs,1h),7.82(brs,2h),7.48(dd,j＝8.4,7.2hz,1h),7.04(d,j＝7.0hz,1h),6.87(d,j＝8.5hz,1h),5.13–4.82(m,1h),3.85–3.60(m,8h),3.55–3.37(m,2h),3.28–3.12(m,2h),2.81–2.58(m,3h),2.09–1.88(m,1h)ppm。
4-((r)-3-(4-(n-(4-(4-((2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基环己-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯氨基)-4-(苯硫基)丁基)-n-(2-(2-(2-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-甲酰胺(xz-14509)的制备
将在3mldcm中的化合物39(20mg)、羰基二咪唑(cdi)(10mg)和tea(7.0μl)的混合物在室温下搅拌2小时。然后将化合物35(15mg)和dipea(0.05ml)添加到以上溶液中。将混合物搅拌过夜并且通过添加nh4cl(水溶液)猝灭、用dcm萃取，并且将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到6.7mg化合物xz14509。产率31％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.24(brs,1h),8.35(s,1h),8.14–7.98(m,1h),7.81–7.62(m,2h),7.52–7.40(m,1h),7.39–7.27(m,4h),7.24–7.15(m,1h),7.12–6.94(m,4h),6.87(d,j＝8.6hz,1h),6.73(d,j＝7.2hz,2h),6.66–6.57(m,1h),6.56–6.46(m,1h),5.20–5.02(brs,1h),5.00–4.83(m,1h),3.95–3.81(m,1h),3.75–3.69(m,2h),3.67–3.61(m,4h),3.61–3.53(m,2h),3.49–3.38(m,4h),3.38–3.18(m,8h),3.12–2.95(m,2h),2.88–2.66(m,5h),2.47–2.18(m,12h),2.17–1.98(m,4h),1.69–1.57(m,1h),1.46(t,j＝6.3hz,2h),0.97(s,6h)ppm。
实施例9：xz-14516的合成
4-(4-((2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基环己-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-n-(4-((2r)-4-(4-(2-(2-(2-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基氨基)乙氧基)乙氧基)乙基硫代氨基甲酰基)哌嗪-1-基)-1-(苯硫基)丁-2-基氨基)-3-(三氟甲基磺酰基)苯基磺酰基)苯甲酰胺(xz-14516)的制备
将在2mldcm中的化合物39(12mg)、1,1'-硫代羰基二咪唑(6mg)和tea(4.2μl)的混合物在室温下搅拌1小时。然后将化合物35(6.5mg)和dipea(0.05ml)添加到以上溶液中。将混合物搅拌过夜并且通过添加nh4cl(水溶液)猝灭。随后，将它用dcm并且将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到6.4mg化合物xz14516。产率68％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.90(brs,1h),8.37(d,j＝2.1hz,1h),8.15–8.00(m,1h),7.65(d,j＝7.6hz,2h),7.51–7.42(m,1h),7.38–7.27(m,5h),7.12–7.05(m,2h),6.99(d,j＝8.4hz,2h),6.87(d,j＝8.5hz,1h),6.75(dd,j＝9.0,3.8hz,2h),6.62(dd,j＝12.9,9.5hz,1h),6.51(t,j＝5.2hz,1h),6.22(brs,1h),4.95–4.80(m,1h),3.90–3.61(m,15h),3.48–3.41(m,2h),3.30–3.20(m,4h),3.13–2.96(m,2h),2.88–2.71(m,5h),2.47–2.22(m,12h),2.13–2.00(m,4h),1.75–1.70(m,1h),1.46(t,j＝6.4hz,2h),0.99(s,6h)ppm。
实施例10：xz-14515、xz-14510和xz-14540的合成
用于制备41a-c的一般程序
将在dmf中的化合物7(1.0当量)、对应的胺40a-c(1.0当量)和dipea(2.0当量)的混合物在90℃下搅拌过夜。将混合物倒入水中并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用etoac和己烷作为洗脱液通过柱色谱法纯化。
用于制备42a-c的一般程序
向在dcm中的化合物41a、41b或41c的混合物添加tfa。将混合物在室温下搅拌过夜并且在减压下去除溶剂。将粗产物用et2o洗涤以分别得到对应的酸42a、42b和42c。
4-(4-((4'-氯代-4,4-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-(((2r)-4-(4-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)哌嗪-1-基)-1-(苯硫基)丁-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺(xz-14515)的制备
将在3mldcm中的化合物35(10mg)、42a(5.5mg)、hatu(4mg)和dipea(20mg)的混合物在室温下搅拌1小时。然后将nh4cl(水溶液)添加到混合物并且将所得的混合物用dcm萃取。将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到6.6mg纯xz-14515。产率47％。1hnmr(400mhz,cdcl3和cd3od)δ9.11(brs,1h),8.36(s,1h),8.08(d,j＝9.1hz,1h),7.66(d,j＝8.2hz,2h),7.46(t,j＝7.8hz,1h),7.39–7.27(m,6h),7.14–7.02(m,2h),6.98(d,j＝8.3hz,2h),6.88(d,j＝8.5hz,1h),6.75(d,j＝8.6hz,2h),6.58(d,j＝5.8hz,1h),6.52–6.43(brs,1h),4.91–4.81(m,1h),4.26–4.15(m,2h),3.94–3.81(m,1h),3.70–3.33(m,12h),3.31–3.22(m,4h),3.12–2.93(m,2h),2.89–2.55(m,5h),2.49–2.00(m,16h),1.74–1.70(m,1h),1.51–1.45(m,2h),0.98(s,6h)ppm。
4-(4-((4'-氯代-4,4-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-(((2r)-4-(4-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)哌嗪-1-基)-1-(苯硫基)丁-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺(xz-14510)的制备
将在3mldcm中的化合物35(10mg)、42b(5mg)、hatu(4mg)和dipea(20mg)的混合物在室温下搅拌1小时。然后将nh4cl(水溶液)添加到混合物并且将所得的混合物用dcm萃取。将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到6.2mg纯xz-14510。产率44％。1hnmr(400mhz,cdcl3和cd3od)δ8.33–8.28(m,1h),8.07(d,j＝9.0hz,1h),7.78(d,j＝8.8hz,2h),7.54–7.45(m,1h),7.41–7.37(m,1h),7.33–7.20(m,5h),7.09(d,j＝7.1hz,1h),7.06–6.98(m,3h),6.94(d,j＝8.6hz,1h),6.79(d,j＝8.9hz,2h),6.61(d,j＝9.4hz,1h),5.00–4.86(m,1h),4.21(s,2h),3.93–3.84(m,1h),3.70–3.39(m,16h),3.32–3.25(m,4h),3.12–3.00(m,2h),2.93–2.71(m,5h),2.46–2.24(m,12h),2.09–2.00(m,4h),1.75–1.63(m,1h),1.47(t,j＝6.3hz,2h),0.99(s,6h)ppm。
4-(4-((4'-氯代-4,4-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-(((2r)-4-(4-(14-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)-3,6,9,12-四氧杂十四烷酰基)哌嗪-1-基)-1-(苯硫基)丁-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺(xz-14540)的制备
将在3mldcm中的化合物35(12mg)、42c(8.2mg)、hatu(5mg)和dipea(30mg)的混合物在室温下搅拌2小时。然后将nh4cl(水溶液)添加到混合物并且将所得的混合物用dcm萃取。将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到13.6mg纯xz14540。产率76％。1hnmr(400mhz,cdcl3和cd3od)δ8.81(brs,1h),8.33(s,1h),8.13–7.99(m,1h),7.79–7.60(m,2h),7.45(t,j＝7.8hz,1h),7.38–7.26(m,5h),7.24–7.17(m,1h),7.12–6.94(m,4h),6.88(d,j＝8.6hz,1h),6.73(d,j＝8.8hz,2h),6.61–6.50(m,1h),6.46(brs,1h),4.95–4.84(m,1h),4.16(s,2h),3.88–3.80(m,1h),3.72–3.39(m,20h),3.32–3.25(m,4h),3.12–3.01(m,2h),2.93–2.71(m,5h),2.46–2.24(m,12h),2.09–2.00(m,4h),1.75–1.63(m,1h),1.47(t,j＝6.3hz,2h),0.96(s,6h)ppm。
实施例11：xz-15416、xz-15405和xz-15418的合成
用于制备44a-c的一般程序
将在dmf中的化合物7(1.0当量)、对应的胺43a-c(1.0当量)和dipea(2.0当量)的混合物在90℃下搅拌过夜。将混合物倒入水中并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化。
2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(44a)的制备
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.25(brs,1h),7.58–7.46(m,1h),7.11(d,j＝7.1hz,1h),6.91(d,j＝8.5hz,1h),6.57(t,j＝5.4hz,1h),4.92(dd,j＝12.2,5.3hz,1h),3.81–3.71(m,4h),3.66–3.61(m,2h),3.48(dd,j＝10.7,5.3hz,2h),2.92–2.67(m,3h),2.32(brs,1h),2.18–2.07(m,1h)ppm。
2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(44b)的制备
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.19(brs,1h),7.55–7.44(m,1h),7.10(d,j＝7.1hz,1h),6.91(d,j＝8.5hz,1h),6.57(t,j＝5.2hz,1h),4.91(dd,j＝12.0,5.4hz,1h),3.85–3.65(m,8h),3.64–3.59(m,2h),3.51–3.43(m,2h),2.92–2.68(m,3h),2.57(brs,1h),2.18–2.07(m,1h)ppm。
2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(44c)的制备
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.23(brs,1h),7.58–7.40(m,1h),7.10(d,j＝7.1hz,1h),6.92(d,j＝8.6hz,1h),6.52(t,j＝5.5hz,1h),4.92(dd,j＝12.0,5.4hz,1h),3.77–3.65(m,12h),3.63–3.58(m,2h),3.52–3.44(m,2h),3.00–2.59(m,4h),2.24–2.04(m,1h)ppm。
用于制备45a-c的一般程序
向在dcm中的44a、44b或44c(1.0当量)、tea(4.0当量)的混合物添加mscl(1.2当量)。将混合物在室温下搅拌3小时。然后将混合物倒入水中并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化。
2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙基甲磺酸酯(45a)的制备
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.10(brs,1h),7.63–7.44(m,1h),7.12(d,j＝7.1hz,1h),6.93(d,j＝8.5hz,1h),6.49(t,j＝5.5hz,1h),4.91(dd,j＝12.1,5.3hz,1h),4.48–4.35(m,2h),3.86–3.66(m,4h),3.58–3.41(m,2h),3.13–2.69(m,6h),2.23–2.05(m,1h)ppm。
2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基甲磺酸酯(45b)的制备
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.14(brs,1h),7.65–7.45(m,1h),7.12(d,j＝7.1hz,1h),6.91(d,j＝8.5hz,1h),6.51(t,j＝5.1hz,1h),4.94(dd,j＝12.0,5.3hz,1h),4.39(dd,j＝5.3,3.7hz,2h),4.00–3.66(m,8h),3.52–3.44(m,2h),3.05(s,3h),2.93–2.62(m,3h),2.28–2.06(m,1h)ppm。
2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基甲磺酸酯(45c)的制备
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.20(brs,1h),7.60–7.41(m,1h),7.10(d,j＝7.1hz,1h),6.92(d,j＝8.5hz,1h),6.48(t,j＝5.6hz,1h),4.92(dd,j＝11.8,5.4hz,1h),4.36(dd,j＝5.3,3.7hz,2h),3.82–3.60(m,12h),3.54–3.40(m,2h),3.07(s,3h),2.98–2.65(m,3h),2.24–2.06(m,1h)ppm。
4-(4-((4'-氯代-4,4-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-(((2r)-4-(4-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)-1-(苯硫基)丁-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺(xz-15416)的制备
将在2ml1,4-二噁烷中的化合物35(25mg)、45a(12mg)、dipea(60μl)和nai(1.6mg)的混合物在90℃下加热过夜。然后将混合物倒入水中并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、nh4cl(水溶液)洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到8.8mg纯xz-15416。产率26％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.35(s,1h),8.09–7.98(m,1h),7.72(d,j＝8.7hz,2h),7.48(t,j＝7.9hz,1h),7.40–7.29(m,5h),7.25–7.20(m,1h),7.10(d,j＝7.1hz,1h),7.06–6.95(m,3h),6.89(d,j＝8.4hz,1h),6.73(d,j＝9.1hz,2h),6.66–6.55(m,1h),6.53–6.42(m,1h),4.98–4.82(m,1h),3.93–3.80(m,1h),3.76–3.40(m,6h),3.32–2.64(m,17h),2.43–1.97(m,16h),1.70–1.66(m,1h),1.52–1.41(m,2h),1.01–0.95(m,6h)ppm。
4-(4-((4'-氯代-4,4-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-(((2r)-4-(4-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)-1-(苯硫基)丁-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺(xz-15405)的制备
将在2ml1,4-二噁烷中的化合物35(10mg)、45b(6mg)、tea(20μl)和nai(1.0mg)的混合物在80℃下加热过夜。然后将反应混合物倒入水中并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、nh4cl(水溶液)洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到5.8mg纯xz-15405。产率42％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.33(s,1h),8.02(t,j＝8.9hz,1h),7.76(d,j＝7.0hz,2h),7.52–7.46(m,1h),7.41–7.33(m,2h),7.32–7.27(m,3h),7.25–7.21(m,1h),7.10(dd,j＝7.1,2.3hz,1h),7.04–6.92(m,3h),6.88(d,j＝8.6hz,1h),6.75(d,j＝8.4hz,2h),6.56–6.40(m,2h),4.96–4.73(m,1h),3.86–3.40(m,11h),3.33–2.51(m,17h),2.50–1.79(m,16h),1.74–1.60(m,1h),1.48–1.37(m,2h),0.95(d,j＝5.4hz,6h)ppm。
4-(4-((4'-氯代-4,4-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-(((2r)-4-(4-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)-1-(苯硫基)丁-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺(xz-15418)的制备
将在3ml1,4-二噁烷中的化合物35(42mg)、45c(24mg)、dipea(100μl)和nai(3mg)的混合物在90℃下加热过夜。然后将反应混合物倒入水中并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、nh4cl(水溶液)洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到16.4mg纯xz-15418。产率25％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.31(s,1h),8.01(d,j＝8.9hz,1h),7.81(d,j＝8.5hz,2h),7.47(t,j＝7.8hz,1h),7.38–7.28(m,5h),7.25–7.21(m,1h),7.08(d,j＝7.1hz,1h),6.99(d,j＝8.3hz,2h),6.96–6.85(m,2h),6.75(d,j＝8.7hz,2h),6.54–6.43(m,2h),4.96–4.83(m,1h),3.90–3.39(m,15h),3.28–2.68(m,17h),2.51–1.95(m,16h),1.61–1.57(m,1h),1.47–1.41(m,2h),0.97–0.93(m,6h)ppm。
实施例12：xz-15421的合成
(r)-n-(4-(4-(4-(2-叠氮乙酰基)哌嗪-1-基)-1-(苯硫基)丁-2-基氨基)-3-(三氟甲基磺酰基)苯基磺酰基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基环己-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺(46)的制备
向在5mldcm中的化合物35(48mg)、2-叠氮乙酸(8mg)和dipea(13μl)的混合物添加hatu(21mg)。将混合物在室温下搅拌3小时。在减压下去除溶剂并且将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到48mg化合物46。产率87％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.35(d,j＝1.9hz,1h),8.11(dd,j＝9.1,1.8hz,1h),7.66(d,j＝8.8hz,2h),7.40–7.26(m,6h),7.08(d,j＝8.4hz,1h),6.98(d,j＝8.3hz,2h),6.76(d,j＝8.8hz,2h),6.57(d,j＝9.4hz,1h),3.93–3.81(m,3h),3.74–3.64(m,1h),3.55–3.42(m,1h),3.36–3.22(m,6h),3.11(dd,j＝13.8,4.8hz,1h),2.99(dd,j＝13.8,7.5hz,1h),2.85(s,2h),2.50–2.21(m,12h),2.20–2.08(m,1h),2.03–1.96(m,2h),1.75–1.61(m,1h),1.46(t,j＝6.4hz,2h),0.97(s,6h)ppm。
4-(4-((2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基环己-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-n-(4-((2r)-4-(4-(2-(4-((2-(2-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基氨基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)乙酰基)哌嗪-1-基)-1-(苯硫基)丁-2-基氨基)-3-(三氟甲基磺酰基)苯基磺酰基)苯甲酰胺(xz-15421)的制备
向在氩气下的在2mlt-buoh-thf(1:1，v/v)中的化合物46(24.0mg)和化合物18(11.0mg)的混合物添加在0.3ml水中的cuso4·5h2o(1.15mg)和抗坏血酸钠(0.91mg)。将混合物在50℃下搅拌2小时并且用dcm萃取。将有机相用盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到16.4mgxz-15421。产率50％。1hnmr(400mhz,d6-丙酮)δ9.91(s,1h),8.34(s,1h),8.10(d,j＝9.2hz,1h),7.92–7.78(m,3h),7.66–7.55(m,1h),7.48–7.20(m,7h),7.17–7.00(m,6h),6.90(d,j＝8.6hz,2h),6.70–6.54(m,1h),5.31(s,2h),5.14–5.05(m,1h),4.63(s,2h),4.33–4.25(m,1h),3.79–3.20(m,20h),3.02–2.83(m,5h),2.58–2.11(m,14h),1.87–1.82(m,1h),1.48(t,j＝6.4hz,2h),1.00(s,6h)ppm。
实施例13：xz-14529的合成
2,2-二甲基-4,15-二氧代-3,8,11-三氧杂-5,14-二氮杂十八烷-18-油酸(47)的制备
将在10mldcm中的化合物37(250mg)、二氢呋喃-2,5-二酮(120mg)和tea(210μl)的混合物在室温下搅拌过夜。然后将反应混合物倒入水中并且用dcm萃取。将有机相用1nhcl(水溶液)洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥以得到320mg化合物47。产率92％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.72–3.51(m,8h),3.49–3.42(m,2h),3.39–3.26(m,2h),2.74–2.62(m,2h),2.58–2.44(m,2h),1.46(s,9h)ppm。
((s)-15-((2s,4r)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-16,16-二甲基-10,13-二氧代-3,6-二氧杂-9,14-二氮杂十七烷基)氨基甲酸叔丁酯(48)的制备
向在10mldcm中的化合物47(100mg)、化合物24(190mg)和dipea(167μl)的混合物添加116mghatu。将所得的混合物在室温下搅拌2小时，然后倒入水中并且用dcm萃取。将有机相用盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥以得到136mg化合物48。产率62％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.67(s,1h),7.53(brs,1h),7.40–7.29(m,4h),6.97(brs,1h),6.53(brs,1h),5.12(brs,1h),4.72(t,j＝8.0hz,1h),4.62–4.44(m,3h),4.33(dd,j＝15.0,5.3hz,1h),4.12–3.91(m,1h),3.65–3.46(m,9h),3.45–3.22(m,4h),2.55–2.37(m,8h),2.21–2.09(m,1h),1.43(s,9h),0.91(s,9h)ppm。
n1-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-n4-((s)-1-((2s,4r)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)琥珀酰胺(49)的制备
向在10mldcm中的化合物48(100mg)的混合物添加tfa(440μl)。将反应在室温下搅拌2天。然后将它用nahco3(水溶液)中和并且用dcm萃取。将有机相用盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥以得到粗产物，所述粗产物可用于下一步骤而无需进一步纯化。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.67(s,1h),7.67–7.58(m,1h),7.39–7.28(m,5h),6.94(d,j＝8.2hz,1h),4.70(t,j＝8.3hz,1h),4.56–4.30(m,4h),4.03(d,j＝10.9hz,1h),3.64–3.49(m,9h),3.43–3.34(m,2h),2.89(t,j＝4.9hz,2h),2.57–2.36(m,8h),2.20–2.13(m,1h),0.95(s,9h)ppm。
n1-(2-(2-(2-(4-((r)-3-((4-(n-(4-(4-((4'-氯代-4,4-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌嗪-1-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)-n4-((s)-1-((2s,4r)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)琥珀酰胺(xz-14529)的制备
将在2mlthf中的化合物49(26mg)和cdi(7.7mg)的混合物在室温下搅拌1小时。然后添加化合物35(14.6mg)和dipea(0.05ml)。将混合物搅拌过夜并且通过添加nh4cl(水溶液)猝灭、用dcm萃取，并且将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到21.1mg化合物xz-14529。产率85％。1hnmr(400mhz,cdcl3和cd3od)δ8.70(s,1h),8.32(s,1h),8.03(d,j＝8.8hz,1h),7.95–7.76(m,3h),7.50–7.38(m,2h),7.37–7.34(m,4h),7.32–7.17(m,5h),7.06–6.95(m,3h),6.78(d,j＝8.9hz,2h),6.65(d,j＝9.4hz,1h),5.87–5.72(m,1h),4.66–4.47(m,4h),4.45–4.33(m,1h),4.01–3.22(m,23h),3.16–3.03(m,2h),2.84(s,2h),2.52–1.98(m,24h),1.75–1.63(m,1h),1.48(t,j＝6.3hz,2h),0.99(m,15h)ppm。
实施例14：xz-14523的合成
4-((4-(n-(2-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-硝基苯基氨基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(52)的制备
将在20mldcm中的化合物50(571mg)、51(415mg)、dmap(244mg)、edci(250mg)和tea(280μl)的混合物在室温下搅拌过夜。在减压下去除溶剂并且将残余物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到呈黄色固体的758mg纯产物。产率79％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.14(brs,1h),9.72(brs,1h),8.89(d,j＝2.2hz,1h),8.52(t,j＝5.4hz,1h),8.21(d,j＝2.5hz,1h),8.16(dd,j＝9.2,2.1hz,1h),7.95(d,j＝9.1hz,1h),7.71(d,j＝2.5hz,1h),7.53–7.43(m,1h),7.22(d,j＝8.4hz,2h),6.94–6.83(m,3h),6.60–6.47(m,2h),5.98(d,j＝2.1hz,1h),4.27–4.13(m,2h),3.32–3.20(m,2h),3.13–3.01(m,4h),2.83–2.65(m,4h),2.26–2.10(m,6h),1.96(s,2h),1.92–1.74(m,3h),1.47(s,9h),1.40(t,j＝6.4hz,2h),1.25–1.18(m,2h),0.93(s,6h)ppm。
2-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-n-(3-硝基-4-(哌啶-4-基甲基氨基)苯基磺酰基)苯甲酰胺(53)的制备
向在20mldcm中的化合物52(578mg)的溶液添加tfa(440μl)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。在减压下去除溶剂并且将et2o添加到残余物。通过过滤采集沉淀的固体并且可将其直接用于下一步骤而无需进一步纯化。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ11.88–11.54(m,2h),9.34(brs,1h),8.66(t,j＝6.1hz,1h),8.59–8.45(m,2h),8.29–8.08(m,1h),8.01(d,j＝2.6hz,1h),7.80(dd,j＝9.2,2.2hz,1h),7.57–7.45(m,3h),7.36(d,j＝8.4hz,2h),7.12(d,j＝9.4hz,1h),7.05(d,j＝8.3hz,2h),6.69(dd,j＝9.0,2.0hz,1h),6.37(dd,j＝3.3,1.9hz,1h),6.22(s,1h),3.84–3.44(m,4h),3.39–3.15(m,6h),3.10–2.60(m,6h),2.22–2.10(m,2h),2.04–1.76(m,5h),1.49–1.26(m,4h),0.91(s,6h)ppm。
2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-n-((4-(((1-(4-叠氮丁酰基)哌啶-4-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-4-(4-((4'-氯代-5,5-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺(54)的制备
向在5mldcm中的化合物53(60mg)、4-叠氮丁酸(7mg)和dipea(42μl)的溶液添加hatu(20mg)。将所得的混合物在室温下搅拌2小时。在减压下去除溶剂并且将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到46mg化合物54。产率94％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.14(brs,1h),9.46(s,1h),8.90(d,j＝2.2hz,1h),8.52(t,j＝5.4hz,1h),8.27–8.10(m,2h),7.95(d,j＝9.1hz,1h),7.71(d,j＝2.5hz,1h),7.51–7.44(m,1h),7.22(d,j＝8.4hz,2h),7.01–6.76(m,3h),6.62–6.43(m,2h),5.98(d,j＝2.1hz,1h),4.72(d,j＝13.5hz,1h),3.94(d,j＝13.8hz,1h),3.40(t,j＝6.4hz,2h),3.34–3.20(m,2h),3.13–2.98(m,5h),2.74(s,2h),2.58(t,j＝11.7hz,1h),2.44(t,j＝7.2hz,2h),2.29–2.09(m,6h),2.04–1.82(m,7h),1.40(t,j＝6.4hz,2h),1.28–1.18(m,2h),0.93(s,6h)ppm。
2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯代-5,5-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-(((1-(4-(4-((2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)丁酰基)哌啶-4-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)苯甲酰胺(xz-14523)的制备
向在氩气下的在2mlt-buoh-thf(1:1，v/v)中的化合物54(20.0mg)、化合物9(10.0mg)的混合物添加在0.3ml水中的cuso4·5h2o(1.0mg)和抗坏血酸钠(0.8mg)。将混合物在55℃下搅拌3小时并且用dcm萃取。将有机相用盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到23.2mgxz-15423。产率82％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.07(brs,1h),9.88(brs,1h),9.61(brs,1h),8.89(d,j＝2.2hz,1h),8.64–8.46(m,1h),8.19(d,j＝2.5hz,1h),8.07(d,j＝9.2hz,1h),7.93(d,j＝9.1hz,1h),7.69(d,j＝2.5hz,1h),7.62(s,1h),7.52–7.42(m,2h),7.23(d,j＝8.3hz,2h),7.08(d,j＝7.1hz,1h),6.96–6.83(m,4h),6.61–6.39(m,3h),5.98(d,j＝2.0hz,1h),4.98–4.90(m,1h),4.76–4.63(m,3h),4.53–4.37(m,2h),3.88–3.62(m,11h),3.50–3.41(m,2h),3.33–3.22(m,2h),3.10–3.02(m,4h),3.02–2.69(m,6h),2.55(t,j＝11.8hz,1h),2.38–2.11(m,11h),2.00–1.80(m,5h),1.41(t,j＝7.3hz,2h),1.27–1.21(m,2h),0.93(s,6h)ppm。
实施例15：xz-14522的合成
2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯代-5,5-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-(((1-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)哌啶-4-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)苯甲酰胺(xz-14522)的制备
将在3mldcm中的化合物53(12mg)、化合物42b(5mg)、hatu(4mg)和dipea(20mg)的溶液在室温下搅拌2小时。然后添加nh4cl(水溶液)并且将其用dcm萃取。将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到10.8mg纯xz-14522。产率82％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.24(d,j＝6.9hz,1h),10.10(brs,1h),9.82(brs,1h),8.87(s,1h),8.49(t,j＝5.3hz,1h),8.16(d,j＝2.1hz,1h),8.07(d,j＝9.0hz,1h),7.92(d,j＝9.1hz,1h),7.75–7.62(m,1h),7.54–7.41(m,2h),7.23(d,j＝8.3hz,2h),7.08(d,j＝7.1hz,1h),6.99–6.78(m,4h),6.60–6.43(m,3h),6.04–5.81(m,1h),5.01–4.85(m,1h),4.63(d,j＝12.5hz,1h),4.39–4.00(m,3h),3.75–3.64(m,10h),3.52–3.40(m,2h),3.31–2.67(m,12h),2.59(t,j＝12.4hz,1h),2.27–1.81(m,12h),1.46–1.38(m,2h),1.26–1.24(m,2h),0.93(s,6h)ppm。
实施例16：xz-14528的合成
n1-(2-(2-(2-(4-(((4-(n-(2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯代-5,5-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯基]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-硝基苯基)氨基)甲基)哌啶-1-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)-n4-((s)-1-((2s,4r)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基)琥珀酰胺(xz-14528)的制备
将在2mlthf中的化合物49(26mg)和cdi(7.7mg)的混合物在室温下搅拌1小时。然后添加化合物53(18.1mg)和dipea(0.05ml)。将混合物搅拌过夜并且通过添加nh4cl(水溶液)猝灭、用dcm萃取，并且将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到16.8mg化合物xz-14528。产率72％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.49(s,1h),8.85(d,j＝2.2hz,1h),8.67(s,1h),8.57–8.43(m,1h),8.15(d,j＝2.5hz,1h),7.99(d,j＝9.2hz,1h),7.92(d,j＝9.1hz,1h),7.62(d,j＝2.4hz,1h),7.46–7.40(m,2h),7.38–7.32(m,4h),7.23(d,j＝8.3hz,2h),6.97–6.88(m,3h),6.80(d,j＝9.4hz,1h),6.62–6.47(m,3h),6.02(d,j＝1.7hz,1h),5.24–5.17(m,1h),4.73(t,j＝8.0hz,1h),4.63–4.47(m,3h),4.35(dd,j＝15.0,5.2hz,1h),4.10–3.89(m,4h),3.64–3.47(m,12h),3.46–3.37(m,4h),3.24(t,j＝6.1hz,2h),3.15–3.01(m,4h),2.87–2.71(m,4h),2.60–2.38(m,8h),2.20–1.76(m,8h),1.42–1.34(m,2h),1.28–1.24(m,2h),0.98–0.92(m,15h)ppm。
实施例17：xz-15434的合成
2-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-n-(4-((1-(2-(2-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基氨基)乙氧基)乙基)哌啶-4-基)甲基氨基)-3-硝基苯基磺酰基)苯甲酰胺(xz-15434)的制备
将在2ml1,4-二噁烷中的化合物53(37mg)、化合物45a(14mg)、dipea(100μl)和nai(3mg)的混合物在90℃下加热过夜。然后将混合物倒入水中并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、nh4cl(水溶液)洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到10.7mg化合物xz-15434。产率31％。1hnmr(400mhz,cdcl3和cd3od)δ8.77(s,1h),8.43(s,1h),8.04(s,1h),7.94–7.83(m,2h),7.59(s,1h),7.50(dd,j＝8.5,7.2hz,1h),7.42(d,j＝3.4hz,1h),7.26–7.17(m,2h),7.09(d,j＝7.0hz,1h),6.96–6.87(m,3h),6.75(s,1h),6.55(dd,j＝9.1,2.1hz,1h),6.45(d,j＝2.8hz,1h),6.03(s,1h),5.00–4.86(m,1h),3.96–3.88(m,2h),3.75–3.68(m,2h),3.57–3.44(m,4h),3.30–2.58(m,15h),2.24–1.83(m,12h),1.45–1.31(m,4h),0.92(s,6h)ppm。
实施例18：xz-15438的合成
2-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-n-(4-((1-(2-(2-(2-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌啶-4-基)甲基氨基)-3-硝基苯基磺酰基)苯甲酰胺(xz-15438)的制备
将在2ml1,4-二噁烷中的化合物53(37mg)、化合物45b(15mg)、dipea(100μl)和nai(3mg)的混合物在90℃下加热过夜。然后将混合物倒入水中并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、nh4cl(水溶液)洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到11.7mg化合物xz-15438。产率31％。1hnmr(400mhz,cdcl3和cd3od)δ10.61(brs,1h),10.19(brs,1h),8.81(s,1h),8.39(s,1h),8.04(s,1h),7.87(d,j＝8.9hz,1h),7.74(s,1h),7.62(s,1h),7.48(d,j＝8.0hz,2h),7.23(d,j＝8.2hz,2h),7.06(d,j＝7.0hz,1h),6.97–6.82(m,3h),6.70–6.43(m,4h),6.01(s,1h),5.15–4.90(m,1h),4.17–3.83(m,2h),3.78–3.58(m,8h),3.48–3.40(m,2h),3.21–2.73(m,15h),2.25–1.94(m,12h),1.45–1.33(m,4h),0.93(s,6h)ppm。
实施例19：xz-15436的合成
2-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-n-(4-((1-(2-(2-(2-(2-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌啶-4-基)甲基氨基)-3-硝基苯基磺酰基)苯甲酰胺(xz-15436)的制备
将在2ml1,4-二噁烷中的化合物53(37mg)、化合物45c(16mg)、dipea(100μl)和nai(3mg)的混合物在90℃下加热过夜。然后将混合物倒入水中并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、nh4cl(水溶液)洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到15.0mg化合物xz-15436。产率39％。1hnmr(400mhz,cdcl3和cd3od)δ10.59(brs,1h),10.06(brs,1h),8.83(d,j＝2.2hz,1h),8.43(t,j＝5.4hz,1h),8.11(d,j＝2.3hz,1h),7.90(d,j＝9.1hz,2h),7.63(d,j＝2.4hz,1h),7.54–7.42(m,2h),7.22(d,j＝8.4hz,2h),7.07(d,j＝7.1hz,1h),6.98–6.84(m,3h),6.73(d,j＝9.2hz,1h),6.61–6.45(m,3h),6.01(d,j＝2.0hz,1h),5.01–4.93(m,1h),3.94–3.79(m,2h),3.76–3.61(m,10h),3.54–3.40(m,4h),3.27–3.17(m,2h),3.16–2.43(m,13h),2.28–2.09(m,7h),1.98–1.82(m,5h),1.41(t,j＝6.4hz,2h),1.26–1.23(m,2h),0.93(s,6h)ppm。
实施例20：xz-14548的合成
1-((r)-3-((4-(n-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1h-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)氨磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯硫基)丁基)哌啶-4-基(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(xz-14548)的制备
将在1.5ml二氯乙烷中的bm1197(11.5mg)和cdi(10mg)的混合物在60℃下加热过夜。然后添加在0.5mldmso中的化合物39(5.5mg)和tea(0.3ml)的溶液并且将所得的混合物加热至70℃过夜。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并且用etoac萃取。将有机相用水洗涤一次、盐水洗涤一次、经na2so4干燥、过滤并蒸发至干燥。将粗产物使用dcm和甲醇作为洗脱液通过柱色谱法纯化以得到3.6mg化合物xz-14548。产率22％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.79(brs,1h),7.99(s,1h),7.65–7.56(m,1h),7.54–7.46(m,1h),7.37–7.27(m,4h),7.26–7.20(m,2h),7.14–7.05(m,3h),7.03–6.94(m,3h),6.91(d,j＝8.4hz,1h),6.81(d,j＝8.8hz,2h),6.70(s,1h),6.66–6.50(m,2h),6.43(d,j＝11.9hz,1h),6.30(d,j＝8.7hz,1h),5.34–5.26(m,1h),4.98–4.88(m,1h),4.73–4.55(m,1h),4.48–4.34(m,1h),3.96–3.81(m,1h),3.75–3.37(m,12h),3.22–3.03(m,10h),2.96–2.61(m,10h),2.57–2.43(m,1h),2.40–1.63(m,11h),1.45(d,j＝7.1hz,6h)ppm。
实施例21：评估式(i)和式(ii)的化合物的选择性地杀死衰老细胞的能力
将正常wi38细胞(nsc)和ir诱导的衰老wi38细胞(ir-sc)与媒介物或增加浓度的式(i)或式(ii)的化合物一起孵育72小时。将细胞用0.25％胰蛋白酶和1mmedta消化，并且在含有2％fbs的pbs中收获。在室温下在pbs中与碘化丙啶(pi，100ng/ml)一起孵育1分钟之后，将细胞以1,200rpm离心6分钟以去除pi，并且然后重悬浮在含有2％fbs的pbs中以供使用流式细胞仪进行分析。在恒定流速下通过流式细胞术分析活细胞(pi-细胞)以计数细胞的数量并计算为用媒介物处理的对照细胞的百分比。表1描绘式(i)的化合物和式(ii)的化合物针对正常wi38和ir诱导的衰老wi38的ec50值。
化合物11(xz-13861)(图2a)和xz-12906(图2b)两者均以剂量依赖性方式选择性地抑制ir-scwi38细胞但是不抑制正常wi38细胞。
实施例22：评估式(i)和式(ii)的化合物的杀死癌细胞的能力
将rs4；11和nci-h146癌细胞与媒介物或增加浓度的式(i)和式(ii)的化合物一起孵育。在处理后72小时，通过mts测量细胞活力并且将ec50计算为用媒介物处理的对照细胞的百分比。表1描绘式(i)和式(ii)的化合物针对rs4；11和nci-h146的ec50值。
表1：式(i)和式(ii)的化合物针对rs4；11和nci-h146的ec50值。
实施例23：衰老细胞中的蛋白质降解测定
将ir-scwi38细胞与媒介物或增加浓度的xz-14439在增加浓度的xz-14439下一起孵育18小时(图3a)并且在固定浓度的xz-14439下一起孵育增加的时间(图3b)。将细胞用0.25％胰蛋白酶和1mmedta消化，并且在具有1％磷酸酶抑制剂混合物3和1％蛋白酶抑制剂混合物的ripa裂解缓冲液中收获。在12％sds-page凝胶上解析来自每种细胞提取物的相当量的蛋白质(15-30μg/泳道)。通过电泳将蛋白质印迹到novexpvdf膜上。将膜用tbs-t阻断缓冲液(在25mmtris-hcl中的5％脱脂奶粉，ph7.4；3mmkcl；1n40mmnacl；以及0.05％tween)阻断，并且用一抗(在预先确定的最佳浓度下)在4℃下探测过夜或在室温下探测1小时。在用tbs-t充分洗涤之后，将膜在室温下与适当的过氧化物酶缀合的二抗一起孵育1小时。在用tbs-t洗涤三次之后，用ecl蛋白印迹检测试剂检测感兴趣的蛋白质并且用自动射线照相术(piercebiotech，rockford，il，usa)记录。一抗bcl-xl(#2762)、bcl-2抗体(#2872s)和β-肌动蛋白(13e5，#4970)购自cellsignaling公司。
xz-14439以剂量依赖性方式(图3a)和时间依赖性方式(图3b)两者消耗ir-scwi38细胞中的bcl-xl。
实施例24：癌细胞中的蛋白质降解测定
将ir-scwi38细胞(图4a)和rs4；11细胞(图4b)与媒介物或增加浓度的式(i)或式(ii)的化合物分别以1μm(图4a)和100nm(图4b)一起孵育6或16小时。在具有1％磷酸酶抑制剂混合物3和1％蛋白酶抑制剂混合物的ripa裂解缓冲液中收获细胞。在12％sds-page凝胶上解析来自每个细胞提取物的相当量的蛋白质(15-30μg/泳道)。通过电泳将蛋白质印迹到novexpvdf膜上。将膜用tbs-t阻断缓冲液(在25mmtris-hcl中的5％脱脂奶粉，ph7.4；3mmkcl；140mmnacl；以及0.05％tween)阻断，并且用一抗(在预先确定的最佳浓度下)在4℃下探测过夜或在室温下探测1小时。在用tbs-t充分洗涤之后，将膜在室温下与适当的过氧化物酶缀合的二抗(jacksonimmunoresearcheurope，suffolk，uk)一起孵育1小时。在用tbs-t洗涤三次之后，用ecl蛋白印迹检测试剂检测感兴趣的蛋白质并且用自动射线照相术记录。一抗bcl-xl(#2762)、bcl-2抗体(#2872s)、bcl-w(#2724s)、mcl-1(#5453s)和β-肌动蛋白(13e5，#4970)购自cellsignaling公司。
xz-15416、xz-15405、xz-15418、xz-15421和pz-15227在1μm(图4a)和200nm(图4b)处消耗ir-scwi38细胞和rs4；11细胞中的bcl-xl。
参考文献：
aguilar，a.，etal.，(2013)apotentandhighlyefficaciousbcl-2/bcl-xlinhibitor，jmedchem56：3048-3067.
bai.l.，etal.(2014)bm-1197：anovelandspecificbcl-2/bcl-xlinhibitorinducingcompleteandlong-lastingtumorregressioninvivo，plosone9：e99404.
baker，d.j.，etal.，(2011)clearanceofp16ink4a-positivesenescentcellsdelaysageing-associateddisorders，nature479：232-236.
baker，d.j.，etal.，(2016)naturallyoccurringp16(ink4a)-positivecellsshortenhealthylifespan，nature530184-189.
bajwa，n.，etal.，(2012)inhibitorsoftheanti-apoptoticbcl-2proteins：apatentreview，expertopin.ther.patents22：37-55.
bruncko，m.，etal.，(2007)studiesleadingtopotent，dualinhibitorsofbcl-2andbcl-xl，jmedchem50∶641-662.
bruncko，m.，etal.，(2015)structure-guideddesignofaseriesofmcl-1inhibitorswithhighaffinityandselectivity，jmedchem58：2180-2194.
campisi，j.，(2005)senescentcells，tumorsuppression，andorganismalaging：goodcitizens，badneighbors，cell120：513-522.
campisi，j.，(2011)cellularsenescence：puttingtheparadoxesinperspective，curr.opin.genet.dev.21：107-112.chang，j.，etal.，(2016)clearanceofsenescentcellsbyabt263rejuvenatesagedhematopoieticstemcellsinmice，nat.med.22：78-83.
chen，j.，etal.，(2012)structure-baseddiscoveryofbm-957asapotentsmall-moleculeinhibitorofbcl-2andbcl-xlcapableofachievingcompletetumorregression，jmedchem55：8502-8514.
delbridge，a.r.，etal.，(2016)thirtyyearsofbcl-2：translatingcelldeathdiscoveriesintonovelcancertherapies，nat.rev.cancer16：99-109.
jing，l.，etal.，(2015)hijackingthee3ubiquitinligasecereblontoefficientlytargetbrd4，chem.biol.22：755-763，2015
rodier，f.andcampisi，j.，(2011)fourfacesofcellularsenescence，j.cellbiol.192：547-556.
park.c.m.，etal.，(2008)discoveryofanorallybioavailablesmallmoleculelnhibitorofprosurvivalb-celllymphoma2proteins，jmedchem51：6902-6915.
pelz，n.f.，etal.，(2016)discoveryof2-lndole-acylsulfonamidemyeloidcelllaukemia1(mcl-1)inhibitorsusingfragment-basedmethods，jmedchem59：2054-2066.
sleebs，b.e.，etal.，quinazolinesulfonamidesasdualbindersoftheproteinsb-celllymphoma2andb-celllymphomaextralongwithpotentproapoptoticcell-basedactivity(2011)jmedchem54：1914-1916.
sleebs，b.e.，etal.，(2013)discoveryofpotentandselectivebenzothiazolehydrazoneinhibitorsofbcl-xl，jmedchem56：5514-5540.
tanaka，y.，etal.，(2013)discoveryofpotentmcl-1/bcl-xldualinhibitorsbyusingahybridizationstrategybasedonstructuralanalysisoftargetproteins，jmedchem56：9635-9645.
tao，z.f.，etal.，(2014)discoveryofapotentandselectivebcl-xlinhibitorwithinvivoactivity，acsmedchemlett5：1088-1093.
zhou，h.，etal.，(2012)structure-baseddesignofpotentbcl-2/bcl-xlinhibitorswithstronginvivoantitumoractivity，jmedchem55：6149-6161.
lessene，g.，etal.，(2008)bcl-2familyantagonistsforcancertherapy，nat.rev.drugdiscov.7：989…1000.
vogler，m.，etal.，(2009)bcl-2inhibitors：smallmoleculeswithabigimpactoncancertherapy，celldeathdiffer.16：360-367
vogler，m.，(2014)targetingbcl2-proteinsforthetreatmentofsolidtumours，adv.med.1…14.
zhu，y.，etal.，(2015)theachilles’heelofsenescentcells：fromtranscriptometosenolyticdrugs，agingcell14：644-658.
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